BIOTECNOLOGÍA DE MICROALGAS

INTRODUCCION

Las microalgas representan un recurso natural muy diverso aún no explotado desde el punto de vista científico e industrial. Son microrganismos fotosintéticos que se encuentran como células individuales o multicelulares, principalmente en ambientes acuáticos.

Características

Sus células funcionan independientemente realizando todas las funciones vitales. A partir de la biomasa de estas microalgas, es posible obtener moléculas simples, sustancias como ácidos grasos poliinsaturados, hidrocarburos, pigmentos, marcadores fluorescentes y compuestos como enzimas, promotores de crecimiento, antioxidantes, vitaminas y antibióticos. La biomasa algal se ha aplicado también en la alimentación animal y humana, como suplemento dietético-medicinal, fertilizantes agrícola y en la remoción de contaminantes.

La alimentación, en general es fotosintética.

Tasa de crecimiento muy alto.

Las microalgas que constituyen el fitoplancton tienen una innegable importancia, pues son las principales productoras de oxígeno y forman la base de las cadenas alimenticias en los medios acuáticos, en la actualidad se estudia su potencial en áreas como la acuacultura, farmacología, genética , bioquímica y biotecnología. Responsables de la producción del 50% del oxigeno y de la fijación del 50% del carbono en el planeta.

La capacidad de las microalgas para fijar el CO2 es de 10 a 50 veces mayor que la de las plantas terretres, por tal motivo, las microalgas consumen la mayor cantidad de CO2 en todo el planeta

MICROALGAS

Son microrganismos fotosintéticos que se encuentran como células individuales o multicelulares, principalmente en ambientes acuáticos.

Características:

A partir de la biomasa de estas microalgas, es posible obtener moléculas simples, sustancias como ácidos grasos poliinsaturados, hidrocarburos, pigmentos,compuestos como enzimas, antioxidantes, vitaminas y antibióticos.

La alimentación, en general es fotosintética. Tasa de crecimiento muy alto.

Las microalgas que constituyen el fitoplancton tienen una innegable importancia, pues son las principales productoras de oxígeno y forman la base de las cadenas alimenticias en los medios acuáticos.

Responsables de la producción del 50% del oxigeno y de la fijación del 50% del carbono en el planeta.

La capacidad de las microalgas para fijar el CO2 es de 10 a 50 veces mayor que la de las plantas terretres, por tal motivo, las microalgas consumen la mayor cantidad de CO2 en todo el planeta

BIOTECNOLOGIA Y MICROALGAS

La utilización de las microalgas dentro de los procesos biotecnológicos es muy diversa, radica principalmente en la obtención de bioproductos para la nutrición humana y animal, y en la obtención de fármacos. 

En el Centro de Investigaciones de Energía Solar (CIES) se obtienen varios bioproductos a partir de microalgas, como extractos oleosos de betacarotenos a partir de la microalga Dunaliella salina, y algunos resultados de su composición, como provitamina A; extractos de clorofilas obtenidas de cultivos de Chlorella vulgaris y su utilización como antiséptico bucal; y fracciones de polisacáridos derivados de cultivos de Porphyridium cruentum con propiedades inmunopotenciadoras, entre otros.

PASOS PARA CULTIVAR MICROALGAS

Toma de muestras

Se obtiene a través de un arrastre horizontal en la superficie del Lago durante cinco minutos para obtener un concentrado del fitoplancton utilizando una red cónica con una abertura de malla de 20 um .Se mantiene in vivo a baja temperatura hasta su traslado al laboratorio para desarrollar su cultivo.

Identificacion

Se utiliza una pipeta pasteur para colocar la muestra y se observa en el microscopio

Cultivar en un medio adecuado

Medios de Cultivo para Microalgas Se han desarrollado diferentes medios de cultivo para microalgas cuyas fórmulas tienen diferentes usos o propósitos:

Enriquecer el agua de mar natural, Enriquecer el agua dulce natural,  Medios artificiales para:

· Agua de mar

· Agua dulce Medios específicos para: especies específicas, Medios selectivos para especies seleccionadas.

 Los medios artificiales permiten resultados constantes en contraste con, los medios para enriquecer que tienen resultados variables debido a, entre otros factores, que dependen del lugar y las características del agua donde se colectan y el tiempo de almacenamiento de la misma. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio; en términos generales los macronutrientes son los factores limitantes del crecimiento y dirigen elmetabolismo basal o primario mientras que, los micronutrientes se requieren en cantidades menores y son indispensables para el metabolismo secundario. Los macronutrientes son: el Carbono, Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio; en tanto que, los micronutrientes son: Hierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto.

CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

Muchos factores contribuyen para el desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas, algunos de éstos afectan las características del crecimiento.

Los recipientes de cultivo más comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plástico, madera y concreto son los más recomendables, incluyendo los estanques rústicos en áreas rurales son los sistemas más económicos.

En cultivos masivos la aereación es un factor muy importante para la homogenización de los nutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, ésto también depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento.

Otro factor importante es la penetración de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetración de la luz es más efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyección de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosintético.

Para muchas especies de Diatomeas la temperatura óptima oscila entre los 15 y 20°C, pocas especies de esta familia crecen a más de 28°C, las cloroficeas pueden soportar altas temperaturas; un ejemplo es el cultivo masivo a la intemperie de Chlorella saccharophila, cuyas temperaturas oscilan entre 12.5 – 30°C (Hirata et al., 1974, 1975, 1977; Torrentera, 1983).

El crecimiento y la división celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas de iluminación y obscuridad) en relación también a la temperatura, por ejemplo en Diatomees a 20°C y 1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable

CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE ALGAS UNICELULARESUTILIZADAS EN ACUACULTURA (COLL-MORALES J., 1983)

GENERO CICLOTEMPERATURA OPTIMA

DIAMETRO MEDIO

Phaeodactylum (diatomea) 10 h 25°C 10.4μ

Skeletonema (diatomea) 13.1 h 18°C >20μ

Dunaliella (cloroficea) 24 h 16°C 17.8μ

Chlorella (cloroficea) 7.7 h 25°C 5μ

Tetraselmis (cloroficea) 18 h 18°C 18.4μ

Monochrysis (crisoficea) 15.3 h 20–25°C 10μ

Isochrysis (crisoficea) 30.2 h 20°C 10.2μ

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, además de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duración del ciclo celular como los requerimientos de temperatura son suceptibles de variación mediante selección de variedades.

REQUERIMIENTOS PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

  REQUERIMIENTOSCOMPUESTOS QUIMICOS

VALORES

FísicosLuz  

2,000 – 4,000 lux

Temperatura   15 – 22°C

Salinidad   0.37‰

pH   7 – 9

Redox    

Nutritivos

C CO2CO3≃ g/100 ml

O, H O2H2O g/100 ml

N N2NH4+ NO3 g/100 ml

P PO4≃ g/100 ml

S SO4≃ g/100 ml

Na, K, Ca, Mg Sales g/100 ml

Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales mg/100 ml

Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al, et

Sales μg/100 ml

VitaminasB12, tiamina, biotina

μg/100 ml

En esta tabla se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus valores aproximados. En cada caso habrá que estudiar los reqùerimientos particulares de la especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por lo que estos datos son sólo orientación (Kinne, 1979).

El fotoperíodo es un factor que regula la división celular, en diatomeas la reproducción asexual (división) ocurre durante el período de luz y éste es acelerado bajo iluminación continua. En contraste las especies formadoras de auxosporas (ésporas sexuales), dan lugar a células del mismo tamaño y ésto ocurre en el período de obscuridad. Por lo tanto, el período de iluminación puede ajustarse de acuerdo a los objetivos del cultivo: el fotoperíodo continuo (horas de iluminación prolongada) produce crecimientos rápidos, un fotoperíodo con horas de luz y obscuridad semejante al fotoperíodo solar mantiene un crecimiente normal y saludable.

En la Table 7 se muestran las características de algunas de las especies de microalgas unicelulares utilizadas en acuacultura para la nutrición de moluscos y crustáceos.

Además del control de los parámetros antes mencionados es necesario considerar que para el establecimiento de un sistema de producción de alimento vivo es importante el dominio de las técnicas de aislamiento, purificación y mantenimiento de cepas, así como el conocimiento de la fisiología, ciclo de vida, bioquímica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y sobre todo su contenido nutricional para poder llevarse a niveles masivos de producción para fines acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de microalgas.

MEDIOS DE CULTIVO

Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las fórmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores depende del lugar donde se colecta ésta, y el tiempo de almacenamiento de la misma.

Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales fórmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta fórmulas específicas para familias como la fórmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para

diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de producción masiva (minerales, enriquecidos y orgánicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16.

El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio. En términos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades.

Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas (vitaminas, aminoácidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxótrofas, es decir que no sintetizan por medio de la fotosíntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas.

TABLA 9. MEDIO CHU 10 (MODIFICADO POR GERLOFF)(0. UMEBAYASHI, 1975)

(Recomendado para aislamiento de microalgas de hábitats oligotróficos y eutróficos)

Ca(NO3)2 0.04%

K2HPO4 0.01%

Na2CO3 0.02%

MgSO4.7H2O 0.025%

Na2SiO3 0.025%

Citrato de Fierro Amoniacal 0.005%

NOTA: Puede usarse para medio solidificado

Agar-Agar 1.0%

TABLA 10. MEDIO ENRIQUECIDO

MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910)

Solución A:

KNO3 20. 2 g

H2O 100 ml

Solución Na2HPO412H2O 4 g

B: CaCl26H2O 4 g

HCl conc. 2 ml

FeCl3 2 ml

H2O 80 ml

Agregar 2 ml de la Solución A y 1 ml de la Solución B a un litro de agua de mar natural, y calentar a 70°C por 20 minutos.

MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b)

 

NaNO3 10 mg

Na2HPO412H2O 2 mg

Extracto de suelo 5 ml

Agua de mar 100 ml

MEDIO ERD-SCHREIBER

 

*Agua de mar 1 litro

Extracto de suelo 50 ml

NaNO3 0.2 g

Na2HPO4.12H2O 0.03 g

* Se recomienda usar el agua filtrada y pasteurizada,y adicionar los ingredientes.

TABLA 11. MEDIO DE YASHIMA (SISFFAA, 1964a)(Para cultivo masivo de cloroficeas marinas)

Sulfato de Amonio (para la agricultura 21%)

 

100 g/t

Superfosfato de Calcio (para la agricultura 21%)

15 g/t

Urea (para la agricultura 21%) 15 g/t

Clewat 3230–50 g/t

Componentes de Clewat 32:

FeCl2 (como fuente de Fe)0.385%

 

ZnCl2 (como fuente de Zn)0.166%

MnCl2 (como fuente de Mn)0.775%

CoCl2 (como fuente de Co)0.017%

CuSO4 (como fuente de Cu)0.007%

(NH4)6Mo7O24 (como fuente de Mo)0.632%

H3 BO3 (como fuente de B) 2.470

%

EDTA0.005%

MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975)

Medio de Yashima (en la misma concentración)

Peptona 50 g/t

 Peptidasa

0.005%

Diaminasa0.005%

TABLA 12. YANASE & IMAI (1968) PARA Monochrysis lutheri, Platymonas sp.,Nitzschia closterium, Chaetoceros calcitrans

NaCl 18 mg Metal Mix* 30 ml

KC1 600 mg Fe (as Cl-) 100 μg

NaNO3 500 mg Tris 1 g

MgSO4 . 7H2O 5 g Vit.B12 3μg

Ca (as Cl-) 100 mg Na2 SiO3 80 mg

K2HPO4 30 mg Vitamin Mix† 1 ml

    H2O 1 l

* Mezcla de metales 100 ml, contanido: Na2 EDTA, 100 mg; Fe, 1 mg; Zn, 0.5 mg; Mn, 4 mg;Co, 0.01 mg; Cu, 0.004 mg; B, 20 mg.† Mezcla de vitaminas 50 ml, contenido: B12, 10 μg; biotina, 50 μg; B1, 5 mg

TABLA 13. MEDIO DE GUILLARD & RHYTER (PARSONS & STRICKLAND, 1961)

A. SOLUCIONES NUTRIENTES

1. Disolver 0.08 gr de clorhidrato de Cobalto CoCl2.6H2O y 0.8 gr de Sulfato de Cobre CuSO4.5H2O; en 100 ml de H2O destilada.

2. Añadir 1 ml de solución A.1. a aproximadamente 800 ml de H2O destilada, que previamente se le ha adicionado:

0.2 gr de Tricloruro Férrico FeCl3.6H2O

0.06 gr de Sulfato de Zinc ZnSo4.7H2O

0.12 gr de Sulfato de Manganeso MnSO4.H2O

0.03 gr de Molibdato de Sodio Na2MoO4.2H2O

3. Añadir 1.2 gr de Etilenodiaminotetracetato Disódico (EDTA) diluído a cerca de 900 ml de H2O destilada.

4. Ajustar el pH de la solución con Hidróxido de Sodio IN-Na(OH), hasta 7.5.5. Evitar la formación de precipitado, el cual puede elevar la adición de mucho

alcali.6. Añadir 10 gr de Nitrato Potásico KNO3 y 1.4 gr de Fosfato Dihidratado de

Potasio KH2PO4.7. Diluir la solución a 1 litro y en autoclave a menos de 15 libras de presión por 15

minutos.8. Guardar la solución en botellas de vidrio en la obscuridad.

TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION

La aplicación de los siguientes métodos para una colecta natural de algas microscópicas produce cultivos monoespecíficos (de una sola especie) o axénicos (libre de contaminantes). Aunque tales métodos son sencillos sin embargo, la preparación de cultivos axénicos requiere paciencia y perseverancia.

A continuación se brinda una breve descripción de algunos de los principales métodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas.

Entre los métodos de aislamiento más usados se nombran:

Pipeta capilar (simplificado). Rallado en agar. Diluciones seriadas

Entre los métodos de purificación más conocidos tenemos:

Lavado. Antibióticos. Potasio telúrico.

1. AISLAMIENTO

Pipeteo capilar

Se utiliza para separar microalgas mayores de 10μ, mediante una pipeta construida con un tubo capilar, a través del microscopio óptico se “pesca” las células y se separan en pequeñas gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escavados.

Fig. 1) Método de filtración a través de una columna empacada con algodón.

Rayado de Placas de Agar

Se transfieren pequeñas gotas de la muestra(microalga) con una asa de siembra, extendiendo por estrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solución nutritiva para microalgas y con una relación de 1–1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminación a 18–20°. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estrías o bien, se transfiere a medios líquidos en subcultivos sucesivos para su purificación, de tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota, es recomendable combinar la técnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonales (de una sola colonia o célula) y poder establecer el cultivo monoespecífico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Método de Hocking o de la micropipeta a medios líquidos.

Fig. 2) Método de aislamiento y purificación de microalgas en placa de agar.

Diluciones seriadas

Esta técnica es selectiva y se emplea para obtener a las especies predominantes y/o más competitivas en una muestra ,a su vez por la misma razón se eliminan fácilmente los menos abundantes que podrían ser considerados de escaso interés debido a su crecimiento aparentemente inferior.

La técnica consiste en hacer diluciones progresivamente decrecientes de orden de 1:10 a partir de la muestra original. Para este fin se evalúa primeramente por conteo directo el número de cel. /ml de la muestra, haciendo diluciones sucesivas hasta lograr concentraciones teóricas de fracciones de células en la última dilución.

Fig. 3) Aislamiento y purificación de microalgas por el método de diluciones sucesivas y subcultivos repetidos.

Aislamiento mediante micropipeta

Es una de las técnicas más simples para el aislamiento de forma microscópica. Se usan micropipetas para obtener células individuales mediante una serie de lavados esteriles.Las micropipetas puedes ser tubos capilares de 3-4 mm de diámetro.El método consiste en tomar una muestra de agua en un frasco transparente y enriquecerlo con nutriente, esperar 1 a 2 días para que crezca, se procede a observar en el microscopio, luego se procede a separar individualmente las microalgas una vez que se certifica que se tiene una sola célula y se procede transferirla en medio de agua de mar esteril,filtrada y enriquecida.

Fig. 4) Aislamiento mediante micropipeta y el uso de microscopio.

2. PURIFICACION

Como ya se mencionó al describir las técnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el cultivo a través de las resiembras clónales sucesivas, pero además es recomendable entre otros métodos el uso de antibióticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano que estén contaminando el cultivo de microalgas de nuestro interés.

Tratamiento con antibióticos

Puede usarse un antibiótico o una combinación de éstos para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos que se adhieren a las células algales. El presente procedimiento corresponde a uno descrito por J. R. Stein en su texto “Handbook of phycological methods”:

a) Preparar la solución de antibióticos, disolviendo primero 100 mg de penicilina G y 50 mg de sulfato de estreptomicina juntos en 10 ml de agua destilada. Agregar a este preparado 10 mg de cloranfenicol que ha sido disuelto primero en 1 ml de etanol al 95% y agitar bien.

b) Filtrar esta solución rápidamente con filtro de membrana (0.2 - 0.45 µ).

c) Colocar 1ml de cultivo algal contaminado en cada uno de los seis Erlenmeyer (fiolas) de 125 ml que contienen 50 ml de medio de cultivo estéril.

d) Agregar uno de los siguientes volúmenes de la solución de antibiótico en cada fiola: 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ml. Esto provee concentraciones de penicilina de aproximadamente 20 a 500 mg/l. y los niveles que corresponden a los otros 2 antibióticos.

e)Las fiolas debidamente tapadas son puestos bajo condiciones favorables de crecimiento.

f) Después de 24 - 48 horas asépticamente transfiera algunas unidades algales de cada fiola a tubos de ensayo conteniendo medio de cultivo estéril y libre de antibióticos. Hacer esto por triplicado en cada intervalo de tiempo.

g) Colocar estos tubos en condiciones favorables de crecimiento. Chequear los tubos y hacer pruebas de contaminación bacteriológica después de 2 y 3 semanas,

En ocasiones las algas pueden contaminarse con otras especies algales como las verde - azules y estas pueden ser eliminadas usando antibióticos. Medios de cultivo conteniendo 25 ppm. de estreptomicina pueden resultar efectivos.

El uso de antibióticos requiere cuidado en la concentración de los agentes químicos y

en la duración del tiempo en que las algas son expuestas al tratamiento.

Fig.5) Purificación: Secuencia de un tratamiento con Antibióticos

Otros antibióticos pueden ser usados para purificación como las sulfonamidas. Para comprobar la presencia de los contaminantes se puede recurrir a la directa observación en el microscopio de contraste de fase:

1. Asépticamente tome muestras del cultivo de algas.

2. Colóquelas en láminas portaobjetos estériles y si es necesario agregar medios de cultivo estériles a las muestras.

3. Cúbralos con laminillas cubreobjetos estériles.

4. Observe al microscopio equipado con iluminación de contraste de fase.

5. Usando el mayor aumento posible: 20X/10X /40 aumento, buscar la presencia de microorganismos en la muestra.

Tabla.1. Antibióticos usados para la Purificación de Cultivo de Microalgas

Bibliografía

Handbook of Phycological Methods, Culture Methods Band Growth Measurements. Janet R. Stein. 1973.

Illustration of the Marine Plankton of Japan. Dr. I. Yamaji. Third Edition, July 1984. Tecnología de Cultivo de Microalgas. Eduardo Uribe T.Universidad Católica del

Norte. Coquimbo, Chile 1992 http://www3.inecol.edu.mx/solabiaa/ARCHIVOS/documentos/relbaa/RELBAA_-

_V2N2.pdf#page=16 http://bioreactorcrc.wordpress.com/2011/05/06/diseo-de-foto-bioreactores-para-el-

cultivo-micro-algas-oleaginosas-parte-1-teora-y-generalidades/ http://es.slideshare.net/julolisapa/microalgas-2-bach http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/ab473s02.htm