bloque x cromatografia

UNIVERSIDAD VERECRUZANAFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICASAPUNTES DE CROMATOGRAFIA

La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de

solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos

que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a

travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual

puede ser lquida o slida. Las propiedades de los componentes de una mezcla

determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la

separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los

mismos.

PrincipiosLa palabra Cromatografa significa Escribir en Colores, porque cuando fue

desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una

tcnica o mtodo fsico de separacin basado en las diferentes velocidades con

que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase

mvil) a travs de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se

distribuyen entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa a travs

o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla

presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la

separacin se da por el movimiento de la fase mvil en relacin con la

estacionaria y de la distribucin de las sustancias entre las dos fases. Las

molculas que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludas ms rpido

que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que

tienden a quedar retenidas. En resumen se

fundamenta en la separacin entre la fase

estacionaria slida o liquida y la fase mvil liquida o

gaseosa

Los fenmenos rectores del proceso de retencin y

separacin son la adsorcin y la absorcin.

El primero queda delimitado a la superficie

NON-ACTIVATEDVERSIONwww.avs4you.com

interfacial es decir se refiere a la fijacin o retencin de la sustancia entre la

superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas qumicas y fsicas que

dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza

del absorbente y concentracin. El segundo fenmeno determina la retencin

de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que

tiene sta a formar mezcla o reaccionar qumicamente con la misma.

Clasificacin de la CromatografaExisten muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, segn su

fase mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de

dos sistemas, gas- lquido y gas-slido y Cromatografa lquida donde el

eluente es un lquido y puede ser lquido-liquido, liquido-slido. Por el

mecanismo de retencin-separacin, es decir el tipo de equilibrio implicado en

la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografa de

reparto, de adsorcin y de exclusin. Segn la forma de contacto entre las

fases se denomina de columna o superficie plana. Tambin se puede clasificar

teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y

gradientes.

Tcnicas cromatogrficas

Segn el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la

estacionaria, se distinguen dos tcnicas:

Columna Se usa un tubo cilndrico

Plana: El soporte es una placa plana o

los intersticios de un papel

Capa fina

Papel (particin)

Cromatografa en capa fina.Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La muestra para

anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina

adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie

por la accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes

de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms utilizados son gel

de silica, alumina, tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como soportes del


adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas

placas tienen indicador de fluorescencia : f254 f366.

La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual

debe encontrarse saturado el eluente (Fase

Mvil lquida).El eluente ascender o

desplazara por capilaridad en la placa y

arrastrar los componentes a lo largo de sta

produciendo manchas que representan a los

componentes, la separacin se da por

migracin diferencial, es decir que la fase

mvil arrastra a las substancias apolares y

aquellas ms polares son retenidas por la

fase estacionaria dando lugar a la separacin.

Posteriormente se evapora el eluente y la

placa se analiza por medio de mtodos

qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o

fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico para carbonizar

compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos utilizando

radiacin UV o luz visible.

El anlisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero

se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre

otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e

intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin

conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin

a travs de la sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde

la sustancia, y espectrofotometra por fluorescencia.

Cromatografa en papel.El proceso es bsicamente el mismo, solo que se usan tiras de

papel cromatogrfico en el tanque cromatogrfico.

Cromatografa en Columna.


Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3), Slica u Oxido de

Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual

queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en

plstico o vidrio. La fase mvil se encuentra formada por la solucin que

lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solucin que sale al final de

la columna se reemplaza constantemente por nueva solucin que se suministra

desde un contenedor por la parte superior de la columna.

La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se

encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que

cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se

separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la

separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. La

banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a

procesos difusinales, disminuyendo por tanto la resolucin.

Cromatografa de gases.Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas

(llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido

(Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin

(Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte

(Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases esta constituido

normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de


inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara

termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar,

registrar e imprimir el cromatgrama.

La muestra se introduce a travs del sistema de

inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde

ocurre la separacin. La columna de aluminio,

acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase

estacionaria slida o lquida y esta sujeta a la

superficie por un soporte que es generalmente de

slice. La fase mvil o gas portador transporta los

componentes de la muestra a travs de la columna,

por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase

estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la

columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las

sustancias, midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las

sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se

amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el

momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la

sustancia se registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan

medidas como la altura y el rea del pico.

Cromatografa Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).Es una Cromatografa de alta presin es

decir se aplica el flujo a presin (entre 1500

a 2200 psi). El tamao de partcula es entre

3 y 10 micras, la longitud de la columna es

entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo


sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reduccin del tiempo en

que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el

ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando por tanto la

resolucin.

El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una

bomba que inyecte el lquido a la columna. Generalmente las columnas de

slica requieren alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la

mezcladora se requiere para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y

el inyector permite la aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se

coloca un detector generalmente de absorcin ultravioleta o de fluorescencia y

si se desea recuperar las molculas que eluyen de la columna, se requiere un

colector.

En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan

mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la

cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su

contenido. Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con

estndares, que permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla.

La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la

curva del pico correspondiente.


Cromatografa de intercambio inico.La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos

cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o

Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH.

En protenas la cromatografa de intercambio inico se basa en las diferencias

en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las protenas a un valor de pH

determinado. La afinidad de cada protena a los grupos cargados de la columna

esta influenciada por el pH y por la concentracin de iones en solucin

(concentracin salina) que compiten con la protena en la interaccin con la

matriz. La separacin de la protena de la matriz cargada puede obtenerse

gradualmente cambiando el pH y/o la concentracin salina de la fase mvil, de

tal forma que se genere un gradiente de concentracin.

Cromatografa por Permeabilidad en Gel.Es til para la separacin de protenas.

La Cromatografa de exclusin molecular, tambin llamada de filtracin en gel,

separa en funcin de su tamao. La matriz de la columna esta formada por un

polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de


mayor tamao migran ms deprisa a lo largo de la columna que las de pequeo

tamao, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros

de las bolas de polmero y por tanto siguen una ruta ms corta y directa a lo

largo de la longitud de la columna. Las protenas de menor tamao, entran en

los poros y su marcha a lo largo de la columna es ms lenta.

Cromatografa de Afinidad.La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por

su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las

protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen

especficamente a un ligando que previamente

se ha unido covalentemente a la matriz de la

columna. Despus de que las protenas que no

se unen al ligando son lavadas o eluidas a

travs de la columna, la protena de inters que

ha quedado retenida en la columna se eluye o

libera mediante el empleo de una solucin que

contiene bien ligando libre u otro compuesto que

rompa la interaccin entre el ligando y la

protena.

Cromatografa de afinidadSe trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la

que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores

enzimticos, lectinas y otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y

enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los solutos

(analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y selectiva.


Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la

biologa molecular.

Fundamento de la cromatografa de afinidad

En la figura se muestra de forma esquemtica el fundamento de las

separaciones mediante cromatografa de afinidad. Un volumen no

excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la

columna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia

activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo

existe interaccin especfica entre este ligando y un soluto-analito (protena) de

la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elucin

de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que

no influye en el acoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase

movil que desactiva el acoplamiento por alteracin reversible de los sitios

activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos; generalmente se

utiliza un cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos; se

eluye as el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la

regeneracin de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo

de la primera fase mvil y constituye una etapa rpida.

La cromatografa de afinidad tiene una serie de caractersticas generales que la

distinguen de otros tipos de cromatografa lquidas

Alta selectividad en el mecanismo de retencin

Campo de aplicacin restringido

Separacin de un solo soluto analito

Empleo de sistema de baja presin

Columnas cortas de escasa eficacia cromatogrfica

Ligandos de afinidad

Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente

sobre el soporte slido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica

de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los

mismos: Segn su naturaleza, pueden ser macromolculas biolgicas o bien

moleculas de bajo peso molecular de biomolculas pequeas o

macromolculas bioqumicas, respectivamente. Y segn su actuacin. Que se


fundamenta en la selectividad en la retencin que condiciona las caractersticas

de la cromatografa de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos

especficos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo

soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de

compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.

Tipos de cromatografa

Naturaleza de fase estacionaria

Naturaleza de fase

estacionaria

Slido Adsorcin

Exclusin

Cambio inico

Afinidad

Lquido Particin

Naturaleza de fase

mvil

Liquido Lquido-lquido ((particin)

Lquido-slido)adsorcin, cambio inico,

exclusin, Afinidad.

Gas Gas-lquido (CGL)

Gas-slido (CGS)


Esquema de un cromatograma de afinidad.

SoportesEl material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con

el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran

superficie, tamao del grano controlable, porosidad controlable, carcter

suficientemente hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas

u otras molculas, estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta

presin.

El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgnicos

derivados de los polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de

acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.

Inmovilizacin de ligandos

La inmovilizacin de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en

cada caso tiene connotaciones especficas.

El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento

de enlaces qumicos covalente con el soporte slido activado y un grupo

reactivo del ligando que est lo ms lejos posible de la zona activa de

bioadsorcin.


El objetivo de la inmovilizacin consiste en obtener una capa estable y densa

del ligando bioqumico que conserve su actividad especfica con plenitud.

La inmovizacin del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos

etapas secuenciales:

Activacin del soporte, que consiste en el ataque qumico con diferentes

reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que

secaracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad

de procedimientos el ms comn es el ataque con bromuro de ciangeno sobre

la matriz de polisacrido. Segn el pito de matriz se originan grupos diferentes:

steres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, segn reacciones

uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente

orgnico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje qumico del ligando

que se da mediante la reaccin de grupos amino del mismo, fundamentalmente

con el soporte activado.

Metodos de elusinSegn la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y

teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave

distinguir los procedimientos generales de elucin como: Elucin bioespecfica:

La fase mvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado

inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo

peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolcula

biolgica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos

de bajo peso molecular, producindose en todos los casos una elucin por

desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular

ligados o no, con el sitio activo de la macromolcula biolgica ligada o libre. Se

distinguen 2 tipos de elucin bioespecfica la normal y la invertida.

La elucin normal se basa en la interaccin inhibidor-analito, que es la situacin

ms frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida

por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que

es tambin de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del

analito, por lo que es retirada del slido y eluida. Ejemplo, la purificacin de la

lectina.


La elucin invertida, se basa en la interaccin inhibidor-ligando de afinidad. El

cual es una biomacromolcula que retienen especficamente el analito. La

presencia del inhibidor en la fase mvil provoca un desplazamiento anlogo al

anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoprotena.

En la elucin no bioespecfica, la fase mvil provoca la denaturacin del ligando

inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y

reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se

interrumpe la adsorcin bioespecfica mediante eliminacin de una o varias de

las causas que la provocan.

NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIATERMINOCromatografa. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que

los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales

est en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve

en una direccin definida.

Cromatgrafo. El instrumento empleado para realizar una separacin

cromatogrfica.

Cromatgrama. Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un

detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada

como medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente

o al tiempo. En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede referirse al papel

o capa con las zonas separadas.

Fase Ligada. Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las

partculas de soporte o a la pared interior de la columna.

Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que est inmovilizada sobre las

partculas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por

polimerizacin in situ (entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento.

Fase Mvil. Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en

una direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas

(Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido


Supercrtico). En la cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas

Portador para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para

la fase mvil la expresin Eluyente.

Eluir. Aplicar la cromatografa de elucin. El proceso de elucin se puede

detener mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho

cromatogrfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se

prefiere el trmino "Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas

anteriores de cromatografa plana.

Efluente. La fase mvil que abandona la columna.

Muestra. Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya

separacin se pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos

por la fase mvil.

Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la

muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no

retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o

retenidos permanentemente. Se aceptan tambin los trminos Eluito y Analito

para un componente de la muestra

Mtodos principales

Cromatografa Frontal: Procedimiento en el que la muestra (lquida o gaseosa)

se alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna

fase mvil adicional

Cromatografa de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase mvil

contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido ms fuertemente que

los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema

en forma discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve.

Cromatografa de Elusin: Procedimiento en el que la fase mvil se pasa de

forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se

suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un

tiempo breve.

Clasificacin de acuerdo al lecho cromatografico

Cromatografa en Columna: Tcnica de separacin en la que el lecho

estacionario est contenido dentro de un tubo. Las partculas de fase

estacionaria slida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria lquida,


pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar

concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta,

no restringida, para el paso de la fase mvil por el centro del tubo (Columna

Tubular Abierta).

Cromatografa plana: Tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est

en forma de plano o sobre un plano. ste puede ser un papel, que sirva como

tal o que est impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria

(Cromatografa en Papel), o una capa de partculas slidas extendida sobre un

soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografa en Capa Fina, TLC). A

veces a la cromatografa plana se la llama tambin Cromatografa de Lecho

Abierto.

Literatura recomendada

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Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimica clinica: Tcnicas de

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