buffer de fosfatos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS

ENZIMOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE ENZIMOLOGÍA

COMPILADORES:

Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega

Colaboradores: Dra. Florinda Jimenez Vega

Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Juárez, Chihuahua

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

2009

p. 22

M. en C. Emilio Clarke Crespo

Coordinador de la Academia de Biología

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biología

Dr. Alejandro Martínez Martínez

Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas

M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomédicas

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

Manual de Prácticas Pag. 2 de 22 Laboratorio de Enzimología Dra. Florinda Jiménez Vega.

PRACTICA No. 1 PREPARACION DE SOLUCIONES DE CONCENTRACION

DEFINIDA Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS (BUFFERS)

Objetivo

El objetivo general de la siguiente practica es el estudiante aprenda a preparar disoluciones en concentraciones definidas en porciento, normalidad, molalidad y molaridad.

Materiales NaCl Probeta Papel encerado Matraces volumétricos

NaOH Pipetas Placa de agitación Vasos de precipitado

HCL Balanza Barras magnéticas Fosfato de Na

Procedimiento

I. Disoluciones de concentración en peso

A) Preparación de 50 mL de una solución de NaCl al 0.9% (p/v)

• Pesar NaCl en la balanza

• Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. 30 mL)

• Colocar la disolución de NaCl en un matráz volumétrico de 50 mL y aforar

con agua destilada.

B) Preparación de 50 mL de una disolución de alcohol etílico al 70% (v/v)


• Con base a la concentración del alcohol etílico comercial determinar el

volúmen necesario para tener 35 mL de alcohol etílico.

• Medir el alcohol en una probeta

• Colocar el alcohol etílico en un matráz volúmetrico de 50 mL y aforar con

agua destilada.

II. Disoluciones de Concentración molar

A) Preparación de 200 mL una disolución de NaOH 1 M

Nota: Los ácidos y los álcalis son agentes corrosivos. Extreme precauciones

para su manejo, evite todo el contacto con la piel y ojos.

• Encontrar el peso molecular de la sustancia.

• Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar 200 mL de NaOH

1M.

• Pese el NaOH requerido y colocaro en un vaso de precipitado de 500 mL

para su disolución con agua destilada (aprox. 150 mL).

• Colocar la disolución en un matraz volúmetrico de 200 mL y aforar con agua

destilada.

B) Preparación de 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM a partir de la

disolución de NaOH 1M

• Aplicar la fórmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M

necesarios para preparar 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM

V1= (C2 x V2)/ C1 Donde: C1= Concentración inicial

V1= Volumen inicial

C2= Concentración final

V2= Volumen final


• Medir el volúmen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos en un

matráz volúmetrico de 100 mL y aforar con agua destilada.

III. Disoluciones de Concentración Normal

A) Preparación de HCL 1N

• Conocer la concentración del HCL concentrado comercial.

• Calcular la cantidad de HCL conc. requerido para preparar 50 mL de HCl 1N.

• Colocar el agua destilada (aprox. 30 mL) en un vaso de precipitado.

• Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado

requerido.

• Nota: Siempre se agrega el ácido al agua nunca el agua al ácido.

• Agitar en la placa de agitación

• Colocar la disolución en un matráz volumétrico de 50 mL y aforar con agua

destilada.

Disoluciones de concentración en peso

A1) Preparación de 200 mL de amortiguador de fosfatos 0.2 M (pH 7.0)

Preparar las soluciones stock de fosfato monosódico y fosfato disódico (0.2

M):

• Disolver 27.6 g (0.2 moles) de fosfato de sodio monobásico monohidratado y

aforar a un litro con agua destilada (Solución X).

• Disolver 28.4 g (0.2 moles) de fosfato de sodio dibásico y aforar a un litro de

con agua destilada (solución Y).

• Mezclar cantidades necesarias según la tabla para preparar 200 mL de

amortiguador de fosfatos (0.2 M) pH 7.0


Cantidades que deben mezclarse de las soluciones “X” y “Y” para obtener el

pH deseado en el amortiguador de fosfatos.

pH requerido mL de

X mL de Y

5.8 92.0 8.0 6.0 87.7 12.3 6.2 81.5 19.5 6.4 73.5 26.5 6.5 68.5 31.5 6.6 62.5 37.5 6.8 51.0 49.0 7.0 39.0 61.0 7.2 28.0 72.0 7.5 18.0 84..0

ß Checar el pH de la disolución resultante y ajustar si es necesario.

Resultados Desarrollar los cálculos que realizaron para preparar las soluciones.

Discusión

Bibliografía


PRACTICA No. 2

CENTRIFUGACIÓN Objetivo Conocer el fundamento de la centrifugación como técnica básica en la separación y separar fracciones de extractos biológicos variando la Fuerza de Centrifugación (RFC). Materiales y Reactivos

Tubos Eppendorf para microcentrifuga refrigerada de 1.5 mL de capacidad Tubos cónicos para centrifuga clínica de 15 mL de capacidad Tubos para ultracentrifuga de 10 mL de capacidad Pipetas de transferencia desechables Material biológico Extracto de Higado de pollo Procedimiento Centrifugación bajo condiciones constantes de muestras de diferente origen. 1. Descongelar los homogenados obtenidos por diferentes tratamientos

(mortero, perlas de vidrio, sonicación y homogenizador de tejidos “POLYTRON”) de higado de pollo.

2. Agitar los homogenizados y colocar 1.2 mL de muestra en tubos de microcentrifuga de 1.5 mL (preparar un tubo del mismo peso para equilibrar los tubos en la centrifuga).

3. Colocar los tubos de centrifuga (previamente marcados) en el rotor de la microcentrifuga refrigerada Eppendorf (cuidando equilibrar todos los tubos correctamente).

4. Colocar la tapa y establecer las condiciones de centrifugación a 10,000 rpm, durante 5 minutos a 5 ºC.


5. Iniciar la centrifugación y recuparar el sobrenadante en recipientes limpios y desechar el sedimento.

6. Determinar densidad óptica del sobrenadante a 580 nm.

Centrifugación bajo diferentes condiciones de un extracto biológico. 1. Colocar 3 mL de extracto de higado de pollo en tubos cónicos para

centrifuga de gabinete Beckman refrigerada. Siguiendo las recomendaciones anteriores, centrifugar esta muestra a 3500 rpm, 10 min y 5ºC.

2. Colocar 3 mL (1.5 mL por tubo) de de higado de pollo en tubos (2) para microcentrifuga (Eppendorf). Siguiendo las recomendaciones anteriores centrifugar esta muestra a 15,000 rpm por 10 min a 5ºC.

3. Colocar 3 mL de extracto de de higado de pollo en tubos para la ultracentrifuga Beckman refrigerada. Siguiendo las recomendaciones anteriores, centrifugar esta muestra a 30,000 rpm, por 10 min a 5º.

4. Una vez centrifugados los extractos de de higado bajo las diferentes condiciones, recuperar el sobrenadante de la manera anteriormente descrita y medir su densidad óptica a 580 nm utilizando agua destilada como blanco, para calibrar el espectrofotómetro.

5. Reportar los resultados en un cuadro comparativo entre el método de centrifugación y la densidad óptica a 580 nm.

6. Calcular las unidades de RFC gravitacionales alcanzadas para cada caso, de acuerdo al nomograma que se anexa.

Resultados Conclusiones Bibliografía


PRACTICA No. 3

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA TECNICA DE BRADFORD

Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de elaborar una curva de calibración para cuantificar la concentración de una proteína.

Materiales Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol por agitación con un magneto, cuando este perfectamente disuelto adicionar 100 mL de ac.fosfórico 85% y aforar a un 1Lt CUIDADO!!! (ácido + agua) Filtrar con papel (Listo para ser empleado). Almacenar a temperatura ambiente. Agua Albúmina Celdas para luz visible Procedimiento Elaboración de curva patrón

1. A partir de una alícuota de proteína de aproximadamente 4 mg/mL (C1), realizar las diluciones necesarias para tener alícuotas de 500 uL con las siguientes concentraciones (0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0, 1.2, 1.4 mg/mL)

Conc

(mg/mL) C2

Microlitros alícuota 4 mg/ml V1

Microlitros agua

Volumen final 500

µL V2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

2. Para la cuantificación, se realizara, cada determinación por duplicado. 3. Marcar para cada concentración 2 tubos


4. Adicionar 100 µL de la proteína de cada una de las concentraciones conocidas

5. Incluir un par de tubos sin muestra, intercambiar por agua (será el control) 6. Adicionar 1 mL de reactivo 7. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente 8. Determinar absorbancia a 595 nm 9. Graficar la concentración de proteína (mg/mL) en el eje X y lectura de

absorbancia (595nm) eje Y. 10. Utilizando el programa Excel, realizar una regresión lineal de los datos y

determinar la curva estándar para cuantificar. Información Adicional Verificar que el material empleado se encuentre perfectamente limpio ya que

concentraciones muy bajas de detergentes pueden interferir en la reacción.

Sustancias compatibles con Bradford NaCl, MgCl, KCl, (NH4)2SO4, Etanol

Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M, Ac. Acético, 2-

Mercaptoetanol 1 M, Sacarosa 1 M, Glicerol 99 %, EDTA 0.1 M, Triton X-100 ≧

0.1 %, SDS 1 %, Hemosol ≧ 0.1 %

Resultados y Discusión Bibliografía


PRACTICA No. 4

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES SDS-PAGE

Objetivo

Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis.

Materiales

Soluciones proteícas

Marcadores de peso molecular

Fuente de poder

Cámara de electroforesis

Puntas de micropipeta

Papel absorbente

Soluc. Azul de Coomasie (tinción) (tabla anexa)

Soluc. PAGE-SDS (Tabla anexa)

Procedimiento Preparación del gel de corrimiento (10%)

1. La preparación del gel de separación se efectúa de acuerdo a la tabla

anexa

2. Una vez polimerizado en el portagel, lavarlo y eliminar el exceso de agua

usando tiras de papel Whatman.

3. Preparar el gel de concentración (stacking gel) de acuerdo a la tabla

anexa.

4. Una vez llena la cámara, colocar el peine evitando la formación de

burbujas.


5. Una vez polimerizado el gel, lavarlo con agua destilada y llenarlo con

buffer de corrimiento (running buffer).

6. Resuspender la buffer muestra en proporción 1:4 (si es necesario agregar

más azul de bromofenol y glicerol).

7. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los carriles

correspondientes.

8. Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la muestra al

gel de separación, una vez dentro, cambiar a 100-120 V (2 h) y vigilar que

las muestras no salgan del gel.

9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel.

10. Teñir el gel utilizando Coomassie Blue, de acuerdo al protocolo anexo.

11. Calcular el peso molecular de las proteínas problema.

Determinación de la aparente masa molecular de las proteínas

1. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido

2. Mida la distancia del origen a cada uno de los estándares de peso

molecular

3. Mida la distancia de la proteína desconocida (X)

4. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total, b / total

Ejemplo a = 0.5cm, total = 4.9cm. 0.5/4.9 = 0.1

5. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estándar

6. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de los

estándares

7. Localizar la movilidad relativa de la proteína de la proteína desconocida,

extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antiligaritmo.

Movilidad

LogM

W




ANEXO

Preparación del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida

(SDS-PAGE) (Laemmli)

A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C)

Acrilamida 146.0 g N’N Bismetilenacrilamida

4.0 g

500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4°C en la obscuridad. Vida media 30 días.

B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

Tris base 54.45 g Agua destilada 150 mL Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua destilada. Almacenar a 4 °C

C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

Tris base 6.0 g Agua destilada 60 mL Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua destilada y almacenar a 4°C.

D) 10% (w/v) SDS

Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y aforar a 100 mL

E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio

100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en el momento.

F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de SDS, pH 8.3

Tris base 45.0 g Glicina 216 .0 g SDS 15.0 g No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones nativas (PAGE).


Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con acido o base. Almacenar a 4°C. Calentar a 37°C antes de usar en caso de precipitación.

G) Sample Buffer

Agua destilada 4.4 mL 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 mL Glicerol 0.8 mL 10 % SDS 1.6 mL 0.5 (w/v) azul de bromofenol en agua

0.2 mL

8.0 mL

Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer. *Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantesy reductoras, se debera adicionar 0.4 mL al sample buffer de beta-mercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habra que calentar las muestras a 95 °C por 4 min. *Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS,

H) Preparación de PAGE-SDS 10%

Volúmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR Gel Separador (Separating) (10 mL) Agua destilada

4.0 mL

1.5 M Tris-HCl pH 8.8 2.5 mL Acrilamida 3.3 mL 10 % SDS 0.1 mL Persulfato de amonio 10% 0.1 mL Temed 0.004 mL Gel Concentrador (Stacking) (4mL) Agua destilada

2.7 mL

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 0.5 mL Acrilamida 0.67 mL 10 % SDS 0.04 mL Persulfato de amonio 0.10 mL Temed 0.004 mL


Tinción de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue Soluciones Coomassie

Coomassie Blue-R250 al 0.1% Disolver 0.1 g en solución de desteñido, dejar a temperatura ambiente hasta el siguiente día, agregar el agua. Filtrar siempre antes de su uso.

Solución A Solución de fijado / desteñido (Metanol 50%, Ac. Acético 10%) Procedimiento

1. Sumergir el gel por 10 minutos en solución A. 2. Teñir con la solución de Coomassie. 3. Desteñir con la solución A hasta que se observen las bandas. 4. Enjuagar con agua destilada.


PRACTICA No. 5

COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LA CATALASA

Objetivo Conocer los principios sobre el funcionamiento de una enzima y su actividad

catalítica

Materiales Mortero

Hoja vegetal

Fosfato de potasio

Peroxido de Hidrógeno

Celdas de cuarzo

Espectrofotómetro

Procedimiento

1. Coloque una hoja en el mortero adicionando 2 mL de la solución de

fosfato de potasio 0.1 M pH 7.4 (frio).

2. Homogenizar

3. Centrifuge a 10 000 x rpm durante 5 minutos

4. Recupere la fracción sobrenadante

5. Inicie sus mediciones

6. Calibrar con un blanco de Fosfato de potasio

7. Establecer la cinética, bajo las siguientes condiciones:

8. Concentración de sustrato variable y enzima constante

a. Concentración de enzima variable y sustrato constante


a) b)

Sustrato Enzima Sustrato Enzima

18.75 µL 10 µL 75 µL 5 µL

37.5 µL 10 µL 75 µL 10 µL

75 µL 10 µL 75 µL 20 µL

100 µL 10 µL 75 µL 40 µL

150 µL 10 µL 75 µL 80 µL

300 µL 10 µL 75 µL 160 µL

9. Para cada uno de los casos, se adicionará un volumen de amortiguador

de fosfato de potasio constante de 875 µL

10. Posteriormente se adicionará el sustrato y enzima mezclando

rápidamente con ayuda de un parafilm

11. Determinar su cinética a 240 nm,



PRACTICA No. 6

CRISTALIZACIÓN DE LISOZIMA

Objetivo Conocer los principios para la cristalización de proteínas puras

Materiales Placas de 24 pozos

Plastilina

Cubreobjetos siliconizados

Aire comprimido

Vaselina o silicón en grasa

Soluciones Lizosima 20mM en Acetato de sodio pH 4.6

NaCl 12% en acetato de sodio 20 mM

Acetato de sodio 20 mM pH 4.0, 4.6 y 5.0

Procedimiento 1. Con ayuda de una jeringa colocar silicon en el borde de la placa, evitando

derramar material dentro del vaso precipitante.

2. Realizar un screening con variaciones de la solución precipitante

conteniendo una concentración de sales de 2, 4, 6, 8 y 10%.

Acetato de Sodio

20mM pH 4.0 +

NaCl 2 %

Acetato de Sodio

20mM pH 4.0 +

NaCl 4 %

Acetato de Sodio

20mM pH 4.0 +

NaCl 6 %

Acetato de Sodio

20mM pH 4.0 +

NaCl 8 %

Acetato de Sodio

20mM pH 4.0 +

NaCl 10 % Acetato de Sodio

20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio

20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio

20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio

20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio

20mM pH 4.6 +


NaCl 2 % NaCl 4 % NaCl 6 % NaCl 8 % NaCl 10 %

Acetato de Sodio

20mM pH 5.0 +

NaCl 2 %

Acetato de Sodio

20mM pH 5.0 +

NaCl 4 %

Acetato de Sodio

20mM pH 5.0 +

NaCl 6 %

Acetato de Sodio

20mM pH 5.0 +

NaCl 8 %

Acetato de Sodio

20mM pH 5.0 +

NaCl 10 %

3. Aplicar 1 mL de solución precipitante conteniendo las concentraciones

preestablecidas en cada pozo.

4. Colocar el el cubreobjetos limpio 3 gotas conteniendo 2µL, 2µL y 1µL de

la proteína y adicionar 1µL, 1µL y 2 µL de la solución precipitante.

5. Invertir el cubreobjeto conteniendo 3 gotas de 3µL cada una sobre el pozo

de la placa previamente engrasado procurando que selle perfectamente.

6. Repetir todas las condiciones planeadas en el esquema.

7. Incubar a temperatura ambiente y vigilar el crecimiento de los cristales por

microscopia.

8. Reportar sus observaciones

9. Describa en que consiste el método de difracción de un cristal por rayos

X, en el cual usted me describa el seguimiento que debería de realizar a

su muestra una vez obtenido el cristal.



PRACTICA No. 7

PURIFICACIÓN DE LISOZIMA DE HUEVO BASADA EN EL CAMBIO DE FUERZA IÓNICA EN LOS

AMORTIGUADORES Objetivo El alumno será capaz de aplicar los conocimientos básicos para la purificación

de enzimas con actividad biológica.

Materiales Bradford Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 + NaCl 0.5M Matriz de intercambio catiónico Procedimiento

1. Separar la clara del huevo

2. Filtrarla a través de tela para fibra cruda o gasa de poro fino (*)

3. La clara diluirla con 200mL de amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0

4. Homogeneizar bien y filtrar nuevamente para eliminar partículas sólidas (*)

5. Pasar esta solución a flujo lento a través de una columna de intercambio

catiónico (10 a 20 mL matriz) previamente equilibrada con amortiguador

Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 (*)

6. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0. hasta que ya

no se detecte concentración de proteína (*)

7. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 con NaCl

0.5M. hasta que ya no se detecte concentración de proteína (*)

8. Determine actividad contra lisozima y concentración de proteína en todas

las fracciones colectadas.



PRACTICA No. 8

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LISOZIMA

Objetivo Evaluar la actividad enzimática de la lizosima purificada en el laboratorio Materiales Micrococcus luteus Amortiguador de fosfatos 50mM pH 6.5 Espectofotómetro Procedimiento 1. En un tubo de ensaye, adicionar 100uL de proteína purificada 2. Adicionar 1mL de solución de M. Luteus (0.25 mg/mL) preparada en

amortiguador de fosfatos 3. Incubar a 37°C por 1hora 4. Medir absorbancia a 540 nm Resultados y Discusión Bibliografía


PRACTICA No. 9

USO DE LA BIOINFORMÁTICA PARA EL ANÁLISIS DE SECUENCIAS

Objetivo Aplicación del uso de las herramientas bioinformáticas accesibles en el Internet

para el estudio de proteínas y los genes que las codifican.

Materiales

Secuencias: AAS65790, NP_003113, Q39837, BAA99079, NP_035564

Procedimiento 1. Elija 3 secuencias de las proporcionadas

2. Busque la secuencia que le fue asignada a través de su número de

acceso del banco de datos NCBI.

3. Asigne identidad a la secuencia.

4. Determine

i. Peso molecular

ii. Punto isoeléctrico

iii. Contenido de aminoácidos

iv. Mencione en que ORF se localiza

v. Describa que tipo de estructura secundaria presenta

5. Determine el sitio de corte del péptido señal (si es que se presenta).

6. Seleccione 3 secuencias similares a nivel de proteína y alinee por Clustal.

i. Calcule el porciento de similitud entre ellas.

ii. Muestre su árbol filogenético.


buffer de fosfatos

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