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Biotempo 2008, Volumen 8,

UNIVERSIDAD RICARDO PALMAFacultad de Ciencias Biológicas

RECTORDr. Iván Rodríguez Chávez

VICE RECTORADO ACADÉMICOArq. Roberto Chang Chao

VICE RECTORADO ADMINISTRATIVODr. Ronald Figueroa Ávila

DECANODr. Hugo Gonzáles Figueroa

CONSEJO DE FACULTAD

Dr. Hugo Gonzáles FigueroaDra. Reina Zuñiga de AcletoQuím. Pilar Caso Caballero

Dr. Fred García AlayoLic. Pedro Huamán MaitaQuím. Víctor Diestra Lara

TERCIO ESTUDIANTILDavid Eduardo Puga DundonGilda Giuliana Ponce Palacios

Graciela Marbetty Porras López

SECRETARIA ACADÉMICADra. Lidia Cruz Neyra

BIOTEMPOVol 8, 2008

Editor: Dra. Lidia Cruz Neyra

Dirección Av. Benavides 5440Lima 33 - Perú

Apartado Postal 18-0131

Telefax: 2753624

La Revista científica BIOTEMPO esuna publicación anual de la Facultad deCiencias Biológicas de la UniversidadRicardo Palma.

El contenido de los trabajos publicadosen esta revista es de exclusivaresponsabilidad de los autores.


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Carátula: Fotografía de la Peninsula de Paracas, Ica - Perú, donde se realizainvestigaciones paleoflorística, presentada en el artículo A greenhousetime before the onset of an ice Age.

Biotempo, Volumen 8, 2008

Revista Biotempo de la Facultad de CienciasBiológicas – Universidad Ricardo PalmaLima – Perú

© Copyright 2008

ISSN 1992-2159Versión Impresa

Dirección:Universidad Ricardo PalmaAv. Benavides 5440. Lima 33, PerúTelf.: (511) 7080032Correo electrónico: [email protected]ágina web: www.urp.edu.pe

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REVISTA BIOTEMPO

Vol. 8 2008

UNIVERSIDAD RICARDO PALMAFacultad de Ciencias Biológicas

COMITE EDITORIAL

Dr. Lidia Cruz NeyraDirectora

Miembro del Instituto de Genética y Biotecnología de la Universidad Ricardo Palma,Doctora en Ciencias- Bioquímica Nutricional y Magíster en Bioquímica.

Dr. Hugo Gonzáles FigueroaDirector del Instituto de Genética y Biotecnología de la Universidad Ricardo Palma,

Doctor en Ciencias Biológicas, especialista en Biología Molecular de la Reproducción.

César Acleto OsorioProfesor Emérito de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos,

Doctor en Ciencias Biológicas, especialista en Botánica

Fred García AlayoDoctor en Química, especialista en Química Orgánica

Víctor Morales MondoñedoDoctor en Biodiversidad y Ecología Evolutiva, especialista en Ecosistemas,

Análisis y Manejo de la Biodiversidad.

Dr. José Iannacone OliverDoctor en Ciencias Biológicas, especialista en Entomología y Conservación.


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CONTENIDO

CICLO BIOLÓGICO Y COMPORTAMIENTO DE Udea Secticastalis HAMPSON(LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)Menandro S. Ortiz y Rubén M. Pulido

CAPACIDAD FECUNDANTE DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMARIOS DECavia porcellus "cuy" MANTENIDOS EN ESTRES HIPOTERMICOHugo Gonzales Figueroa y Hugo Mauricio Gonzales Molfino.

EFECTO DEL EXTRACTO DE BERENJENA EN CONEJOSHIPERCOLESTEROLÉMICOSLidia Cruz Neyra

TOXICIDAD DE NUEVE PLANTAS Y DE LA CIPERMETRINA EN GORGOJOS DEPRODUCTOS ALMACENADOS Y EN LA PULGA DEL AGUA Daphnia Magna ENEL PERÚIannacone José, Lorena Alvariño, Hildebrando Ayala y Neil Salazar

A GREENHOUSE TIME BEFORE THE ONSET OF AN ICE AGEH. W. Pfefferkorn y Vera Alleman

MORFOLOGIA DEL APARATO BUCAL EN Hypostomus aculeus y Hypostomuspyrinensi (PISCES, SILURIFORMES, LORICARIIDAE)Ruth Dueñas Peralta

CUIDADO PARENTAL A UNA ESCUELA DE RENACUAJOS EN Leptodactyluspetersii (STEINDACHNER, 1864) (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) EN LAAMAZONIA PERUANAVíctor R. Morales , Caroll Landauro y Reginald B. Cocroft

PROTRUSION DE LA ABERTURA BUCAL EN Atherinella serrimover (TELEOSTEI,ATHERINIDAE)Pamela Olaechea

BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS: BIOPRESERVANTE DE LOS ALIMENTOSTomás Agurto Sáenz y Juan Carlos Ramos Gorbeña

EFECTOS ECOTOXICOLOGICOS DEL PETROLEO CRUDO, DIESEL 2 Y KEROSENESOBRE EL CRECIMIENTO POBLACIONAL DE LA MICROALGA Chaetoceros gracilisSCHUTTGiovanna Vera, Jorge Tam, Edwin Pinto

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CICLO BIOLÓGICO Y COMPORTAMIENTO DE Udea secticastalis HAMPSON(LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)

Menandro S. Ortiz1

Rubén M. Pulido2

RESUMEN

El presente trabajo se llevó a cabo en el insectario del Departamento de Entomología de la Universidad NacionalAgraria, durante cinco meses continuados. Se obtuvieron tres generaciones sucesivas de Udea secticastalisHampson. Se observó las diferentes etapas de desarrollo, detallándose la duración de cada unos de ellos,comparándose con especies relacionadas de misma familia y observadas por diferentes autores. Además seincluye el comportamiento de la larva y del adulto.

Palabras claves: Udea, Pyralidae, Lepidoptera.

SUMMARY

The present paper has been deployed at the insectary of the Entomological Department of the UniversidadNacional Agraria La Molina during five continued months. Three successive generations of Udea secticastalisHampson has been observed. Different deployment stages were noticed, detailing the duration of each one ofthem and compared with species of the same family and observed by different authors. Also the larvae andadult behavior has been included.

Key words: Udea, Pyralidae, Lepidoptera.

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1 Facultad de Medicina Humana y Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma,Avenida Benavides 5440, Lima, Perú, E-mail: [email protected]

2 Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma.

INTRODUCCIÓN

En muchos lugares del mundo existe un déficitalimenticio que cada día se agudiza más, por lo cuallos gobiernos de la mayoría de países han orientadouna buena parte de sus esfuerzos y economía fiscalhacía la solución de éste problema que resultabastante complejo.

El Perú no escapa a éste problema, por lo que esnecesario fomentar y tecnificar la pequeñaagricultura, fundamentalmente hacía los cultivoshortícolas.

En las variadas especies hortícolas conocidas, el apio(Apium graveolens) es una de las que se encuentranentre las más importantes, tanto por el área sembradacomo por sus rendimientos

económicos (Semsch, 1961). En nuestro país, el apioes una de las hortalizas bastante cultivadas (Esculies,1966), tratando de mejorar la calidad en diversoscentros de investigación con la finalidad de obtenermejores rendimientos.

La planta de apio es nativa de las tierras pantanosasdel norte de África; luego su cultivo se extendió desdeSuiza hasta Egipto y al oriente de Asia, el Cáucaso ylas montañas de la India (Semsch, op. cit.). EnEstados Unidos de Norteamérica su consumo sepopularizó gracias a cultivadores holandeses-americanos que habitaban próximos a Michigan.

En la terapéutica antigua era muy usado como plantamedicinal, considerando al zumo con propiedadesantiescorbúticas, las hojas cocidas en leche contra laafonía y el asma, la infusión de semillas era


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estomática. Antiguamente esta planta no se comíani se usaba cruda, empleándose por mucho tiempopara sopas y guisos. Más tarde en Estados Unidosde Norteamérica e Inglaterra se consumió cruda.

La hoja y el peciolo del apio constituyen la porciónde la planta que tiene valor y calidad, determinandoconsecuentemente su valor comercial. Del mismomodo estas estructuras de la planta presentancaracteres físicos y químicos que determinan losnutrientes del que se disponen.

Para el cultivo del apio, el clima ideal es aquel quecontenga baja humedad atmosférica y bastanteluminosidad; como lo es la región de la sierra denuestro país (Esculies op. cit.). En algunas otraslocalidades diferentes también es posible su cultivo;pero se debe tener mucho cuidado por el ataque deplagas y enfermedades que puede tener.

Sobre éste último factor, excluyendo los factoresclimáticos y edáficos, se nos presenta la evidenciainobjetable de las estadísticas que nos indican lamagnitud de las mermas producidas por las plagas,enfermedades y malezas.

Respecto a las plagas se hallan los lepidópteros delas familias Noctuidae y Pyralidae, hemípteros delas familias Cicadellidae y Aphididae y ácaros de lafamilia Tetranychidae. El éxito del control de plagasdepende del conocimiento que se tenga de lasespecies de insectos dañinos, por lo cual el estudiode los aspectos básicos de biología, hábitos, capacidadde oviposición, porcentaje de fertilidad de los huevos,longevidad de los adultos, influencia de la temperaturay humedad sobre el desarrollo de Udea secticastalisHampson constituye un aporte a la solución racionalde éste problema con la finalidad de ir cubriendoeste vacío; y que son los objetivos del presentetrabajo.

ANTECEDENTES

En nuestro país no se han realizado trabajos sobreUdea secticastalis Hampson, ni tampoco existentrabajos relacionados con especies del mismo génerocomo son U. profundalis (Packard) y U. rubigalis(Guenée), las que también se hospedan sobre apio,registradas en otras regiones zoogeográficas.

Sólo se cuenta con el trabajo de Wille (1952) quiencita a Nomophilla noctuella (D. et S.) en la costacentral, estando más bien ésta especie distribuida en

Europa (Wolf, 1975) y que probablemente se refirióa U. secticastalis.

Sobre la biología de especies de éste género seencuentran pocos trabajos, destacando los deMetcalf y Flint (1965) y Tamaki y Butt (1977). Estosúltimos sólo refieren que el desarrollo larval presenta5 estadíos y es completado en 17,58 días en U.profundalis. Por otro lado Metcalf y Flint (op. cit.)presentan datos adicionales sobre U. rubigalis.Refieren que el período de incubación varía de 5 a12 días, señalando además que la pre-pupa tiene unaduración promedio de 2 días y que el estado de pupaoscila entre 10 a 12 días, según la temperaturaimperante. Agregan que la duración total del ciclode desarrollo es de aproximadamente 40 días,pudiendo haber 7 a 8 generaciones al año en losinvernaderos. Finalmente señalan que ésta especieparece estar afectada adversamente portemperaturas mayores a 30° C.

Sobre el comportamiento, Tamaki y Butt (op. cit.)refieren que las larvas de U. profundalis, cuandorecién emergen se alimentan principalmente de losbrotes, cubriendo además las hojas con hilos de seday excrementos hasta cuando llega aproximadamentea la mitad de su desarrollo. Estiman que la larvaindividualmente, durante el tiempo de su desarrollo,consume alrededor de 14,67 cm2 de hoja, siendo ésteconsumo cerca del 79 % durante el último estadíolarval.

Metcalf y Flint (op. cit.) reseñan que los insectoscuando se hallan listos para empupar, usualmenteforman un estuche protector, enrollando las hojas,luego interiormente tejen un capullo de seda (cocón)y finalmente se transforman al estado de pupa,emergiendo las polillas adultas entre los 10 a 12 días.Los adultos permanecen quietos en el cultivo la mayorparte del día, volando activamente durante la noche.

Finalmente Peterson (1951) señala que ésta especiees polífaga, teniendo como plantas hospedadoras alalgodonero, papa, rosa, fucsia, lechuga, crisantemo,dalia, geranio, entre otras; y evidentemente el apio.

Sobre la distribución geográfica, Munroe (1967)registró por primera vez en el Perú al género UdeaGuenée al describir a U. punoalis procedente delvalle de Chuchito, aproximadamente a 4000 m sobreel nivel del mar, en el Departamento de Puno. Otrosregistros acerca de éste género lo otorga el mismoMunroe (op. cit.) describiendo a U. decoripennis

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para Chile y U. soratalis, U. coranialis y U.annectans para Bolivia.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo fue conducido en el insectariodel Departamento de Entomología de la UniversidadNacional Agraria La Molina, durante 5 meses, épocaen se obtuvo 3 generaciones sucesivas.

El primer paso consistió en conseguir materialbiológico del campo, colectándose larvas y pupas deésta polilla. Estos estados de desarrollo junto conhojas de apio se trasladaron al insectario en dondese les dispuso en frascos de boca ancha, cubriéndolascon tela sujetada con una banda elástica, a fin deobtener adultos. Obtenidos éstos se trasladaron aotros frascos similares, alimentándolos con miel deabeja diluida en agua en una proporción de 1:3. En elinterior se dispuso frasquitos con agua sosteniendoramitas de apio para la postura de huevos.

Producida la eclosión de los huevos, se tomaron 40larvas recién emergidas, individualizadas en vasitosde plástico, previamente numerados. La observaciónfue diaria para cada una de las 40 larvas a fin deobtener la duración de cada uno de los diferentesestadíos. Este se determinó midiendo el diámetrotransversal de la cápsula cefálica, buscándose lasexuvias para confirmar la muda producida. Formadala pupa se conservó en condiciones similares hastala emergencia del adulto.

La determinación de la capacidad de oviposición ylongevidad de los adultos se efectuaron con parejasaisladas. Se consideró 10 parejas como mínimo. Seusaron adultos recién emergidos en condicionessimilares a lo anteriormente descrito, efectuándoselas observaciones de modo diario.

Respecto al estudio del comportamiento se realizaronsobre los estados larval y adulto. Fue necesario usarjaulas de malla y naturalmente tomando notas sobrelo que acontece al interior de ella.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados sobre la duración del ciclo dedesarrollo comprende el período de incubación, dedesarrollo larval y período pupal, para las tresgeneraciones sucesivas criadas en condiciones deinsectario.

Período de incubaciónLos huevos eclosionaron 10 días después de laoviposición para la primera generación, 7 días parala segunda y 5 días para la tercera generación. Losdatos obtenidos concuerdan ampliamente con loobservado por Metacalf y Flint (1965) quienesencontraron que los huevos incuban entre 5 a 12 díasen Udea rubigalis (Guenée), plaga de importanciaen cultivo de apio. Igualmente se observa la influenciade la temperatura en la sucesión de generaciones,según los estimados de Jacob y Cox (1977), pues elregistro de temperatura promedio para la incubaciónde los huevos de la primera generación fue de 15,6°C en el mes de septiembre, para la segundageneración fue de 16.8° C en octubre y para la tercerageneración fue de 19.6° C en el mes de diciembre.

Desarrollo LarvalSe observa con claridad las diferencias existentesen las tres generaciones. Para la primera generaciónla duración promedio observada fue de 19,78 días enel mes de octubre cuando la temperatura en uninsectario (en ésta oportunidad cerrado) fue de 18,4°C. Luego para la segunda generación en el mes denoviembre (a partir de la cual el insectario fue abierto)fue de 23,7 días con una temperatura promedio de17,7° C. Finalmente la tercera generación necesitó19,58 días promedio, en el mes de enero con unatemperatura de 21,1° C.

Igualmente, para ésta fase la influencia de latemperatura se hace presente, dándonos a saber quela duración del estado larval se hace más corto en laestación de verano, donde la temperatura es mayor.Los resultados obtenidos por Jacob y Cox (1977)quienes condujeron la biología del pirálido Ephestiakuehniella Zeller conforman estas variantes. Entodos los casos el desarrollo del estado larval requirióde 5 estadíos larvales.

Particularmente, en el quinto y último estadío larval,se observa un requerimiento mayor de días en lastres generaciones. Cabe destacar que en promediolos últimos 1,93 días, para las tres generaciones,corresponden a una etapa inactiva del quinto estadíolarval, llamada pre-pupa. Tamaki y Butt (1977) en sutrabajo con U. profundalis (Packard) encontraronque las larvas presentan 5 estadíos antes de empuparen condiciones de medio ambiente.

Con respecto a la pre-pupa, se considera dentro deldesarrollo larval por producirse sin muda adicional; y

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su duración es el promedio registrado por Murat(1961) e Hinostroza (1975) para el pirálido Hellulaundalis Fabricius.

La disminución relativa de la duración total deldesarrollo larval bajo la influencia de la temperaturaprogresivamente ascendente y considerando elperíodo pre-pupal en cada generación sucesiva, esreflejo de la duración del estado larvalcorrespondiente, ya que la duración del período depre – pupa para las tres generaciones no varíamayormente; siendo la duración larval totalcorrespondiente a la primera generación de 21,45 días,para la segunda generación de 25,72 días y de 21,60días para la tercera generación. Esta duración encondiciones de insectario, está en relación con elresultado obtenido por Prabha et al. (1978), quienesencontraron una duración variable de 19,95 a 29,3días, al efectuar estudios biológicos con Phycitainfusilla Meyrick, especie que también pertenece ala familia Pyralidae.

Por otro lado, al evaluar los datos obtenidos, seconstata que la duración promedio del desarrollo larvalde la segunda generación es mayor debido a que latemperatura descendió, en comparación a la primeray segunda generación, donde sí hubo una mayortemperatura.

Período de PupaEl período de pupa es semejante al de la incubación;se reduce a medida que se suceden las generaciones.Sin embargo, se puede notar un ligero aumento en laduración de la segunda generación (10,8 días) conrespecto a la primera generación (9,17 días) y luegoclaramente una disminución en la duración de latercera generación. Es preciso, para ello, anotar lainfluencia de la temperatura en éste período, tal comose notó en el desarrollo de los estados anteriores.Esta duración, con los rangos observados, sonsignificativamente semejantes a los observados porMetcalf y Flint (1965) en U. rubigalis (Guenée).

Ciclo Total de DesarrolloUdea secticastalis Hampson presenta para lascondiciones de insectario, un ciclo total de desarrolloque implica una menor duración según se sucedenlas generaciones. Así tenemos 35,33 días para latercera generación cuanto la temperatura fluctuabacon un promedio de 21° C, con respecto a la primerageneración (40,62 días) cuando la temperatura fuede 18,4° C.

Igualmente, el período mínimo y máximo paracompletar el desarrollo total, disminuye en las nuevas

generaciones, así se observa que para la primerageneración el rango es de 38 a 47 días, disminuyendoen la tercera generación de 32 a 41 días.

Los experimentos demostraron por otro lado, aunqueen forma no muy marcada, que las hembrascompletan primero el desarrollo de su ciclo total quelos machos. Así mismo se menciona nuevamente quela segunda generación tiene una duración mayor(43,52 días) que la primera generación (40,62 días)dado que desarrolló bajo una menor temperaturapromedio.

Los organismos sujetos normalmente a temperaturasvariables en la naturaleza dentro de un rangopermisible, propenden a adaptarse a éstos cambios;y por ello podría explicarse la duración del ciclo enlas siguientes generaciones criadas en insectario apartir de la primera generación, cuando se elevó latemperatura.

Metcalf y Flint (1965) encontraron en U. rubigalis(Guenée) que la duración del ciclo de vida es dealrededor de 40 días. Datos relacionados encontraronBouhelier y Hudalt (1935) y Wille (1952) para elpirálido Hellula undalis Fabricius, señalandoduraciones menores en los meses de verano y otoñoy períodos mayores para completar el ciclo dedesarrollo durante los meses más fríos.

Así mismo Wille (op. cit.) amplía sus obervacionespara la especie tratada, indicando que el número degeneraciones son 4, durante el verano y otoño; y queprobablemente éstas sean 8 al año. Igualmente,Metcalf y Flint (op. cit.) señalan que en U. rubigalis(Guenée) pueden existir 7 ú 8 generaciones en losinvernaderos. Finalmente señalan que ésta especiees adversamente afectada por temperaturas mayoresa 28° C. Hecho similar ha sido posible observar en elpresente trabajo en donde generaciones posterioresno se obtuvo una población semejante como al iniciode éste ciclo biológico.

Período de Pre-OviposiciónSe considera a este período al comprendido entre laemergencia del adulto y el inicio de la oviposición.Este período tuvo una duración que varía en las tresgeneraciones sucesivas, sin embargo la duraciónmínima observada fue de 2 días para las tresgeneraciones. La mayor variabilidad se presenta enlas generaciones anteriores (8 días máximo en laprimera generación) a la tercera generación (4 díasmáximo); por lo tanto debido a la acción de losfactores físicos medio ambientales, principalmentela temperatura, la duración promedio es menor

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conforme suceden las generaciones entendiéndoseque debe haber un límite, pudiendo observarse unamenor variabilidad en la tercera generación (3,5 díascon respecto a la primera generación (4,1 días).

Período de OviposiciónLas hembras depositan los huevos en un período, endonde se notó una tendencia a la disminución en elnúmero de ellos, según se suceden las generaciones.Se apreció que para la primera generación elpromedio de oviposición es de 6,20 días, para lasegunda generación es de 4,83 días y 3,66 para latercera generación.

La oviposición se completa en un período mínimo de1 a 3 días, mientras que el máximo varía de 6 (segunday tercera generación) a 8 días (primera generación).Este período se completa en la mayor parte de lashembras varios días antes de su muerte.

Período de Post-OviposiciónSe considera al período comprendido entre el términode la oviposición y la muerte del adulto. Durante ésteperíodo las hembras presentaron una duración nosimilar a los períodos precedentes (pre-oviposición yoviposición). Sino más bien de modo irregular. Así laduración de éste período para la segunda generaciónfue de 3,0 días y 4,16 días para la tercera generación,menores con respecto a la primera generación queposee un tramo de 6,20 días, debido probablementea que es una generación cuyos padres proceden delcampo. En cambio las dos últimas generacionesproceden de una crianza llevada a cabo en insectario,por lo que sus valores son más próximos.

Longevidad en Relación al SexoConsiderando sólo adultos apareados, la longevidadpor sexo en promedio varió notablemente en cadageneración, manteniéndose las hembras vivas pormayor tiempo. La longevidad máxima para machos(9,8 días) y hembras (15,5 días) se observó en laprimera generación; mientras que la longevidadmínima para machos (8 días) y de hembras (10,4días) se observaron en la última generación obtenidaen el presente trabajo.

Longevidad de Adultos no ApareadosConsiderando adultos machos no apareados, lalongevidad promedio por generación no fue muyvariable, manteniéndose más bien casi estable; perosí resultaron más longevos que los adultos apareados.

Los adultos hembras no apareadas presentaron unalongevidad promedio casi constante por generación,

es decir, presentaron un rango estrecho devariabilidad. Esta longevidad con respecto a la de losadultos hembras apareadas, resultó ser similar.

Comparando longevidad entre machos y hembras noapareados resultaron con mayor longevidad éstasúltimas, de modo similar que el caso de adultosapareados.. El promedio obtenido para machos noapareados fue de 10,2 días y para hembras noapareadas fue de 12,5 días.

Capacidad y Ritmo de OviposiciónLa capacidad de oviposición de cada hembra es muyvariable. Se encontró que las hembras ovipositaronde 3 hasta 414 huevos, con un promedio de 167,5huevos, teniendo en cuenta a las tres generacionesobservadas.

El número máximo de huevos se observó en laprimera generación; éste resultó ser muy superior alpromedio. Girlind (1978) encontró un potencial deoviposición entre 400 a 600 huevos por hembra enun trabajo realizado con Eldana saccharina(Walker). Prabha et al.(1978) encontraron quePhycita infusilla Meyrick pone casi 100 huevos porhembra.

Como se deducirá, en los Pyralidae, que agrupa a lasespecies antes citadas, al igual que las de Udea,parece ser que el número de huevos por hembra esvariable; presentando nuestra especie en estudio unaoviposición que se le puede considerar relativamentealta.

La cantidad de huevos ovipositados por las hembras,disminuye en promedio conforme suceden lasgeneraciones; así ésta reducción se observó en latercera generación (114,83 huevos) con respecto ala segunda generación (221 huevos).

El ritmo de oviposición diario en las diferentesgeneraciones en general, presentó una tendenciasimilar en todas ellas, depositando el mayor númerode huevos los primeros días hasta el cuarto o quintodía; y luego ésta cantidad disminuye progresivamentehasta ser nulo entre el séptimo y noveno días. Elmáximo número de huevos se observó al tercer día.

El mayor número de huevos por día se dio en laprimera generación, disminuyendo luego dichascantidades en las sucesivas generaciones. En latercera generación, si bien hubo poca oviposición,ésta luego se levantó proporcionalmente, pero enmenor número que en generaciones anteriores.

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Relación de la Longevidad de la Hembra y elNúmero de HuevosObservando el promedio de huevos puestos porhembra y su longevidad también promedio, de cadageneración, se aprecia que existe una relacióndirectamente proporcional entre éstas dos variables,es decir que a mayor longevidad la capacidad deoviposición es también mayor. Este hecho se deducedestacando el máximo promedio de huevos puestos(221 huevos) por la máxima longevidad promedio dehembra (15,5 días) que se dio en la primerageneración; mientras que el promedio mínimo dehuevos puestos (114,83 huevos) por una longevidadpromedio mínima de hembras se dio en la tercerageneración.

Fertilidad de HembrasDe las tres generaciones estudiadas, en la segundase observó un 25% de infertilidad, correspondiendoun 100% de fertilidad potencial a las otrasgeneraciones. Sin embargo no todas las hembras queovipositaron dieron lugar a huevos viables,observándose en cada generación una marcadatendencia a disminuir la viabilidad de huevos.

Así, de la primera a la tercera generación, elporcentaje de hembras que pusieron huevos no viablesfue de 20, 50 y 83,3%, respectivamente; es decirque las hembras que ovipositaron y cuyos huevosfueron viables decreció hasta 16,7% en la tercerageneración. Este hecho pueda deberseprobablemente a una serie de factores como porejemplo que las hembras no copularon o no fueronreceptivas o copularon con machos estériles o puedehaber existido una cópula imperfecta. Por otro lado,debe tenerse en cuenta que la baja de fertilidad delas hembras por generación, pudo verse afectadaadversamente por la temperatura cada vez mayor,tal como los señala Metcalf y Flint (1965). Así mismodebe tenerse en cuenta la influencia que ejerce laluz; ya que ésta especie parece ser un insecto dedías cortos.

Proporción de sexosSe aprecia que la producción de hembras enindividuos criados en insectario fue ligeramente mayoral de los machos, aunque esto no sucedió en lasegunda generación, pues aquí la proporción de sexosfue de 1:1. Por lo tanto se estima que en el campoésta proporción estaría equilibrada lo cual asegura lasucesión de generaciones con poblacionesapreciables. Estos resultados obtenidos están acordescon los que presentaron El-Kilf et al. (1974) conPalpita unionalis Hübner, también polilla de lafamilia Pyralidae.

ComportamientoAl eclosionar los huevos, las larvitas emergendirigiéndose a los brotes, donde inician el daño a lashojas, según el lugar de oviposición. Cuando atacana los brotes, las hojitas son reunidas mediante hilosde seda para construir un lugar protegido. En talsituación consumen totalmente a los brotes atacados.Cuando se dirigen a las hojas se posesionan en elenvés del limbo, plegando los bordes de ésta o conlas hojas vecinas mediante los hilos de seda yacitados, alimentándose dentro de éstos túneles. A lahoja la consumen hasta llegar a la nervadura central.

Una larva puede destruir más de una planta pequeñae igualmente, ésta puede albergar más de una larvaen sus primeros estadíos de desarrollo. En plantasmás desarrolladas, las larvas de los dos primerosestadíos y aún del tercero, raspan las hojas. En elcuarto estadío larval ya se hace notorio que la larvacome la hoja, practicándole perforaciones.

En todos los casos el lugar donde las larvas seposesionan, se va a encontrar abundanteexcrementos de las mismas, de apariencia granulary húmeda, ensuciando las hojas. Estos coprolitos lesdan una característica típica al daño ocasionado,además de los hilos de seda plegando a las hojas obrotes, según lo citado anteriormente.

La larva de quinto estadío sigue siendo muy voraz,con abundante coprolitos; plega más a las hojas yempieza a formar un capullo de hilos de seda en elque permanecen hasta dar lugar a la pupa.

Los adultos emergen rompiendo la cubierta pupal porla parte antero-dorsal. Una vez fuera el nuevo adultomueve las antenas y camina inmediatamente por uncorto trecho después del cual permanece quieto. Enéste momento el color no es muy nítido, pero se puedediferenciar los colores y ornamentación que presentael ala del adulto maduro, aunque éstas aún no hansido extendidas.

Luego de casi una hora se observa que el adulto estáapto para volar, después que las alas se han extendido,dejando al descubierto el dorso del abdomen.También se observó la expulsión de un líquido marrónrojizo por el ano, quedando finalmente el nuevo adultocompletamente hábil.

Al iniciar el vuelo, es característica la formazigzageante pudiendo observarse también un vueloalto y sostenido; durante el día permanecenescondidos entre las hojas, especialmente en el envés.Estos adultos son de hábitos nocturnos tal como lo

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señalan Bohulier y Hudault (1935) y Metcalf y Flint(1965).

La cópula se realiza en la noche, estimándose sea enla noche del primer día. Durante éste acto el machoy la hembra permanecen unidos en sentido opuestopor un determinado tiempo (cuando se intentódeterminar el tiempo, estas polillas interrumpían lacópula, por la aproximación de una luz muy tenue).

Las hembras ovipositan durante la noche, las posturasse realizan generalmente en el envés de las hojas,aunque eventualmente pueden hacerlo en el haz yen toda la hoja. Esto fue observado por Wille (1952),quien mencionó además que el peciolo servía tambiéncomo lugar de oviposición. Los huevos son puestosen grupos superpuestos, constituyendo masas y aveces de manera individual. Esta forma de oviposiciónconcuerda con lo citado por Metcalf y Flint (1965) yWille (1952).

CONCLUSIONES

• El período de incubación disminuye conformese sucede las generaciones, correspondiendopara cada una de éstas: 10, 7 y 5 díasrespectivamente.

• Presenta 5 estadíos larvales, cuya duración decada una de ellas es variable en las diferntesgeneraciones obtenidas, siendo el último estadíolarval el que requirió mayor tiempo para sudesarrollo.

• El tiempo requerido para el completo desarrollolarval en las tres generaciones, son: 21,45;25,72 y 21,60 días, respectivamente.

• La larva tiene por hábito el pegar las hojas,ubicándose dentro de ésta cubierta protectora,donde se alimenta y posteriormente empupa,protegiéndose éste con hilos de seda, formandoun capullo (cocón).

• Las hembras apareadas tienen una longevidadpromedio para las tres generaciones de 12,21días, similar al de las hembras no apareadas.En ambos casos resultan ser más longevas quelos machos.

• Los machos apareados muestran una menorlongevidad que los machos no apareados.

• El potencial de reproducción en condicionesde invernadero disminuye en 65,5 % en latercera generación.

• La máxima oviposición se produce al tercerdía de iniciado este período.

• La proporción de sexos es 1:1.

LITERATURA CITADA

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CAPACIDAD FECUNDANTE DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMARIOS DECavia porcellus "cuy" MANTENIDOS EN ESTRES HIPOTERMICO

Hugo Gonzales Figueroa1

Hugo Mauricio Gonzales Molfino1

RESUMEN

Durante el estrés hipotérmico los espermatozoides de cuy conservan sus patrones de capacitación espermática,hiperactivación, reacción del acrosoma y fecundación in vitro El piruvato, componente del medio de cultivo SanMarcos (SM), sería la fuente energética preferencial para mantener la supervivencia espermática en estréshipotérmico prolongado, a lo mejor, regulando el metabolismo oxidativo en el espermatozoide. De la mismamanera se constituiría en el sustrato ideal de la piruvato deshidrogenasa para iniciar la capacitación e hiperactivacióncuando los espermatozoides son incubados a 37°C. El imidazol provoca reacción acrosómica espontánea en losespermatozoides hiperactivos y permite que estos puedan interaccionar con ovocitos maduros, fecundarlos einiciar el desarrollo embrionario temprano hasta blastocisto. La madurez ovocitaria se consiguió cultivandoComplejos Ovocito-Cumulo (COCs) en el medio North Carolina State University 23 (NCSU-23), usado porprimera vez para cuy.

En este trabajo se demuestra que la hipotermia prolongada a 5°C en un medio químicamente definido, SM, noafecta los procesos espermáticos fundamentales para la adquisición de la capacidad fértil del espermatozoide decuy.

Palabras claves: Estrés hipotérmico, hiperactivación, reacción del acrosoma. blastocisto

SUMMARY

During hypothermic stress, guinea pig sperm retain their of sperm capacitation, hiperactivation, acrosomereaction and in vitro fertilization patterns. The pyruvate, a component of San Marcos (SM) culture medium,would be the preferred energy source to keep the sperm survival prolonged stress hypothermic, perhaps byregulating the oxidative metabolism in the spermatozoon. In the same way would constitute the ideal substratefor the pyruvate dehydrogenase regulates to sperm capacitation and hiperactivation when sperm are incubatedat 37 ° C. The imidazole causes spontaneous acrosome reaction in the hyperactived sperm and allows them tointeract with mature oocytes, fertilized and begin start early embryonic development to blastocyst.Mature oocyte was achieved by cultivating Cumulus-Oocyte complexes (COCs) in the North Carolina StateUniversity 23 (NCSU-23), used for the first time in guinea pig.In this work demonstrates that the prolonged hypothermia at 5 ° C in a chemically defined, medium SM, does notaffect sperm fundamental processes for the acquisition of the capacity of fertile sperm of guinea pig.

Key words: Hypothermic stress, hiperactivation, acrosome reaction, blastocyst.

1 Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Animal, Instituto de Genética y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas.Universidad Ricardo Palma.

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INTRODUCCIÓN

El espermatozoide de mamífero para fusionarse conel ovocito necesita de cambios morfológicos yfisiológicos conocidos como capacitación,hiperactivación y reacción del acrosoma.La capacitación in vivo, tiene lugar en el tracto genitalde la hembra y se acepta que es la fase o las fasesque promueve alteraciones en los patrones demotilidad «hiperactivación» (Yanagimachi, 1988;Frasser, 1977) y precede a la reacción del acrosoma(Bedford, 1970). Está comprobado que no todas lascélulas de una población espermática inician lareacción del acrosoma después de una inducción, estasólo ocurre en los espermatozoides hiperactivos(Yanagimachi, 1994).La capacitación espermática, la hiperactivación y lareacción del acrosoma pueden lograrse in vitroutilizando medios de cultivo adecuados, químicamentedefinidos o semidefinidos. Un sistema de cultivo puededenominarse «medio químicamente definido» cuandoen su composición sólo se encuentra sustanciasquímicamente puras sin fluidos biológicos y ademáscontener algún producto biológico purificado comoalbúmina sérica de bovino (Biggers et al. 1971). Sinembargo algunas veces es necesario agregar fluidosbiológicos para estudiar la sensibilidad y losrequerimientos necesarios para los complejosmecanismos que ocurren desde la fecundación hastael desarrollo embrionario temprano en mamíferos,denominándose, entonces, sistemas de cultivo semi-definidos (Van Thuan et al.. 2002).La capacitación y reacción del acrosoma puedenlograrse en medios químicamente definidos (Jaiswalet al., 1998). Al respecto, se han encontradoespermatozoides de cuy hiperactivos en el medio SanMarcos (SM) que contiene 22,3 mM de piruvato desodio (Gonzales-Figueroa, 1988).Las hembras de los mamíferos tienen ovariosbifuncionales que cumplen una función exocrinacuando liberan ovocitos y una endocrina cuandoproducen: estrógenos, progesterona, inhibina yactivina. El crecimiento folicular tiene un controlintraovárico y otro gonadotrófico, regulados porseñales paracrinas y endocrinas (Manikkan et al..2002). Los ovocitos y las células foliculares formanuna unidad estructural y funcional denominadacomplejo cúmulo-ovocito (COC).El estrés hipotérmico, consiste en colocar caudas deepidídimos de cuy sumergidas en el medio SM atemperaturas entre 4-6°C por varios días (Gonzales-Figueroa, 1988).Se ha reportando que el uso de sistemas de cultivodefinidos in vitro, permiten un mejor esclarecimiento

de los mecanismos moleculares que promueven oinhiben el desarrollo embrionario. Sustancias comoaminoácidos, sustratos energéticos, citrato y vitaminaspueden tener una influencia decisiva en el desarrolloembrionario (Keskintepe & Brackett, 1996).En el presente trabajo se relaciona la permanenciaprolongada de espermatozoides epididimarios de cuyen estrés hipotérmico con la capacitación espermática,reacción del acrosoma y fecundación in vitro en elmedio San Marcos (SM).


Colecta del material biológicoLas caudas de epidídimo y los ovarios de cuy fueronobtenidos de animales sacrificados para el consumohumano en el mercado mayorista de Lima.Supervivencia espermática en cauda deepidídimos mantenidas en estrés hipotérmicoLas caudas de epidídimo seleccionadas fueroncolocadas en tubos de polipropileno que contenían 30ml de medio SM, cubriéndose la superficie del tubocon una capa de aceite mineral. Cada tubo contenía4 caudas, que se mantuvieron entre 4 a 6°C, siendoel medio renovado cada 48 horas.Para verificar la supervivencia de los espermatozoidesse extraía en tiempos diferentes de estrés hipotérmicouna cauda. Con una tijera de punta fina se disectabala parte distal de la cauda que era colocada en 200 ulde medio SM en un disco de cultivo Falcon. Con laayuda de pinzas de punta fina era trozada para facilitarla salida de los espermatozoides, formándose una«suspensión patrón». El movimiento masal de losespermatozoides en la «suspensión patrón» observadoa través de un microscopio estereoscópico, nosindicaba la supervivencia espermática.

Capacitación espermáticaA partir de la «suspensión patrón» se hacía unadilución cuya concentración final tenía 105

espermatozoides/µl. Se prepararon microgotas de 100µl de medio SM cubiertas de aceite mineral. Estaseran temperadas a 37º C entre 15 a 20 minutos antesde agregarle 10 µl de la dilución espermática, paraluego ser incubadas a 37º C entre1 a 2 horas. Altérmino del periodo de incubación se contaba, a travésde un microscopio compuesto de campo claro, 100espermatozoides libres, determinándose el número deespermatozoides hiperactivos que tenían movimientosrápidos y el batimiento del flagelo asincrónico.

Evaluación de la reacción del acrosomaAl término de 60 minutos de incubación, se agregó ala microgota, que contenía espermatozoideshiperactivos, 10 µl de una solución de imidazol (5mM),

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para incubarse nuevamente. Entre los 15 y 30 minutosde incubación, se evalúo el número deespermatozoides reaccionados. Sólo en losespermatozoides recién obtenidos (control) lareacción del acrosoma se logró después de 2 horasde capacitación.

Recuperación y selección de ovocitosSe utilizaron ovarios de hembras de cuy de los cualesse recuperaron los complejos cúmulo-ovocito(COCs) mediante el método de cortes transversales.Utilizando una jeringa hipodérmica de 10 ml y unaaguja de 21G se aspiró los folículos que tenían entre4 - 6 mm de diámetro, los que fueron colocados enun tubo de polipropileno (50 ml) mantenido a unatemperatura de 37º C en baño María. Luego de 10minutos de reposo, se extrajo el sedimento del fondodel tubo llevándolo a una placa Petri, a la que se leagregó 25 mM Hepes-buffer TCM-199 (SigmaChemical Co., St. Louis, MO, USA) . Para la selecciónde los COCs se tomaron en cuenta indicadoresmorfológicos del cúmulo: número de capas,compactación y transparencia, y del citoplasma delovocito, el color (densidad) y el tamaño de losgránulos.

Maduración in vitro de los COCsComo medio de maduración se utilizó el (NCSU-23;North Carolina State University 23) (Petters y Wells,1993) suplementado con 0.57 mM de cisteína, 10%fluido folicular porcino, 10 IU/ml de gonadotropinacorionica equina, 10 IU/ml de gonadotropina coriónicahumana y 50 µg/ml sulfato de gentamicina (Sigma)las que fueron colocadas en placas cubiertas conaceite mineral e incubadas por 12 - 14 horas a 39ºCcon 5% CO2, 90% humedad. Transcurrido estetiempo, los ovocitos se colocaron en el mismo mediolibre de hormonas por un periodo adicional de 10-12horas.Al término del cultivo de maduración, las células delcúmulo fueron separadas empleando un vortex por 4minutos en una solución buffer fosfato PBS(Dulbecco´s) sin Ca2+ y Mg2+ con hialuronidasa(0,1%)colocándolos después en el medio TCM-199 conbuffer Hepes (25mM). En este medio fueronseleccionados aquellos ovocitos maduros, quepresentaron el primer corpúsculo polar

Fecundación in vitro.Al medio que contenía los ovocitos maduros, se lesagregó 10 ul del cultivo de espermatozoides conreacción del acrosoma. Se incubaron entre 24 y 120horas a 39ºC con 5% CO2 y 90% de humedad

Pruebas estadísticasSe emplearon las pruebas estadísticas de análisis devarianza (ANOVA) para comparar si los patronesde capacitación espermática y reacción del acrosomason significativamente distintos en los diferentesmomentos del estrés hipotérmico y la prueba de Tukeypor medio de la cual se realizó una comparación delos grupos por pares, para establecer cual grupo marcala diferencia.

RESULTADOS

Hiperactivación y reacción del acrosomaLos espermatozoides que permanecieron en estréshipotérmico entre 24 a 264 horas, adquirían el estadocapacitado y perdían su acrosoma cuando fueronincubados a 37º C. En el cuadro N° 1 se puedeobservar que no existe diferencia significativa, encuanto a hiperactivación entre los espermatozoidesque permanecieron hasta 120 horas en estréshipotérmico, sin embargo esta diferencia se apreciaen los que estuvieron por 264 horas en hipotermia.Con respecto al tiempo de inicio de la hiperactivación,los espermatozoides recién extraídos de la caudademoran 2 horas mientras los que permanecieron enestrés hipotérmico, lo logran a los 6º minutos del iniciode la incubación a 37º C.En el cuadro N°2, se presentan los porcentajes dereacción del acrosoma a través del tiempo depermanencia en hipotermia. La reacción del acrosomase evalúo 30 minutos después de agregar imidazol5mM a las microgotas de espermatozoideshiperactivos. Como se puede apreciar, el la reaccióndel acrosoma es muy similar a las 24 hrs. (67,20 %),72 hrs (66.88%) y 120 hrs.(66,80%) en estréshipotérmico, sin embargo existe una disminución dereacción del acrosoma (47.90 %) en los que estuvieronpor 264 horas a baja temperatura.

Maduración de ovocitosLos tipos de COCs seleccionados de ovarios dehembra fueron madurados por 13 horas en el NCSU23 con hormonas y después 12 horas en el medio sinhormonas. Se utilizaron 283 COCs y se observó laexpansión del cúmulo sólo en 158 (55.8%). Laexpansión del cúmulo es el indicador morfológico demaduración.

Fecundación in vitroEspermatozoides sin acrosoma se agregaron a losovocitos con cúmulo expandido y después de 24 horasse verificaba la presencia de embrión de 2-células ya las 120 horas si se había formado blastocistos .

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Se fecundaron ovocitos con espermatozoides que nohabían permanecido en hipotermia y conespermatozoides de 72 y 120 horas de hipotermia.En cada caso se utilizaron 50 ovocitos. En la tablaN°1 se muestran los resultados preliminares obtenidosdonde se puede apreciar que el estrés hipotérmicono es un factor limitante de la fecundación ni deldesarrollo embrionario temprano en cuy.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se demuestra que losespermatozoides epididimarios de cuy en estréshipotérmico adquieren capacidad fértil hasta 264 horasinclusive en el medio SM, en relación a los medios decultivo que contienen entre 0.25 a 0.33 mM depiruvato en los cuales el tiempo máximo de viabilidadalcanza sólo a 120 horas (Gonzales Figueroa, 1988).Esto sugiere que el piruvato, en una concentraciónelevada (22,3 mM), sería la fuente energéticapreferida para mantener la supervivencia espermáticaen estrés hipotérmico. Conjuntamente con lassustancias que se encuentran en el fluido de la caudadel epidídimo que inhiben capacitación y reacción delacrosoma cuando los espermatozoides se encuentranalmacenados en la cauda (Bavister et al., 1978).Los espermatozoides cuando abandonan el testículo,lo hacen morfológicamente completos, pero nofuncionalmente (Austin, 1952). La funcionalidad totalse adquiere en el tránsito por el epidídimo y por eltracto reproductor de la hembra o mediante lacapacitación espermática in vitro. Durante lacapacitación ocurren cambios en los patrones debatimiento del flagelo espermático, fenómenoconocido como hiperactivación (Yanagimachi, 1969).El aumento de la motilidad de los espermatozoideshiperactivos presumiblemente les ayuda a superar labarrera de la mucosa del tracto reproductivo femeninoy es crucial para lograr la fecundación de losgametos. Durante la capacitación los espermatozoidesexperimentan una pérdida de colesterol de lamembrana, probablemente desde un microdominio demembrana (glicoesfingolípido, colesterol y proteína),que asociada al ingreso de bicarbonato de sodio desdeel medio (aparato reproductor femenino o suequivalente in vitro) generan la activación de unmecanismo original de transducción de señales Estavía conduce a fosforilación de residuos de tirosina enproteínas específicas ricas en este aminoácido(Boarelli et al, 2007). Es interesante tener en cuentaque a partir de las 24 horas de estrés hipotérmico, lacapacitación espermática se logra 60 minutos despuésdel inicio de la incubación a 37°C, en relación a las 2horas que demora este proceso en los

espermatozoides recién obtenidos del epidídimo. Estopodría deberse a la formación de microdominioslipídicos, provocado por el estrés hipotérmico, peroque no compromete la integridad funcional de losespermatozoides. Los valores de hiperactivación entre24 a 120 horas en estrés hipotérmico son similarescon respecto a los espermatozoides de 264 horasdonde se evidencia una baja porcentual significativade hiperactivación.Existen proteínas fosforiladas en tirosina como lapiruvato deshidrogenasa A2 (PDHA2) que esrequerida para la hiperactivación y la reacción delacrosoma en espermatozoides de hamster (Kunar etal., 2008) y otra, la dihidrolipoil deshidrogenasa (DLD)que se mantiene fosforilada en tirosina durante lacapacitación de espermatozoides de mamíferos(Mitra &. Shivaji, 2004). La presencia de estasenzimas, servirían para regular la oxidación delpiruvato, y de esta forma provocar la hiperactivaciónen el medio SM (22.3 mM de piruvato). A juzgar pornuestros resultados estas enzimas no se deteriorandurante la permanencia de los espermatozoides decuy en estrés hipotérmico, puesto que losespermatozoides de 24 horas y los de 264 horasmantienen los patrones de hiperactivación y reaccióndel acrosoma.Sólo los espermatozoides hiperactivos inician lareacción del acrosoma inducida por el imidazolpresente en el medio de cultivo. Existen evidenciasque algunas sustancias como el bicarbonato de sodio,promueven la reacción acrosómica espontánea enespermatozoides de hámster (Boatman & Robbins,1991), es probable que el imidazol, sea un reguladordel pH del medio de cultivo y la variación de pH seauna de las causas de la reacción acrosomal, pero nose puede descartar que el imidazol pueda provocar,también, la formación de microdominios lípidicos quefacilitarían la exocitosis acrosomica.El desarrollo embrionario está influenciadodirectamente por mecanismos que ocurren durantela maduración del ovocito. Si bien es cierto quemuchos ovocitos inmaduros son capaces de completarla meiosis in vitro, sólo un pequeño porcentaje deellos adquieren una correcta competencia dedesarrollo, para continuar hasta el estado deblastocisto. Los ovocitos recolectados de ovariosprocedentes de mataderos son una fuenteextremadamente heterogénea en términos de calidady competencia de desarrollo (Brackett & Zuelke,1993). De los 283 COCs de cuy seleccionados 158(55.8%) maduraron en el medio NCSU 23expandiendo el cúmulo, indicador importante de lacapacidad de competencia ovocitaria (Krisher, 2004).Es interesante mencionar que es la primera vez que

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se usa este medio de cultivo para madurar con relativoéxito ovocitos de cuy.La eficiencia del medio de maduración ovocitaria,sirvió para comprobar que los espermatozoides quesobreviven en estrés hipotérmico prolongado, soncapaces de fecundar ovocitos maduros y ademásiniciar el desarrollo embrionario hasta el estado deblastocisto.Se puede afirmar que sistemas de cultivoquimicamente definidos, como el medio SM, permitenque los espermatozoides de cuy sobrevivan en estréshipotérmico sin alterar su capacidad fértil.

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Cuadro 1. ESPERMATOZOIDES HIPERACTIVOS EN ESTRÉS HIPOTERMICO

Cuadro 2. REACCIÓN DEL ACROSONA EN ESPERMATOZOIDES DE CUY EN ESTRESHIPOTERMICO.

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Tiempo en estrés hipotérmico Número de ovocitos maduros 2-células blastocisto

Control (0 hrs) 50 31 (62 %) 19 (38.0 %)72 hrs 50 23 (46 %) 15 (30.0 %)120 hrs 50 19 (38 %) 17 (34.0 %)

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Tabla 1. Embriones obtenidos in vitro con espermatozoides que permanecieron en estréshipotérmico


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EFECTO DEL EXTRACTO DEL FRUTO DE Solanum melongena "BERENJENA" EN CONEJOS HIPERCOLESTEROLÉMICOS

Lidia Cruz Neyra1

RESUMEN

El propósito de la presente investigación fue determinar el efecto del extracto crudo del fruto de la «berenjena»,Solanum melongena, sobre el perfil lipídico y la peroxidación lipídica en conejos hipercolesterolémicos. Seutilizaron treinta conejos, separados en tres grupos que recibieron dieta control (GC), dieta hipercolesterolémica(GH) y dieta hipercolesterolémica y extracto de berenjena (GB). Se evaluaron el perfil lipídico y la peroxidaciónen la lipoproteína de baja densidad (LDL) nativa y oxidada. El colesterol plasmático, LDL y triglicéridos que seincrementaron en el grupo GH se redujeron en 19, 29 y 38% respectivamente en el grupo GB. En el grupo GBdisminuyeron el contenido de malonaldehído (MDA) en las LDL nativas (56%) y oxidadas (22%) en comparaciónal grupo GH (p< 0.05). Se evidencia que la berenjena tiene un papel protector sobre la peroxidación lipídica.

Palabras claves: Berenjena, hipercolesterolemia, peroxidación lipídica

SUMMARY

The purpose of this study was to determine the effect of crude extract from the fruit of the eggplant, Solanummelongena, on the lipid profile and lipid peroxidation in hypercholesterolemic rabbits. Thirty rabbits were used,separated into three groups that received control diet (GC), hypercholesterolemic diet (GH) andhypercholesterolemic diet and extract eggplant (GB). These were evaluated lipid profile and lipid peroxidation inlow-density lipoprotein (LDL) native and oxidized. The plasma cholesterol, LDL and triglycerides are increasedin the GH group, but were reduced by 19, 29 and 38% respectively in group GB. The group GB decreased thecontent of malonaldehide (MDA) in the native LDL (56%) and oxidized (22%) compared to the GH group (p<0.05). It was evident that the eggplant has a protective role on lipid peroxidation.

Key words: Eggplant, hypercholesterolemia, lipid peroxidation

INTRODUCCIÓN

En la actualidad existe un consenso en relación alpapel del estrés oxidativo en la aterosclerosis, querepresenta un mayor estado de oxidación de lípidos yproteínas en la pared vascular. (Witztum, 1994,Stocker et al. 2004)La hipótesis de la modificación oxidativa en laaterosclerosis predice que la oxidación de laslipoproteínas de baja densidad (LDL) es un eventotemprano en la aterosclerosis y su modificaciónoxidada contribuye a la formación de ateromas. Estahipótesis, se evidencia in vitro cuando LDL oxidada

forma células espumosas (foam cell) e in vivo tieneuna serie de actividades potencialmenteproaterogenica, y varias de ellas estructuralmente novinculadas a la inhibición por antioxidantes enaterosclerosis experimental en animales. Un consensoen la enfermedad vascular destaca la importancia delos eventos oxidativos, además de la oxidación delLDL (Aviram, 1996).Los eventos oxidativos incluyen la producción deespecies reactivas de oxígeno y nitrógeno por lascélulas vasculares, así como las modificacionesoxidativas que contribuyen a importantesmanifestaciones clínicas de las enfermedades cardio-

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1 Laboratorio de Bioquímica y Nutrición. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.E-mail: [email protected]

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vasculares, tales como la disfunción endotelial y lainterrupción de la placa. A pesar de estos abundantesdatos, sin embargo, siguen habiendo problemasfundamentales con la implicancia de la modificaciónoxidativa como un requisito patofisiologicamenteimportante de la aterosclerosis (Ylä-Herttuala, 1991).El daño oxidativo que se produce por el desequilibrioentre fenómenos antioxidantes/proxidantes parececrucial en el origen de la ateroesclerosis, y estoaumenta la posibilidad que los antioxidantes, como lavitamina C, betacaroteno y en especial el alfa tocoferol(vitamina E), puedan prevenir o retardar el desarrollode esta enfermedad (Miller, 1998, Stocker y Keaney,2004)Por otro lado, hay una corriente de utilizar dietas ricasen alimentos que contengan antioxidantes como es elcaso del uso de Solanum melongena L "berenjena",por lo que se deberá estudiar sus principios químicosque tengan una mayor implicancia en el secuestrode radicales libres.La berenjena es una especie vegetal originaria delsudeste asiático, es consumida cocida o cruda.Estudios farmacológicos demuestran propiedades anti-inflamatorias, así como efecto antioxidante depreparados del fruto dada la alta composición deflavonoides. Se ha reportado 115 compuestos dediversa familias química, los que se encuentran en elfruto y corresponden a aminoácidos (alanina, 5-hidroxitriptamina, arginina, glicina, leucina, serina),ácidos carboxílicos (alfa-linolénico, araquidónico,ascórbico, aspártico, glutámico, oxálico, palmítico),aminas (fenilalanina, triptamina), alcaloides(isoescopoletina, solanina, solanidina), flavonoides(delphinidin-3-rutinósido-3-(4'-coumaroilrutinósido)-5-glucósido) y oligoelementos (aluminio, bario, boro,cadmio, calcio, cobre, hierro, magnesio, potasio,selenio, sodio).Sudheesh et al., 1999 reportaron que flavonoidesaislados de Solanum melongena (berenjena)muestra una potente actividad antioxidante en ratasalimentadas con dieta hipercolesterolémica a quienesse les administró 1 mg de extracto de flavonoide por100 gramos de peso / día. Las concentraciones demalonaldeído, hidroperóxidos y conjugados dienosfueron sgnificativamente disminuidos. Los niveles deglutationa aumentaron y significativamenteestimularon la actividad de catalasa, que podría serla responsable de los efectos de los flavonoides de laberenjena.Botelho et al., 2004 evaluaron el efecto de la berenjenaen el metabolismo de colesterol y la aterogenesis enratones LDLR (homocigote para receptor de LDL).Los animales fueron alimentados con dieta normal ohipercolesterolémica por doce semanas, recibiendoademás el grupo control agua y el grupo experimental

extracto de berenjena. Al término del experimentofueron evaluados el estrés oxidativo a través de laformación de conjugados dienos, anticuerpos anti LDLoxidada por inmunoensayo. El colesterol total y laslipoproteínas aterogénicas no disminuyeron con laingesta de extracto de berenjena, pero incrementaronlos anticuerpos anti LDL oxidada indicando un altonivel oxidativo . Asimismo el extracto de berenjenano disminuyó el colesterol plasmático, ni la placaaterogénica. Sus resultados no sostienen el uso deextracto de berenjena como agentehipocolesterolémico.El propósito de la presente investigación fuedeterminar el efecto del extracto crudo del fruto dela "berenjena" sobre el perfil lipídico y la peroxidaciónlipídica en conejos hipercolesterolémicos.


Se usaron conejos machos de la raza Nueva Zelandiade aproximadamente 2.60 kilos de peso, los cualesfueron colocados en jaulas independientes. Lascondiciones ambientales fueron: temperaturapromedio 22-25ºC, humedad 75% y un foto períodode 12 horas.Los animales de experimentación fueron separadosen 3 grupos como sigue: Grupo I, dieta control (GC);Grupo II, dieta hipercolesterolémica (GH),conteniendo 0.5% y 10% de aceite de coco y GrupoIII, dieta hipercolesterolémica + 20 ml de extracto deberenjena (vía nasofaríngea), GB. La dieta fueproporcionada diariamente a razón de 100 gramos yagua ad libitum, durante 30 días, luego de los cualeslos animales fueron sacrificados previo ayuno de 14horas, colectándose la sangre.Fueron determinados enzimáticamente los valores detriglicéridos (TG) y colesterol total (CT). La LDL sedeterminó por precipitación selectiva mediante el usode heparina. Dicho valor se obtiene por diferenciaentre los valores de colesterol total y los de VLDL(lipoproteína de muy baja densidad) HDL (lipoproteínade alta densidad). HDL se obtuvo precipitandoselectivamente las lipoproteínas LDL y VLDL, yquedando HDL en solución, determinándose elcontenido de colesterol, según Trinder 1998.Para la determinación de la peroxidación lipídica seaisló LDL por ultracentrifugación de acuerdo alprocedimiento de Havel et al. 1995. La oxidación deLDL fue realizada mediante incubación de 100 ug deproteína/ mL en buffer fosfato salino 1 mM, pH 7.4en presencia de sulfato de cobre (5 mM) a 37 C por24 horas. La determinación del contenido deMalondialdehído (MDA) fue realizada según elmétodo de Buege y Aust, 1978, utilizando 150 ug deproteína de LDL. El fundamento es la reacción de

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MDA, producto de lipoperoxidación con el ácidotiobarbitúrico, formándose el complejo MDA-TBA,que se determina a 535 nm por absorbancia.El análisis estadístico se realizó usando el test deKruskal Wallis a un nivel de significancia de p<0.05.

RESULTADOS

Los valores del perfil lipídico de los tres grupos deconejos: control (GC) hipercolesterolémico (GH) yel tratado con extracto de berenjena (GB) sonmostrados en la Tabla 1.

Los valores de colesterol total CT, LDL, VLDL yTriglicéridos aumentaron significativamente en el

grupo sometido a dieta hipercolesterolémica, encomparación con el grupo control; mientras que elgrupo tratado con extracto de berenjena disminuyeronsignificativamente. (p< 0.05). Sin embargo, no haydiferencias significativas para los niveles de VLDL yHDL entre los grupos hipercolesterolémicos y tratadoscon extracto de berenjena.

La concentración de malonaldehído en las LDLnativas y oxidada aumentaron significativamente (p<0.05) en los animales del grupo hipercolesterolémicosen relación al grupo control y disminuyeron en el grupotratado con extracto de berenjena (Tabla 2)

Tabla 2. Niveles de peroxidación lipídica en LDL de conejos según dieta

LDL=lipoproteína de baja densidad, MDA-LDL nativa y oxidada = nanomoles de malonaldehído / mg deproteína de la fracción de LDL. Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (p< 0.05) segúnel test de Kruskall –Wallis

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Tabla 1. Perfil Lipídico en conejos según dieta

CT= colesterol total; TG= triglicéridos, VLDL= lipoproteína de muy baja densidad, LDL=lipoproteína de bajadensidad, HDL= lipoproteína de alta densidad. Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos(p< 0.05) según el test de Kruskall –Wallis.

mg/dL GrupoI (Control) Grupo II (Hipercolesterolémicos)

Grupo III (Hipercolesterolémico

+ extracto de berenjena)

CT 59.60 ± 5.39c 1,360 ± 59.80a 1,097.70± 80.90b C-VLDL 9.7 ± 0,16b 410.53 ± 42.50a 435.89 ± 67.54a C-LDL 16.91 ± 2.40c 841.33 ± 140.62ª 595.87 ± 207.06c C-HDL 32.85 ± 5.65b 49.19 ± 4.63ª 32.85 ± 5.15ª TG 119.00 ± 35.26c 326.54 ± 78.61a 119.00 ± 35.26b

mg/dL GrupoI (Control) Grupo II (Hipercolesterolémicos)

Grupo III (Hipercolesterolémico

+ extracto de berenjena)

MDA-LDL oxidada 31.21 ± 5.06ª 57.23 ± 5.26ª 44.67 ± 7.42b

MDA-LDL nativa 1.49 ± 0,46b 3.31 ± 0.65a 1.45 ± 0.92b

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DISCUSIÓN

La administración de dietas enriquecida con colesteroly aceite de coco a conejos de la raza Nueva Zelandia,durante treinta días mostró un incrementó de losniveles de colesterol, y de las lipoproteínasplasmáticas, cuando se compara con los niveles deconejos sometidos a una dieta control.En los animales hipercolesterolémicos tratados conextracto de berenjena, se observó una reducción del19% del colesterol total en comparación con el grupohipercolesterolémico, esta disminución fue observadapor Mitschek en 1975 en tejidos aórticos de conejoshipercolesterolémicos, a través de su estudiohistológico cuyas alteraciones fueron muy discretasen aquellos animales tratados con berenjena.Asimismo Cruz et al. 1997 reportó que tratando apacientes hipercolesterolémicos con extracto deberenjena y jugo de naranja observaron una reduccióndel colesterol total y de las fracciones LDL y VLDLsin observar cambios en los valores de HDL.Se ha reportado que la berenjena tiene flavonoidesentre ellos destaca el delphin-3-rutinosido-3-(4’-coumaroilrutinosido)- 5’glucósido, además decontener más de 115 compuestos. Los flavonoidespodrían jugar un rol importante en la actividadantioxidante que evitaría la oxidación de laslipoproteínas, particularmente LDL, a quien se leatribuye papel importante en la formación de la placaaterogénica.De manera que el efecto antioxidante podría ser unacausa de la observación de la resistencia de LDL aoxidarse como se aprecia en la tabla 2; sin embargo,se necesita realizar mayores pruebas para establecerlas propiedades de la berenjena como reductor de laoxidación y disminución de las concentraciones decolesterol total y de las lipoproteínas plasmáticas.

LITERATURA CITADA

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SUDHEESH ,S., Sandhya, C., Asha Sarah Koshy yVijayalakshmi, N. R. 1999. Antioxidant activityof flavonoids from Solanum melongena.Phytotherapy Research, 13 (5):.393-396

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YLÄ-HERTTUALA, S. (1991) Macrophages andoxidized low density lipoproteins in thepathogenesis of atherosclerosis. Ann. Med.,23(5):561-567.

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TOXICIDAD DE NUEVE PLANTAS Y DE LA CIPERMETRINA EN GORGOJOSDE PRODUCTOS ALMACENADOS Y EN LA PULGA DEL AGUA DAPHNIA MAGNA

EN EL PERÚIannacone José1,Lorena Alvariño,

Hildebrando AyalaNeil Salazar

RESUMEN

Se realizaron bioensayos para evaluar el efecto tóxico de diferentes sustancias químicas sobre Sitophiluszeamais Motschulsky, 1855, S. oryzae Schoenherr, 1838 (Coleoptera: Curculionidae), Stegobium paniceum(Linneus, 1761) (Coleoptera: Anobiidae) y Daphnia magna Straus, 1820 (Cladocera: Daphnidae). Los ensayosbiológicos incluyeron evaluaciones del: 1) efecto insecticida de tres plantas: zapallo (Cucurbita maxima Duch.Ex Lam, Cucurbitaceae), eucalipto (Eucalyptus globulus Labill, Myrtaceae) y coca (Erythroxylon coca[Lamark], Erythroxylaceae) sobre adultos de S. zeamais y de S. paniceum, en bioensayos de mortandad bajocondiciones de laboratorio hasta 120 h de exposición. Se evaluaron estas tres plantas bajo las cinco formulacionessiguientes: polvo seco (1,6 g·10 g de maíz), extractos acuosos en frío (20 % p/v), infusión (20 % p/v), cocción(20% p/v) y extracto etanólico (0,2 g·1mL de etanol en 10 mL de agua). A las concentraciones seleccionadasninguna de las tres plantas presentó efecto sobre S. zeamais y S. paniceum. 2) efecto insecticida, repelente yatrayente de seis plantas: hoja y flor de floripondio (Brugmansia candida Pers., Solanaceae), hoja y flor deruda (Ruta graveolens L., Rutaceae), semilla de higuerilla (Ricinus communis L., Euphorbiaceae), bulbo deajo (Allium sativum L, Liliaceae), hoja de muña (Minthostachys setosa (Briquet) Epling, Lamiaceae) y hojasde eucalipto sobre adultos de S. zeamais, bajo condiciones de laboratorio entre 1 h a 120 h de exposición paramortandad y 1 h de exposición para repelencia-atracción. Ninguno de los extractos acuosos en infusión mostróefectos estadísticamente significativos de mortandad en comparación con el control. El extracto de eucalipto yde hoja de floripondio produjeron repelencia sobre de los gorgojos. El resto de extractos mostraron efectosatrayentes. 3) efecto tóxico de la cipermetrina al 1,3% sobre S. zeamais y S. oryzae, mostrando a 24 h valorescercanos al 40% de mortalidad en comparación con el control.4) la actividad biológica de toxicidad aguda a 48h de exposición empleando eucalipto, coca, zapallo, muña y granado (Punica granatum L. Punicaceae) enneonatos de la pulga de agua D. magna. Se observó la mayor actividad en la formulación acuosa de muñasobre D. magna.

Palabras claves: Daphnia, extractos vegetales, insecticidas botánicos, Sitophilus, Stegobium.

SUMMARY

Bioassays were performed to evaluate toxic effect of different chemical substances on Sitophilus zeamaisMotschulsky, 1855, S. oryzae Schoenherr, 1838 (Coleoptera: Curculionidae), Stegobium paniceum (Linneus,1761) (Coleoptera: Anobiidae) and Daphnia magna Straus, 1820 (Cladocera: Daphnidae). Biological assaysincluded the next evaluations: 1) insecticide effect of three plants: great pumpkin (Cucurbita maxima Duch. ExLam, Cucurbitaceae), eucalyptus (Eucalyptus globulus Labill, Myrtaceae) and coca (Erythroxylon coca[Lamark], Erythroxylaceae) on adults of S. zeamais and S. paniceum, on mortality bioassays at laboratoryconditions until 120 h of exposure. Three plants were evaluated on the next five formulations: dry dust (1.6 g·10

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g of corn), watery extracts on cold (20 % w/v), infusion (20 % w/v), baking (20% w/v) and ethanolic extract(0.2 g·1mL of ethanol in 10 mL of water). At selected concentrations none of three plants presented effect onS. zeamais and S. paniceum. 2) insecticide, repellence and attraction of six plants: leaves and flower of angel’sTrumpet (Brugmansia candida Pers., Solanaceae), leaves and flower of rue (Ruta graveolens L., Rutaceae),seeds of perennial castor (Ricinus communis L., Euphorbiaceae), bulb of Garlic (Allium sativum L, Liliaceae),leave of muña (Minthostachys setosa (Briquet) Epling, Lamiaceae) and leave of eucalypt on adults of S.zeamais, on laboratory conditions between 1 h to 120 h exposure of mortality and 1 h exposure for repellence-attraction. None of watery extracts of infusion showed significantly statistical mortality effects in comparisonto control. Eucalyptus and angel’s trumpet leaves extract produced repellence on weevils. The rest of extractsshowed effects of attraction. 3) Toxic effect of cypermethrine at 1.3% on S. zeamais and S. oryzae, showedat 24 h values near to 40% of mortality in comparison to control. 4) biological activity of acute toxicity at 48 hof exposure employing eucalyptus, coca, great pumpkin, muña and Pomegranate (Punica granatum L.Punicaceae) on neonates of water flea D. magna. More activity was observed on watery formulation of muñaon D. magna.

Key words: Daphnia, botanical extracts, botanical insecticide, Sitophilus, Stegobium.

INTRODUCCIÓN

Uno de los principales problemas de los agricultoresen los países del tercer mundo es la destrucción delas cosechas de los granos almacenados en calidady cantidad por roedores, insectos, hongos y bacteriasentre un 20% a 80% (Silva et al., 2003, 2006; Ngamoet al., 2007). Una de las plagas de mayor relevanciaen granos almacenados es Sitophilus zeamaisMotschulsky (Coleoptera: Curculionidae) (Salvadoreset al., 2007). Esta especie produce perdida de pesoen el grano, reducción en el valor estético y en elmercado, disminución en la germinación y en el valornutritivo del maíz (Udo, 2005; Akob & Ewete, 2007).Otras plagas de importancia en granos almacenadosson Stegobium paniceum (Linnaeus, 1758)(Gunasekaran & Rajendran, 2005; Gamalie, 2007)y Sitophilus oryzae (Mazzuferi, 2000; Ngamo et al.,2007; Salem et al., 2007).Es necesario buscar métodos alternativos armónicoscon la realidad de cada país, que sean baratos yaltamente disponibles (Silva et al., 2004, 2006; Akob& Ewete, 2007). Muchos insecticidas sintéticos sonteratogénicos, mutagénicos, carcinogénicos y afectanla salud de las personas que los emplean (Asawalam,2006; Iloba & Ekrakene, 2006; Asawalam et al.,2007). Por ende es vital buscar alternativas que seanaccesibles y de bajo impacto para el control de granosalmacenados (Ngamo et al., 2007). Una alternativaes emplear plantas biocidas que presentencompuestos químicos secundarios y activos contralas plagas (Awoyinka et al., 2006; Rahman et al.,2007), muchas de las cuales no han sidoadecuadamente evaluadas y es importante surevalorización como fuente de sustancias conpropiedades insecticidas, repelentes, deterrentes dela oviposición y alimentación, y reguladores de

crecimiento (Silva et al., 2005; Asawalam, 2006).Las plantas biocidas son una alternativa armónicacon el desarrollo sostenible (Salvadores et al., 2007).Daphnia magna Strauss, 1820 (Crustácea:Daphniidae) es una especie de cladóceropartenogenética usada ampliamente en ensayos deecotoxicidad (Tonkopii & Iofina, 2007), para evaluarsustancias químicas puras, aguas residualesdomésticas e industriales, aguas superficiales osubterráneas, agua potable, y lixiviados entre otros(Iannacone & Alvariño, 2007a; Iannacone et al.,2007). Su uso es debido a varias razones: 1) ampliadistribución geográfica, 2) importante papel en lacomunidad zooplanctónica, 3) facilidad de cultivo, 4)corto ciclo de vida con la producción de un alto númerode crías (Castillo, 2004).El objetivo de este trabajo fue evaluar bajocondiciones de laboratorio, 1) el efecto toxicológicode tres plantas: zapallo (Cucurbita maxima Duch.Ex Lam, Cucurbitaceae), eucalipto (Eucalyptusglobulus Labill, Myrtaceae) y coca (Erythroxyloncoca [Lamark], Erythroxylaceae) sobre adultos deS. zeamais y de S. paniceum, en bioensayos demortandad bajo condiciones de laboratorio hasta 120h de exposición. 2) efecto insecticida, repelente yatrayente de seis plantas: hoja y flor de floripondio(Brugmansia candida Pers., Solanaceae), hoja yflor de ruda (Ruta graveolens L., Rutaceae), semillade higuerilla (Ricinus communis L., Euphorbiaceae),bulbo de ajo (Allium sativum L, Liliaceae), hoja demuña (Minthostachys setosa (Briquet) Epling,Lamiaceae) y hojas de eucalipto sobre adultos de S.zeamais, 3) efecto tóxico de la cipermetrina al 1,3%sobre S. zeamais y S. oryzae, mostrando a 24 hvalores cercanos al 40% de mortalidad encomparación con el control, y 4) la actividad biológicade toxicidad aguda a 48 h de exposición empleando

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eucalipto, coca, zapallo, muña y granado (Punicagranatum L. Punicaceae) en neonatos de la pulgade agua D. magna.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los bioensayos se realizaron en el Laboratorio deInvertebrados de la Facultad de Ciencias Biológicasde la Universidad Ricardo Palma entre agosto del2004 a febrero del 2008.Gorgojos de granos almacenados. Las crianzasde S. zeamais, S. oryzae y de S. paniceum fueroniniciadas a partir de adultos procedentes del MercadoJorge Chávez, La Victoria, Lima, Perú, y alimentadascon maíz variedad amarillo duro para pollo y variedadcancha. Posteriormente los individuos fuerontrasladados al laboratorio, separados por especie ycolocados en envases plásticos de 1 L de capacidad,y mantenidos a una temperatura aproximada de 25°C± 3°C, para favorecer la reproducción, oviposición yobtención de los adultos requeridos para realizar losbioensayos toxicológicos (Iannacone et al., 2005).Pulga del agua. Hembras adultas de esta especiese obtuvieron del acuario «Cleo» procedente deldistrito de Lince, Lima, Perú, y se llevaron allaboratorio en recipientes plásticos de 2 L decapacidad. Hembras partenogenéticas se colocaronen el medio nutritivo ADaM. La preparación delmedio se realizó de la siguiente forma: 9,9 g de salesobtenidas por evaporación del agua de mar seadicionaron a 60 L de agua de grifo declorinada,reposada y hiperoxigenada durante 24 h. Luego seagregó 138 mL de una solución de cloruro de calcio(117,6 g ·L-1), 132 mL de una solución de bicarbonatode sodio (25,2 g· L-1) y 6 mL de una solución deOxido de Selenio (0,07 g L-1) (Klüttgen et al., 1994).Plantas. Las plantas utilizadas en los ensayostoxicológicos provinieron de distintos mercados yParques de Lima, Perú (Tabla 1). 250 g de bulbo,hojas, flor o semilla de cada especie según lo indicadoen la Tabla 1 para cada uno de los diferentes ensayos,fueron secadas en estufa a 37 ºC, por 70 haproximadamente, hasta obtener un peso constantepor la pérdida de agua. Posteriormente las hojasfueron trituradas en un mortero (Haldenwanger®) yel residuo obtenido fue pasado secuencialmente por2 tamices de 500 µ y 250 µ. Las muestras fueronenvasadas en frascos de vidrio color ámbar paraevitar la fotolisis, rotuladas, y guardadas a temperaturade 25°C ± 3°C hasta el día a ser utilizadas en losbioensayos (Iannacone & Lamas, 2003).

BIOENSAYOS

1) Efecto insecticida de tres plantas (Cucurbitamaxima, Eucalyptus globulus y Erythroxyloncoca) sobre adultos de S. zeamais y de S.paniceum.En seco: Se colocaron 10 individuos de cada especiede gorgojo en envases cuadrangulares de plásticocon cuatro réplicas. La distribución del polvo secode las plantas se realizó de la siguiente manera: 0,1g, 0,2 g, 0,4 g, 0,8 g y 1,6 g por cada 10 g de maíz encada una de las cuatro replicas, y cinco dosis más uncontrol (Iannacone et al., 2004, 2006); los insectosfueron controlados cada 24 h durante 5 días (= 120h), según la técnica sugerida por Mazzonetto &Vendramim (2003).En acuoso: El extracto botánico acuoso crudo, fuepreparado con agua destilada (pH 6±0,5) a cincoconcentraciones, y filtrados a través de un papelfino (Whatman® Nº 5, USA). Solo se usaronextractos acuosos que habían sido recientementepreparados (no más de 48 h), debido a quemicroorganismos fúngicos pudieran afectar la calidadde los mismos (Iannacone & Lamas, 2003). Secolocaron 10 g de maíz previamente remojados por5 seg por cada concentración y cada tratamiento, yse agregaron 10 individuos de cada especie degorgojo en cada envase con las concentraciones de1,25 %, 2,5 %, 5 %, 10 % y 20 %, respectivamente,con cuatro replicas más un control, evaluados cada24 h durante 5 días (= 120 h), para obtener el efectode mortalidad. Para los extractos de cocción e infusiónen agua destilada se prepararon a las mismasconcentraciones que los extractos acuosos atemperatura ambiente, siguiendo lasrecomendaciones de Iannacone et al. (2004).Extracto etanólico: Se tomó 0,2 g de cada una delas tres plantas y se colocó en un 1 mL de etanol yposteriormente en 10 mL de agua destilada. A partirde los cuales se hicieron las otras cuatro dilucionesempleando un factor de 0,5. De igual manera seevaluó cada 24 h durante 5 días (120 h).2) Efecto insecticida, repelente y atrayente deseis plantas (Brugmansia candida, Rutagraveolens, Ricinus communis, Allium sativum,Minthostachys setosa y eucalipto) sobre S. zeamais.Se usó sobre S. zeamais el extracto de infusiónacuosos para evaluar la actividad insecticida de seisplantas: B. candida, R. graveolens, R. communis,A. sativum, M. setosa y eucalipto. Se siguió elprotocolo y las concentraciones indicadas paraextractos acuosos del primer caso.

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Para el ensayo de repelencia y atracción se empleóel método estándar (Asawalam, 2006). Los polvossecos de cada una de las seis plantas fueron disueltosen agua destilada para hacer una solución al 20% p/v. Papeles filtros Whatman N°40 de 9 cm de diámetrofueron cortados en dos mitades. Una de las mitadesfue sumergida en el extracto acuoso y la otra mitaden agua destilada. Los discos tratados y no tratadosfueron secados a la estufa y colocados en placas depetri, previamente fueron unidas las dos mitadesempleando una cinta adhesiva. 10 insectos fueroncolocados en el centro de la placa de petri y luego de1 h fueron contados los insectos que se encontraron

en cada una de las mitades de los discos en l placade petri. El porcentaje de repelencia fue calculadousando la siguiente fórmula de Abbotts:

Porcentaje de repelencia = [(A-B)/A] x 100

A = Promedio del número de insectos presentes enla porción no tratada. B = Promedio del número deinsectos presentes en la porción no tratada.

El porcentaje de repelencia fue categorizado deacuerdo a la siguiente escala:

3) Efecto tóxico de la cipermetrina al 1,3%sobre S. zeamais y S. oryzae.Se usó la cipermetrina en formulación tipo fumígena.La composición química es 1,3% de cipermetrina y98,7% de inertes (Iannacone & Alvariño, 2007b). Seempleó una pastilla por cada por habitación de 9 m2,la cual fue colocada sobre el suelo en un trozo demayólica de 20 cm x 20 cm. Los ensayos con ambasespecies de gorgojos S. zeamais y S. oryzae fueronrealizados en simultáneo. El control consistió en elempleo de una habitación de 9 m2 sin la aplicaciónde la cipermetrina. En cada recipiente cuadrangularde 40 mL fueron colocados 10 gorgojos. Se realizaron25 orificios en cada uno de los cuatro lados lateralesy en la tapa de cubierta. 13 recipientes fueroncolocados sobre el suelo a 50 cm de separación entrerecipientes. Las lecturas se realizaron a las 3h, 6h y24 h de exposición a la cipermetrina fumígena.4) Actividad biológica de toxicidad aguda a 48 hde exposición empleando eucalipto, coca,zapallo, muña y granado (Punica granatum L.Punicaceae) en neonatos de la pulga de agua D.magna.La duración total de la prueba fue de 48 h deexposición para todos los casos. A cada envasecircular de 250 mL se procedió a agregar 100 mL decada una de las concentraciones de las sustanciasquímicas empleadas, a los que se transfirieron diezneonatos de D. magna. Se usó como criterio demortalidad la carencia de movilidad o la ausencia deritmo cardiaco a 15 s de observación al microscopioestereoscopio (Castillo, 2004).

Diseño experimental y tratamiento estadístico.Las pruebas de toxicidad aguda se evaluaron enconcentraciones nominales para cada planta a travésde un ANDEVA, con el modelo aditivo lineal,empleando un diseño en bloque completamentealeatorizado (DBCR) de 6 concentraciones-dosis x4 repeticiones. Los datos fueron transformados aarcoseno (porcentaje de mortalidad de adultos/100)0,5

antes del análisis, para estabilizar el error de lavarianza. En el caso de existir diferenciassignificativas entre las repeticiones y entre lostratamientos se hicieron pruebas de diferenciasverdaderamente significativas (DVS) de Tukey. Solocuando en los bioensayos se encontraronmortalidades diferentes de cero en el control losanálisis estadísticos se realizaron con los valoresajustados según la fórmula de Abbott (Iannacone &Lamas, 2003). Se empleó el paquete estadístico SPSSen español, versión 15,0 para el cálculo de laestadística descriptiva e inferencial.

RESULTADOS

Se encontró que C. máxima, E. globulus y E. cocaen polvo seco, en extracto acuoso, extracto eninfusión, en cocción, y etanólico no produjeron efectossobre la mortalidad de S. zeamais y S. paniceum a120 h de exposición (Tabla 2).Ninguna de las seis plantas ensayadas en extractode infusión produjo efecto en la mortalidad de S.zeamais a 120 h de exposición (Tabla 3). Las hojasde B. candida y E. globulus ocasionaron repelencia

En el caso de dar resultados negativos se consideró como atracción.

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Clase Repelencia Clase Repelencia Porcentaje (%) Porcentaje (%) 0 >0,01 a 0,10 III 40,1 a 60 I 0,10 a 20 IV 60,1 a 80 II 20 a 40 V 80,1 a 100


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en escala II y III, respectivamente sobre S. zeamais.La flor de B. candida, la hoja y flor de R.graveolens, las semillas de R. communis, el bulbode A. sativum y la hoja de M. setosa produjeroncontrariamente un efecto atrayente (Tabla 3).A 3 h, 6 h y 24 h se observó igual mortalidad por lacipermetrina en adultos de S. zeamais que en S.oryzae. Para ambos gorgojos se observarondiferencias en los porcentajes de mortalidad entrelos controles y los tres periodos de exposiciónensayados (Tabla 4).Con relación a los extractos de infusión de las cincoplantas evaluadas a las 24 h de exposición se vio un80% de mortalidad sobre D. magna para las hojasde E. coca y para las flores de P. granatum; asícomo un 90% de mortalidad para M. setosa. A las48 h, todas las plantas ocasionaron un 100% demortalidad en D. magna (Tabla 5).

DISCUSIÓN

La literatura científica señala diversas plantaspromisorias con propiedades biocidas sobre gorgojosde granos almacenados, principalmente en S.zeamais (Oliveira et al., 2003; Akon & Ewete, 2007).Las hojas de E. globulus ocasionaron repelencia enescala III sobre S. zeamais. Se ha encontradoausencia de efecto en la mortalidad de S. zeamaispor acción de polvos secos, extractos acuosos, deinfusión y cocción de E. globulus a 120 h deexposición (Iannacone et al., 2006). Lee et al. (2004)evaluó los efecto fumigantes de Eucalyptus blakelyisobre huevos, larvas, pupas y adultos de S. oryzae.El efecto tóxico de E. blakeli sobre S. oryzae esatribuido al cineol. Sin embargo, los análisiscromatográficos han detectado más de 57 sustanciasen E. blakeli. En Sitophilus granarius (Linnaeus)ha sido evaluado el efecto en la emergencia de losadultos, daño en las semillas, perdida de peso einhibición por acción de Eucalyptus macrorhyncha(Rahman et al., 2003). De igual manera, se haencontrado mortalidad significativa en los adultos deS. zeamais bajo tratamientos con Eucalyptussargentii, Eucalyptus intertexta, Eucalyptuscamaldulensis, Eucalyptus grandis y Eucalyptussaligna (Akob & Ewete, 2007; Negaban &Moharramipour, 2007). De igual forma las hojas deB. candida ocasionaron repelencia en escala II sobreS. zeamais. PIER (2008) realizó una evaluación deriesgo toxicológica de B. candida. Se ha observadomortalidad y repelencia de larvas del gorgojoRhynchophorus palmarum por acción de B.candida (Pérez & Iannacone, 2006). Pérez &Iannacone (2008) encontraron bajo efecto en lamortalidad, pero alto efecto en la repelencia sobre

las larvas del lepidóptero Eupalamides cyparissiasa 24 h de exposición.Con relación a los extractos de infusión de las cincoplantas evaluadas a las 24 h de exposición sobre D.magna se vio un 90% de mortalidad para M. setosa.De igual manera, Sutil et al. (2006) encontrarontoxicidad de los aceites esenciales de Minthostachysverticillata sobre Artemia salina y en líneascelulares Vero y HEp-2. De igual manera, Ciccia etal. (2000) evaluó la toxicidad de Minthostachyssetosa sobre Aedes aegypti. Alkire et al. (1994) ySchmidt-Lebuhn (2008) evaluaron el efectotoxicologico y la composición bioquímica del géneroMinthostachys.

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Tabla 1. Especies de plantas evaluadas para el control de gorgojos de granos almacenados yDaphnia magna.

Caso 1 = efecto toxicológico de tres plantas: zapallo (Cucurbita maxima, Cucurbitaceae), eucalipto (Eucalyptus globulus, Myrtaceae)y coca (Erythroxylon coca, Erythroxylaceae) sobre adultos de S. zeamais y de S. paniceum, en bioensayos de mortandad bajocondiciones de laboratorio hasta 120 h de exposición.Caso 2 = efecto insecticida, repelente y atrayente de seis plantas: hoja y flor de floripondio (Brugmansia candida, Solanaceae), hojay flor de ruda (Ruta graveolens, Rutaceae), semilla de higuerilla (Ricinus communis, Euphorbiaceae), bulbo de ajo (Allium sativum,Liliaceae), hoja de muña (Minthostachys setosa, Lamiaceae) y hojas de eucalipto sobre adultos de S. zeamais,Caso 4 = actividad biológica de toxicidad aguda a 48 h de exposición empleando eucalipto, coca, zapallo, muña y granado (Punicagranatum, Punicaceae) en neonatos de la pulga de agua D. magna.

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Nombre científico Nombre vernacular Familia Parte

empleada Caso

empleada Allium sativum ajo Liliaceae bulbo 2 Brugmansia candida floripondio Solanaceae Hoja y flor 2 Cucurbita maxima zapallo Cucurbitaceae semilla 1 y 4 Erythroxilon coca coca Erythroxylaceae hoja 1 y 4 Eucalyptus globulus eucalipto Myrtaceae hoja 1, 2 y 4 Minthostachys setosa muña Lamiaceae hoja 2 y 4 Punica granatum granada Punicaceae flor 3 Ricinus communis higuerilla Euphorbiaceae semillas 2 Ruta graveolens ruda Rutaceae Hoja y flor 2

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Tabla 2. Porcentaje de mortalidad de las tres plantas evaluadas sobre el gorgojo del maízSitophilus zeamais y del gorgojo de la galleta Stegobium paniceum a 120 h de exposición.

A = Polvo seco (1,6 g. 10 g de maíz). B = Extracto acuoso en frío (20%). C = Extracto infusión (20%). D = Extracto cocción (20%). E= Extracto etanólico (0,2 g 1 mL de etanol en 10 mL de agua).

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad y repelencia de seis plantas en extracto de infusión evaluadassobre el gorgojo del maíz Sitophilus zeamais a 120 h de exposición.

Valores son signos negativos indican que los extractos fueron atrayentes.Valores con signos positivos señalan que los extractos fueron repelentes. Escala de repelencia II = 20 a 40% de repelencia. Escala derepelencia III = 40 a 60% de repelencia.

Tabla 4. Toxicidad de la cipermetrina al 1,3% sobre Sitophilus zeamais y S. oryzae a 3 h, 6 h y 24 hde exposición.

Letras minúsculas iguales en una misma columna indican que los promedios son estadísticamente iguales a un P< 0,05 según la pruebade Tukey.

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Tratamientos Sitophilus zeamais (% mortalidad)

Stegobium paniceum (% mortalidad)

A B C D E A B C D E Cucurbita máxima 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Eucalyptus globulus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erythroxilon coca 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Extracto de infusión (20%) (% Mortalidad)

Porcentaje de repelencia

Escala de repelencia

Brugmansia candida (Solanaceae), hoja 0 33,3 II Brugmansia candida (Solanaceae), flor 0 -70 Atrayente Ruta graveolens (Rutaceae), hoja 0 -35,3 Atrayente Ruta graveolens (Rutaceae), flor 0 -66,7 Atrayente Ricinus communis (Euphorbiaceae), semillas

0 -22,2 Atrayente

Allium sativum (Liliaceae), bulbo 0 -50 Atrayente Minthostachys setosa (Lamiaceae), hoja 0 -10,5 Atrayente Eucalyptus globulus (Myrtaceae), hoja 0 57,1 III Control 0 0 -

Periodo de exposición

Tratamientos S zeamais (% mortalidad)

S. oryzae (% mortalidad)

Control 0,76a 0a 3 h cipermetrina 19,2bc 14,6bc Control 1,98a 0a 6 h cipermetrina 30cd 26,9cd Control 1,98a 0a 24 h cipermetrina 40,7d 38,5d


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Tabla 5. Porcentaje de mortalidad de cinco plantas en extracto de infusión evaluadas sobre lapulga del agua Daphnia magna a 120 h de exposición.

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Tratamientos a base de extracto infusión (1 g del P de la planta L-1)

24 h (% de mortalidad)

48 h (% de mortalidad)

Eucalyptus globulus (Myrtaceae), hoja 85b 100b Erythroxilon coca (Erythroxylaceae), hoja 80b 100b Cucurbita maxima (Cucurbitaceae), semilla 85b 100b Minthostachys setosa (Lamiaceae), hoja 90b 100b Punica granatum (Punicaceae), flor 80b 100b Control 0a 10a

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A GREENHOUSE TIME BEFORE THE ONSET OF AN ICE AGE(Open Air Lecture and Demonstration in the «La Mina» Section

Reserva Nacional de Paracas (Ica, Peru) on May 30, 2008)

H. W. Pfefferkorn1

V. Alleman2

RESUMEN

Se hace una reseña de los diferentes logros alcanzados, durante los últimos veinte años de investigacionesdesarrolladas, en la localidad tipo de la faja paleoflorística de Paraca. La edad del afloramiento en La Mina esViseana y produjo una biozona única. La evidencia de varios ambientes de deposición contienen al menos seiscomunidades vegetales, incluyendo bosques monoespecíficos de Lycopsida en posición erguida, Sphenopsida yPteridospermas y además de varios conjuntos de flora aloctónicos. La vegetación se extendió a lo largo deplanicies costeras, meandros fluviales, canales tidales e islas barreras.

Palabras clave: Perú, Gondwana, faja paleoflorística Paraca, paleoclimatología, Viseana, paleobosques.

SUMMARY

We present a summary of the past twenty years of continous investigations in the type locality of the Paracapaleofloral belt. The type section in «La Mina» has an Visean age and developed a unique biozone. Theevidence of several environmental deposits contains at least six plant communities, including monospecificforests of lycopsids in up-right position, sphenopsids and pteridosperms and other aloctonics sets of flora. Thevegetation extended throughout coastal plains, fluvial meanders, tidal channels and barrier islands.

Key words: Peru, Gondwana, Paracas Floral belt, paleoclimatology, Visean, paleoforests.

1 University of Pennsylvania. Email: [email protected] Museo de Historia Natural, Universidad Ricardo Palma. Email: [email protected]

INTRODUCTION

Professors Hermann W. Pfefferkorn, University ofPennsylvania, Philadelphia, USA, and Vera Alleman,Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú,demonstrated and explained on May 30, 2008, to anaudience of 22 persons the results of their researchon one example of ancient global climate change,paleoecology, paleoenvironments, and paleobotany.They demonstrated these results in the locality wherethe research had been and is being conducted.Among the participants were members of the fieldresearch group from the Universidad Ricardo Palma,University of Pennsylvania, staff from the ReservaNacional de Paracas, the director of the Ica Office

of the «Instituto National de Cultura», academicpresence of the Universidad Nacional del Altiplanode Puno, professors and students of the UniversidadRicardo Palma of Lima and the Universidad NacionalSan Luis Gonzaga de Ica.

History of «La Mina»

The presentation began with a general introductioninto the history and general geology of the area. APeruvian geologist named Fuchs discovered coalseams and the Carboniferous age of these beds in1900. In the following years a company was formedto mine this coal. The company brought in two steamengines rusted remnants of which can still be seen

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on the beach at La Mina and above the far end ofthe section. They drove four tunnels and sank oneshaft but did not find enough coal to even fire theirown steam engines and the venture was abandonedwith a loss of the investments. What remains is thename «La Mina» and rocks that contain anoutstanding example of paleoclimatic history of theEarth.

History of previous paleobotanical researchThe fossil flora of the La Mina section was first listedby Fuchs in 1900 and correctly identified asCarboniferous. However, all the names he used forthe fossils were incorrect. About every two decadesa geologist would collect material in the section andsend it to a paleobotanist who would write apublication on the unusual and enigmatic plant fossilsthat were so different from those known from otherparts of the world. Some of these publicationscontributed new valid names but all had shortcomingsbecause the descriptions were based on collectionsof loose material found on the beach that had alreadyundergone some weathering and lost important detail.For instance, there are two common tree-lycopsidspresent at La Mina that were both found anddemonstrated during the lecture. These two specieswere described over the years by eight generic namesbut all eight are incorrect.

Geologic OverviewThe Carboniferous beds (327 millions of years old)occur in an uplifted area and the fault that is itsboundary can be seen in the cliff. The neighboringdown-thrown area consists of Tertiary (Eocene, about45 million years old) beds that are more easily erodedthan the more resistant Carboniferous rocks. In thefar distance the group could see the next upliftedblock consisting of mostly red volcanic rocks ofJurassic age (about 18 0 millions of years old). Thenext uplifted block in the other direction at theMirador de Lobos consists of Precambrian rocks thatare more than a billion years old. These uplifted(horsts) and down-thrown blocks (grabens) havebeen formed due to the subduction of the PacificPlate under the South American Plate that producedand still produces a fracturing, thinning, and generaluplift of the South American margin. However, someareas subsided relative to others within the generaluplift.

Current researchOur own research began more than 20 years agowhen Professor Alleman discovered material in thesection that was much better preserved than anypublished specimens. She contacted Professor

Pfefferkorn and the two have been the leaders ofthis investigation since then. Over the years, studentsfrom the Universidad Ricardo Palma in Lima, Peru,and graduate students and postdoctoral fellows fromthe University of Pennsylvania have participated inthe investigations. In recent years a colleague fromBrazil, Professor Iannuzzi, has also been part of theteam. Our research included taxonomy andnomenclature of the plant fossils, reconstruction ofthe plants, biostratigraphy, i.e. the determination ofthe age of the beds, plant taphonomy, paleoecology,and paleoclimatology. Over the years we haveprogressed from the more basic to the more complexquestions. At every step of the way we havepresented our results in Spanish in Peru and in Englishin international journals. Currently, the group has anumber of manuscripts in preparation.

MATERIALS AND METHODS

MaterialsPlant fossils (leaves, stems, pollen organs, seeds, orsporangia, rooting structures) and forests incarboniferous rocks over an 170 meters thick section.

Methods: Reconstructing the whole plantPlants are complex and large organisms that normallyfall apart before they get preserved. Thus, we findand collect pieces. Out of the different parts, wehave to reconstruct a whole plant. In addition, evenin live many plants and plant parts can show a largeamount of variability. We have to collect and curate(i.e. number, photograph, describe, and preserve in apermanent museum) a large number of specimensbefore we can judge what belongs together.Afterwards we have to work with artists to makedrawings that show our conclusions. With new findsthese reconstructions are then to be revised asnecessary.

RESULTS

The age for the rock layers at La MinaOne of the most important questions is the age of therocks at La Mina. Fuchs (1900) identified the ageas Carboniferous and nobody has doubted this ageassignment since. However, the Carboniferous wasapproximately 74 million years long and a moreprecise dating is needed to make best use of all theinformation gained from the research. A direct datingis not possible because this occurrence ofCarboniferous rocks is isolated. Underlying rocksare not exposed and overlying beds have been eroded.No rock types are present that would allow dating ofthe rocks through isotopes. The plant fossils are

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actually the only available material to determine theage.

The plant fossils encountered at La Mina on theParacas Peninsula are quite different from thoseknown from either North America and Europe orfrom most localities in South America or othersouthern continents and do not allow a directcomparison. A critical evaluation of those plantsknown from elsewhere gave a tentative age but onlythe comparison with specific floras found in Bolivia,Brazil, Niger in Africa, the Indian Subcontinent, andAustralia finally gave a precise age of late Visean(about 327 million years ago). We could achieve thisgoal only by including in our team a colleague fromBrazil and visiting museums in Paris for the Africanmaterial and in Australia. Between the members ofthe team we have seen the material from each ofthe locations we use for comparison except that inIndia which we know only from the literature. Thus,the question of the precise age could only be solvedby comparison with other countries and continents.

Duration of deposition for the La Mina sectionAnother question of interest is how much time thelate Visean beds of La Mina represent. The answercan be given based on the fossil plants, theenvironments of deposition, principles of stratigraphy,and sequence stratigraphy. The overall compositionof the fossil flora does not change from the base ofthe section to the top of the section. In other wordsonly one biozone is represented. Plant biozones inthe Carboniferous have an average length of 3 millionyears, i.e. the flora was quite stable for long periodsof time. However, there are also biozones that areonly 1 to 1.5 million years long. In any stratigraphicsection most of the time is represented by gaps ofdeposition that appear in the section as beddingplanes. This certainly is the case here, too. However,there are no large gaps or hiatuses present in thissection. Thus, we can estimate the time it took todeposit the rocks and use that as the lower limit forthe time duration. The different environmentsdiscussed below could have formed over a relativelyshort period of time geologically speaking. The sectionis 170 meters thick. If we assume an overallsedimentation rate of 1 mm per year after compactionwe would come to 170 000 years. This wouldrepresent the rate of subsidence of the area that wouldbe a reasonable assumption. The sedimentsthemselves could have been deposited in as little as10 000 years. However, that would require a veryhigh rate of subsidence and there is no other indicationwhy it should have existed in this area at this time.

In terms of sequence stratigraphy, the beach barriercomplex near the top of the section could representa sea level high stand. If that is the case all the bedshere belong to one sequence. Assuming this to be athird order cycle the length of time would be typicallyless than three million years. In summary one cansay that the exact duration cannot be determined atthis time but we can say that it was in all likelihoodbetween 170 000 and 1.5 million years. Furtherresearch in this area and in other areas of the sameage will help us to narrow this time range in the future.

Environments of depositionThe environments in which the beds of the La Minasection were deposited can be determined from acombination of data from the rocks, i.e. theircomposition (sedimentary petrology), grain size, andsedimentary structures (sedimentology), and datafrom the fossil floras. A detailed sedimentological-sedimentpetrographic study is still outstanding butpreliminary investigations of our group allow a generalinterpretation. The rocks in the lower part of thesection were deposited on a fluvial plain with smallmeandering rivers. In the middle part of the sectiontidal influence becomes noticeable. In other wordstides extended deep into the freshwater realm butbrackish influence may be present. The beds of atidal channel are overlain by coastal plain sedimentsfollowed by the sands of a beach barrier bar complex.In this complex a tidal channel is present that wasfilled by sandy tidalites that represent as a firstapproximation about 9 month of sedimentation. Thiscomplex is in turn capped by another sequence ofcoastal plain sediments. The plants contribute to thisinterpretation by the presence of rooted horizon thatrepresent incipient paleosols and are indicators for ashort hiatus in sedimentation. A layer with stemsthat are all oriented in the same direction indicatesits origin in a flood where the stems were felled andoriented in the direction of the flow.

Trees and forests in placeOne exiting observation are tree stumps that occurin place. A forest was growing during an interruptionof sedimentation. A new flood event than coveredthe base of the trees with sediment so that they died.The parts of the trees not covered by sedimentdecayed but those in the wet sediment werepreserved. We can see them today in one fluvialunit in the middle of the section in side view and insome beds of the coastal plain in map view in theupper part of the section so that we can reconstructthe actual forest with the proper diameter and spacingof the trees.

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Fossil plant communitiesWe mentioned above that the overall composition ofthe fossil flora does not change throughout the section.However, if we collect only from a specific bed wefind that different plant communities lived in differentsubenvironments of the fluvial and coastal plains.There were forests that consisted only of either oneof the two common species of lycopsids. Thesphenopsid Archaeocalamites formed monospecificthickets, as did some pteridosperms. However, therewere also plant communities with higher diversity andrepresentatives of all three groups both in thebackswamps and on the levels. We can so fardistinguish six different plant communities that livedin the sedimentary environments and have beenreconstructed by us. In addition, there were one orseveral extrabasinal floras that we find only as verysmall swept-in fragments in specific beds. We donot have enough data from these fragments toreconstruct plant communities but we can name somespecies that occurred only in these erosionalenvironments and not in the lowland depositionalsettings. In this way these fragments widen ourhorizon and preserve indications of what wasremoved by erosion.

DISCUSSION

Climate change and the Paracas sectionThe fossil flora of the La Mina section represents aclimatic belt that existed on Earth only during thelatest Visean time. Professors Pfefferkorn andAlleman first recognized it after they began theirresearch (Alleman & Pfefferkorn, 1988; Pfefferkorn& Alleman, 1989) and they named it after the Paracassection the Paraca Floral Realm. This work waslater refined and published (Iannuzzi & Pfefferkorn,2002) showing that this belt existed between 30Úand 60Ú South on the Gondwana continent. TheParaca Floral Realm is characterized by (a) plantsthat can live only in a frost-free climate, (b) plantsthat migrated from the tropics, and (c) endemicspecies. A frost-free belt reaching 60Ú southindicates an interval of strong greenhouse conditionson Earth. It is important to note that the next geologicstage, the Serpukhovian or Namurian A, saw thebeginning of the Carboniferous icehouse world. Thus,the flora of Paracas tells an important story aboutclimate change and it took the decade long study ofthis flora in this section to recognize this situation.

CONCLUSIONS

The importance of long-term studiesAll previous paleobotanical studies of the La Minasection had been short-term affairs. Somebody, often

a geologist, had collected material for a few hours ora few days and shipped it to a paleobotanist. Resultson single species could be achieved but it wasimpossible to develop a coherent picture or solve themost important questions. Only the systematic workof our group that lasted in the beginning for a montheach year could begin to accumulate enough goodmaterial to be able to address these questions. Weemployed different methods of collecting andobserving, building in each successive stage on theresults of the earlier one. This is an example of thevalue and necessity of long-term studies.

Why study paleobotanyReconstructing 320 million year old plants, landscapesand climates sounds exotic and interesting but thequestion might arise what the relationship is to ourlives and why we should study it. The first answer isthat basic research is concerned with answering allquestions that arise. At the time basic research isdone there is normally just curiosity and applicationsor importance of the answer might not be knowableat all. However, this curiosity driven science hasturned out to be highly applicable and needed at alater time. In other cases the results of curiositydriven sciences have opened insights into othercurrently critical areas. Actually, the countries thathad the highest support for basic science bothfinancially and in terms of esteem given to its pursuithave shown the most dramatic advances in theireconomy.If we ask what the study of paleontology cancontribute to our current life, three short points willdemonstrate its importance. (1) «Civilization existsby geological consent – subject to change withoutnotice» (attributed to the philosopher Will Durant).All cultures can only exist within the framework setby Earth systems and the current state of Earthsystems is the result of 4.5 billion years of Earthhistory. Thus, we have to understand Earth systemsand their evolution in deep time to understand ourown current position. The next points are specificexamples. (2) When paleontologists analyzed theconsequences of the very large meteorite impact onthe Yucatan Peninsula 65 million years ago theydiscovered an impact winter that lasted years withdeadly consequences for life everywhere on Earth.Soon it became clear that similar worldwideconsequences would follow an attack with atomicbombs. This lead the two largest nations to negotiate,reduce their stockpile of atomic weapons andprincipally give up on the idea of atomic war. Thus,the result of a curiosity driven question lead toconsequences that are of benefit to all mankind. (3)Global warming is of great concern to all of us. How

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will the climate change? How will vegetation andthat means agriculture change? Only the study ofclimate changes that have happened on Earth beforecan teach us what to expect. Thus, the studies offossil plants have direct applicability to the predictionsfor the future of mankind. (3) Our findings in theParacas section demonstrate that extreme conditionscan exist close to each other in geologic time. In thiscase a greenhouse time just before the onset of anicehouse time with glacial and interglacial times similarto our current climate state. The obvious questionabout the speed with which these changes occur canonly be answered by further research.

Thanks and outlookWe would like to thank the participants of the open-air lecture for their interest and their excellentquestions. We will be happy to answer furtherquestions by e-mail or in person. Many of thequestions might be answered by our previouspublications that are available as PDFs on our webpages or by those that we will put onto the Internet

shortly. Other questions might be answered bypublications we have in preparation. Some of thesewill appear in the near future.

REFERENCES

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PFEFFERKORN, H.& V. ALLEMAN 1989 Newclimatic Belt in Carboniferous of SouthernHemisphere. Abstracts 28 th InternationalCongress, Washington 2 -3: 2-602.

Paracas Peninsula, south: general sight to the access at the Carboniferous outcrop (photo J.Yovera).

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Field research group with section «La Mina» on the background.

Tree-lycopsid Tomiodendron peruvianum (Gothan, 1929) Pfefferkorn & Alleman comb. nov.

(in press), in situ , «Playa La Mina».

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Tree-lycopsid «Cyclostigma» pacifica Steinmann, 1929

on the beach, «Playa La Mina».

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MORFOLOGIA DEL APARATO BUCAL EN Hypostomus aculeus e Hypostomus pyrinensi(PISCES, SILURIFORMES, LORICARIIDAE)

Ruth Dueñas Peralta1

RESUMEN

Se describió aquí las características morfológicas del aparato bucal de dos especies simpátridas y sintópicas de«carachamas» de la familia Loricaridae (Hypostomus aculeus e H. pyrinensi), del rio Huallaga, Tingo Maria,Huanuco. Por la forma bucal en diamante y sus dientes robustos y fuertes en H. aculeus le permite raspar enel substrato y se alimentaría de partículas grandes. Sin embargo, en H. pyrinensi se alimentaría de partículasmuy finas y por succión ya que sus dientes son pequeños y débiles.

Palabras Claves: Aparato bucal, Loricaridae, Hypostomus aculeus e Hypostomus pyrinensi.

SUMMARY

Buccal morphology of Carachaza of the Loricaridae Family (Hypostomus aculeus e H. pyrinensi) from rioHuallaga, Tingo Maria, Huanuco were described here. By the buccal form in diamond and its robust and strongteeth in H. aculeus allows it to scrape in the substratum and it would be fed on great particles. Nevertheless, inH. pyrinensi would be fed on very fine particles and by suction because their teeth are small and weak.

Key words: Buccal apparatus, Loricaridae, Hypostomus aculeus e Hypostomus pyrinensi.

INTRODUCCION

Alexander (1965), Schaefer & Lauder (1986) yGeerinckx et al. (2007) mensionaron que los pecesde la familia Loricariidae son muy especiales porquepueden replegar su labio inferior contra de la caraventral de la cabeza, de tal forma, que los dientesson dirigidos hacia el sustrato y así poder alimentarse,principalmente de algas y detritus.Esta actividad pone al descubierto una variaciónmorfológica bucal. Asi, Delariva & Agostinho (2001),analizaron la cavidad oral y dientes de seis especiesde la familia Loricariidae (Rhinelepis aspera,Megalancistrus aculeatus, Hypostomus regani, H.microstomus, H. ternetzi e H. margaritifer)observando la cavidad oral en R. aspera servía paraingerir finos sedimentos asociados a sus dientespequeños y cónicos, sin embargo, M. aculeatus, H.microstomus e H. margaritifer, tienen dientes largosy espatulados con el arco dental en forma de rombo,el cual, le permite raspar superficies duras. En H.regani e H. ternetzi tienen labios y arcos dentarios

en forma de semi-luna con dientes delgadosapropiados para el raspado de las partículas máspequeñas que se encuentran en las superficies. Lavariabilidad de formas de dientes en Hypostominaey Ancistrinae se ha ido observando desde el desarrolloontogénico, lo que permite agruparlos en especieshermanas (Muller & Weber 1992).En el presente trabajo se describió las característicasmorfología del aparato bucal de dos especiessimpátridas y sintópicas de Loricariidae (Hypostomusaculeus e Hypostomus pyrinensi), del río Huallaga,Tingo Maria, Huanuco. El material estuvo depositadoen el Museo de Historia Natural de la UniversidadRicardo Palma – MHNURP: Hypostomus aculeus(MHNURP 75-84) e Hypostomus pyrinensi(MHNURP 68-70). El análisis del aparato bucal decada especie se hizo bajo la técnica de coloraciónAzul Alcian – Rojo de Alizarina (Dingerkus & Uhler,1977) para tener un mejor contraste.

Morfología de Hypostomus aculeusPosición y forma de la boca

1 Museo de Historia Natural – Universidad Ricardo Palma. Av. Benavides 5440, Las Gardenias, Lima 33, Perú[email protected]

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Presenta la boca en posición ventral, labios en formade ventosa. Labio superior menos desarrollado queel inferior y presenta una barbilla a cada lado; amboslabios son carnosos y posee papilas adhesivas, conel cual puede adherirse al substrato; boca en formade embudo. (Fig. 1A).DientesLas mandíbulas forman un ángulo 43º. Cadamandíbula presenta dos filas de dientes dispuestosen forma de «V» (Fig. 1A), cada fila posee 10 dientes,no se observaron diferencias en la forma de losdientes, a excepción de los dientes laterales que sonmás pequeños. Los dientes maxilares son ordenadosen una fila formando una estructura muy parecida aun rastrillo, los dientes son robustos, unicuspides (Fig.1B). Las coronas de los dientes son curvados y enforma de cuchara (Fig. 1C).

Morfología de Hypostomus pyrinensiPosición y forma de la bocaPresenta la boca en posición ventral, labios en formade ventosa. Labio superior menos desarrollado queel inferior y presenta una barbilla a cada lado; amboslabios son carnosos y posee papilas adhesivas, conel cual puede adherirse al substrato; boca en formade embudo. (Fig. 2A).DientesCada mandíbula presenta dos filas de dientes, cadafila posee aproximadamente 46 dientes, no seobservaron diferencias en la forma y tamaño de losdientes. Los dientes maxilares de Hypostomuspyrinensi, son ordenados en una fila formando unaestructura muy parecida a un rastrillo. Las coronasde los diente son recta, más delgada y corta y tieneforma de espátula (Fig. 2B). Dientes delgados, lacorona presenta una cúspide principal grande, al ladouna bicúspide lateral pequeña (Fig. 2C).

DISCUSION

Ambas morfologías, boca y dientes, facilitan laadquisición de alimento; estas estructuras determinanla forma en la cual la especie toma el alimento.El desarrollo de las valvas orales y el ancho de lacavidad de la boca de Hypostomus pyrinensi, facilita

la ingesta de finas partículas de sedimento haciendouso de la succión. H. pyrinensi probablemente noraspa arduamente el substrato, porque tiene dientesen forma de espátula, rectos, pequeños y algo débiles,mientras que Hypostomus aculeus, presenta lasvalvas orales y la cavidad de la boca en forma dediamante probablemente para la ingesta de partículasno muy finas haciendo uso de los dientes, los cualesson robustos y duros; presentan la corona del dienteen forma de cuchara lo cual le facilita raspar en elsubstrato duro.

LITERATURA CITADA

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DELARIVA R. L. & A. A. AGOSTINHO. 2001.Relationship between morphology and diets ofsix neotropical loricariids. Journal of FishBiology 58: 832-847.

DINGERKUS G. & L. UHLER. 1977. Enzymeclearing of alcian blue stained whole smallvertebrates for demonstration of cartilage. StainTechnology. 52: 229-232

GEERINCKX, T.; DE POORTER J. & D.ADRIAENS. 2007. Moorphology andDevelopment of Teeth and Epidermal Brushesin Loricariid Catfishes. Journal of Morphology.268: 805-814.

MONTEIRO, A. C.; CASTELO, C. W. & V.GUIMARÃES. 2005. Estudo da dieta natural depeixes no reservatório de Ribeirão das Lajes, Riode Janeiro, Brasil. Acta de la Sciedade deBiologia 27: 355-364,

MULLER, S. & C. WEBER. 1992, Les dents desous-families Hypostominae et Ancistrinae(Pises, Siluriformes, Loricariidae) et leer valeurtaxonomique. Rev Suisse Zool 99: 747-754.

FIGURAS

Fig. 1.- A: Vista del disco bucal de Hypostomus aculeus, que presenta 2 pares filas de dientes dispuestas en forma de «V»,con aproximadamente 10 dientes en cada fila. B: La corona del diente presenta forma de cuchara, todos los dientespresentan la misma forma, a excepción de los laterales que son más pequeños. C: Esquema de la corona del diente deHypostomus aculeus. Barra = 4 mm.

Fig. 2.- A: Vista del disco bucal de Hypostomus pyrinensi, que presenta 2 filas de dientes por mandíbula, con aproximadamente46 dientes cada fila. B: La corona del diente presenta forma de espátula, con una cúspide grande al lado de una bicúspidelateral pequeña; todos los dientes presentan la misma forma y tamaño. C: Esquema de la corona del diente de Hypostomuspyrinensi. Barra = 7 mm.

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CORONA

Bicúspide Lateral

B

C

Cúspide principal

FIGURA 1

A

CB

CORONAS

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CUIDADO PARENTAL A UNA ESCUELA DE RENACUAJOS EN Leptodactylus petersii(STEINDACHNER, 1864) (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) EN LA AMAZONIA PERUANA

Víctor R. Morales1

Caroll Landauro1

Reginald B. Cocroft2

RESUMEN

El cuidado parental es la actividad de cuidar a los neonatos o crías por parte de la madre, el padre o ambos. Estaactividad que no es tan común en anfibios la realizan algunas familias con diversas modalidades. Se observó elcuidado parental de una hembra de Leptodactylus petersii a una escuela de sus renacuajos en un pantanotemporal en la amazonia sur del Perú. La hembra realizaba movimientos de llamado para formar la escuela y lasiguiera, sin embargo, estos permanecían, a veces, inmóviles y no acataban el llamado de la hembra.

Palabras claves: Cuidado parental, Leptodactylus petersii, renacuajos.

SUMMARY

Parental care is the activity to care for the newborns or young for the mother, father or both. This activity thatis not than common in amphibians but some families do it with different modalities. We observed parental careof Leptodactylus petersii female to a school of her tadpoles in a temporary swamp in the South Amazonia ofPeru. The female made call movements to form the school and follow her; nevertheless, they sometimes remainedinmovables and did not obey the call of the female.

Key words: Parental care, Leptodactylus petersii, tadpoles.

1 Museo de Historia Natural, Universidad Ricardo Palma, Av. Benavides 5440, Apartado Postal 18-01, Urb. Las Gardenias,Surco, Perú.

2 Division of Biological Sciences, University of Missouri-Columbia, Columbia, MO, 65211, USA.

INTRODUCCION

La actividad de cuidar a los neonatos o crías por lamadre o el padre o por ambos es lo que se denomina«cuidado parental». Entonces, el cuidado parental enanfibios no es tan diverso como en el caso de aves ymamíferos. A pesar de la poca diversidad de cuidadoparental en anfibios, muchas familias realizan estaactividad de forma más compleja. (McDiarmid,1978).Así, se conocen diversas modalidades de cuidadoparental en anfibios, como es el caso de proteger alas larvas en espuma (Ej. la mayoría deleptodactílidos); llevar a las larvas en la espalda (Ej.

los dendrobátidos); depositar los huevos en unamarsupia dorsal (Ej. algunos hílidos); tragarse loshuevos y estos se desarrollen en el estomago (Ej.algunos Racophoridos); poner los huevos en gelatinasobre las hojas u otro sustrato (Ej. algunos hílidos,leptodactílidos y bufónidos ) y mantener las larvasagrupadas en una escuela (Ej. algunos leptodactílidose hílidos). Esta última modalidad es una actividad raraen anfibios, ya que, solo algunas especies la realizancomo el caso de Leptodactylus bolivianus, cuyaescuela de renacuajos formaron un paquete densocon individuos orientados en la misma dirección yfueron guiados con movimientos lentos de la hembraque hizo en el agua (Well y Bard, 1988). EnLeptodactylus ocellatus la hembra permaneció con

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la escuela en todo su desarrollo, acompañándolos díay noche hasta la metamorfosis (Vaz- Ferreira yGehrau, 1975). A parte de los leptodactílidos, en lafamila Hylidae también se reporta la modalidad deformar escuelas, como el caso de Hyla semilineatafue muy común observar escuelas de renacuajos tantoen el estado natural como en cautiverio y presentotres tipos de escuelas: densas, débiles y desplazadas(Heursel y Haddad, 2002). La escuela de Xenopuslaevis tiene mas organización, ya que, los renacuajosemplean su visión y reconocer las lineas laterales desus vecinos y así los renacuajos se mueven en paralelo(Katz et al. 1981). Sea ha sugerido que la modalidadde que algunas especies hagan escuelas de renacuajosfue como un comportamiento de protección antidepredador (Wassensug, 1873 y Waldman, 1982).En el presente trabajo reportamos un comportamientode cuidado parental de una hembra de Leptodactyluspetersii a una escuela de renacuajos.

MATERIAL Y METODOS

Se observo el cuidado parental sobre la escuela derenacuajos de Leptodactylus petersii en un pantanotemporal a 500 m, aproximadamente, sobre la trochaLaguna Chica del área del Albergue de Explore´s Inn,en la Reserva Nacional de Tambopata, Provincia deTambopata, Departamento de Madre de Dios. Seobservaron cinco hembras de L. petersii, cada unacon sus respectivas escuelas, durante la noche (20:00a 22:00 horas) entre el 4 y 5 de diciembre de 1990.

RESULTADOS

De las cinco hembras con escuela, solamente sedescribió el comportamiento de una hembra; ya queal mismo tiempo las otras hembras también hacíansus movimientos estereotipados de guiar a lasescuelas.Así, el 4 de diciembre se observo el comportamientode la hembra A con su escuela (Fig. 1) durante unahora y 15 minutos. (1) 20:45 horas la escuela semovió de 3 a 4 m hacia el punto dos después que lahembra hizo cuatro movimientos; (2) 20:51 hrs. la & hace 8 golpes y se movió 6 cm, allí tanto la escuelacomo la hembra se quedaron inmóviles; (3) a las 21:04la & da un aviso y los renacuajos se escondieron yse alojaron, no hubo un movimiento de llamado; (4) alas 21:09 la no hace nada y los renacuajos seacercaron de 6-8 cm. de ella; (5) a las 21:11, la ataco a un insecto acuático; a las 21:15 no se visualizaa la escuela; (6) a las 21:18 se acerca otra , y laprimera hizo 14 golpes, moviéndose 1 cm.; (7) a las21:22, la da otra señal de aviso, haciendo 5 golpes yluego golpes de 2 en 2; a las 21:24 hay mas señales

de aviso, con golpes entre débiles y fuertes queduraron 4.3 segundos, recuperando así a la escuela;a las 21:25 la da otro aviso y los renacuajos otra vezse juntaron a ella; (8) a las 21:26 la se mueve 3cm.; (9) a las 21:30 hubieron golpes entre débiles yfuertes, y los renacuajos no se movieron, la avanzade 7-8 cm.; (10) a las 21:33 hubieron 5 golpes hechospor la que luego volteo y los renacuajos se acercana 4 cm. de ella, luego esta se va.; a las 21:47 la sale;(11) a las 21:50 hace 2 golpes alejándose 10 cm.;(12) dos minutos después – 21:52 0- se aleja 30 cm.;(13) y dos minutos mas tarde regresa 10 cm., y losrenacuajos están en un solo lugar; (14) la hace otroscinco golpes entre cortos y largos para luego volteary los renacuajos no se movieron; (15) a las 21:57 losrenacuajos se acercan a la y esta hace 7 golpes yluego golpes entre débiles y fuertes, haciendo que losrenacuajos se acerquen 10 cm.; (16) los renacuajosse dispersan alrededor de ella y cuando esta semueve, los renacuajos vuelven a formar la escuela; alas 22:01se realizan 7 golpes y otros mas entre débilesy fuertes, los renacuajos están 10 cm. dispersos de la, luego esta se mueve y los renacuajos se juntan;(17) a las 22:04 la se acerca 3 cm. de la escuela,haciendo golpes entre débiles y fuertes, moviéndosea 15 cm. y los renacuajos no se movieron; (18) a las22:08 otra vez hace 6 golpes; a ;las 23:24 la escuelase acerca a 30 cm. de ella; cuatro minutos mas tardela da otra señal de aviso haciendo 19 golpes,moviéndose 4 cm., luego hace 3 golpes mas, nadahacia los renacuajos y se aleja de ellos 10 cm.El tercer día de investigación 15/12/1990, a las 18:51una 6 se acerca a la escuela de 8-10 cm.; a las19:06 la junto a la escuela, esta ultima se mueve 10cm. +/- por 2 minutos, los renacuajos siguen el caminode la ; a las 19:14 la se mueve para comer y laescuela se mueve a 2 cm. de ella.A las 22:02 una en una 1o frecuencia se aleja 10cm. de la escuela, en una 20 frecuencia, se aleja 2cm., en la 30 se aleja 3 cm.; a las 22:10 en una 10

frecuencia la escuela se acerca 6 cm. de la , en la20 frecuencia la escuela se agrupa y se acercan a la.A las 22:15 en una 30 frecuencia los renacuajos seacercan rápido a la , en la 40 frecuencia la escuelase agrupa y se acerca a 5 cm. de la .A las 22:22 la escuela se movió 6 cm.; en una 50 losrenacuajos se acercaron de 4-5 cm. de la , en la 60

los renacuajos se acercaron la misma distanciaagrupados, en la 70 la escuela agrupada se acerco 5-6 cm. de la ; en la 80 la escuela se acerco 10 cm., enla 90 se acerco 20 cm. y ya estaba agitada, en una100 la escuela se acerco 15 cm. de la , en la siguientefrecuencia esta se acerco 30 cm., moviéndose haciael lado de la ; en la 120 la escuela se acerco 10 cm.,

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acercándose por debajo de la hojarasca; en la 130 laescuela se acerco 20 cm. de la , quedándose intactosy en la 140 la escuela se volvió a acercar 10 cm.

DISCUSIÓN

La funcion del comportamiento en la escuela derenacuajos ha sido discutida por varios autores(Wassersug, 1973; Waldman, 1982, Guilford, 1988) ylas ventajas más probables para este comportamientofacilitarían la adquisición del alimento y disminuiría elriesgo de depredación.La escuela de renacuajos de Leptodactylus petersiiformaron escuela en determinados momentos, perola mayor parte del tiempo los renacuajos permanecíaninmóviles o seguían a la hembra sin coordinación detiempos, como si lo hay en Leptodactylus bolivianus(Well y Bard, 1988). Entonces, el comportamientoen L. petersii indica que la escuela formada no erapolarizada y durante toda la observación realizadaestos no eran obedientes y se acercaban a la hembrapocas veces. Esto puede deberse a que en ese díahabían cinco hembras con escuelas y la incidenciade depredadores fue muy baja.Este reporte da a entender que las hembras realizabanmovimientos de llamado, a lo que la escuela sentíaeste llamado y seguía a la hembra en un acto deobediencia como en H. semilineata (Heursel yHaddad, 2002) y L. bolivianus (Well y Bard, 1988),no obstante la escuela de Leptodactylus petersii noacataban los movimientos de llamado de la hembra,por lo que esta se alejaba y los renacuajos no siemprela seguían.

AGRADECIMIENTOS

A Max Günter, por permitirnos la estancia en elalbergue Explorer Inn para la realización de este

trabajo. A Mercedes Gonzáles, directora del Museode Historia Natural de la Universidad Ricardo Palma,por la ayuda en las investigación.

LITERATURA CITADA

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Figura 1.- Desplazamiento de la hembra (línea sólida) y de la escuela de renacuajos (línea puntiaguda) deLeptodactylus petersii durante el cuidado parental. Los números en círculo son las estaciones de movimientode la hembra; las letras son las estaciones de movimiento de la escuela de renacuajos. Para cada estación de lahembra se asocian los movimientos de señales que hace ésta; la distancia de desplazamiento de la hembra sedetalla entre cada estación (explicación dentro del texto).

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PROTRUSION DE LA ABERTURA BUCAL EN Atherinella serrimover(TELEOSTEI, ATHERINIDAE)

Pamela Olaechea1

RESUMEN

Se describe el diseño estructural involucrado en la apertura bucal del pejerrey brillante (Atherinella serrimover),para entender el mecanismo utilizado por la especie para la captura de alimento y tomando en cuenta su diseñoestructural, forma de desplazamiento de los huesos involucrados y grado de protrusión premaxilar. Se comparocon otros modelos de Atherinidae. Por lo evidenciado, se situó a la especie como succionadora-masticadora, locual le da la posibilidad de ajustar dicho mecanismo a las características y condiciones de las presas.

Palabras claves: Atherinidae, mecanismos alimentarios, protrusión premaxilar.

SUMMARY

The involved structural design in the buccal opening of the «shining pejerrey» is (Atherinella serrimover)described, to understand the mechanism used by the species, for the capture of food and about of its structuraldesign, form of displacement of the involved bones and degree of premaxilar protrusion. It mechanism wascompared with other models of Atherinidae. By the evidenced, it was placed as species like succionadora-masticadora, which it gives the possibility of fitting to this mechanism to the characteristics and conditions of theprey.

Key Words: Atherinidae, feeding mechanism, premaxilar protrusion.

1 Museo de Historia Natural, Universidad Ricardo Palma, Av. Benavides 5440, Apartado postal 18-01, Las Gardenias,Surco, Lima, Peru. [email protected]

INTRODUCCIÓN

La diversidad de sistemas de locomoción yalimentación en varios animales es muy extensa, perose conoce poco acerca de la integración evolutivade estos sistemas, principalmente en peces que nadane ingieren presas a la vez (Higham et al, 2006). Losestudios de la relación entre la forma de lasestructuras y la realización de una actividadespecífica, han sido de fundamental importancia enla comprensión del diseño en relación al medio.(Dullemeijer, 1974; Dullemeijer & Barel, 1997). Enpeces, los estudios se han centrados principalmenteen el análisis de los mecanismos de captura eingestión de alimentos, que han permitido entenderel significado de las adaptaciones estructurales yfuncionales en relación a las especializaciones

tróficas.(Anker, 1978; Laudery, 1981; Liem, 1979,1980; Osse, 1969: Otten, 1982; Sibbing, 1982).Es conocido que los depredadores pueden modificarsu cinemática en respuesta al tipo de presa (Coughlin& Strickler, 1990; Norton, 1991; Van Wassenberghet al, 2006), incluyendo una rápida expansión bucalcuando las presas son evasivas.(Coughlim &Strickler, 1990; Wainwright et al, 2001). Lascaracterísticas de los movimientos de una estructuraestán determinadas por la configuración estructuraldel sistema y por la localidad funcional del sistemamuscular. (De la Hoz, 1994)Así, en estudios realizados con 3 géneros deAtherínidos: Cauque, Basilichthys yAustromenidia, se analizó el mecanismo de mordidapremaxilar a través de modelos cinemáticos, quepermitieron describir las características de los

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movimientos de piezas bucales, demostrándose que,en el caso de los géneros Cauque y Austromenidia,las trayectorias angulares del premaxilar y mandíbula,son semejantes y muestran un incremento develocidad del premaxilar, a medida que se aproximaa la posición de cierre, lo que denota que estos génerospresentan mayor especialización en relación a suscaracterísticas cinemáticas de mordida; mientras queen el género Basilichthys, el premaxilar se muevemuy poco en relación al desplazamiento de lamandíbula, y mantiene una velocidad angularconstante durante toda la trayectoria , lo que muestraque este género tiene una posibilidad de mordidarestringida.( De la Hoz, 1994)El presente trabajo explicará el modelo de aberturabucal y mecanismo de mordida en Atherinellaserrimover, un habitante del estuario marino-continental.

MATERIAL Y METODOS

Los ejemplares de Atherinella serrimover provienende la colecta realizada en el mes de enero de 2008en el estuario de Virrilá. Estuario marino conocasionales ingresos de agua continental aportadapor el río Piura, que esta ubicado en kilómetro 83 dela carretera Piura- Sechura, en la provincia deSechura, con una extensión de 25 Km.Los especimenes fueron fijados y preservados enformol al 10 %, para ser pasados, posteriormente, alalcohol de 70%. Para ver las estructuras óseas queestán asociadas con la cinemática de protrusion seutilizo la técnica de tinción Rojo-Azul enzimático(diafanización) propuesto por Dingerkus & Uhler (1997).

RESULTADOS

Bajo la técnica de diafanización se pone endescubierto que son tres huesos que intervienen enla cinemática de abertura de la boca en Atherinellaserrimover. Dentario: Posee dentario alto con láminadorsal posterior desarrollada y los dientes ocupanmenos de la mitad anterior del borde curvo deldentario (Fig. 1a).Premaxilar: Proceso ascendente largo y angosto,originado en el tercio anterior, extremo distalensanchado en una plaza laminar amplia (Fig. 1b).Maxilar: Con cabeza proximal bien desarrollada

DISCUSIÓN

Una mayor magnitud del desplazamiento de lospremaxilares en la protrusión determina unacapacidad de mordida en posiciones de abducciónmandibular mayores en algunas especies, y en otras,

la menos capacidad de protrusión limita la realizaciónde mordidas en posiciones más abducidas de lamandíbula. (De la Hoz, Cancino & Ojeda, 1994). Laacción de mordida con el premaxilar es un mecanismode alimentación y de apertura bucal más limitado,llevada a cabo mediante el movimiento relativo delpremaxilar con un punto del extremo postero-dorsaldel dentario. Para que este mecanismo sea ejecutado,es condición indispensable que el extremo anteriordel premaxilar esté en algún grado de proyección, esdecir adelantando al neurocráneo. (De la Hoz, 1994)En la especie estudiada podemos observar que suesquema estructural coincide con la configuraciónde géneros de Atherinidae como Cauque yAustromenidia , en las cuales el maxilar posee unacabeza proximal bien desarrollada, premaxilar largo,angosto y con una amplia placa laminar (Fig. 2a), eldentario es alto, con una lámina posteriordesarrollada. Estas características que les proveenalto grado de plasticidad y capacidad de modulacióndurante la mordida (apertura bucal).

En cuanto al mecanismo de apertura bucal deAtherinella serrimover observamos eldesplazamiento casi sincronizado (simultáneo o enmisma proporción) de los huesos maxilar y dentario,pero pareciendo no existir un eje de rotación entreambos, siendo la apertura bucal iniciada por elmovimiento del maxilar, que pasa el movimiento alpremaxilar y posteriormente se mueve el dentario,pero aparentemente por una función muscular, porno existir un eje de rotación (Fig. 2b.La mayor capacidad de protrusión es consecuenciade un diseño distinto del sistema de ligamentosrostrales. En grupos con estas características, seobserva la aparición de una conexión tendinosaadicional con el maxilar, lo que permite mayorindependencia de los movimientos del maxilar conrespecto a la mandíbula, de otro modo existiría unacoplamiento directo entre maxilar y mandíbula através del ligamento primordial. (De la Hoz, Cancino& Ojeda, 1994)También se evidencia la apertura bucal total,encontrándose en el máximo posible por lo quepodemos entender que la especie posee una ampliagama de posiciones en el sistema de mordida, ya que,en sistemas con un sólo patrón de mordida el gradode protrusión premaxilar no alcanza el máximoposible, como en el género Basilichthys. (De la Hoz,Cancino & Ojeda, 1994)Por las características observadas en la especieAtherinella serrimover, tanto en su esquemaestructural como en las características del mecanismode apertura bucal, vemos que coincide con el modelocinemático de De la Hoz & Vial (1994), en Cauque

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y Austromedinia que son succionadores-masticadores. Asi, el modelo que más se adecuaAtherinella serrimover es al género Austromedinia,en el cual el hueso dentario se encuentra ligeramentemas adelantado que el premaxilar, cuando el sistemase encuentra en la máxima protrusión, como enpejerrey brillante.

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AGRADECIMIENTOS

A Mercedes Gonzáles, Directora del Museo deHistoria Natural de la Universidad Ricardo Palma,por su apoyo en nuestras investigaciones. A Víctor

R. Morales por su constante ayuda y asesoramiento.

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FIGURAS

Fig. 1.- Huesos que intervienen directamente en la protrusion bucal de Atherinella serrimover. A) Huesodentario, B) premaxilar. No a escala.

Fig. 2.- Disposición de los huesos craneales y región oromandibular de Atherinella serrimover. A) disposiciónde los huesos en un estado de boca cerrada; B) disposición de los huesos el la protrusión bucal. No a escala.

FIG. 1

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FIG. 2

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de fermentos industriales con la capacidad deasegurar la calidad y estabilidad de los productos.Normalmente las bacterias que constituyen estosfermentos son especies determinadas y su actividadestá bien caracterizada. Actualmente las cepascomercializadas han sido aisladas a partir de la lecheo productos lácteos derivados y muy en particular delos cultivos iniciadores artesanales.

Un ejemplo claro son los géneros Lactobacillus,Lactococcus, Streptococcus, etc. que tiene lacapacidad de transformar el alimento, permitir unabuena conservación de los mismos y defenderlo en

BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS:BIOPRESERVANTE DE LOS ALIMENTOS

Tomás Agurto Sáenz1

Juan Carlos Ramos Gorbeña1

1 Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencias biológicas. Universidad Ricardo [email protected], [email protected]

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RESUMEN

Las bacterias lácticas son un grupo representativo de microorganismos que tienen la capacidad de realizartransformaciones alimenticias relacionadas con las fermentaciones, además de ser capaces de sintetizar unaserie de metabolitos importantes como ácido láctico y péptido de cadena corta con actividad antimicrobianadenominadas bacteriocinas, utilizadas en beneficio del hombre. Las BAL están siendo ampliamente utilizadasen la industria de los alimentos para prolongar el tiempo de durabilidad del mismo, así como también preservandoy transformando las características organolépticas y calidad microbiológica del producto alimenticio debido a suacción antagónica frente a los microorganismos deterioradores de los alimentos.

Palabras claves: Bacterias ácido lácticas; Ácido láctico; Bacteriocinas; Fermentación; Glucolisis

SUMMARY

The lactic bacteria are a representative group of microorganisms that have the capacity to realize nutritionaltransformations related to the fermentations, besides being able to synthesize a series of important metaboliteslike lactic acid and peptide of short chain with antimicrobial activity denominated bacteriocinas, used to thebenefit of the man. The BAL are widely being used in the industry of foods to prolong the time of durability ofthe same, as well as preserving and transforming the organoleptic characteristics and microbiological quality ofthe nutritional product due to their antagonistic action in front of the deterioradores microorganisms of foods.

Key words: Lactic bacteria acid; Lactic acid; Bacteriocin; Fermentation; Glycolisis

INTRODUCCIÓN

Desde hace muchos años el hombre utiliza lasbacterias lácticas para la conservación de susalimentos. Tal vez el descubrimiento de su acciónsobre la leche fue probablemente accidental pero suutilización se hace permanente en la actualidad enforma de cultivos iniciadores o cepas.Las bacterias lácticas y otros microorganismosresponsables de las transformaciones alimenticiasfueron desconocidos y el éxito de estas operacionesalimentarias estaba sometido a errores y aciertos.Ya con el desarrollo de la industria, en particular laindustria alimentaria, se ha llevado a la producción

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particular contra el deterioro de otrosmicroorganismos.

HISTORIA DE LA FERMENTACIÓN

El procesamiento moderno de los alimentos dependede una tecnología preservativa que asegure quealimentos se encuentran mantenidos en un aceptablenivel de calidad, desde la fecha de producción hastasu posterior consumo.Una de estas antiguas tecnologías es la fermentación,un proceso que depende solo de la actividad biológicade los microorganismos para producir una líneadiversa de metabolitos que puedan suprimir elcrecimiento y supervivencia de la microfloraindeseable en los productos alimenticios.La fermentación como una de las técnicas depreservación de los alimentos ha dejado huella desdehace miles de años. Considerando que el arte defabricar queso fue desarrollado hace más de 8000años en la fértil Cresent entre los ríos Tigres yEufrates en Iraq, en el tiempo en que plantas yanimales fueron domesticados (Fox, 1993). Despuésla fermentación alcohólica se involucro en laelaboración de cerveza y vino aunque el desarrollofue durante el periodo 2000 a 4000 aC con losEgipcios y Sumarios. Los Egipcios tambiéndesarrollaron la fermentación de la masa en laelaboración del pan. Si bien las fermentaciones fueronexplotadas como un método para la preservación delos alimentos y bebidas hace miles de años, estostuvieron reconocimiento recientemente como losresponsables de los procesos fermentativos.La pasteurización desarrollada en 1861 y al principio,el papel de los microorganismos en los procesosfermentativos fue reconocida. Coincidentemente estofue durante la revolución industrial y el resultado dela concentración de las poblaciones en las grandesciudades. Por consiguiente un dramático cambiosurgió en la producción de alimentos, se hacíanecesario para las comunidades locales, la produccióna gran escala de alimentos. La necesidad deexpandirse a mercados más distantes demandaba laimperiosa necesidad de contar con una gran cantidadde productos alimenticios de calidad y duraderos. Estaventaja transformó el desarrollo de los procesosfermentativos a gran escala para la produccióncomercial de alimentos fermentados y bebidasalcohólicas con el más variado uso demicroorganismos incluyendo levaduras para laproducción de vino, cerveza y alcohol, y las bacteriaslácticas (LAB) para una variedad de fermentacionesde lácteos, carnes, pescados y vegetales.En cada caso, la materia prima para los alimentos ybebidas proveía los sustratos para la formación de

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una línea de metabolitos microbianos que contribuíana extender el tiempo de vida y la calidad del producto.La producción moderna a gran escala de alimentosy bebidas fermentadas depende casi enteramente deluso de cepas iniciadoras definidas que reemplazan alas tradicionales cepas mixtas indefinidas utilizadasen la elaboración de estos productos.Este cambio de cepas pretende que el desempeñodel cultivo, la calidad del producto y su consistenciay su estandarización tienen que ser los mejores.El nexo entre la fermentación y la preservación es labiopreservación, que se refiere a extender el tiempode vida útil y mejorar la seguridad de los alimentosutilizando microorganismos y/o sus metabolitos. Eneste caso es sabido que los microorganismosiniciadores pueden producir una amplia línea decomponentes antimicrobianos o sustanciasproteínicas que puedan inhibir o reducir la florabacteriana indeseable en los productos alimenticios.

PRESERVACIÓN DE ALIMENTOS

Las bacterias lácticas tienen roles importantísimosen la producción de alimentos fermentados y algunasde estas bacterias muestran la capacidad de inhibirel crecimiento y desarrollo de una amplia variedadde microorganismos indeseables en los alimentos.Las fermentaciones alimentarias han sido practicadasdesde hace miles de años con resultados de teneruna amplia variedad de alimentos fermentadosderivados de la leche, carne, pescado y vegetales.En cada caso, los procesos fermentativos involucranla oxidación de los carbohidratos para generar ungrupo de productos los cuales son generalmenteácidos orgánicos, alcohol y CO2 (Ray y Daeschel,1992).Tales productos tienen un efecto preservantelimitando completamente el crecimiento de losmicroorganismos patógenos y deterioradores de losproductos alimenticios. Además un número deproductos ejerce un efecto sobre la calidad de losalimentos produciendo componentes que resaltan elsabor como es el caso del diacetilo y acetaldehídos,así como también componentes que tieneimplicaciones positivas para la salud como es el casode las vitaminas, antioxidantes y péptidos bioactivos(bacteriocinas). (Cuadro 1).La acción preservante de las cepas iniciadoras enlos sistemas de alimentos y bebidas es atribuida a laacción combinada de una línea de metabolitosantimicrobianos producidos durante los procesosfermentativos (Vuyst y Vandamme, 1994; Caplice yFitzgerald, 1999).Estos incluyen algunos ácidos orgánicos como porejemplo el ácido láctico, acético, propiónico y ácidos


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En 1920, Orla – Jensen, clasifico las bacterias lácticasen dos grupos según sus características bioquímicas:Las homofermentativas y las heterofermentativas.Las bacterias heterofermentativas no tienenfructuosa-difosfato-aldolasa y por lo tanto, degradanlos glúcidos por la vía denominada pentosas fosfatoso hexosas fosfatos.La vía homofermentativa sintetizan dos moléculasde ATP por cada molécula de glucosa, mientras quepor la vía heterofermentativa solo se sintetiza unamolécula de ATP.

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIASLÁCTICAS

Las interacciones establecidas entre las bacteriaslácticas y los alimentos llamaron la atención de loscientíficos como de Louis Pasteur quien en 1857demostró que los procesos fermentativos ibanacompañados invariablemente del desarrollo demicroorganismos y que cada tipo de fermentaciónestaba asociado a un tipo específico demicroorganismo. Posteriormente, Lister, en 1873 aislóel primer cultivo puro de un microorganismos al cualdenomino Bacterium lactis. En 1884, Hueppedescribió por primera vez la microflora responsablede la acidificación y coagulación de la lechedenominándola «Milchsauerbacillus», y Weigmamnen 1899 propuso el término «Bacterium acidilactici»para estos microorganismos.A principios del siglo XX el empleo de lactobacilosen la alimentación humana cobro un enorme interés,a raíz de la propuesta realizadas por Elie Metchnikoffdel Instituto Louis Pasteur de Paris de promover suutilización en la dieta como un agentebacterioprofiláctico y bacterioterapéutico (Bibel,1988).El habitad natural de las bacterias lácticas son losvegetales, que por un proceso de adaptación han idocolonizando otros sustratos que reúnen lascondiciones necesarias para su desarrollo. Algunasbacterias lácticas bien en asociación con los vegetalesy desarrollan a expensas de los nutrientes liberadostras la muerte y descomposición de los tejidosvegetales, también se encuentran en los encurtidos,la col ácida, el pienso, los productos de panadería, lacerveza, el vino y los zumos de frutas. Otro nichoecológico es la leche a la que llegan a través delcuerpo de la vaca, el estiércol y los vegetales, poreso que se encuentran íntimamente relacionados condiversos productos lácteos fermentados. Otro grupode bacterias lácticas se encuentra formando partede la flora bacteriana normal del cuerpo del animal ytambién en el tracto gastrointestinal y mucosas, porlo que se encuentra asociado a la carne y productos

producidos como producto final que proporciona unaacidificación medioambiental desfavorable para elcrecimiento de algunos microorganismos patógenosy deterioradores de los alimentos.Los ácidos ejercen su efecto antimicrobiano eninterferencia con el mantenimiento del potencial demembrana celular, inhibiendo el transporte activo,reduciendo el pH intracelular e inhibiendo unavariedad de funciones metabólicas (Doores, 1993).Es por eso que tienen una amplia acción inhibiendotanto a bacterias grampositivas como gramnegativas,así como también levaduras y mohos (Blom yMortvedt, 1991; Caplice y Fitzgerald, 1999).Obviamente cada componente antimicrobianoproducido durante la fermentación proporciona unobstáculo adicional a los microorganismos patógenoso microorganismos deterioradores de los alimentosque puedan sobrevivir o proliferar en los alimentos ybebidas, desde de la fecha de producción hasta suconsumo.Entonces algún microorganismo puede producir unnúmero de sustancias inhibitorias, estos potencialesantimicrobianos están determinados por la accióncolectiva de estos productos metabólicos sobre lasbacterias indeseables. Otros metabolitos secundariosproducidos por LAB que presentan actividadantagonista incluyen al compuesto Reuterin (Axelssonet al., 1989; Chum et al. 1989, Talarico y Dobrogosz,1989) y el descubrimiento del antibióticoReuterocyclin (Ganzle et al., 2000; Holtzel et al.,2000) ambos compuestos producidos por cepas deLactobacillus reuteri, tienen un amplio expectro deactividad inhibitoria sobre hongos, protozoo y una líneaextensa de bacterias grampositivas y gramnegativas.

LAS BACTERIAS LÁCTICASGENERALIDADES

Las bacterias de las fermentaciones alimentarias songrampositivas, presentan forma de cocos y/obastoncitos, son catalasa negativas (-), sintetizan suATP de la fermentación láctica de los glúcidos, elácido láctico es el único producto final que producen(homofermentativos) y en otras ocasiones puedenproducir etanol, CO2 y acetato (heterofermentativos).Las bacterias lácticas son generalmenteaerotolerantes, existiendo anaerobias estrictas comolas que se encuentran en el intestino de los animales.Incluso en presencia de oxígeno no son capaces dellevar a cabo las fosforilaciones oxidativas, lo queestá muy relacionado con su incapacidad parasintetizar citocromos y enzimas del grupo hemo. Sinembargo, gracias a las flavoproteínas, oxidasas operoxidasas, pueden realizar limitadas oxidaciones nofosforilantes.

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cárnicos. Finalmente algunas otras bacterias lácticashan sido aisladas a partir del pescado, del estiércol yaguas residuales.En la edición de Bergey’s Manual of SistematicBacteriology» (1986), las bacterias grampositivas,de forma cocoide o bacilar, no esporuladas, anaerobiasfacultativas, catalasa negativa y productoras de ácidoláctico tras la fermentación de la glucosa seclasificaron en los géneros:• Lactobacillus• Erysipelotrhrix• Streptococcus• Pediococcus• Leuconostoc• Aerococcus• Gemella.

GÉNERO LACTOBACILLUS

El género Lactobacillus (Kandler y Weiss, 1986)incluían 45 especies dividida en tres gruposdependiendo de la presencia o ausencia de la fructosa1,6-difosfato aldolasa y fosfocetolasa, enzimas clavesdel proceso homofermentativos y heterofermentativode los carbohidratos respectivamente.Los Lactobacillus se caracterizan por ser célulasen forma de bastoncillos agrupadas en cadena,presentan una exigencia de nutrientes en los factoresde crecimiento, una acidificación de la leche más lentaque en el caso de los estreptococos perogeneralmente más intensa gracias a una mejorresistencia a los pHs ácidos (hasta pH 3.5) y a unaproducción más elevada de ácido láctico con unmáximo de 27 g/litro.Las especies del género Lactobacillus secaracterizan por la heterogeneidad de la composiciónde su ADN, el porcentaje (%) de su GC varia del 32al 53% (Kandler y Weiss, 1986ª).Este género clasificado originalmente por Orla –Jensen en 1919 en tres grupos:1. Thermobacterium: homofermentativos y termófilos2. Streptobacterium: homofermentativos y mesófilos3. Betabacterium: heterofermentativo, ya sea

mesófilo o termófilo

Los resultados de la taxonomía molecular, ladeterminación del tipo de PTG (peptidoglicano), laspropiedades de ciertas enzimas como la LDH (lactatodeshidrogenasa), la determinación del isómero delácido láctico (Botazzi, 1988), el crecimiento delgenoma y la hibridación ADN-ADN (Sriranganathanet al., 1985), han permitido (Kandler y Weiss 1986b)dividir a los Lactobacillus en tres grupos que cubre,bajo nuevas definiciones, los grupos de Orla – Jensen(Cuadro 2).

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1. Grupo I: Lactobacillus homofermentativosobligatorios, que incluyen a las especies del grupoThermobacterium y otras especies nuevas descritas.Son incapaces de fermentar las pentosas y elgluconato (Kandler y Weiss, 1986b).Sus células son alargadas, rectas y a menudo enempalizada (Botazzi, 1988). Presenta dos conjuntosde especies centrados principalmente en Lb.delbrueckii y Lb. acidophilus. Las subespecies deLb. delbrueckii poseen una homología de su ADNen más del 80% (Weiss et al., 1983). Lb. delbrueckiisubsp. delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb.delbrueckii subsp. leichmanii. Estas bacteriasproducen hasta 18 g/litro de ácido láctico D (-).Las especies de Lb. acidophilus es por el contrariomuy heterogéneo, está formado por tres subgruposcaracterizados cada uno de ellos por las siguientesespecies. Lb. acidophilus, Lb. helveticus, Lb.gasseri. Lb. helveticus es considerada como unaderivada de Lb. acidophilus por adaptación allactosuero ácido, se caracteriza por ser el productormás grande de ácido láctico DL entre losLactobacillus 27 g/litro (Kandler y Weiss, 1986b).

2. Grupo II: Lactobacillus homofermentativosfacultativos , formado por el grupoStreptobacterium y especies nuevas. La fermentaciónde las hexosas es homofermentativa, la de laspentosas y el gluconato es heterofermentativa conproducción de ácido láctico y acético (Kandler yWeiss, 1986b).Sus células son cortas, a menudo ordenadas enfilamentos (Botazzi, 1988). Grupo muy heterogéneoformado por tres conjuntos de especies centradasen Lb. plantarum, Lb. casei, y el grupo de Lb. sake– Lb. curvatus – Lb. bavaricus. Se caracterizanpor producir poco ácido láctico entre 3 a 13 g/litro dela forma L (+) o DL según la especie. Lb. plantarumes una especie gigante formada por cepas dehomología variable con la cepa tipo.El conjunto de Lb. casei contiene tres genotipos: lacepa tipo, un grupo de tres sub-especies Lb. caseisubsp. casei, Lb. casei subsp. pseudoplantarumy Lb. casei subsp. tolerans y el tercer grupoconstituido por Lb. casei subsp. rhamnosus.

3. Grupo III: Lactobacillus heterofermentativosobligatorios, se incluyen a los del grupoBetabacterium. Como producto de la fermentaciónde las hexosas se obtiene ácido láctico, acético, (oetanol) y CO2 en una relación 1:1:1; la de laspentosas, ácido láctico y acético (Kandler y Weiss,1986b).


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• Streptococcus sensu estrictos• Enterococcus• Lactococcus

El género Streptococcus sensu estrictos comprendea la mayoría de Streptococcus incluidos en la últimaedición de «Bergey’s Manual» (1986) en los grupospiógenos, orales y «otros» estreptococos, así como alas diversas especies de identificación reciente yquedan excluidos del género los Streptococcusanaeróbicos (Schleifer y Kilpper – Balz, 1987). Delos Streptococcus la especie útil en la industria delos alimentos es Streptococcus thermophilus quejunto a Lactobacillus delbrueckii subespeciebulgaricus, se utilizan para la elaboración del yogurty algunas variedades de queso.

El género Lactococcus (Schleifer et.al, 1985)alberga a los Streptococcus lácticos o del grupo Nde Lancefield (Jones, 1978), representada porLactococcus lactis subespecie lactis, ahoraLactococcus lactis (incluye a las especiesanteriormente denominadas S. lactis subespecielactis, S. lactis subespecie diacetylactis y Lb.Xilosus) y Lactococcus lactis subespecie cremorisahora Lactococcus cremoris. Además estánpresentes Lactococcus lactis subespecie hordniae(anteriormente Lb. hordniae) ahora denominadaLactococcus hordniae; a Lactococcusraffinolactis (anteriormente S. raffinolactis),Lactococcus garviae, Lactococcus plantarum yLactococcus piscium de reciente identificación(Williams et. Al, 1990).

El género Enterococcus se encuentra formado porlos anteriormente denominados Streptococcusfecalis o del grupo D de Lancefield (Jone, 1987)con excepción de Streptococcus bovis yStreptococcus equinus junto a otras especies dereciente identificación.Cabe señalar que los Streptococcus del grupo N deLancefield, incluidas previamente en el géneroLactococcus, has pasado a formar parte del géneroVagococcus con la especie Vagococcus fluvialescomo cepa tipo (Collins et. al 1989ª). Posteriormentealgunos lactobacilos atípicos aislados del salmón sehan identificado como Vagococcus salmoninarum(Walbanks et.al, 1990).

Respecto al género Lactobacillus, las especies Lb.piscícola, Lb. divergens y Lb. carnis, anteriormenteclasificadas en el grupo III, han pasado a constituirel género Carnobacterium, que actualmentecomprende también las nuevas especiesCarnobacterium gallinarum, C. mobile, C.

Sus células son cortas, rectas y separadas (Botazzi,1988). Incluyen especies muy diversas que poseen,a pesar de tener a veces un % de GC muy cercano,poca homología entre ellas, su producción de ácidoes débil, 5 g/litro, y el ácido láctico producido es de laforma DL.Las especies más destacables son Lb. sóme, Lb.buchneri y Lb. reuteri; Lb. fermentum; Lb. brevis;Lb. bifermentans, capaz de producir hidrógenogracias a una formiato hidrogeno liasa.

GÉNERO ERYSIPELOTHRIX

El género Erysipelothrix (Jones, 1986) era monoespecifico.

GÉNERO ESTREPTOCOCCUS

El género Streptococcus (Hardie, 1986; Mundt, 1986)engloba a un total de 30 especies distribuidas en 6grupos: estreptococos piógenos, estreptococos orales,estreptococos anaeróbicos, estreptococos lácticos,otros estreptococos y enterococos.

GÉNERO PEDIOCOCCUS y LEUCONOSTOC

El género Pediococcus y Leuconostoc (Garvier,1986) comprendías un total de 8 y 4 especiesrespectivamente.

GÉNERO AEROCOCCUS

El género Aerococcus (Evans, 1986) era monoespecífico.

GÉNERO GEMELLA

El género Gemella ( Reyn, 1986) era monoespecifico.

Pero con los últimos avances en el desarrollo y lautilización de técnicas bioquímicas y molecularescomo la determinación de la composición de las basesnitrogenadas adenina y guanina del ADN (mol%GC),la hibridación química de los ácidos nucleicos(ADN:ADN – ADN:ARN) y su secuenciación hanproducido cambios en la taxonomía de las bacteriaslácticas, la mayoría de los cuales aparecen en la 9na

edición del «Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology» (Holt et al.,1994).Refiriéndonos a la secuenciación de ARNr 16s y haestudios de hibridación ADN:ARNr (Garvier yFarrow, 1981; Kilpper – Balz y Schleifer, 1981;Schleifer et.al, 1985) el género Streptococcus se hadividido en tres grupos filogenéticamente distintos:

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funditum, C. alterfunditum (Collins et al.,1987ª;Walbanks et al., 1990), Collins et al., 1991 sugiere elnombre C. maltaromicus (antiguamente Lb.maltaromicus) como sinónimo de C. piscícola.

En relación al género Pediococcus, la especies P.urinaeequi se ha transferido al género Aerococcus(A. urinaeequi) y la especie P. halophilus ha pasadoa constituir el nuevo género denominadoTetragenococcus (T. halophilus), de este modo elgénero Pediococcus queda finalmente constituidopor los siguientes géneros: P. acidilactici, P.pentosaceus, P. dammnosus, P. dextranicus, P.inopinatus y P. parvulus.

Finalmente, el género Leuconostoc esta constituidopor 4 especies que se incluyen en la ultima edicióndel «Bergey’s Manual of Systematic bacteriology»(1986) (Lc. mesenteroides, Lc. lactis, Lc.paramesenteroide y Lc. oenos) y por 6 especies dereciente identificación: Lc. gelidum, Lc. carnosus,Lc. amelobiosum, Lc. citreum, Lc.pseudomesenteroides y Lc. fallax (Martínez –Murcia et al., 1991ª; Pot et al., 1994b).

Considerando como características finales de lasbacterias lácticas su carácter Grampositivo, noesporulados, microaerofilos o anaerobios facultativos,catalasa y oxidasa negativos y su capacidad deproducir ácido láctico como producto final ymayoritario derivado de la fermentación de losazúcares y su estrecha relación con los alimentos seconsideran que el grupo de las bacterias lácticasestá constituido por los siguientes géneros:• Lactobacillus• Carnobacterium• Streptococcus• Lactococcus• Vagococcus• Enterococcus• Leuconostoc• Pediococcus• TetragenococcusRespecto al metabolismo de los carbohidratos lasbacterias lácticas se agrupan en tres categorías(Axelsson, 1993) que son:• Homofermentativas obligadas• Heterofermentativas obligadas• Heterofermentativas facultativas

Las bacterias lácticas homofermentativasobligadas (Lactobacillus del grupo I) oxidan laglucosa y otras hexosas hasta acido láctico a travésde vía fermentativa Embden-Meyerhof-Parnas,mediante la participación de la enzima denominada

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fructosa 1,6-difosfato aldolasa. Estas bacteriascarecen de las enzimas glucosa 6-fosfatodeshidrogenada y 6-fosfogluconato deshidrogenasadebido a ello no son capaces de fermentar las pentosasni el gluconato (Cuadro 3).

Las bacterias lácticas heterofermentativasobligadas (Leuconostoc y Lactobacillus del grupoIII) degradan la glucosa y otras hexosas hasta ácidoláctico, dióxido de carbono, ácido acético o etanol ylas pentosas hasta ácido láctico y ácido acético, através de la ruta metabólica de las pentosas fosfatocon la participación de la enzima fosfocetolasa. Estasbacterias lácticas carecen de la enzima fructosa 1,6-difosfato aldolasa.

El resto de las bacterias lácticas (Lactobacillus delgrupo II, Carnobacterium, Lactococcus,Vagococcus, Streptococcus, Enterococcus,Pediococcus y Tetragenococcus) fermentan lashexosas casi exclusivamente hasta ácido láctico porla vía Embden –Meyerhoff – Parnas (igual que lasbacterias lácticas homofermentativas obligadas), peroalgunos microorganismos a pesar de no presentar laenzima fosfocetolasa, en condiciones limitantes decarbohidratos y anaerobiosis producen además ácidofórmico, ácido acético y etanol (Cogan et al., 1989).En lo que respecta la utilización de las pentosas, lamayoría de estos microorganismos son capaces defermentarla por la acción de la fosfocetolasa inducible,produciendo cantidades equivalentes de ácido lácticoy ácido acético (Kandler, 1983).De otro lado las bacterias lácticas también puedenutilizar a los disacáridos como la lactosa y sacarosa.Estos disacáridos ingresan a la célula mediante unsistema de permeasa dependiente del ATP o delsistema fosfotransferasa dependiente delfosfoenolpiruvato (Sistema PEP – PTS) y sondesdoblados hasta sus monosacáridoscorrespondiente los cuales son utilizados mediante elproceso fermentativo para producir ácido láctico yotros metabolitos (Kandler, 1983).

EL ÁCIDO LÁCTICO

El ácido láctico fue descubierto en 1780 por Scheelecomo causante de la acidificación y consiguientecortado de la leche. No fue sino hasta mediados delsiglo XIX que Pauster demostró que el ácido lácticoes producido por microorganismos presentes en laleche.La elaboración del ácido láctico en 1880 fue laprimera producción de un ácido orgánico de origenmicrobiano. (Crueger y Crueger, 1984).


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La glucólisis es una vía fermentativa denominadatambién Vía Embden-Meyerhof-Parnas. Esta sedivide en tres etapas principales donde se produceuna serie de reacciones individuales catalizadasenzimáticamente.

ETAPAS I Y II: REACCIONES PRELIMINARESY REACCIONES REDOX

Durante la Etapa I, la glucosa se fosforiliza mediantela molécula de ATP formando a la glucosa-6-fosfato,que luego será convertida en un isómero, la fructosa-6-fosfato, que mediante una segunda fosforilaciónes convertida a fructosa-1,6-difosfato, que es elmetabolito intermediario clave en el proceso de laglucólisis. La enzima aldolasa cataliza la ruptura dela fructosa-1,6-difosfato en dos moléculas de trescarbonos denominadas gliceraldehído-3-fosfato y suisómero dihidroxiacetonafosfato. Durante esta etapano ha ocurrido ninguna reacción redox, el consumode ATP tiene lugar sin la transferencia de electrones.Recién en la segunda etapa se produce la primerareacción redox durante la conversión delgliceraldehído-3-fosfato en ácido 1,3-difosfoglicérico,que ocurre dos veces por cada molécula degliceraldehído-3-fosfato, una enzima cuya coenzimaes NAD+ acepta dos átomos de hidrógeno y elNAD+ se convierte en NADH; esta transformaciónes catalizada por una enzima denominadagliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.Simultáneamente, cada molécula de gliceraldehido-3-fosfato es fosforilizada por adición de una moléculade fosfato inorgánico. Esta reacción, en la que elfosfato inorgánico se convierte en orgánico, preparael escenario para la conversión de la energía porfosforilación a nivel del sustrato, la formación del ATPes posible porque cada uno de los fosfatos de lamolécula de ácido 1,3-difosfoglicérico presentaun enlace de alta energía. La síntesis del ATP tienelugar cuando cada molécula de ácido 1,3-difosfoglicérico se convierte en ácido 1,3-fosfoglicérico y cuando más tarde en la vía metabólica,cada molécula de fosfoenolpiruvato se convierte enpiruvato.

ETAPA III: PRODUCCIÓN DE PRODUCTOSDE FERMETACIÓN

Durante la formación de dos moléculas de ácido 1,3-difosfoglicérico, se reducen dos moléculas de NAD+

a NADH. Sin embargo, las células contienen solouna pequeña cantidad de NAD+, y si todo seconvirtiera en NADH se detendría la oxidación de laglucosa. La oxidación continua del gliceraldehído-3-fosfato solo puede proseguir si está presente una

El ácido láctico es el resultado final del metabolismoanaeróbico, principalmente de ciertas bacteriasdenominadas bacterias lácticas (LAB). El ácidoláctico es utilizado en una amplia variedad deproductos como alimentos fermentados y bebidas.El uso de compuestos acidificantes en laconservación y mejora de las propiedadesorganolépticas en los alimentos es extensa. Estosácidos genéricamente denominados ácidos orgánicos,son intermediarios o productos finales de ciclosmetabólicos básicos lo cual ocurre en una granvariedad de organismos vivos. Tales compuestosincluyen a los ácidos: cítrico, málico, láctico, acéticoy fumárico.La incorporación de ácidos o sus sales en losalimentos cumple diversas funciones dentro de lascuales cabe destacar el gran poder acidificante, lacapacidad amortiguadora o reguladora del pH,emulsificante, y sus efectos organolépticos.El principal uso es su capacidad de acidificación ycontrol del pH en el producto final; un pH bajo retarday/o elimina el crecimiento de microorganismosindeseables en los productos alimenticios. Asimismoreduce la necesidad de tratamientos térmicosdrásticos durante la esterilización por ejemplo defrutas y verduras enlatadas.

BIOQUÍMICA DEL ÁCIDO LÁCTICO

Todas las LAB son sacarolíticas y deficientes enmalas rutas biosintéticas. En consecuencia presentanrequerimientos nutricionales complejos que obligana restringirse a medios altamente ricos en nutrientescomo por ejemplo el tracto intestinal y la leche.Estas bacterias son anaeróbicas pero esencialmenteaerotolerantes. Existen dos rutas metabólicas dedegradación de carbohidratos hasta ácido láctico.

1. Ruta homofermentativa, es la que genera ácidoláctico como único producto al final de la degradaciónde los carbohidratos, con un rendimiento neto de dosmoles de ácido láctico por un mol de glucosa, y espor consiguiente, la de interés en la producción.

2. Ruta heterofermentativa, es la que genera laproducción de etanol y CO2 en cantidadesequimolares al ácido láctico sintetizado.

GLUCÓLISIS

La glucolisis o fermentación es una reacción de oxido-reducción interna equilibrada en la que algunosátomos de la fuente de energía se reduce mientrasotros se oxidan, y la energía se produce porfosforilación del sustrato.

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molécula de NAD+ para aceptar los electronesliberados. Este «bloqueo» se supera en lafermentación mediante la nueva oxidación de NADHa NAD+, a través de reacciones que supone lareducción del piruvato a una extensa variedad deproductos de fermentación. En el caso de laslevaduras, el piruvato se reduce a etanol y se liberaCO2. en las bacterias ácido lácticas (LAB) el piruvatode reduce a lactato.Durante cualquier proceso que produzca energía, laoxidación debe acompañarse de una reducción y debehaber un aceptor de electrones por cada electróncedido. En este caso, la reducción del NAD+ en unpaso enzimático de la glucólisis se equilibra con suoxidación en el otro paso. Los productos finalestambién deben estar en equilibrio redox con el sustratoinicial, la glucosa. Es así que los productos finalesque se generan etanol más CO2 o lactato másprotones, estén en equilibrio atómico y electrónicocon la glucosa inicial.La glucólisis consume dos moléculas de ATP durantelas dos fosforilaciones de la glucosa y se sintetizancuatro moléculas de ATP, dos por cada molécula deácido 1,3-difosfoglicérico convertida a piruvato, portanto, la ganancia neta del organismo es de dosmoléculas de ATP por cada molécula de glucosafermentada.

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62

Cuadro 1Biopreservación por Bacterias Lácticas (LAB)

Fuente: Caplice y Fitzgerald (1999) y Cleveland et al. (2001)

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Producto Microorganismo Substrato

Vino - cerveza

Saccharomyces cerevisae, LAB

Uva, cereales, lúpulo

Pan

Saccharomyces cerevisae, LAB

Cereales, arroz, trigo

Queso cheddar

Lactococcus (cremoris, lactis) y Leuconostoc

Leche

Queso tipo suizo

Lactobacillus ( delbruckii, bulgaricus,

helveticus)

Leche

Yogurt

Streptococcus thermophilus y Lb. bulgaricus

Leche

Carnes

fermentadas

Pediococcus, Staphylococcus, varios

LAB

Cerdo, res

Vegetales

Enterococcus (mundtii, faecium)Lactococcus (cremoris, lactis)

Lactobacillus (plantarum, casei)

Vegetales

Pescado Carnobacterium (piscicola, divergens) Peces

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Biotempo 2008, Volumen 8, 54 - 64

Cuadro 2


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Cuadro 3

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1 Universidad Ricardo Palma, Apdo. 1801, Lima, Perú. E-mail: [email protected] Instituto del Mar del Perú, Apdo. 22, Lima, Perú.

EFECTOS ECOTOXICOLOGICOS DEL PETROLEO CRUDO, DIESEL 2 Y KEROSENESOBRE EL CRECIMIENTO POBLACIONAL DE LA MICROALGA Chaetoceros gracilis

SCHUTT

Giovanna Vera1

Jorge Tam2

Edwin Pinto2

RESUMEN

Se realizaron pruebas ecotoxicológicas para determinar los efectos del petróleo crudo, petróleo Diesel 2 ykerosene sobre el crecimiento poblacional de la diatomea Chaetoceros gracilis. Se determinó la concentraciónefectiva media (CE50%) a un tiempo de exposición de 96 horas, siendo más tóxica la solución con petróleoDiesel 2 (90 mg.L –1), seguida de la solución con kerosene (98 mg.L –1) y la solución con petróleo crudo (867.5mg.L –1). Además, se evaluó los efectos ocasionados en la tasa intrínseca del crecimiento poblacional y en latasa de división de la especie expuesta a los diferentes compuestos orgánicos.

Palabras claves: Pruebas ecotoxicológicas, hidrocarburos de petróleo, Chaetoceros gracilis.

SUMMARY

Ecotoxicological tests were carried out to determine the effects of crude oil, Diesel 2 oil and kerosene on thepopulation growth of the diatom Chaetoceros gracilis. The mean effective concentration (CE50%) at anexposure time of 96 hours was determined. The solution with Diesel 2 oil was more toxic (90 mg.L –1), followedby the solution with kerosene (98 mg.L –1) and the solution with crude oil (867.5 mg.L –1). In addition, the effectsof the different organic compounds on the intrinsic population growth rate and division rate of Ch. graciliswere assessed.

Key words: Ecotoxicological bioassays, oil hydrocarbons, Chaetoceros gracilis.

INTRODUCCIÓN

Una de las fuentes más importantes de contaminaciónmarina en el Perú son los hidrocarburos de petróleoy sus derivados, especialmente durante el cabotaje.En 1990, se derramaron 14000 barriles de keroseney 438 barriles de petróleo en 1995 (Sánchez y Orozco,1997). Otros registros que datan de 1995 al 2001sobre derrames de petróleo en nuestro mar fueronpublicados por Vizcarra (2002).El primer impacto al producirse un derrame dehidrocarburo ocurre con el fitoplancton, debido a quelos hidrocarburos forman una capa impermeable que

obstaculiza el paso de la luz solar, fuente necesariapara realizar el proceso fotosintético. Las microalgasunicelulares cumplen un rol esencial en el normalfuncionamiento de los ecosistemas marinos, ya quecomo productores primarios, son el primer eslabónde la cadena alimentaria, oxigenando el agua yparticipando en los ciclos biogeoquímicos desustancias orgánicas e inorgánicas. Conocer losefectos ecotoxicológicos de los contaminantes de tipoorgánico a través de datos obtenidos en las pruebasde toxicidad usando especies sensibles, ayudará apredecir los posibles efectos sobre las poblaciones ycomunidades algales.

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En el Perú, existen pocos estudios acerca del efectode los hidrocarburos sobre los organismos marinosnativos (Ibañez y Huanes, 1999 y Alayo, 2000). Enel presente trabajo, se eligió como organismo pruebala diatomea Chateoceros gracilis por ser de fácilmanejo en laboratorio, tamaño pequeño, y ciclo devida corto, características que son ventajosas parala conducción de pruebas ecotoxicológicas. Estaespecie ya ha sido usada como organismo prueba enotros estudios ecotoxicológicos (Vera et al. 2001,Alayo et al. 2004).Chaetoceros gracilis es una especie que forma partede la flora fitoplanctónica del mar peruano (Ochoaet al. 1999), y los efectos ecotoxicológicos de lasconcentraciones de hidrocarburos presentes en lasaguas marinas, son transmitidos a niveles tróficossuperiores.Por tales motivos, se planteó como objetivo de lapresente investigación evaluar los efectosecotoxicológicos de los hidrocarburos de petróleo(petróleo crudo, el petróleo Diesel y el kerosene)sobre el crecimiento poblacional de la diatomeaChaetoceros gracilis y determinar la concentraciónefectiva media (CE50%).

ANTECEDENTES

Los derrames de petróleo a nivel mundial son un temacotidiano, el reporte más antiguo causado por elhombre fue en 1907, pero el más famoso fue en 1967en Torrey Canyon con 117000 toneladas de petróleocrudo vertidos en Kuwait. En 1979, en el Golfo deMéxico se derramaron 700 millones de litros depetróleo; en 1983 otro accidente ocurrió en las costasde la Ciudad del Cabo; en Sudáfrica se derramaron300 millones de litros; y en Alaska se derramaron 41millones de litros de petróleo, entre otros. Cada añose vierten aproximadamente 6 millones de toneladasde petróleo al mar (Neff 1987).Se calcula que el mar recibe cinco millones de Tmde crudo cada año y de este tanto solo el 10% soninherentes a tanques accidentados, el resto se vinculaa fuentes menos publicitadas y diferenciables por suprocedencia como por ejemplo: residuos municipalese industriales, desechos de refinerías, escapesfortuitos por rotura de tuberías submarinas (carga ydecarga), fallas en ensamblaje, lavado ymantenimiento descuidados de sentinas y sala demáquinas,etc. (Vizcarra, 2002).En la explotación del petróleo se derrama cerca dela mitad en el área de perforación, lo que implicagrandes pérdidas y contaminación del aire, agua ysuelo. La manera tradicional de extraer o recuperarel petróleo es mediante bombeo con agua lo cualrepresenta una pérdida considerable de agua.

Los efectos del petróleo sobre los ecosistemasmarinos dependen de factores como: tipo de petróleo(crudo o refinado), cantidad, distancia del sitiocontaminado a la playa, época del año, condicionesatmosféricas, temperatura media del agua ycorrientes oceánicas.En el Perú, existen 39 lotes con contratos vigentespara operaciones petroleras, de las cuales 8 seencuentran distribuídas en la zona norte del marperuano, abarcando los departamentos de Tumbes,Piura, Lambayeque, La Libertad y Ancash con lassiguientes cuencas: Cuenca Progreso, CuencaLancones, Cuenca Talara , Cuenca Sechura, CuencaSalaverry. Los otros lotes se encuentran distribuídosal interior del país. También se encuentran 6 plantasde refinamiento: Talara (Piura), La Pampilla (Lima),Conchán (Lima), El Milagro (Amazonas), Pucallpa(Ucayali) e Iquitos (Loreto), así como también 4plantas de fraccionamiento: Pluspetrol (Ica), Pariñay EEPSA (Piura) y Aguaytía (Ucayali). En la costaperuana existen 18 plantas de abastecimiento: Talara,Piura, Chiclayo (Eten), Trujillo (Salaverry), Chimbote,Supe, Lima (9 plantas), Pisco, Mollendo e Ilo(Ministerio de Energía y Minas 2006).El Instituto del Mar del Perú (IMARPE) ha realizadodiversas evaluaciones de hidrocarburos de petróleoen las zonas de Paita, Talara, Bayóvar, Chimbote,Supe-Paramonga, Callao y Paracas encontrándoseen muchos casos altas concentraciones dehidrocarburos en el mar (Guzmán, 1995; Jacinto et.al., 1996a; 1996b; 1997; 1998; Guzmán et al., 1997y Cabello et al., 1 999).

MATERIAL Y METODOS

Material biológicoLa diatomea Chaetoceros gracilis se obtuvo delCepario del Laboratorio de la Línea deInvestigaciones en Ecotoxicología Acuática delIMARPE. Esta alga es usada habitualmente comoalimento de organismos reproductores de bivalvos ycrustáceos en laboratorio, cuyas larvas se utilizan enlas diferentes pruebas ecotoxicológicas.

Cultivo de la microalgaLas cepas de Ch. gracilis se mantuvieron en faselíquida en un medio Guillard «f/2» modificado(Guillard, 1975 en González et al., 1995). Lacomposición del medio de cultivo utilizado se presentaen la Tabla 1.

Pruebas ecotoxicológicasLa metodología usada para la obtención de lassoluciones mezcla de hidrocarburos (petróleo crudo,Diesel 2 y kerosene) y agua de mar, fue tomada de

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D´Croz et al. (1988). De dos pruebas preliminaresse obtuvieron los siguientes rangos de diluciones:solución con petróleo crudo de 420 a 2500 mg.L-1,solución con petróleo Diesel 2 de 67 a 400 mg.L-1 ysolución con kerosene entre 9 a 640 mg.L-1. Laprueba fue de tipo estático, es decir, lasconcentraciones fueron añadidas al medio por únicavez al inicio de la prueba.Después de preparar las soluciones de hidrocarburosy agua de mar, se distribuyeron en matraces de 250mL hasta 150 mL y se inocularon 10 mL demicroalgas para lograr una densidad inicial promediode 30000 cél.mL-1, ésta densidad corresponde al finalde la fase de exponencial. Las muestras demicroalgas para el conteo, se colectaron en viales de5 mL, al inicio y cada 24 horas, durante 96 horas. Secolectaron las muestras tanto de los controles comode las diferentes concentraciones de hidrocarburo yderivados. Se ejecutaron los conteos celulares dentrode las 24 horas, utilizando una cámara de Neubauer.Las pruebas se realizaron en un ambiente con aireacondicionado a una temperatura de 20°C ± 1 °C.Un resumen de las condiciones de la pruebaecotoxicológica se presenta en la Tabla 2.

Análisis de datosEl diseño experimental en las tres pruebas,comprendió 7 tratamientos (6 concentraciones + 1control) y 2 repeticiones por cada tratamiento. Larelación dosis-respuesta se obtuvo a partir de los datosde concentración como variable independiente yporcentaje de inhibición como variable dependiente.El porcentaje de inhibición del crecimiento poblacionalfue calculado usando la siguiente fórmula (Joubert,1980):

NcNeI 1100

Donde:I = Inhibición del crecimiento poblacional (%)Ne = Densidad celular expuesta al tóxico (cél.mL-1)Nc = Densidad celular del control (cél.mL-1)

Con los datos de inhibición se determinó laconcentración efectiva media (CE50%) utilizando elprograma computacional PROBIT (Weber, 1993),que calcula la concentración de hidrocarburo quedetermina una inhibición del crecimiento poblacionaldel 50 %.Adicionalmente, se estimó la tasa intrínseca decrecimiento poblacional exponencial, usando los datosdel control mediante la siguiente fórmula (Rabinovich,1978):

)(

ln

12

1

2

ttNN

r t

t

Donde:r = Tasa intrínseca de crecimiento poblacional (día-1)Nt1 = Densidad celular en día t1 (cél.mL-1)Nt2 = Densidad celular en día t2 (cél.mL-1)

La tasa de división por día se calculó a través de lafórmula:

D = 1/T

Donde:D = Tasa de división (div.día-1)T = Tiempo de división (días)

RESULTADOS

Petróleo crudoA partir de las concentraciones de 1225, 1750 y 2500mg.L-1 se observa una inhibición en el crecimientopoblacional dentro de las 24 horas de exposición de67 %, 70 % y 92 %, respectivamente, recuperándoseal tercer día de exposición, siendo afectada la tasade división por día en más del 50 % con respecto alcontrol (Fig. 1).La tasa intrínseca del crecimiento poblacional (r) parael control fue de 1.001 día–1 mientras que para lascélulas expuestas al petróleo crudo estuvo entre 0.75a 0.89 día–1 . La tasa de división por día (D) para elcontrol fue de 1.45 div.día-1, mientras que para laspoblaciones expuestas al petróleo estuvo en rangode 1.08 a 1.28 div.día-1 (Tab. 3). Se obtuvo unaCE50% de 867.5 mg.L –1 (Fig. 2).

Petróleo DieselConcentraciones de petróleo Diesel mayores de 196,280 y 400 mg.L-1 inhibieron el crecimiento de lapoblación expuesta en 97 %, 100 % y 100 %,respectivamente, dentro de las 24 horas de exposición,no se observó recuperación celular (Fig. 3).La tasa intrínseca del crecimiento poblacional (r) parael control fue de 0.84 día–1 mientras que para laspoblaciones expuestas a diferentes concentracionesdel petróleo Diesel estuvo entre 0.30 a 0.85 día–1.La tasa de división por día (D) para el control fue de1.21 div.día-1, mientras que para las poblacionesexpuestas al petróleo estuvo en rango de 0.44 a 1.23div.día-1 (Tab. 3). Se obtuvo una CE50% de 90 mg.L–1 (Fig. 4).

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KeroseneConcentraciones de kerosene de 640 y 320 mg.L-1

produjeron una inhibición en el crecimiento poblacionaldel 96 % y 83 % en el tercer y cuarto día de exposición,respectivamente. Mientras que en concentracionesentre 20 a 160 mg.L-1 causaron una inhibición entreel 8 % al 29 % (Fig. 5).La tasa intrínseca del crecimiento poblacional (r) parael control fue de 0.81 día–1 mientras que para laspoblaciones expuestas a diferentes concentracionesdel kerosene comercial estuvo entre 0.38 a 0.78 día–

1. La tasa de división por día (D) para el control fuede 1.17 div.día-1, mientras que para las poblacionesexpuestas al kerosene estuvo en rango de 0.55 a 1.12div.día-1 (Tab. 3). Se obtuvo una CE50% de 98 mg.L–1 (Fig. 6).

DISCUSIÓN

La compleja composición del petróleo y la extremavariabilidad en la composición del petróleo y losproductos refinados del petróleo ha llevado a losinvestigadores a examinar la toxicidad de una mayordiversidad de ingredientes químicos del petróleo enun esfuerzo por mejorar el entendimiento de lascausas de la toxicidad.Los hidrocarburos alifáticos en el petróleo sonrelativamente no tóxicos. Los alifáticos de bajo pesomolecular desde metano hasta octano soncompletamente volátiles y son rápidamente perdidosdesde la preparación petróleo-agua por evaporación.Algunos de estos componentes pueden producirefectos narcóticos en animales marinos enconcentraciones cerca a su solubilidad acuosa (Crispet al, 1967).Los alifáticos de alto peso molecular son taninsolubles que no es posible disolverlos con suficienteagua de mar para causar toxicidad en organismosmarinos y éstos finalmente se acumulan en lossedimentos.En las pruebas realizadas en el presente trabajo sedeterminó que el efecto inhibitorio del petróleo crudo,el petróleo Diesel 2 y el kerosene se encuentrandentro de las primeras 24 horas de exposición, siendomás tóxico el petróleo Diesel 2 debido a que presentamayor concentración de fracciones volátiles, algo muysemejante ocurre con el kerosene, ésto apoyaría aCraddock (1977 en Neff 1987) quien señala que latoxicidad aguda se incrementa conforme aumenta laconcentración de hidrocarburos aromáticos.En las pruebas con petróleo crudo si bien es ciertoproduce un efecto inhibitorio a las 24 horas, se puedeobservar una recuperación en la pendiente decrecimiento celular a partir del segundo día,especialmente en células expuestas a bajas

concentraciones del petróleo. Igualmente ocurre enlos trabajos realizados en otras condiciones detemperatura y salinidad realizada por D´Croz (1988)quien determinó un crecimiento celular después del2do día tendiendo a igualar el crecimiento del cultivocontrol y después del 3er día parece estar estimulado,superando al cultivo control.Después de la volatilización de los hidrocarburosaromáticos hay una tendencia a la recuperación enlos 3 casos, especialmente en los cultivos que tienenlas más bajas concentraciones.Comparando los resultados obtenidos en el presenteestudio para la especie Chaetoceros gracilis, conlos resultados en otras especies (Tab. 4), se obtuvolas siguientes secuencias de sensibilidad:- Petróleo crudo: Microalga (Chaetoceros gracilis)

> Pez (Orthopristis ruber) > Pez (Mugil curema)> Bivalvo

- Petróleo Diesel: Microalga (Chaetoceros gracilis)> Pez (Mugil curema) > Bivalvo

- Kerosene: Microalga (Chaetoceros gracilis) >Pez (Mugil curema) > Bivalvo

En el Perú, la Ley General de Aguas vigente (ElPeruano 1969) no considera estándares de calidadpara los hidrocarburos de petróleo. Sin embargo, enAlaska, el estándar de calidad acuática marina parael crecimiento y propagación de peces, mariscos, vidaacuática y vida silvestre es de 15 mg.L-1 parahidrocarburos acuosos totales (HAT) (ADEC 2003).

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Las soluciones con petróleo crudo, petróleo Diesel 2y kerosene produjeron un efecto inhibidor sobre elcrecimiento poblacional de la diatomea Chaetocerosgracilis, siendo las concentraciones efectivas media(CE50%) de 867.5, 90.0 y 98.0 mg.L-1,respectivamente. Este efecto inhibidor fue mayordentro de las 24 horas, siendo afectadas la tasaintrínseca de crecimiento y la tasa de división pordía.La recuperación celular fue notable a partir del tercerdía con una tendencia a alcanzar los cultivos controlesen los días posteriores.Chaetoceros gracilis fue la especie más sensible alos derivados aromáticos del hidrocarburo de petróleo(petróleo crudo, petróleo Diesel, kerosene), por loque puede ser utilizada como organismo prueba paraevaluar la toxicidad de otros compuestos orgánicos,siguiendo las condiciones recomendadas.Se recomienda realizar estudios subletales paraobservar los efectos en largos periodos de tiempo,para evaluar el daño potencial causado por un eventode derrame o una descarga crónica y para predecir

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el valor de recuperación del medio afectado oimpactado.

LITERATURA CITADA

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Tabla 1. Composición del Medio de cultivo f/2 Guillard (1975 en Gonzáles et al. 1995).

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Reactivos Volumen (mL.L-1)

Nutrientes Stock (g.L-1)

Medio (g.L-1)

Medio (mol.L-1)

Solución 1 1 NaNO3 75 0.075 8.83 x 10-4

Solución 2 1 NaH2PO4 5 0.05 3.63 x 10-5

Solución 3 1 Na2SiO4. 9H2O 10 0.01 3.25 x 10-5

Solución 4 1 FeCl3. 6H2O 3.15 0.00315 1.16 x 10-5

955 Na2EDTA. 2H2o 4.36 0.00436 1.17 x 10-1

1 Mn. Cl2.

4H2O 18 g .(100 mL)-1 0.00018 9.10 x 10-7

1 ZnSo4. 7H2O 2.2 g .(100 mL)-1 0.000022 7.65 x 10-8

1 CoCl2. 6H2O 1.05 g.(100 mL)-1 0.0000105 4.42 x 10-8

1 CuSO4. 5H2O 0.98 g.(100 mL)-1 0.0000098 3.93 x 10-8

1 Na2MoO4. 2H2O 0.63 g.(100 mL)-1 0.0000063 2.62 x 10-8

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Tabla 2. Condiciones de las pruebas ecotoxicológicas usando Chaetoceros gracilis expuesta asoluciones de petróleo crudo, Diesel 2 y kerosene.

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Organismo Prueba Chaetoceros gracilis

Tipo de Prueba Estática, 96 horas

Agua de dilución Agua de mar filtrada estéril y saturada de

oxígeno (6-7 mg.L-1)

Temperatura 20 ºC ±1 ºC .

Fotoperiodo L:O = 24:0

Tamaño de matraces 250 mL

Volumen de las soluciones 150 mL

Número de células por matraz 30000 cél.mL-1.

Número de réplicas por concentración. 2

Tasa de agitación 3 veces al día, manualmente

Agua de dilución Medio de cultivo f/2 Guillard

Concentraciones de prueba Mínimo 6 y un control

Punto final de la prueba Inhibición del crecimiento poblacional

(CE%)


72

Tabla 3. Tasa intrínseca del crecimiento poblacional (r), tasa de división por día (D) yconcentración efectiva media (CE50%) obtenidas en las pruebas ecotoxicológicas.

Tabla 4. Concentración efectiva media (CE50%, 96 h) de hidrocarburos de petróleo y derivadosusando diferentes especies acuáticas.

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entes tóxicos r (dia-1) D (div.dia-1) CE50% (mg.L-1) troleo crudo 0.75-0.89 1.08-1.28 867.5 Kerosene comercial 0.38-0.775 0.55-1.12 98 Diesel 2 0.30-0.85 0.44-1.23 90

Organismo prueba Estadio

Agente tóxico CE50% (mg.L-1) Autor

Orthopristis ruber Juvenil Petroleo liviano 680 Quevedo et al. (1983) Mugil cephalus Juvenil Kerosene industrial 628.6 Ibañez y Huanes (1999)

Mugil curema Juvenil Petróleo crudo

liviano Wax 1350 Aguilera y Huq (1982 en Ibañez y Huanes 1999)

Mugil curema Juvenil Petróleo crudo

oficina 1350 Aguilera y Huq (1982 en Ibañez y Huanes 1999)

Mugil cephalus Juvenil Petróleo Diesel 2 694 Ibañez y Huanes (1999) Moluscos bivalvos Petróleo crudo 1000-100000 Neff (1987)

Moluscos bivalvos Petróleo

Diesel/Kerosene 30000-40000 Neff (1987) Chaetoceros gracilis Adulto Petróleo crudo 867.5 Presente estudio Chaetoceros gracilis Adulto Petróleo Diesel 2 90 Presente estudio Chaetoceros gracilis Adulto Kerosene 98 Presente estudio

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Figura 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento poblacional de Chaetoceros gracilis expuestapor 96 horas a una solución con petróleo crudo.

Figura 2. Curvas de crecimiento poblacional de Chaetoceros gracilis expuesta a diferentesconcentraciones de petróleo crudo (mg.L-1).

65 - 75

y = 1.0321x - 1.4977

r2 = 0.8146

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.5

log (concentración) (mg.L-1)

log

(inh

ibic

ión)

(%)

0

500000

1000000

1500000

0 24 48 72 96 120

Tiempo de exposición (h)

Con

cen

trac

ión

célu

lar

(cel.m

L-1

)

0 858 600 420

1225 1750 2500


74

Figura 3. Porcentaje de inhibición del crecimiento poblacional de Chaetoceros gracilis expuestapor 96 horas a una solución con petróleo Diesel 2.

Figura 4. Curvas de crecimiento poblacional de Chaetoceros gracilis expuesta a diferentesconcentraciones de petróleo Diesel 2 (mg.L-1).

65 - 75

y = 0.7175x + 0.007

r2 = 0.9462

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

1 1.5 2 2.5 3

log (concentración) (mg.L-1)

log

(in

hib

ició

n)(%

)

0

200000

400000

600000

800000

1000000

0 24 48 72 96 120


Co

nc

en

tra

ció

nce

lula

r

(ce

l.mL

-1)

0 20 40 80

160 320 640

75


Figura 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento poblacional de Chaetoceros gracilis expuestapor 96 horas a una solución con kerosene comercial.

Figura 6. Curvas de crecimiento poblacional de Chaetoceros gracilis expuesta a diferentesconcentraciones de kerosene comercial (mg.L-1).

65 - 75

y = 0.732x + 0.2172

r2 = 0.7438

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8

Log (concentración) (mg.L-1)

log

(inh

ibic

ión

)(%

)

0

200000

400000

600000

800000

1000000

0 24 48 72 96 120


Conc

entr

ació

nce

lula

r

(ce

l.mL-1

)

0 67 96 137

196 280 400


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REVISTA BIOTEMPO, VOL 8, 2008Se terminó de imprimir

en el mes de diciembre del 2008, en los talleres gráficos de Garden Graf, Cel. 99732 5176 / [email protected]

biotempo 2008, volumen 8, - universidad ricardo palma · se observó las diferentes etapas de...

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