bir vol 4 biologia molecular 2014

Manual bIR

VOLUMEN IV: MANUAL DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Autor: Dr. Tomás E. Verdura González

Editora: Dra. Iliana Perdomo López

Manual BIR. VOLUMEN IV: MANUAL DE BIOLOGÍA

MOLECULAR

Autor: Dr. Tomás E. Verdura González

© Iliana Perdomo López (editora). Depósito legal: DLC 614-2012

Reservado todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil previsto en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito de la editora.

ÍNDICE BIOLOGÍA MOLECULAR BIR

1.- COMPONENTES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 1

2.- ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 13

2.1- ESTRUCTURA PRIMARIA 14

2.2- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. 14

3.- ESTRUCTURA SECUNDARIA 17

3.1- REGLAS DE CHARGAFF 17

3.2.- MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL ADN 17

3.3.- VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL ADN 20

3.4.- PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ADN 26

3.5.- PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ARN 29

4.- ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DEL ADN Y DEL ARN 31

4.1.- SUPERENROLLAMIENTO DEL ADN (ESTRUCTURA TERCIARIA) 31

4.2.- ESTRUCTURA DE LOS ARNs 35

4.3.- LOS RIBOSOMAS 41

5.- CONDENSACIÓN DEL ADN Y CROMOSOMAS 43

5.1.- PROTEÍNAS COMPONENTES DE LA CROMATINA 43

5.2.- NIVELES DE CONDENSACIÓN DEL ADN NUCLEAR EUCARIÓTICO 45

5.3.- EL CROMOSOMA METAFÁSICO 50

5.4.- DOTACIÓN GENÉTICA EN EUCARIOTAS 56

6.- ORGANIZACIÓN DEL GENOMA DE EUCARIOTAS 57

6.1.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL GENOMA. DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

57

6.2.- COMPLEJIDAD DEL GENOMA EUCARIÓTICO 58

6.3.- COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO 59

6.4.- ADN DE COPIA ÚNICA, SIMPLE O NO REPETITIVO 60

6.5.- ADN REPETITIVO 60

6.6.- ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA COMPLEJIDAD 66

7.- EL CICLO CELULAR 71

7.1.- CONTROL DEL CICLO CELULAR 72

7.2.- DIVISIÓN CELULAR 84

7.3.- DIFERENCIAS ENTRE MITOSIS Y MEIOSIS 93

7.4.- LA GAMETOGÉNESIS 94

8.- GENÉTICA MENDELIANA Y AMPLIACIÓN DEL MENDELISMO 97

8.1.- LAS LEYES DE MENDEL 97

8.2.- AMPLIACIÓN DEL MENDELISMO 104

8.3.- HERENCIA EN RELACIÓN CON EL SEXO 112

8.4.- COMPROBACIÓN DE LAS PROPORCIONES MENDELIANAS. PRUEBA

CHI-CUADRADO

116

8.5.- POLIGENIA. HERENCIA MULTIFACTORIAL 117

8.6.- LA HERENCIA NO NUCLEAR 118

9.- LIGAMIENTO Y RECOMBINACIÓN 121

9.1.- GENES LIGADOS 121

9.2.- LA RECOMBINACIÓN 124

9.3.- CARTOGRAFÍA EN ORGANISMOS DIPLOIDES 126

9.4.- SEGREGACIÓN Y RECOMBINACIÓN MITÓTICA 132

9.5.- INTERCAMBIOS ENTRE CROMÁTIDAS HERMANAS 132

10.- MECANISMOS DE RECOMBINACIÓN 135

11.- LA REPLICACIÓN DEL ADN 145

11.1.- CARACTERÍSTICAS 145

11.2.- ENZIMOLOGÍA DE LA REPLICACIÓN 148

11.3.- ETAPAS DE LA REPLICACIÓN 152

11.4.- REPLICACIÓN MITOCONDRIAL 159

11.5.- REPLICACIÓN POR CÍRCULOS RODANTES 161

12.- LA TRANSCRIPCIÓN 163

12.1.- CONCEPTO DE GEN 163

12.2.- ENZIMOLOGÍA DE LA TRANSCRIPCIÓN 165

12.3.- TRANSCRIPCIÓN DEL GENOMA MITOCONDRIAL 175

12.4.- INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN 175

13.- REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EUCARIOTAS: CONTROL

PRETRANSCRIPCIONAL Y TRANSCRIPCIONAL

177

13.1.- CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL 177

13.2.- CONTROL TRANSCRIPCIONAL 184

14.- CONTROL POSTRANSCRIPCIONAL O PROCESAMIENTO DEL ARN 191

14.1.- PROCESAMIENTO DEL ARN MENSAJERO 193

14.2.- PROCESAMIENTO DE LOS ARNs RIBOSÓMICOS Y TRANSFERENTES 200

14.3.- MADURACIÓN DEL ARN MITOCONDRIAL 200

14.4.- REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL Y PRETRADUCCIONAL 201

15.- EL CÓDIGO GENÉTICO 203

15.1.- CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO 203

15.2.- DESCIFRAMIENTO DEL CÓDIGO GENÉTICO 205

16.- TRADUCCIÓN O SÍNTESIS DE PROTEÍNAS 207

16.1.- FASE PREVIA: ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS 208

16.2.- INICIACIÓN 209

16.3.- ELONGACIÓN 212

16.4.- TERMINACIÓN 214

16.5.- ENÉRGETICA 215

16.6.- INHIBIDORES DE LA TRADUCCIÓN 216

16.7.- REGULACIÓN TRADUCCIONAL 218

17.- MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES 219

17.1.- TRÁFICO O DESTINO DE LAS PROTEÍNAS 219

17.2.- MADURACIÓN DEL POLIPÉPTIDO NACIENTE 221

17.3.- DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS 230

18.- MUTACIÓN 233

18.1.- MUTACIONES GÉNICAS 233

18.2.- MECANISMOS DE ORIGEN DE LAS MUTACIONES GÉNICAS 236

18.3.- MUTACIONES CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES 240

18.4.- MUTACIONES CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS 240

19.- REPARACIÓN DEL ADN 241

19.1.- SISTEMAS PREVENTIVOS 241

19.2.- REVERSIÓN DIRECTA DE LA LESIÓN 241

19.3.- REPARACIÓN POR ESCISIÓN 242

19.4.- REPARACIÓN POSREPLICACIÓN 245

19.5.- REPARACIÓN GO 248

20.- ENFERMEDADES GENÉTICAS. ENFERMEDADES MONOGÉNICAS Y

MULTIFACTORIALES

249

20.1.- CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS 249

20.2.- ENFERMEDADES MONOGÉNICAS NUCLEARES 251

20.3.- ENFERMEDADES MITOCONDRIALES 260

20.4.- ENFERMEDADES POLIGÉNICAS, MULTIFACTORIALES, COMPLEJAS

O MIXTAS

261

20.5.- ENFERMEDADES COMPLEJAS: ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 263

21.- CROMOSOMOPATÍAS O ENFERMEDADES CITOGENÉTICAS 265

21.1.- CARIOTIPO HUMANO Y SISTEMA INTERNACIONAL DE

NOMENCLATURA

265

21.2.- CROMOSOMOPATÍAS ESTRUCTURALES 267

21.3.- CROMOSOMOPATÍAS NUMÉRICAS 278

22.- BASES MOLECULARES DEL CÁNCER 285

22.1.- GENES RESPONSABLES DEL CÁNCER 285

22.2.- RUTAS REGULADORAS DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR 288

23.- MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN 293

23.1.- HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA 294

23.2.- HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO 294

23.3.- HIBRIDACIÓN IN SITU 296

23.4.- MICROARRAY O MICROCHIP DE ADN 300

23.5.- SINTESIS DE ADNc 303

23.6.- CGH (HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA) 303

23.7.- TRANSFERENCIA WESTERN 304

24.- CLONACIÓN ACELULAR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 305

24.1.- OBJETIVO Y APLICACIONES DE LA PCR 305

24.2.- REQUERIMIENTOS 306

24.3.- ETAPAS DEL PROCESO 306

24.4.- CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO 308

24.5.- VARIANTES DEL MÉTODO 309

25.- TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 313

25.1.- NUCLEASAS 313

25.2.- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 313

25.3.- CLONACIÓN CELULAR DE MOLÉCULAS DE ADN 317

25.4.- GENOTECAS 326

26.- MAPA GENÉTICO Y FÍSICO DEL GENOMA 329

26.1.- MAPA GENÉTICO O DE LIGAMIENTO 329

26.2.- MAPA FÍSICO 329

26.3.- SECUENCIACIÓN 334

27.- LOS GENES EN LAS POBLACIONES 341

27.1.- EQUILIBRIO DE HARDY-WEINBERG 341

27.2.- MODIFICACIÓN DE LAS FRECUENCIAS GÉNICAS Y GENOTÍPICAS 343

27.3.- CÁLCULO DEL COEFICIENTE DE CONSANGUINIDAD INDIVIDUAL 344

BIBLIOGRAFÍA 345

Biología Molecular InspiracleBIR/2014

1

1. COMPONENTES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. (2011) 212; (2010)

167, 219; (2009) 260; (2008) 174, 215, 216, 237; (2007) 185, 186; (2005) 241; (2003) 188.

Los ácidos nucleicos son macromoléculas catenarias compuestas exclusivamente por C,

H, O, N y P y constituidas por monómeros denominados nucleótidos. Existen dos tipos de

ácidos nucleicos, ADN y ARN, formados cada uno por un tipo de nucleótido:

- ADN (ácido desoxirribonucleico) por desoxirribonucleótidos.

- ARN (ácido ribonucleico) por ribonucleótidos.

Independientemente de su tipo, cada nucleótido consta de tres componentes:

1. Una pentosa.

Aparece en su forma más estable, la configuración β: la β-D-ribofuranosa en el ARN y la

β-D-2-desoxirribofuranosa en el ADN.

Fuente: Figura apartado 2.2 (pag 11) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.,

Barcelona, 1ª ed., 2008”.

2. Una base nitrogenada heterocíclica.

Moléculas con más de un átomo de nitrógeno. Pertenecen a dos familias distintas:

- pirimidínicas: derivadas de la pirimidina, formadas sólo por un anillo. Son tres: citosina (C),

timina (T) y uracilo (U).

- púricas: formadas por dos anillos condensados. Son dos, adenina (A) y guanina (G).

MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA

InspiracleBIR/2014 Biología Molecular

2

Fuente: Figura apartado 2.31 (pag 12) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.,

Barcelona, 1ª ed., 2008”.

Las bases nitrogenadas poseen las siguientes propiedades:

a) Hidrofobicidad. La naturaleza aromática de los anillos hace que las bases tengan un

marcado carácter apolar, sean hidrofóbicas y poco solubles en agua a pH celular. A pH

ácido o alcalino adquieren carga y se hacen más solubles en agua.

b) Existencia de dipolos. Salvo la adenina, todas las bases poseen átomos de nitrógeno y

oxígeno, lo que determina que se formen entre ellas enlaces polares como los puentes de

hidrógeno.

c) Disposición coplanar de los enlaces de cada anillo.

d) Tautomería. Consiste en el desplazamiento de un H desde un átomo de N o de O nuclear

hacia otro extranuclear y viceversa. Hay dos tipos de tautomerías:

d.1. Tautomería ceto-enol. El grupo ceto forma parte de un enlace amida cíclica o lactama.

Al migrar el átomo de H desde el N nuclear al O del grupo ceto, se convierte en el tautómero

lactima (enol). Esta tautomería afecta a T, G, C y U.



20

g) Superficie de la molécula. Todo a lo largo se forman dos surcos, uno mayor y otro menor,

que van girando de forma helicoidal y dejan espacio suficiente para que moléculas externas

puedan interaccionar con las bases.

h) Idoneidad para la replicación. Este modelo permite explicar de una forma muy simple la

duplicación del ADN y la reparación de mutaciones.

3.3. VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL ADN

La molécula de ADN es flexible y dinámica. Gracias a la capacidad de rotación

alrededor de los enlaces de los nucleótidos, el ADN puede adoptar in vivo diversas formas

distintas de la forma B, como son:

- conformaciones A y Z. Descubiertas por difracción de rayos X.

- variaciones conformacionales locales en torno a la forma B.

- interacción de regiones específicas del ADN con estructuras características de

algunas proteínas.

3.3.1. Conformaciones A y Z.

Forma A del ADN

No se encuentra en condiciones fisiológicas, sino en disoluciones muy concentradas

con una humedad relativa por debajo del 75%. Es la forma que adopta el ARN cuando

posee regiones de doble hebra, así como los híbridos ADN-ARN.

Es más ancha (mayor diámetro), más corta para un mismo número de nucleótidos

(menor distancia entre pares de bases) y tiene mayor número de pares de bases por vuelta.

Las bases se disponen inclinadas con relación al eje y más separadas de él. El surco mayor

es más estrecho y muy profundo y el menor casi no se aprecia por ser ancho y poco

profundo.

Comparación entre los tres tipos estructurales básicos de DNA en doble hebra

TIPO DE HÉLICE

A (deshidratada) B (Watson-Crick) Z (Rich-Dickerson)

Sentido de giro de la hélice Dextrógiro Dextrógiro Levógiro

Forma y tamaño La más ancha y corta Intermedia La más estrecha y larga

Diámetro de la hélice 2,55 nm (25,5 Å) 2,37 nm (23,7 Å) 1,84 nm (18,4 Å)

Distancia entre bases (d)1 0,23 nm (2,3 Å) 0,34 nm (23,4 Å) 0,38 nm (3,8 Å)

Pares de bases por vuelta (n) 11 10,4 12

Rotación por cada base (360° ln)2 + 32,7° + 34,6° -30°

Longitud vuelta de hélice (n/d)3 2,53 nm (25,3 Å) 3,54 nm (35,4 Å) 4,56 nm (45,6 Å)

Inclinación del plano de los pares

de bases4

19°

(gran inclinación)

1,2° (casi perpendicular al

eje de la hélice)

9°

(ligera inclinación)

Surco mayor o grande Estrecho, profundo Ancho, profundidad media Plano, sin profundidad

Surco menor o pequeño Amplio, no profundo Estrecho, profundidad

media

Estrecho, profundo

Enlace N-glicosídico Anti Anti Anti (C, T) y Sin (G)

Notas: 1 Distancia entre pares de bases, medida a lo largo del eje de la hélice.

2 Rotación por cada par de bases, o giro respecto al par anterior (+ dextrógiro, - levógiro).

3 Longitud de la vuelta de hélice, medida a lo largo del eje; coloquialmente “paso de rosca” o paso de hélice”.

4 Inclinación respecto al plano perpendicular al eje de la hélice.

Fuente: Tabla apartado 6.1 (pag 52) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética., Barcelona, 1ª ed., 2008”.



21

Fuente: Figura apartado 6.1.1 (pag 53) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería

Genética., Barcelona, 1ª ed., 2008”.

Fuente: Figura apartado 6.1.1 (pag 53) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería




42

Fuente: Figura apartado 7.3.2.2 (pag 80) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería




52

heterocromáticas de los cromosomas 1, 9 y 16 y en los satélites de los acrocéntricos, que

dan una tinción variable.

Las bandas oscuras del bandeado G y las fluorescentes o brillantes del bandeado Q

representan regiones cuyo ADN es rico en el par A-T. De manera que su coloración es

proporcional a la concentración de A + T. Esto ha sido corroborado por los resultados

obtenidos con sustancias estrictamente específicas por su afinidad por pares A-T, como la

daunomicina y el “Hoescht 33258”. Las sustancias que se unen preferentemente al par G-C,

como la cromomicina A3, dan un patrón de bandeado fluorescente inverso al bandeado Q y

al G.

Además de ser ricas en A-T, las bandas G se caracterizan porque su ADN se replica

en la segunda mitad (tardía) del período S del ciclo celular; aunque no tan tardíamente como

las regiones de heterocromatina constitutiva, como los centrómeros. También se

corresponden con los cromómeros o grumos de cromatina de los cromosomas meióticos.

Por último se considera que contienen relativamente pocos genes en comparación con las

bandas claras (no coloreadas) y que las proteínas que contienen son diferentes de las que

integran las bandas claras.

Se ha propuesto que el patrón de bandas G o Q respondería a un empaquetamiento

diferencial de las regiones cromosómicas axiales. Estas regiones constituyen la base de los

lazos de cromatina y se unen a proteínas no histónicas del “armazón cromosómico” rico en

la enzima topoisomerasa II. Son regiones pobres en genes, sólo contienen el 20% del total

de ellos y funcionalmente tienden a la represión génica.

Bandeo R: Se desnaturaliza con calor el ADN rico en AT y luego se tiñe con Giemsa.

Aparecen bandas oscuras, bandas R, que coinciden con las bandas G y Q claras. Del patrón

reverso deriva el nombre. Se consigue el mismo patrón empleando olivomicina, un colorante

con afinidad por los pares GC. Con cromomicina A3 las bandas R son fluorescentes. Las

bandas R contienen ADN rico en GC (50 -60%) poco condensado y activo

transcripcionalmente.

Bandeo T: Identifica un subconjunto de bandas R concentradas en los telómeros, las

de tinción más intensa, que se visualizan aplicando un tratamiento térmico severo antes de

teñir los cromosomas con Giemsa o con una combinación de tinciones y fluorocromos.

Para situaciones particulares se emplea:

- Bandeo C: tiñe sólo la heterocromatina constitutiva, compuesta por ADN de tipo

satélite, muy repetitivo. Sólo tiñe las regiones centroméricas y los bloques de

heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del brazo largo del cromosoma Y. El

material cromosómico se desnaturaliza y se extrae con álcali y se incuba en solución salina

para teñirlo después con Giemsa u otros colorantes. Como las regiones de bandas C son



53

altamente polimórficas en la población humana, este bandeado está indicado para la

búsqueda de polimorfismos de heterocromatina.

Bandas cromosómicas del cariotipo de acuerdo con el sistema internacional

- Tinción N o NOR: para la región organizadora del nucleolo que contiene los genes

del ARNr 18S y ARNr 28S. Tiñe las constricciones secundarias en los cromosomas 13-15 y

21-22. El patrón es totalmente diferente al clásico (Q y G) puesto que se basa en la

presencia de proteínas argentafines en esas regiones, que se tiñen con nitrato de plata.

- Bandeo de profase y prometafase o de alta resolución: sobre cromosomas

detenidos en una etapa temprana de la mitosis en un estado relativamente descondensado

en el que su mayor longitud permite apreciar más detalles.

- Hibridación in situ con fluorescencia (FISH): emplea sondas de ADN clonado

específicas para regiones cromosómicas o para cromosomas individuales que permiten

identificar reordenamientos particulares o la existencia de un número anormal de

cromosomas. Es la técnica de mayor potencialidad para el análisis cromosómico.



85

pierdan su forma habitual y adopten una forma esférica. La actina y miosina se dispersan

por toda la célula y los microtúbulos se fragmentan y reorganizan para formar el huso

acromático.

Los cromosomas profásicos aparecen como delicados filamentos extendidos o

enrollados dentro del núcleo. Cada uno de ellos está compuesto por dos filamentos

denominados cromátidas, que se encuentran estrechamente asociados todo a lo largo. A

medida que la profase progresa, las cromátidas van acortándose y engrosándose. Esto se

debe a una espiralización de la cadena de nucleosomas, produciéndose una condensación

de las histonas, que pierden agua y sufren una serie de cambios como acetilación y

fosforilación (hasta 6 fosfatos por molécula de histona H1) por las proteínas quinasas

mitóticas, y también a cambios en la concentración iónica (Ca++, Mg++) del citoplasma. Un

cromosoma de 10 µm de largo y 1 µm de ancho tiene 80.000 µm de longitud de ADN, lo que

significa que el empaquetamiento es de 8.000 veces.

Hacia el final de la profase, los cromosomas tienden a acercarse al borde del núcleo.

En este momento el acortamiento y engrosamiento de la cromatina es máximo y los

cromosomas alcanzaron su configuración completa.

El nucleolo va disgregándose en cuerpos pequeños progresivamente.

Tiene lugar la formación del huso acromático. Hacia la mitad de G1 los dos centríolos

comienzan a separarse, iniciando la duplicación a finales de G1 o principios de S y

finalizándola a finales de G2, dando lugar a una pareja doble de centríolos. Rodeando los

centríolos hay un áster, una estrella de microtúbulos cortos y una zona clara periférica,

donde no penetran los microtúbulos del áster, que se llama centrosfera. A microscopio

electrónico se observa un material denso del que salen los microtúbulos. Esta matriz

pericentriolar es el verdadero centro organizador de microtúbulos. Uniendo ambas parejas

de centríolos hay un haz de microtúbulos, denominados microtúbulos polares, que va

alargándose a medida que las parejas de centríolos comienzan a separarse. Uno de los

pares de centríolos permanece en su lugar, mientras que el otro par, describe un trayecto

semicircular de 180º alrededor del núcleo para alcanzar el polo opuesto. Al final, cada pareja

de centríolos, con su áster, queda en un polo de la célula.

Los microtúbulos están en constante renovación, perdiendo tubulinas por sus

extremos – en los polos e incorporando tubulinas por sus extremos + en la zona ecuatorial.

Los haces se solapan en la zona ecuatorial, donde se interconectan con proteínas motoras

del tipo quinesinas, que contribuyen a estabilizar su posición.

Las mitosis cuyo aparato acromático contiene centríolos, ásteres y husos, se

denominan astrales o anfiastrales.



135

10. MECANISMOS DE RECOMBINACIÓN. (2013) 95.

La fuente primaria de variabilidad es la mutación, sin embargo, en los organismos

con reproducción sexual la producción de individuos con nuevas combinaciones de alelos a

partir de los ya existentes en la población, es el mecanismo más importante de producción

de variabilidad genética. Existen diferentes tipos de recombinación:

- recombinación homóloga general.

- recombinación específica de sitio.

- transposición.

En eucariotas la recombinación genética se produce por la distribución independiente

de los cromosomas durante la meiosis y por la existencia de un intercambio físico de

segmentos cromosómicos entre dos cromátidas no hermanas de dos cromosomas

homólogos, a través del entrecruzamiento que tiene lugar en la profase I de la meiosis. En

procariotas la recombinación genética se lleva a cabo mediante fenómenos parasexuales:

conjugación, transformación, transducción y sexducción.

MECANISMOS MOLECULARES DE LA RECOMBINACIÓN GENERAL HOMÓLOGA

1. MODELO DE HOLLIDAY

El primer modelo aceptado fue propuesto por Holliday en 1964 para procariotas.

Consiste en un proceso de ruptura de dos moléculas de ADN homólogas en el mismo lugar

de una sola cadena en cada doble hélice, seguido de un intercambio de fragmentos entre

ellas y una reconstitución de dos moléculas que contienen partes intercambiadas. Los

pasos básicos son los siguientes:

- Apareamiento de los cromosomas homólogos mediado por el complejo sinaptonémico. Las

dobles hélices implicadas en el entrecruzamiento rotan de manera que queden enfrentadas

con la misma polaridad.

- Producción de cortes en las dos cadenas de la misma polaridad y desenrollamiento de la

doble hélice. Este paso lo lleva a cabo el complejo RecBCD con actividad nucleasa y

helicasa, que genera cadenas sencillas. La actividad nucleasa reconoce el sitio chi, una

secuencia constituida por 8 pb (5´-GCTGGTGG-3´) y que se encuentra en multitud de sitios

del genoma. La cadena sencilla originada, una vez estabilizada por la proteína Ssb

desencadena el proceso.

- Los extremos rotos invaden la doble hélice contraria: una hélice sencilla desplaza a la

cadena de su misma polaridad y la otra hace lo mismo. Las cadenas desplazadas se unen a

RecA, que reconoce el ADN de cadena sencilla y promueve la invasión de esta cadena

hacia una doble hélice que esté en su proximidad. Si encuentra homología desplaza a la

cadena de igual polaridad. El que se mueve es siempre el extremo 3´-OH. La cadena



136

desplazada formaría un bucle D. Las cadenas invasoras buscan la posibilidad de

apareamiento y cuando encuentran la zona con bases complementarias se fijan

estableciendo puentes de hidrógeno entre ellas. Finalmente los huecos que se han originado

son sellados mediante una ligasa. Este es el intermediario de Holliday: dos dobles hélices

entrecruzadas por una de sus cadenas.

- Migración: el intermediario de Holliday crea un cruce entre las cadenas que puede moverse

a lo largo del heterodúplex (doble hélice híbrida). Este movimiento se origina desde el punto

en que se produjo la invasión y, en su movimiento, incrementa la región de ADN

heterodúplex. Las proteínas RuvA y RuvB son responsables de la migración. RuvA es un

tetrámero que reconoce específicamente el punto de entrecruzamiento y, entonces, dos

moléculas de RuvB la flanquean, constituyendo un complejo hexamérico. El complejo se

desplaza abriendo la hélice en dirección 5´ y cerrándola por detrás (3´).

- Resolución del intermediario de Holliday: Tiene lugar por un corte y posterior unión entre

las dos cadenas originales o de las cadenas intercambiadas. En el primer caso, el corte no

da lugar a cromátidas recombinantes entre los marcadores flanqueantes A y B. Sin

embargo, en el segundo caso, el corte origina recombinación, cambiando las relaciones de

ligamiento de los marcadores (aB/Ab). Los cortes son realizados por RuvC, una

endonucleasa que realiza dos cortes simétricos en cadenas que no se crucen. Parece que

también podrían intervenir en el corte RecG y Rus.



142

TRANSPOSICIÓN

Descubiertos por McClintock, los elementos genéticos transponibles son elementos

genéticos capaces de moverse de una posición a otra del mismo cromosoma o a otros

cromosomas y se han detectado por las alteraciones que producen en los genes a los que

se mueven. La entrada y salida del elemento se realiza por recombinación, pero no hay

homología de secuencias ni sitios específicos, es una recombinación al azar. Hay diferentes

tipos en los distintos seres vivos.

Elementos genéticos transponibles bacterianos

1. Secuencias de inserción (IS): Son los elementos transponibles más simples. Su tamaño

va de 768 pb a más de 5000.Contienen sólo los genes necesarios para la movilización: el

gen de la transposasa (enzima necesaria para la transposición) rodeado de repeticiones

invertidas. Cuando se insertan provocan la repetición directa de una de una secuencia diana

corta. La transposición de una secuencia de inserción puede provocar mutaciones de

inserción. También pueden producirse deleciones e inversiones por entrecruzamiento entre

IS repetidas en el genoma.



143

2.Transposones: Son elementos transponibles más complejos. Contienen los genes

necesarios para la transposición y generalmente otros genes que confieren resistencia a

determinadas drogas. Algunos fagos se comportan como transposones, por ejemplo el fago

Mu. Hay dos tipos:

· Transposones compuestos: Flanqueados por dos elementos IS del mismo tipo. Ejemplos:

Tn9, Tn10

· Transposones no compuestos: No terminan en elementos IS pero sí están flanqueados

por repeticiones terminales invertidas y también dan lugar a la duplicación directa de la

secuencia diana. Ejemplo: Tn3, contiene tres genes: tnpA, gen de la transposasa, tnpB, gen

de la resolvasa, y bla, gen de la b-lactamasa, que confiere resistencia a ampicilina.

Mecanismos de transposición

a) Transposición replicativa: el elemento se duplica, una copia permanece en la posición

original y otra se mueve a otro lugar. Ejemplo: Tn3, modelo del cointegrado.

b) Transposición conservativa (no replicativa): el elemento cambia de posición sin dejar una

copia en la posición original



150

ADN polimerasa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III

Actividades

enzimáticas

1. Polimerasa 5´→3´.

Elongación.

2. Exonucleasa 3´→5´.

Correctora de pruebas.


Eliminación del cebador y

traslación de la mella.


Elongación.


Correctora de pruebas.


Elongación.


Correctora de

pruebas.

Función en

la célula

Eliminación del Cebador y

Extensión de los fragmentos

de Okazaki.

Reparación. Replicación (síntesis

continuada de las dos

hebras).

Velocidad

de

replicación

-16-20 nucleótidos/segundo.

- Procesividad baja: 3-200

nucleótidos añadidos antes

de su disociación.

- 2-7 nucleótidos/seg.

- Procesividad media: ≥

10.000 nucleótidos

añadidos.

- 250 -1000 nucl/seg.

- Procesividad muy alta:

≥ 5 ∙ 105 nucleótidos

añadidos.

Las ADN polimerasas IV y V intervienen en la ruta de reparación “síntesis de

ADN propensa al error a través de la lesión” (Respuesta SOS). Carecen de actividad 3´

exonucleasa correctora por lo que reducen la fidelidad de la replicación a un error cada 1000

nucleótidos.



151

Formación y composición de la holoenzima ADNpol III



288

periférico) y leucemia mieloide.

NF-2 Relacionado con meningioma y ependinoma (encéfalo) y

schwanoma (nervios periféricos)

Genes de proteínas nucleares

MTS1 Codifica para la proteína p16, uno de los frenos del sistema de

control del ciclo celular. Relacionada con muchos cánceres.

RB Codifica para la proteína RB (retinoblastoma). Esta proteína es uno

de los principales frenos en el ciclo celular.

p53 Codifica para la proteína p53, la cual detiene la división celular e

induce a las células anormales al suicidio (apoptosis). Relacionado

con la mayoría de los cánceres .

WT1 Relacionado con el Tumor de Wilms del riñón.

Genes que codifican proteínas de ubicación aún no determinada

BRCA1 Relacionado en cánceres de mama y ovario.

BRCA2 Relacionado con cáncer de mama.

VHL Relacionado con cáncer de células renales.

22.2. RUTAS REGULADORAS DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR.

Las tres rutas que regulan la proliferación celular y cuya alteración conduce al

cáncer son:

1. La transducción de señales extracelulares al interior celular hasta conectar con

el ciclo celular.

2. La regulación del ciclo celular.

3. La apoptosis o muerte celular programada.

22.2.1. La transducción de la señal extracelular al interior celular.

El mecanismo de activación en el que interviene la proteína Ras, causante de

numerosos procesos cancerosos, es un paso esencial en la transducción de señales

producidas por muchos factores de crecimiento.

1.- La molécula señal actúa como ligando al interaccionar, con gran afinidad y de modo

reversible, con el dominio extracelular de una proteína receptora específica, cuyo dominio

transmembrana hidrofóbico está insertado en la bicapa lipídica de la membrana. El

número de receptores de un tipo concreto en cada célula es muy variable, desde cientos

a millones. En el caso de la ruta que activa a Ras, la señal procede de diversos

receptores: para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de

crecimiento epidérmico (EGF), la insulina, etc.

2- Al unirse el ligando al receptor, éste se estimula.En el caso del receptor de PDGF,

forma un dímero y se activa una actividad proteína quinasa intrínseca, concretamente del

tipo tirosina quinasa, fosforilando con gasto de ATP, el dominio intracelular propio o bien

otras proteínas.



289

3- La “1ª cascada de transmisión de la señal “, puede realizarse por varias vías en las que,

se producen modificaciones en la conformación de una proteína que a su vez permiten la

interacción con otras proteínas “adaptadoras” o su fosforilación.

4- La propagación de la señal continúa mediante la activación de la proteína Ras, una

proteína G monomérica (también llamada p21Ras, por su masa de 21 kDa). Las proteínas

G actúan en numerosos procesos como “interruptores moleculares”, al poder pasar de su

forma inactiva, unida a GDP, al estado activo , unida a GTP. El complejo activo Ras :GTP

trasmite la señal mediante su interacción con otras proteína quinasas citoplasmáticas

(proteínas “efectoras”), activándolas, con lo que comienza una “2ª cascada de transmisión

de la señal”. La consiguiente hidrólisis del GTP por Ras devuelve a ésta al estado

inactivo, interrumpiendo así la transmisión de señal hasta que haya un nuevo estímulo.

Existen otras proteínas relacionadas que forman la familia Ras e intervienen en varios

procesos celulares ( como Rab, Rho y Arf).

Una alteración frecuente en una proporción elevada de tumores (especialmente de

colon y páncreas ) es la mutación del gen ras, dando lugar a una proteína Ras incapaz

de hidrolizar GTP, y que permanece siempre en su forma activa Ras: GTP,

desencadenando una señal de proliferación continua.

5- Cada proteína efectora activada por Ras produce a continuación cambios de

conformación o fosforilaciones en sucesivas proteínas componentes de la “ 2ª cascada

de señales”, entre las que cabe citar Raf, MEK y MAP quinasas.

6- Finalmente, algunas de estas proteína quinasas de la 2ª cascada actúan sobre un

factor de transcripción, al que fosforilan. Como consecuencia, éste cambia su

conformación, lo que le permite unirse al DNA y activar o reprimir la transcripción de

genes específicos que codifican las proteínas que regulan el ciclo celular y la apoptosis.

22.2.2. La regulación del ciclo celular.

El gen supresor del retinoblastoma (Rb)

El descubrimiento de una predisposición hereditaria para sufrir retinoblastoma, un

tipo infrecuente de cáncer que afecta a los ojos, permitió identificar un gen (denominado Rb

) cuyo producto génico, la proteína del retinoblastoma ( Rb, pRb), se encuentra presente y

actúa en el control de todo tipo de células normales.

La proteína Rb experimenta cambios de fosforilación a lo largo del ciclo celular,

que modulan su actividad como freno en el punto de control G1/S. Esta actividad se debe

a la asociación de Rb no fosforilada con una gran cantidad de otras proteínas necesarias

para la proliferación celular, en especial factores de transcripción inducibles como Myc y

E2F.



314

Poseen una gran especificidad de reconocimiento de una secuencia corta de ADN

dúplex, e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra en secuencias concretas llamadas

sitios de reconocimiento o de restricción. Los fragmentos de ADN originados son útiles

para realizar la clonación, elaborar mapas físicos de restricción, detectar polimorfismos. . .

Hay 3 familias de enzimas de restricción:

Tipo I y Tipo III

- Tienen actividad endonucleasa (cortan) y metilasa, en distintas subunidades de una

misma proteína.

- Necesitan como coenzimas o cosustratos: ATP para moverse a través de la molécula de

DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte; Mg2+ y S-adenosilmetionina.

- Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento:

Las tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, a unos 1000 pb upstream

o downstream y corta las dos hebras en puntos cercanos entre sí y poco específicos.

Las tipo III cortan las dos hebras en puntos distales entre sí 2 ó 3 nt, situados a 24-

26 pb del sitio de reconocimiento.

- El punto de metilación está dentro de la secuencia de reconocimiento. En el tipo I en

ambas hebras y en el tipo II es una adenina presente sólo en una hebra.

- Estructura proteica: en el tipo I hay 3 subunidades, la S de reconocimiento, la R de

restricción y la M de mutilación. En el tipo II hay 2 subunidades: MS de reconocimiento y

mutilación y la R de restricción.

- El sitio de reconocimiento no es palindrómico. En el tipo I consta de 2 partes separadas (ej.

TGA(N)8TGCT).

Tipo II

- Sólo tienen actividad endonucleasa.

- Es una sola subunidad, aunque actúa como homodímero.

- Sólo requieren Mg++ como cofactor.

- El sitio de reconocimiento es palindrómico, de 4-8 pb. Los más frecuentes tienen 6 pb.

- Corta las 2 hebras en puntos equivalentes, muy específicos, dentro de la secuencia de

reconocimiento.

- El punto de metilación es una adenina o un citosina muy específica dentro de la

secuencia de reconocimiento, en ambas hebras.



315

25.2.2. Papel biológico del sistema metilación-restricción

Los sistemas de restricción-modificación o metilación-restricción son un

mecanismo de defensa bacteriano frente a fagos.

El ADN propio de la bacteria es metilado de una forma característica específica de

cada especie en secuencias reconocidas por la restrictasa y por la metilasa. La metilación

de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el ADN propio no es

hidrolizado. Si en la célula entra ADN de otro organismo, no metilado o con un patrón de

mutilación distinto, es degradado por la nucleasa.

Si está metilada una sola hebra de ADN, el sitio no es reconocido por la enzima de

restricción, pero sí por la metilasa, que añade el grupo metilo a la otra hebra. Esto ocurre al

final de la replicación. La metilación afecta principalmente a citosinas y adeninas de la

secuencia reconocida y las metilasas utilizan como donador del grupo metilo el compuesto

S-adenosilmetionina.

25.2.3. Enzimas de restricción de tipo II.

Son las empleadas en ingeniería genética como tijeras para cortar el ADN. El sitio de

restricción es sitio de reconocimiento y de hidrólisis. El enlace hidrolizado es siempre el 3´-P

(tipo a) y no necesitan ATP.

Algunas enzimas cortan ambas hebras justo en el centro de simetría del palíndromo

y resultan dos fragmentos de ADN dúplex cuyos extremos no contienen bases

desapareadas. Se denominan extremos romos. Ejemplo de estas endonucleas es Hae III.



342

Una vez calculadas las frecuencias alélicas, se comprobará mediante una prueba de

X2 con 1 grado de libertad, si el número de individuos esperado de acuerdo con H-W y el

número observado difieren o no significativamente.

Si no hay diferencias significativas será un indicio de que la población está en

equilibrio.

2º- Genes autosómicos con dominancia

Si no se distinguen los homocigotos dominantes (AA) de los heterocigotos (Aa), no

se pueden calcular directamente las frecuencias alélicas. Una forma indirecta de estimarlas

es suponer que la población está en equilibrio (el número de individuos observado y

esperado coinciden) y como la frecuencia de homocigotos recesivos (aa) es q2, la frecuencia

del alelo recesivo será

q = √ frecuencia de aa

3º - Genes ligados al X (o al Z) codominantes o con herencia intermedia

Hay que tener en cuenta la estructura genotípica de la población;

La frecuencia de los fenotipos de los machos da directamente la frecuencia de los

alelos. Si la población está en equilibrio, no se detectarán diferencias significativas en las

hembras entre el número observado y el esperado, teniendo en cuenta las frecuencias

alélicas de los machos.

Para una estima conjunta de las fecuencias alélicas hay que tener en cuenta que en

las hembras se encuentran las 2/3 partes de los alelos de un gen dado y el cálculo se hace

según la fórmula:

A2 = q = (2Q + H + S) / 3 Siendo Q = frecuencia de A2A2

H = frecuencia de A1A2

S = frecuencia de A2Y

Genotipo Nº esperado por H-W Nº observado

A1A1 p2 x total Número de individuos A1A1

A1A2 2pq x total Número de individuos A1A2

A2A2 q2 x total Número de individuos A2A2

Hembras Machos

A1A1, A1A2 A2A2 A1 o A2

p2 , 2pq , q2 p o q



343

27.2. MODIFICACIÓN DE LAS FRECUENCIAS GÉNICAS Y GENOTÍPICAS.

Las excepciones al modelo de H-W permiten averiguar las causas que modifican el

equilibrio en las poblaciones reales y que dan lugar a cambios en las frecuencias.

a. Un alelo presente en la población desaparece y se convierte en otro por mutación, con el

consiguiente cambio de las frecuencias alélicas. Puede establecerse el equilibrio:

u v

A1 (p) → A2 (q) A1 (p) ← A2 (q)

en donde u es la tasa de mutación directa de A1 a A2 , y v,la tasa de mutación retrógrada de

A2 a A1. El equilibrio se alcanzará cuando el número de alelos A1 que pasa a A2 (p x u) sea

igual al número de alelos A2 que pasa a A1 (q x v). Sustituyendo q = (1 – p) o p = (1 – q),

tenemos:

p = v / (u+v) y q = u / (u+v)

Debido a que las tasas de mutación, por gen y por generación, son muy bajas, los

cambios en las frecuencias alélicas por mutación son lentísimos.

b. La migración de los individuos de una población puede aumentar o disminuir la

frecuencia de los alelos de la misma. Tiene efectos similares a la mutación pero a gran

escala. Si emigran individuos desaparecen sus alelos en la población y si entran individuos

aparecen nuevos alelos. La tasa de cambio por gen y por generación depende del

porcentaje de migrantes y de la frecuencia de sus alelos.

c. La selección natural puede disminuir la frecuencia de ciertos alelos que confieren menos

eficacia a sus portadores, permitiendo que aumenten otros. En el modelo más simple, un

gen con dos alelos, si la selección (s) actúa en contra de un alelo recesivo (referido a la

eficacia biológica), disminuirá el número de los genotipos A2A2 en una fracción s.

d. Las poblaciones son de tamaño finito, lo que hace que por azar pueden pasar a la

siguiente generación más alelos de un tipo que de otro y sus frecuencias pueden variar

aleatoriamente, lo que recibe el nombre de deriva genética. En una población el efecto de

la deriva será mayor cuánto menor sea su tamaño y puede dar lugar a que un alelo

desaparezca y otro quede fijado. En un conjunto de muchas poblaciones, lo que variará

serán las frecuencias genotípicas, aumentando los homocigotos, sin que varíen las

frecuencias alélicas en el conjunto.

e. Los individuos no se aparean totalmente al azar sino que lo hacen siguiendo criterios de

semejanza, apareamiento selectivo, o de parentesco, apareamiento consanguíneo. El

apareamiento no aleatorio, selectivo o consanguíneo, al igual que la deriva, modifica las

frecuencias genotípicas, aumentando los homocigotos sin que varíen en conjunto las

frecuencias alélicas. Es una consecuencia del tamaño finito de las poblaciones.



345

BIBLIOGRAFÍA

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bir vol 4 biologia molecular 2014

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