biotecnologia de la reproduccion

Transferencia de embriones

Prefacio Con la finalidad de incrementar la tasa reproductiva de la hembra bovina se desarroll la transferencia de embriones hace 20 aos. La experiencia obtenida en ese tiempo indic que el efecto de la transferencia de embriones sobre la multiplicacin de la descendencia es limitado, sin embargo permiti el desarrollo de una nueva constelacin de biotecnologas al permitir disponer de embriones en estadios tempranos durante su trnsito uterino. En la actualidad los embriones bovinos son congelados, divididos, clonados, microinyectados y cultivados in vitro durante un tiempo ms o menos prolongado. La necesidad de disponer de un gran nmero de embriones en estadios ms tempranos, durante su trnsito oviductal, motiv el estudio y desarrollo de su pro-duccin in vitro. Este libro fue escrito para mdicos veterinarios, genetistas, bilogos, estudiantes de medicina veterinaria y biologa, interesados en los fundamentos bsicos e implementacin prctica de la manipulacin embrionaria como as tambin en los actuales mtodos biotecnolgicos de la reproduccin bovina y su impacto gentico. El contenido del mismo fue dividido en tres partes para su mejor desarrollo y comprensin. La primera parte describe en detalle la informacin descriptiva, el modus operandi y los resultados obtenidos y esperables con el empleo de la transferencia de embriones. Se dio especial importancia a la descripcin y discusin de los diferentes mtodos y tcnicas como as tambin a los tratamientos ms empleados. En la segunda parte se presentan las biotecnologas asociadas que son aplicadas en la prctica y las que se encuentran an en la fase experimental. De las tcnicas aplicadas en la rutina mdicoveterinaria los autores hacen referencia a las que fueron desarrolladas o aplicadas en sus laboratorios y en los de otros autores. De aquellas sobre las que no existe an informacin suficiente en la especie bovina, se recurri a la descripcin en otras especies. En la tercera parte se hace referencia a las aplicaciones de las biotecnologas descriptas en la produccin animal, considerando estrictamente sus efectos sobre el mejoramiento gentico. Es nuestro deseo que este libro contribuya a responder a las necesidades e interrogantes de profesionales y estudiantes y con ello a desmistificar la tcnica de la transferencia de embriones y sus biotecnologas asociadas en la especie bovina.

G.A. Palma

G. Brem

Munich, enero de 1993

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Indice de autores

Indice de autores

Ricardo H. Alberio. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria, Prof. titular de la Ctedra de post-grado de Fisiologa Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata. Tcnico del Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA), Balcarce. Depto. de Prod. Animal, Unidad Integrada FCA-INTA. C.C. 276. 7620 Balcarce, Buenos Aires. Repblica Argentina. Ulrike Berg. Farmacloga, Dr. en Ciencias Naturales. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian, Munich. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen 22. Repblica Federal de Alemania. Gottfried Brem. Med. Vet., Ing. Agr., Dr. en Medicina veterinaria. Prof. titular de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Repblica Federal de Alemania Miembro ordinario de la Academia de Ciencias de Rusia. Prof. invitado de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Budapest, Hungra. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen 22. Repblica Federal de Alemania. Jorge Cabodevila. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. Adjunto de la Ctedra de Obstetricia y Ginecologa de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Centro de la Pcia. de Buenos Aires. Pinto 399, 7000 Tandil, Buenos Aires. Repblica Argentina. Annette Clement-Sengewald. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro cientfico del Laboratorio para la investigacin del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungs-forschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstrae 27, 8042 Badersfeld. Repblica Federal de Alemania. Peter Dovc. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Miembro del staff cientfico del Instituto de Produccin Animal de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Repblica Federal de Alemania. Institut fr Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt Mnchen. Veterinrstre 13, 8000 Mnchen. Repblica Federal de Alemania Horst Krulich. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Prof. emrito de la Ctedra de mejoramiento Animal y Director del Instituto de Produccin Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Dr. honoris causa otorgado por la Universidad de Gdll, Hungra. Dr. honoris causa otorgado por la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Alemania. Institut fr Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen. Repblica Federal de Alemania. Gustavo A. Palma. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. libre de la Ctedra de Anatoma y Fisiologa Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata, Argentina. Miembro de la carrera de investigador cientfico del Concejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), Argentina. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro cientfico del Laboratorio para la investigacin del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungsforschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstrae 27, 8042 Badersfeld. Repblica Federal de Alemania.


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Transferencia de embriones

Horst Reichenbach. Med. Vet., M.Sc., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universitt, Mnchen. Hackerstrae 27, 8042 Badersfeld, Repblica Federal de Alemania. Gonzalo Rivera. Med. Vet., becario del Concejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), Argentina. Laboratorio de Reproduccin y Lactancia (LARLAC, CONICET). CC. 855, 5500 Mendoza, Repblica Argentina. Sergio Torquati. Med. Vet. Centro Integral Baha Blanca de Inseminacin Artificial (CIBBIA). Ruta 35. Km 9,5; 8000 Baha Blanca, Buenos Aires. Repblica Argentina. Eckard Wolf. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad LudwigMaximilian de Munich. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen 22. Repblica Federal de Alemania.

Abreviaturas y smbolos

Abreviaturas y smbolos

AA ADN AMPc ADNc ARNm B Be Bp BSA Bt PT, BV CE CG Cito B CL COB COB Cov G d DMSO E E2 ec eCG EPE-HAP ES FD FF FIV FSH FSH-p GH G/L GnRH h h2 HCG HE HMG IA IETE IGFI LH LUV M Mt MC Mc MCCG MCCO

aminocidos cido desoxirribonucleico adenosin monofosfato cclico cido desoxirribunucleico complementario cido ribonucleico mensajero blastocisto blastocisto expandido blastocisto protruido bovine serum albumin, albmina srica bovina blastocisto temprano padres de toros ciclo estral clulas de la granulosa citocalasina B cuerpo lteo clulas del oviducto bovino complejo ovocito blastmero covalencia progreso gentico da dimetilsulfxido embrin estradiol clulas embrionarias equine corionic gonadotropin, gonadotrofina corinica equina extracto de pituitaria equina clula embrionaria primordial totipotente folculo dominante fluido folicular fecundacin in vitro follicle stimulant hormone, hormona folculoestimulante follicle stimulant hormone porcine, hormona folculoestimulante de origen porcino growth hormone, hormona de crecimiento, somatotrofina intervalo generacional gonadotropin realising hormone, hormona liberadora de gonadotrofinas hemi heredabilidad human corionic gonadotropin, gonadotrofina corinica humana hemi-embriones gonadotrofina menopusica humana inseminacin artificial International Embryo Transfer Society, Sociedad internacional de transferencia de embriones Insulin like growth factor I, factor de crecimiento similar a la insulina hormona luteinizante luz ultravioleta mrula mrula temprana microciruga mrula compacta medio condicionado con clulas de la granulosa medio condicionado con clulas del oviducto

Palma & Brem

Transferencia de embriones y biotecnologa

MCI MFCZ MOET MP MPM MV, KM OD OI OT pb, pB PBS PBSS P4 PCR PEG PGF2 PIV PLFR PMSG PV, KV RN RS SOTE SFB SVC STH TL TE VEM VNTR ZP

masa celular interna medio de fusin celular de Zimmermann multiple ovulation and embryotransfer, ver SOTE membrana pelcida modified Parker's medium, medio Parker modificado madres de vacas ovario derecho ovario izquierdo oxitocina pares de bases solucin fosfatada bufferada solucin fosfatada bufferada con suero progesterona polymerase chain reaction, reaccin en cadena de polimerasa polietilenglicol prostaglandina F2 produccin in vitro restrictions-fragment-large polymerase pregnancy mare serum gonadotropin, gonadotrofina srica de yegua preada padres de vacas reproduccin normal respuesta superovulatoria superovulacin y transferencia de embriones suero fetal bovino suero de vaca en celo somatotropin hormone, hormona somatotrfica tirodes lactato transferencia de embriones valor de la eficiencia de los mellizos variable numberd tandem repeats zona pelcida

Biotecnologa

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BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMALA. Clement-Sengewald, G. Palma & G. Brem Introduccin La mayor intervencin del hombre en el pool gentico de los actuales animales domsticos fue a travs de la domesticacin. Ninguna otra medida productiva puede o podr afectar el componente gentico poblacional en una forma tan completa. En los comienzos de la domesticacin el hombre no produjo cambios en la reproduccin de los animales. De esta forma se mantuvo la seleccin natural. Posteriormente se observ que la reproduccin programada de los animales conduca a un aceleramiento de la seleccin. A travs del aprovechamiento de la variabilidad gentica podan criarse animales, que respondan mejor al fenotipo establecido, o sea aquellos que posean las caractersticas externas deseadas. Con el tiempo se establecieron programas de mejoramiento que no respondan solamente al deseo de una persona sino de varias y ms tarde al objetivo de agrupaciones de criadores. El empleo de la gentica poblacional como tambin de los mtodos gentico-estadsticos permiti, junto con la aplicacin de la inseminacin artificial, el desarrollo de exigentes programas de seleccin y evaluacin de la descendencia. Con el desarrollo de la biotecnologa se alcanz un nivel, en el cual es posible la manipulacin dirigida del genoma o determinados genes con mayor rapidez. Es posible adems alcanzar la manifestacin de algunas particularidades productivas, las cuales con la seleccin natural o programas de mejoramiento seran difciles de alcanzar. Las tcnicas reproductivas, mediante las cuales es posible afectar el genoma de los animales (cuadro 2), se diferencian de las tcnicas gnicas, las cuales se ocupan de los genes en forma individual (cuadro 3). Tcnicas reproductivas Las tcnicas reproductivas abarcan la inseminacin, la congelacin de semen, la micromanipulacin, la produccin in vitro, el clonado y la congelacin de los embriones. Los tratamientos hormonales de induccin y sincronizacin del celo de las hembras receptoras de semen y embriones como as tambin de las donantes de embriones, garantizan en muchos casos que las mencionadas tcnicas se cumplan con xito. La tcnica reproductiva de mayor aplicacin es la inseminacin artificial (IA) y con ella la congelacin de semen. A pesar de la resistencia presentada originalmente por razones ticas se reconoci rpidamente una de las ventajas de la IA con la disminucin de las enfermedades infecciosas transmitidas a travs de la cpula. Con la misma celeridad se observ que era posible obtener una mayor descendencia de un solo macho dividiendo el semen de un eyaculado en porciones e inseminando con las mismas varias hembras simultneamente. De esta forma es posible aprovechar el potencial de los machos en forma intensiva y mejorar as la estimacin del valor gentico de los reproductores, dado que las particularidades heredables son mejor evaluadas con un gran nmero de hijos. La conservacin de semen congelado en nitrgeno lquido posibilit su almacenamiento durante dcadas, sin que ello afecte la fertilidad del mismo. La IA juega, junto con la congelacin de semen, un rol de importancia en la produccin bovina. La inseminacin artificial en las especies ovina, porcina y equina no alcanz un significado equivalente al existente en la especie bovina. En las dos ltimas es necesario modificar an los mtodos empleados para mejorar los resultados. La tcnica de inseminacin artificial por medio de laparoscopa en la especie ovina permite actualmente obtener resultados satisfactorios, lo que abri las posibilidades del comercio internacional de semen. La transferencia de embriones es una tcnica reproductiva en constante desarrollo. Su evolucin es observable particularmente en la especie bovina. La TE asociada a la superovulacin de las donantes (captulos, II al VIII) puede aumentar considerablemente el nmero de la descendencia por donante y de esta forma multiplicar el componente gentico materno (captulo XVII). En la tabla 1 se resume el significado que tiene la transferencia de embriones actualmente en Europa. Lamentablemente seBiotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com

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Clement-Sengewald, Palma y Brem

dispone de poca informacin de la TE en pases sudamericanos aunque las actividades y comercializacin con embriones frescos y congelados son actualmente relevantes en Argentina (cuadro 1), Brasil y Paraguay. Tabla 1: Transferencias de embriones en Europa durante el ao 1991 (8th Scientific Meeting, A.E.T.E., Lyon, 11-12 sept. 1992) Embriones por donante tiles Transferidos (n) frescos % 5 62 5 54 4 59 6 32 3 43 4 71 6 49 5 50 3 50 6 63

Pais Alemania Blgica Francia Holanda* Inglaterra* Checoslovaquia Union Sovitica* Irlanda Espaa Italia

Lavajes de donantes (n) 4170 2169 7896 2521 2141 1507 4800 979 306 1060

9 8 8 s.i. s.i. 7 10 7 7 9

Congelados % 38 46 41 68 57 29 51 50 50 37

s.i.: Sin informacin; *: registros de la misma fuente del ao 1990 Produccin de terneros por medio de transferencia de embriones durante un ao (7.917.92) en la Repblica Argentina (Memorias de la Sociedad Rural Argentina, 1992) Raza Aberdeen Angus Holando Argentino Hereford Limousin Fleckvieh Otras Total Descendencia (n) 804 704 556 129 83 121 2897

Cuadro 1:

A travs de la TE es posible aumentar el progreso gentico, porque a travs del aumento del nmero de embriones y terneros el potencial gentico de la hembra puede reproducirse y emplearse con ms eficacia. Razas y animales exticos pueden, segn las necesidades, reproducirse rpidamente. La eficiencia de los programas de seleccin y cruzamiento aumentan considerablemente con la aplicacin de la transferencia de embriones. Junto con la TE es preciso tambin mencionar la congelacin de embriones por medio del mtodo estndar y vitrificacin (captulo IX). El almacenamiento de los embriones congelados se lleva a cabo en nitrgeno lquido (-196oC). De la misma forma que el semen los embriones pueden almacenarse durante dcadas. Las ventajas que ofrece esta tcnica es una mayor eficacia y ahorro en el uso de las receptoras en un programa de TE, facilidad en el transporte de los embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material gentico. De esta forma los animales nacen en el lugar de destino y se adaptan al macro- y microclimaBiotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com

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de la regin. La congelacin de los embriones permite la formacin de reservas genmicas en forma de bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservacin de razas en peligro de extincin, cuya produccin y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente costosos. Cuadro 2: Objetivos de las tcnicas reproductivas en el bovino

- IA y Congelacin de semen Combate y disminuye enfermedades sexuales Empleo intensivo del potencial gentico del macho y mejoramiento de la estimacin del valor gentico (prueba de la descendencia) - Sincronizacin del celo induccin de la ovulacin y el parto Facilidad en el manejo reproductivo y productivo Disminucin de la mortalidad neonatal - Superovulacin, TE, congelacin de embriones Optimizacin del potencial de la hembra Rpida reproduccin de individuos exticos o razas en peligro de extincin Formacin de bancos de reservas genmicas Facilidad en la importacin y exportacin del material gentico - Manipulacin y microciruga de embriones para la produccin de mellizos monocigotas y quimeras Aumento del nmero de animales nacidos por embrin recolectado Optimizacin de la estimacin del valor gentico Creacin de modelos de investigacin - Determinacin del sexo Seleccin del sexo de acuerdo a los objetivos establecidos - Produccin in vitro de embriones Ahorro de donantes Produccin de embriones de vacas donantes que no responden a los tratamientos superovulatorios - Clonado de embriones por medio de transferencia nuclear Variabilidad libre de recombinaciones de genotipos individuales Aumento del nmero de terneros por embrin La TE posibilit la microciruga de los embriones, con la produccin de mellizos monocigotas (captulo X) y quimeras a travs de la combinacin de mitades de embriones diferentes. Por medio de la divisin de los embriones es posible aumentar el nmero de embriones producidos en un programa convencional de TE de 0,6-0,7 a 0,9-1,2 terneros por embrin dividido. Los mellizos producidos de esta forma constituyen modelos adecuados en produccin animal e investigacin. Las pruebas llevadas a cabo con mellizos idnticos permite una mayor exactitud de la estimacin del valor gentico de los padres, dado que la varianza de los mellizos es menor que las de los hermanos enteros y medio hermanos (captulo XX). Posibilita tambin la evaluacin de la influencia ambiental sobre los reproductores; si los animales idnticos se cran en medios diferentes su condicin gentica idntica facilitar la determinacin de cada diferencia ambiental (foto 1).


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Foto 1: Mellizos monocigotas de la raza Fleckvieh producidos por medio de Micromanipulacin (BREM, captulo X) La produccin microquirrgica de quimeras puede llevarse a cabo de dos formas. En primer lugar a travs de la inyeccin de clulas en el blastocele de embriones, en este caso se espera que las clulas inyectadas tomen parte en el desarrollo del embrin. Otro mtodo es la produccin de quimeras a travs del agregado de embriones o hemi-embriones diferentes en una misma zona pelcida (figura 1). Las dos o ms mitades o embriones enteros a agregar son liberados de la membrana pelcida y posteriormente las combinaciones deseadas nuevamente transportadas a una zona pelcida comn. El nuevo embrin, producto del agregado, se organiza rpidamente y se transfiere de acuerdo con el programa convencional. Embrin I Embrin II Embrin I Embrin II

Fig. 1: Modelo de produccin de quimeras a partir de varios embriones

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Si se emplea como marcador el color de piel, la presencia de la quimera se determinar por los diferentes colores del pelaje (foto 2).

Foto 2: Quimera producida con las razas Fleckvieh y Murnau Werdenfelser (BREM, 1986) Las quimeras se emplean en la investigacin gentica bsica de mutaciones y fallas genticas dado que es posible establecer como se comportan dos lneas diferentes en un individuo y su efecto sobre el desarrollo corporal. Intensos trabajos de investigacin en los ltimos 10 aos hicieron posible la produccin in vitro (PIV) de embriones (captulo XI) y de la misma forma su cultivo hasta estadios transferibles en condiciones convencionales. Las ventajas de la PIV de embriones son numerosas: disminucin del costo de los embriones, disponibilidad de embriones en estadios tempranos de desarrollo a bajos costos, dado que con la produccin in vivo la recoleccin de los embriones del oviducto se lleva a cabo por medio de ciruga. El nmero de donantes pude reducirse. La PIV de embriones puede ser utilizada adems en aquellos casos en los cuales una vaca no puede ser sometida a los lavajes convencionales o debe ser sacrificada. Esto es particularmente importante cuando se trata de animales de alto valor gentico como as tambin razas en peligro de extincin (foto 3).

Foto 3:

Ejemplar de la raza Murnau Werdenfelser en peligro de extincin, obtenido por medio de la produccin in vitro de embriones (BERG, captulo XI)www.reprobiotec.com


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Hace pocos aos se emplea la tcnica de transferencia nuclear en la produccin de clones, esto es, la posibilidad de producir varios embriones genticamente idnticos (captulo XII). Con ayuda del clonado es posible transferir algunos embriones para probar los animales nacidos mientras otros tantos permanecen congelados. Si el resultado de las pruebas es positivo los embriones pueden descongelarse emplearse como donantes de blastmeros en un reclonaje. En teora se dispone de un nmero ilimitado de ncleos para nuevos reclonados. Las aplicaciones de esta tcnica son interesantes como numerosas: las pruebas de evaluacin con estos animales es ms exacta por la menor variabilidad gentica de los clones, posibilitando una evaluacin ms precisa de las influencias ambientales. Ahorra animales de experimentacin y de prueba (por ejemplo, descendencia) frente a aquellos con un menor vnculo familiar. Con la multiplicacin de animales de alto valor gentico puede acelerarse el progreso gentico. Adems es posible destinar un embrin para diagnosticar el sexo del clon, lo que permite seleccionar los animales producidos tambin por su sexo.

Tcnicas gnicas Las tcnicas gnicas conocidas tambin como de ingeniera gentica incluyen el clonado de genes, el anlisis de los mismos para el diagnstico de determinadas variantes gnicas, que llevan consigo particularidades positivas o negativas y la transferencia gnica (Cuadro 3). Cuadro 3: Objetivos de las tcnicas gnicas en produccin animal

- Produccin gnica de productos a travs de la transformacin de clulas de levaduras, de bacterias o de animales mamferos con un ADN recombinante in vitro - Formacin de un banco de genes para la conservacin de material gentico - Modificacin gnica de los microorganismos del rumen con el objeto de alcanzar una digestin ms eficiente y la disposicin endgena de producir componentes metablicos esenciales - Mtodos analticos (Anlisis gnico) Ayuda en la orientacin de anlisis gnicos posteriores Estudio de la relacin entre marcadores ADN e importantes caractersticas productivas - Diagnstico Estudio gentico y diagnstico de fallas genticas Determinacin de variantes gnicas definidas para caractersticas deseadas Determinacin de la identidad de la ascendencia de animales reproductores ("impresin digital ADN") - Transferencia de genes Mejoramiento de la calidad de productos animales Produccin de animales resistentes a enfermedades Mejora de la eficiencia productiva Produccin de protenas (Gene Farming) En la tcnica de produccin gnica de sustancias por medio de la transformacin de clulas de levaduras, de bacterias o de mamferos se introduce un ADN recombinante en las clulas a fin de capacitarlas en la produccin de protenas. De esta forma pueden producirse hormonas, vacunas y otras sustancias en forma idntica a la natural, pura y a bajos costos.Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com

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El empleo de microorganismos ruminales modificados gnicamente permiti reducir el nivel de hidrlisis de nitrgeno, la protelisis y la produccin de lactato regulando la relacin de acetato, propionato y butirato. A travs de los organismos ruminales modificados genticamente se espera una digestin ms eficiente y una mejora de la disponibilidad de aminocidos y vitaminas. Este mtodo de tcnica gnica se encuentra an en la fase de prueba y sometido a discusin sobre su libertad de aplicacin, dado que los microorganismos del rumen son liberados tambin en el ambiente. El anlisis genmico tiene el objetivo de describir una especie animal en forma progresiva y completa con ayuda de mtodos celulares y gnicos. El mismo pretende identificar los genes y analizar sus secuencias de nucletidos para aclarar finalmente el modo de efecto de genes o complejos de ellos (captulo XV). Contrariamente a la especie humana, sobre la cual se discute el conflicto tico de analizar la totalidad del genoma, ese aspecto no juega rol alguno en produccin animal. Un anlisis completo significa, sin embargo, costos y esfuerzos muy grandes, razn por la cual slo se llevan a cabo anlisis parciales. Los conocimientos obtenidos en la especie humana, ms avanzados que en otras especies, convierten a la primera en una modelo adecuado para el anlisis del genoma de los animales de inters zootcnico. Una vez identificado el gen deseado pueden buscarse las variantes naturales del mismo y emplear los animales portadores en programas de mejoramiento. El nmero de genes identificados en animales de inters productivo no supera en la actualidad los 100. En el hombre se identificaron hasta ahora ms de 3000 genes. El anlisis genmico comprende 3 reas: Mapa gnico Anlisis de acoplamiento Caracterizacin individual de genes

El mapeo gnico pretende determinar la localizacin de caractersticas heredables en los cromosomas y establecer una relacin lineal entre ellos. Entre los mtodos de mapeo se incluyen el empleo de hbridos celulares, la hibridacin in situ, la microdiseccin cromosmica y la subordinacin de una caracterstica al efecto conjunto de varios genes. Los mapas gnicos sirven de orientacin en el genoma. Cuanto ms exacto es el conocimiento de la estructura y localizacin individual de los genes, ms exacto es el reconocimiento de la totalidad del genoma. El anlisis de acoplamiento gentico pretende determinar la distancia entre dos localizaciones gnicas. En produccin animal se intenta establecer una relacin entre marcadores ADN y caractersticas de importancia productiva. De esta forma el marcador ADN se convierte en el punto de partida del segmento que contiene el gen de inters. Actualmente se dispone de dos mtodos de anlisis de acoplamiento gentico: polimorfismo del largo del fragmento de restriccin (restrictions-fragment-large-polimorphisms) PLFR y el VNTRs. El PLFR basa su actividad en la capacidad de las enzimas de restriccin de cortar una cadena de ADN slo en aquellas posiciones donde se encuentran las secuencias de bases que responden a la enzima de restriccin. Si se modifican slo los pares de bases, se originan fragmentos de restriccin de diverso largo, que pueden separase con ayuda de electroforesis en gel. Si la caracterstica en cuestin aparece en una familia, se aisla el ADN de cada uno de los miembros y con ayuda de enzimas de restriccin y una sonda de ADN se producen muestras fragmentadas. Cuando el marcador gentico se encuentra ubicado lo suficientemente cercano al segmento de ADN que codifica la caracterstica a estudiar, se heredar siempre junto con l. Esto es, estn acoplados. El segundo mtodo de acoplamiento es el conocido como "variable numberd tandem repeats" (VNTR). Estas son pares de bases muy cortas ordenadas en tandem con diferente nmero de copias y que pueden estar distribuidas en gran nmero sobre todo el genoma. La diferencia de largo se establece por medio de PLFR. La diferencia se basa en que dada la frecuencia de su presencia con este mtodo se aumenta la posibilidad de establecer un acoplamiento. El tercer campo de anlisis genmico es el de la caracterizacin individual. Genes individuales deBiotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com

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importancia para la produccin animal son caracterizados en su estructura de secuencia ADN a fin de establecer un cuadro exacto de los fenmenos hereditarios a nivel molecular. Un ejemplo de ello es la aracnomegalia en la raza Braunvieh europea, gen letal con un ndice endmico de 5%. Etiolgicamente se supone un defecto en los genes responsables de la produccin del colgeno. Si ese gen fuera identificado a nivel molecular podra ser evaluada su presencia en cada reproductor de forma tal de eliminar a los portadores. Con el diagnstico gnico se pretende en produccin animal reconocer variantes gnicas, que influencian en forma positiva ciertas caractersticas de inters productivo. En la actualidad existen dos mtodos diagnsticos disponibles para determinar segura y rpidamente la presencia de esas variantes gnicas: hibridacin y sonda de ADN o PCR (Polymerase-Chain-Reaction). La hibridacin consiste en el corte de la hlice de ADN en fragmentos por medio de enzimas de restriccin, los fragmentos son separados electroforticamente. Genes individuales pueden ser identificados con ayuda de una sonda gnica, dado que sta se deposita en el fragmento de ADN. PCR permite obtener de un slo fragmento de ADN varios millones de copias en un lapso de pocas horas. Estas se hacen visibles con ayuda de una minielectroforesis, ahorrando el trabajoso mtodo de hibridacin. Con ambos mtodos de diagnstico gnico pueden identificarse variantes gnicas an cuando se presentan en estado heterocigota. Un ejemplo de ello es la determinacin del sexo de embriones, que se lleva a cabo con PCR antes de la transferencia (captulo XV). El principio del fenmeno conocido como impresin digital ADN se basa en que si el genoma total de los animales fuera cortado y evaluado con diferentes pruebas se observara que ningn animal es idntico a otro, respondiendo al mismo principio de la impresin digital. A ello se lo denomina polimorfismo del lugar de corte. El mismo est determinado por fenmenos de mutacin natural y tiene como consecuencia diferentes largos de fragmentos de restriccin, lo que establece un modelo individual para cada animal. En teora puede identificarse cada animal sin riesgo de confusin. Dado que el ADN se transmite a la descendencia y las mutaciones ocurren raras veces se emplea este mtodo para la determinacin de la ascendencia, ya que los hijos portan slo fragmentos de ADN que estn presentes en los padres. La transferencia de genes (captulo XIII) se estableci como tcnica a partir de la dcada de 1980 transfiriendo, en primeras experiencias, secuencias recombinadas a ratones. A partir de 1985 se inform sobre los primeros animales domsticos transgnicos. Para la transferencia gnica es importante que cada gen sea aislado, caracterizado y recombinado con elementos reguladores adecuados. Ello ocurre gracias a la ayuda de mtodos biolgico-moleculares. La transferencia gnica debe llevarse a cabo en lo posible en estadios embrionarios tempranos, a fin de que la estructura gnica se integre en todas las clulas corporales. Por esa razn el mejor momento del desarrollo del individuo es el estadio unicelular. Para llevar a cabo la transferencia de genes existen 3 tcnicas disponibles: la microinyeccin de ADN en el proncleo de los cigotos, la transferencia a travs de vectores retrovirales y a travs de clulas totipotentes transformadas genticamente. El espectro de aplicaciones de la transferencia gnica en produccin bovina es grande. En primer lugar pueden mejorarse la calidad o la composicin de sus productos. Ejemplos de ello son: la produccin de leche libre de lactosa para aquellas personas que sufren de insuficiencia de lactasa, la mejora en la composicin crnea de la res, la produccin de animales resistentes a enfermedades, la produccin de protenas importantes para el hombre en animales. En ese "gene farming" se acoplan promotores a interesantes estructuras gnicas (factores de la coagulacin, por ejemplo) y transfieren a animales que producirn la protena deseada. Adems se pretende modificar el equilibrio dinmico entre la biosntesis y degradacin de determinados productos a travs de enzimas claves para favorecer la produccin de ciertos productos de regulacin compleja. La investigacin y desarrollo de estas tcnicas significan un esfuerzo econmico de magnitud y una inversin de tiempo muy grande. Es de esperar, sin embargo, que los resultados brindarn importantes aportes a la produccin animal.Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com

Alberio

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MANEJO DE DONANTES Y RECEPTORAS R.H. Alberio Introduccin La produccin de embriones por las donantes y la transferencia a receptoras es el trabajo bsico de la transferencia de embriones. El manejo de las donantes para maximizar la produccin de embriones y el de las receptoras para tenerlas disponibles en el momento oportuno y para que tengan una buena fertilidad, forma parte de las tareas ms importantes de la TE. La evolucin hacia un sistema de manejo eficiente toma tiempo y paciencia y vara ligeramente de situacin en situacin.

Donantes El manejo de las donantes es uno de los puntos crticos. Si estas hembras no estn reproductivamente bien y en un adecuado estado de balance nutricional el programa puede fracasar antes de haber comenzado. Slo ocasionalmente se deber trabajar con vacas que carezcan de una ptima historia reproductiva o que tengan algn problema reproductivo determinado. Estos son casos especiales que no siempre se pueden rechazar y en los cuales las probabilidades de xito son menores. En tales casos se debe prevenir al propietario sobre el mayor riesgo y el animal ser tratado en relacin con el problema detectado. El manejo de la donante debe comenzar bastante antes de entrar en el programa y en esta etapa se deber cumplir con el propietario para que comprenda y aprecie cmo debe ser manejada la vaca y cul es su responsabilidad en ello. Por ejemplo, si la vaca ir a un Centro de TE es importante sealar al propietario la necesidad de establecer un seguro para la misma como se hace con un toro cuando va a un Centro de IA. Si la vaca tiene un ternero al pie, es conveniente que el mismo sea destetado o dejado con una vaca ama. Esto es particularmente importante si la donante es trasladada a un Centro de transferencia. No slo importa por la salud del ternero sino tambin para el mejor rendimiento de la madre a quien, adems del stress del cambio se suma el de la lactancia y cuidados del ternero. Muchas vacas ciclarn en forma irregular en los dos primeros meses posparto si estn bien nutridas y luego comenzarn a ciclar ms regularmente. Otras no ciclarn mientras tengan su ternero al pie aun estando bien nutridas y esto no constituye una patologa sino que es una respuesta natural en los mamferos. Una alternativa de manejo cuando hay varias donantes con cra, es llevar a los terneros a mamar una o dos veces por da. Algunas razas requieren esto ms que otras por lo que sus necesidades se establecern en funcin del conocimiento que se tenga de la misma. Las vacas primparas o las vacas viejas representan un problema particular en estos casos. En general se debera disponer de una buena historia reproductiva de una donante antes de incluirla en un programa de TE. Muchos productores no hablarn fcilmente de sus vacas problema y un cuidadoso cuestionario permitir detectar tales situaciones. Es frecuente escuchar por ejemplo "la vaca est seca porque el ternero muri de diarrea" o "que no ha parido este ao porque fue preparada para una exposicin". Lo que no se dice es que la muerte del ternero o la exposicin han ocurrido dos o tres aos antes y que luego de ese perodo la vaca no ha quedado nuevamente gestante. Con respecto al estado nutricional, uno de los problemas importantes en TE es paradojicamente el inverso al que ocurre en la vaca de cra; es decir el de las vacas demasiado gordas. El propietario deber ser advertido que este exceso de alimentacin tiene un efecto negativo sobre la reproduccin, la lactancia y la longevidad. Indicaciones referentes a las hembras que son trasladadas al Centro de transferencia Si bien la mayora de estas observaciones aparecen como obvias, es siempre conveniente hacer un

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repaso de las mismas para asegurarse de su cumplimiento. - Al llegar la vaca al centro, se debern tomar todos los datos posibles tales como da, hora, nombre del propietario y del transportista, tipo de animal, nmero de caravana o tatuaje, etc. Se determinar el estado general del animal, presencia de golpes, lastimaduras, etc. con lo que se har un informe firmado por el transportista. - Se pesar la vaca y su peso ser registrado. - Se har una revisacin completa del animal ya que, si bien el tracto genital es de particular inters, tambin se deber determinar la existencia de problemas de locomocin, ojos, abscesos, etc. los que sern informados al propietario. - Suele ocurrir que se envan vacas preadas por descuido o por simple desconocimiento de su estado. No hacer abortar a estos animales sin consultar a su propietario. - Si la vaca se encuentra con alguna infeccin o problema especial, se establecer un tratamiento adecuado para el caso previniendo nuevamente al propietario. - Cuando las vacas van a un potrero definitivo y reciben racin, es conveniente separarlas de acuerdo a edad, tamao, estado (seca o lactando), presencia o ausencia de cuernos. La racin como nico alimento o como suplemento de la pastura ser balanceada para permitir el mantenimiento del peso o ligeras ganancias de acuerdo con la edad, condicin corporal y estado fisiolgico. Un nfasis particular debe ser puesto en lo correspondiente a la suplementacin mineral. Se debe recordar asimismo que los animales necesitan ms energa en tiempo fro y hmedo que en clido y seco. La presencia de parsitos debe ser controlada cuidadosamente, ya que su incidencia es mayor en sistemas con alta concentracin de animales. Aproximadamente cada 60 das se deber realizar un tratamiento de rutina. La revisacin y cuidados de los animales deben ser exhaustivos y en general, no se cargan en los costos de mantenimiento. Cunto tiempo se debe mantener la vaca en el sistema? En general esto es una decisin del propietario y no se la debe tomar por l, a menos que la vaca ya no produzca embriones en cantidad que justifique continuar con los tratamientos o que haya aparecido algn problema. En principio, una vaca de alto valor gentico debe permanecer el mayor tiempo posible en un programa de TE. En cuanto a la produccin de embriones en forma permanente, el tiempo de estada vara en la mayora de los casos de una vaca a otra. Habr hembras que luego de uno o dos tratamientos disminuyen su produccin y otras que la mantienen por aos. En tanto una vaca produzca terneros cuyo precio justifique los costos, sta debera permanecer en el sistema. Muchos productores se preocupan sin embargo por el retorno de la vaca al servicio luego de un tiempo. Esto es correcto si slo es necesario un nmero determinado de embriones, pero se deber tener en cuenta que al poner la vaca en servicio se perder como mnimo un ao en la produccin de embriones. En ese ao la vaca puede morir, enfermar, quedar estril o ser superada por otra vaca. Es necesario sin embargo remarcar que desde un punto de vista biolgico no hay problemas para prear vacas que han estado sometidas a TE salvo que tengan un problema reproductivo especfico. Lo nico que puede ocurrir es que una vaca mantenida por largos perodos en un programa de TE necesite mayor nmero de inseminaciones para concebir. Esto suele ocurrir cuando hay un gran apuro en dar servicio a la vaca luego de la ltima recoleccin. Pero si se espera 2 3 meses, al primer o segundo servicio concebir sin problemas. Cuando una vaca est lista para retornar a su lugar de origen, se deber hacer un chequeo clnico completo y se elaborar un informe para el propietario. Cualquier problema observado durante la estada deber ser protocolado e informado.


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Receptoras Las receptoras forman una parte esencial del programa de TE y tambin uno de los problemas ms serios. Las buenas receptoras son caras, su mantenimiento costoso y su estado de salud es crtico para el xito de la TE. Ya sea que el programa se lleve a cabo en el campo o en un Centro, la obtencin y mantenimiento de las receptoras condicionarn el xito o el fracaso del mismo. Desde el punto de vista reproductivo una buena receptora es la hembra capaz de recibir un embrin y llevarlo a trmino. Ms an, la receptora deber ser capaz de parir sin grandes dificultades y luego alimentar al ternero de manera que le permita expresar su potencial gentico. En consecuencia, deber ser de buen tamao, tanto general como reproductivamente sana y de buena capacidad lechera. Esto no parece ser tan complicado, sin embargo tanto el tamao como la produccin de leche pueden tener significados diferentes. El tamao de la receptora depender del tipo de animal (embrin) que se transferir. De acuerdo con las tendencias actuales, particularmente en las razas para carne, se busca un gran tamao de ternero con pesos al nacimiento de 40 50 kg y an ms. Por lo tanto, no se deben tener dudas de elegir hembras de gran tamao. La edad de la receptora es un aspecto importante en el cual sin embargo, no hay coincidencias entre autores. En general se difiere en el criterio s es mejor una vaquillona que una vaca que ya ha parido alguna vez. Una forma de tomar el problema que puede resumir las diferentes posiciones es la siguiente: la vaquillona permite obtener tasas de preez ligeramente superiores, sin embargo los problemas de manejo durante la gestacin, el parto y la lactancia pueden producir resultados finales inferiores a los de las vacas. El uso de vacas multparas, con historia reproductiva conocida, que garantiza en cierta manera su comportamiento futuro, sumado al hecho de tener menos problemas de parto, hacen que ste sea finalmente el animal de eleccin. Se debe recordar que el genotipo del embrin transferido es diferente al que la vaca hubiese tenido en un servicio de la propia raza. Uno de los errores ms frecuentes que se cometen al hablar de las receptoras, es relacionar su tamao con el tamao al nacimiento del embrin transferido. Mucha gente cree que a mayor tamao de la receptora, mayor tamao de la cra y viceversa. El largo de gestacin y el peso al nacimiento son determinados genticamente y poco afectados por el ambiente uterino de la receptora. Su gentica no juega ningn rol en el tamao o estructura del ternero resultado de una transferencia. Este concepto no parece tener actualmente la certeza que se le asignaba aos atrs. Si bien es cierto que la gentica de la receptora no influye en la gentica del embrin, el ambiente uterino (especialmente el espacio o tamao) parece tener una interaccin con el genotipo del feto mayor que la supuesta. Algunos trabajos con animales de laboratorio han demostrado la magnitud de esta interaccin y la misma es coincidente con observaciones empricas provenientes de trabajos en bovinos. El punto importante es no poner embriones que darn nacimiento a terneros de gran tamao en vacas que son demasiado pequeas y en general disponer de vacas grandes que minimizan los problemas y permiten expresar el potencial de crecimiento fetal. De acuerdo con nuestra experiencia bajo condiciones extensivas los resultados con vacas jvenes (primera y segunda paricin) han sido superiores a los obtenidos con vaquillonas y los problemas de parto en las primeras son casi inexistentes. El programa de alimentacin de las receptoras es vital en el xito final de la transferencia. La hembra gestar y amamantar a los terneros de mayor valor del establecimiento. Criar terneros que son mayores a los que hubiera producido y deber proveer nutrientes en forma suficiente para que se exprese el potencial gentico del ternero. Ante estas consideraciones, la receptora preada no debe ser tratada como cualquier otra vaca de cra sino, al menos, como lo son las donantes.


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Uno de los puntos crticos es dnde conseguir vacas receptoras. Lo ideal es obtenerlas del propio establecimiento con el consiguiente conocimiento de su historia reproductiva. Estas vacas sern a su vez portadoras de inmunidad a las bacterias y virus locales y la pasarn a sus cras. Su stress ser menor al haber sido criadas en el lugar. En general las tasas de preez que se obtienen en este tipo de receptoras suele superar en 10 a 15% a las obtenidas en animales recientemente incorporados. Si la situacin anterior no es posible, se debern comprar receptoras. Desde el punto de vista reproductivo, la mejor receptora es la vaca preada o la que tiene un ternero al pie. Sin embargo, estas vacas cuestan ms y tienen mayores problemas de manejo que una vaca seca. Otra alternativa es comprar vacas con preez de 90 a 120 das, hacerlas abortar y usarlas como receptoras un mes ms tarde. Si bien esta metodologa se lleva a cabo sin inconvenientes, la desconfianza que este manejo implica hace que no sea aconsejable salvo que se est muy seguro en su aplicacin. En general se tiende a comprar vacas secas o vaquillonas, es a veces una buena opcin la compra de animales lecheros de descarte por baja produccin. El manejo de los animales en estas condiciones es mucho ms simple que con las vacas con cra. La compra de vacas exige precauciones y tratamientos particulares segn los casos. Una vaca preada o con cra "habla por s sola" y no requiere muchas ms informacin. Si se compra una vaca vaca, es importante saber si tuvo o no servicio, si el mismo fue por medio de IA o natural, cunto dur, etc. ya que en cada caso el problema puede ser diferente. Otro aspecto de importancia en la compra de vacas vacas, es verificar este estado ya que es frecuente encontrar una buena proporcin de ellas en condicin gestante. Una vez conseguidos los animales, stos sern sometidos a un exhaustivo examen clnico tanto general como ginecolgico en particular. Se tomarn muestras de sangre para determinar brucelosis y cualquier otra enfermedad endmica en la regin de compra. Se proceder a la correcta identificacin de cada animal establecindose una ficha individual. Si tienen preez reciente se abortarn con prostaglandina. Se harn las vacunaciones de rutina y se desparasitarn. Debern ser alimentadas de manera tal de ganar 500 a 600 g/da. Se detectar celo dos veces al da y si una vaca no ha sido vista en celo en 25 das, ser palpada de nuevo y se proceder de acuerdo al diagnstico. La sincrona de celos entre donante y receptoras puede obtenerse de formas diferentes. Si la disponibilidad de receptoras es muy alta (feed-lot) es probable que los animales en celo en un da determinado sean suficientes para los embriones producidos ese da. Esto no es lo ms frecuente. En general se procede a utilizar diferentes esquemas de sincronizacin artificial de los celos. Esto implica en primer lugar que las hembras sean cclicas y en segundo lugar, que alrededor de slo un 70% responder al tratamiento. Los tratamientos pueden seguir la rutina clsica de doble aplicacin de PGF2 con un intervalo de 11 das o alternativas de menor costo. Ejemplo: palpar un nmero mayor del necesario, elegir aquellas con cuerpo lteo e inyectar con PGF2alfa. Esta inyeccin se har el da previo a la inyeccin de PGF2alfa que reciben las donantes ya que en stas ltimas, la presentacin de celo es ms temprana y la ovulacin se puede extender durante un perodo que puede superar las 12 h. Cada receptora podr tener tres oportunidades "buenas" de quedar gestante. Esto significa haber sido transferida correctamente con un buen embrin. Las tasas de gestacin en la primera y segunda transferencia son similares y disminuyen en la tercera oportunidad. Luego de esto la cada es alta y no justifica el mantenimiento de esta vaca. La tasa de abortos en las receptoras preadas puede ser ligeramente superior a la de vacas servidas normalmente. Por ello nunca se deber entregar una receptora sin verificar previamente su estado de gestacin. En sntesis, el manejo de las receptoras incluye la eleccin de hembras de buena calidad que sean reproductivamente aptas, que tengan un buen nivel de alimentacin y estn libres de enfermedades. Los sistemas para conseguirlas son tan variados como oportunidades aparezcan. No olvidar que las receptoras constituyen uno de los puntos clave de la TE exitosa y por ello debern ser tratadas en consecuencia.


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PROGRAMA DE TRANSFERENCiA DE EMBRIONES J. Cabodevila Introduccin La transferencia embrionaria puede ser llevada a cabo en Centros de TE o directamente en el campo. Existen opciones intermedias, por ejemplo, que las donantes se encuentren en un Centro de TE donde se efecta la recoleccin de los embriones, las receptoras en un campo cercano, donde se llevan a cabo las transferencias. La organizacin del programa de TE es diferente en cada una de estas circunstancias. En todos los casos, comienza con la seleccin de las donantes y finaliza con el diagnstico de preez efectuado a los 60 das post-transferencia. En general, la seleccin de hembras como donantes es responsabilidad del productor y al profesional le queda la opcin de aceptarlas o no despus de: 1. 2. Efectuar una anamnesis exhaustiva considerando especialmente los antecedentes de superovulacin. Llevar a cabo un examen clnico a donde se considere el estado corporal y el estado de los rganos genitales (ver planilla de anamnesis y examen clnico de donantes).

Teniendo en cuenta la variabilidad que existe en la respuesta a los tratamientos de superovulacin y la importancia econmica que tiene la sincronizacin de las receptoras en la financiacin de un programa de TE, es conveniente efectuar el mismo, con un mnimo de 3 donantes. Para ingresar a un programa de TE, las donantes seleccionadas deben cumplir los siguientes requisitos: - Tener un perodo post-parto no menor a 60 das, habiendo registrado un ciclo previo de duracin normal. - Haber transcurrido ms de 50 das de un tratamiento superovulatorio anterior. - Es conveniente que al efectuar el tratamiento la donante no se encuentre con cra al pie. Para facilitar la comprensin del programa se debe considerar en primer trmino, la sincronizacin de celos en las donantes y luego en las receptoras. Sincronizacin de celos en donantes La forma ms comn de sincronizar el celo en las donantes es mediante la administracin de PGF2alfa o sus anlogos sintticos. Otra forma, es prolongar la fase luteal de manera artificial mediante la administracin de progesterona o progestgenos. Cuando se inyecta PGF2alfa, puede ocurrir: - Que todas las donantes presenten celo inducido o natural en los prximos 5 das. - Que no todas presenten celo. En ese caso, al administrar una segunda dosis de PGF2alfa 11 das despus, todas las donantes estarn en fase luteal. Luego de la presentacin del celo natural o inducido (da 0 -cero-), el tratamiento de superovulacin puede comenzar indistintamente entre los das 8 y 12 del ciclo estral. Es decir que, la induccin puede comenzar en el mismo momento en aquellas donantes en las que la diferencia entre sus das 0 no sea mayor de 4 das. En el cuadro 1 se presenta un programa de TE donde la sincronizacin de celos entre donantes y receptoras se lleva a cabo con PGF2 y la induccin a la superovulacin con FSH-p. La sincronizacin de celos en las donantes puede efectuarse tambin mediante el empleo de distintos dispositivos conBiotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com

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progesterona o progestgenos (PRID), esponjas intravaginales, implantes subcutneos (MAPLETOFT, 1987) o directamente inyectando diariamente progesterona durante 9 das (MAPLETOFT, 1982). La utilizacin de progesterona o progestgenos tiene la ventaja de poder comenzar el programa de TE en forma inmediata independientemente que la donante se encuentre en fase luteal.

Donantes

Receptoras1a dosis PGF2

Da 0 (natural o inducido) 07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p

Da 102

Da 112

07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p 2a dosis* PGF2

Da 122

07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2

Da 132

07h 3 mg FSH-p 19h 3 mg FSH-p + deteccin de celo deteccin de celo e IA

Deteccin de celo Da 0 = celo inducido

Da 142

Da 152

IA

Recoleccin de embriones mtodo no quirrgico

Da 71

TE

Cuadro 1: Programa de TE donde la sincronizacin de celos entre donantes y receptoras se lleva a cabo con PGF2alfa y la induccin a la superovulacin con FSH-p. * La sincronizacin de celos en receptoras puede efectuarse tambin administrando una sola dosis de PGF2alfa a hembras seleccionadas, mediante palpacin transrectal, por poseer un cuerpo lteo. En el cuadro 2 se describe un programa de TE donde la sincronizacin de celos en las donantes se lleva a cabo con progesterona o progestgenos. La sincronizacin de celos en las receptoras no sufre variaciones con respecto a lo descrito en el cuadro 1. Durante el perodo de deteccin de celo en donantes y receptoras, cuadros 1 y 2, es conveniente efectuar 3 detecciones diarias (maana, medioda, tarde) empleando el mtodo visual, 30 minutos en cada oportunidad.

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Da 0 Colocacin del PRID, esponja intravaginal o implante subcutneo

Da 7

07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p

Da 8

07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p

Da 9

07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 retiro del PRID, esponja o implante 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 07h 3 mg FSH-p

Da 10

19h 3 mg FSH-p + deteccin de celo deteccin de celo e IA IA

Da 0 = celo inducido

Da 11 Da 12

Da 18

Recoleccin de embriones mtodo no quirrgico

Cuadro 2: Programa de TE donde la sincronizacin de celos en las donantes se lleva a cabo con progesterona o progestgenos

Sincronizacin de celos en receptoras La transferencia de embriones puede efectuarse indistintamente sobre celo natural o inducido. Hay que tener en cuenta que para obtener buenos resultados de preez, el celo de las receptoras deber tener una sincronizacin no mayor a las 24 h con el de la donante, ver captulo VIII, (ROWSON y col., 1972). La sincronizacin de celos con PGF2 se describi en la Tabla 1. Cuando se efecta la administracin de una sola dosis de PGF2 a hembras seleccionadas por poseer un CL es necesario reservar un nmero mayor de receptoras por donante porque el diagnstico de CL mediante palpacin transrectal tiene una eficacia que vara entre el 71 y el 96% (FORTIN, 1989). En general, considerando que el promedio de embriones transferibles por cada donante es alrededor de 5, se sincronizan 8 receptoras por donante dado que algunas deben ser descartadas antes de efectuar la transferencia por razones diversas: quistes ovricos, celos anovulatorios, imposibilidad de cateterizar la crvix.Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com

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La donante presenta celo generalmente 48 h post primera administracin de la PGF2alfa. Se efectan 2 inseminaciones, la primera a las 8-12 h del comienzo del celo y la segunda IA, 12 h despus de la primera. En cada IA, se utiliza una dosis de semen de ptima calidad. Cuando la donante no presenta celo, la decisin a tomar depender de cada situacin en particular. Hay que tener presente que las donantes que sufren un desfasaje en la presentacin del celo o que directamente no presentan celo generalmente tienen una respuesta superovulatoria pobre o nula. Toda la informacin relacionada con donantes y receptoras se anota en las planillas respectivas. Luego de la transferencia, en las receptoras se controla el no retorno. A los 14 das post-transferencia puede extraerse una muestra de sangre para efectuar un dosaje de progesterona en plasma. Finalmente, a los 60 das post-transferencia se hace la palpacin transrectal. Manejo de la hormona El FSH-p se diluye en solucin fisiolgica estril (la relacin 1 mg = 1 ml, es la ms prctica) y se conserva refrigerada o congelada. Es conveniente fraccionarla de manera tal que la totalidad de la hormona descongelada sea utilizada en el mismo momento. Caso contrario hay que refrigerarla sin volver a congelarla. La hormona debe ser descongelada o calentada a temperatura ambiente.

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PROTOCOLO DE SUPEROVULACION DONANTE N : .......................... PROCEDENCIA: ...................... FECHA LTIMO CELO: ................ OBSERVACIONES ................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. .................................................................................................................................................................. SUPEROVULACION: DILUCION: ....................................... ESQUEMA DE TRATAMIENTO: .................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................... ..................................................................................................................................................................... FECHA DEL CELO: ...................... INSEMINACION ARTIFICIAL: 1o I.A.: 2o I.A.: OBSERVACIONES: ....................................................................................................... ............................................................................................................................................... TACTO PREVIO: OVARIO DERECHO OVARIO IZQUIERDO ........................................... ........................................... HORA: ............... DROGA: .................................... RAZA: ........................................ EDAD: ........................................

FOLICULOS: ............................................. CUERPOS LUTEOS: .................................. RECUPERACION DE EMBRIONES: DIA: ........

OBSERVACIONES: ....................................................................................................... . ............................................................................................................................................ EVALUACION MORFOLOGICA: EMBRIONES VIABLES: CLASIFICACION: ...........................................

EMBRIONES ANORMALES: ........................................... OVOCITOS SIN FERTILIZAR:........................................... TOTAL RECUPERADO: CELO POST-SUPEROVULACION: .................................... ........................................... firma del profesional


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TRANSFERENCIA DE EMBRIONES PROTOCOLO DE DONANTES Donante N : Raza: Edad: Peso actual: Fecha ltima participacin en Exposicin Rural: Comentarios: Nmero de partos: Fecha del ltimo parto: Para la ltima gestacin cuntos Servicios Recibi?.... Ha sido repetidora?: Fecha del ltimo celo: Fecha ltimo servicio: REVISACION CLINICA Estado Corporal: Estado de los rganos genitales en general: Estado de los ovarios en particular: O.D. Tamao: Folculos: Cuerpos Lteos: .............. .............. ............. O.I. .............. .............. .............. 1.Normal, 2.Distcico, 3.Ternero Muerto 4.Cesrea Tipo de parto: Procedencia:

Semen que se utilizar: Prueba de enhebrado con pipeta de I.A.: Fecha: Resultado:Biotecnologia de la Reproduccin www.reprobiotec.com

1. Pasa sin Dificultad 2. Pasa con Dificultad 3. No pasa

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ANTECEDENTES DE SUPEROVULACION

PRIMER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

SEGUNDO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

Total de Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado:

Total Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado:

TERCER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

CUARTO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:



Bibliografa FORTIN, M. 1989. Sincronizacin de celos en bovinos con prostaglandinas. Aspectos prcticos. CABIA, 15: 29-39. MAPLETOFT, R. 1982. Superovulation and recovery of ova from the bovine. Proc. Owners. Managers Workshop IETS, 37-50. MAPLETOFT, R.1987. Sincronization of donor cows and recipients. XI Jornadas de Reproduccin Animal del CIAVT. Venado Tuerto, Pcia. de Santa Fe. ROWSON, L., LAWSON, R., MOOR, R., BAKER, A. 1972. Egg transfer in the cow: Synchronization requirements. J. Reprod. Fert. 28: 427-431.


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Rivera

REGULACION NEUROENDOCRINA DE LA FUNCION OVARICA G. Rivera Introduccin. Control de la secrecin de gonadotrofinas La secrecin de gonadotrofinas hipofisarias (LH y FSH), es el principal factor que regula la funcin ovrica. Neuronas hipotalmicas especializadas (decapeptidrgicas), producen y secretan la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), que controla la funcin hipofisaria. A su vez, otros sistemas de neuronas (catecolaminrgicas y opioidrgicas) integran la informacin del medio externo (luz, temperatura, olores, interacciones sociales) e interno (concentracin de esteroides), y convergen sobre la neurona decapeptidrgica para regular su funcin (KALRA y KALRA, 1984). La GnRH es secretada en forma de pulsos discretos (CLARKE, 1988), que -va sistema porta-hipofisario- alcanzan la adenohipfisis. Los pulsos de GnRH determinan la secrecin tpica de pulsos de LH/FSH. Los esteroides ovricos afectan la secrecin de LH/FSH a travs de un mecanismo de retroaccin negativa (GOODMAN y KARSCH, 1980; CLARKE, 1988; PRICE y WEBB, 1988). La progesterona (P4) inhibe la liberacin de LH, que es secretada en pulsos caractersticos de baja frecuencia (1 c/6-8 h) y gran amplitud durante la fase luteal (RAHE, 1980). Cuando se produce la lutelisis, la concentracin de P4 en sangre disminuye y aumenta la frecuencia de los pulsos de LH. Estos, estimulan la produccin de andrgenos tecales, que son convertidos a E2 en las clulas granulosas. El E2 estimula la secrecin de pulsos de LH de alta frecuencia, pero de baja amplitud (GOODMAN y KARSCH, 1980; KARSCH, 1987). En el control de la secrecin de FSH interviene, adems de E2, la inhibina que es un pptido de origen ovrico (FINDLAY y CLARKE, 1987).

Regulacin endocrina de la funcin ovrica El ciclo estral (CE) de la vaca tiene una extensin media de 21 das. El celo dura aproximadamente 18 h y la ovulacin tiene lugar 15 h despus de la finalizacin del mismo. El CL se desarrolla y la secrecin de P4 aumenta entre el 4 y 12 da del ciclo y permanece constante hasta la lutelisis. La regresin del CL es variable y ocurre entre el 15 -20 da del CE (HANSEL y ECHTERNKAMP, 1972; LUQUE y col., 1983). Con el objeto de hacer un anlisis detallado de las interacciones endocrinas durante el CE, es conveniente dividirlo en 3 etapas (HANSEL y CONVEY, 1983): - fase folicular o de regresin luteal - fase periovulatoria - fase luteal

Fase folicular o de regresin luteal Las concentraciones de P4 en sangre, decaen abruptamente a niveles 1 ng/ml entre las 24-36 h de iniciada la lutelisis, ya sea en forma natural (DIELEMAN y col., 1986) o inducida por PGF2 (SCHAMS, 1987). La cada de las concentraciones de P4 por debajo de un determinado nivel "umbral", en presencia de concentraciones bajas de E2, elimina la retroaccin negativa sobre la secrecin de gonadotrofinas. Consecuentemente, aumenta la frecuencia de la descarga de LH y, en menor grado, la de FSH (SCHAMS, 1987). En esta fase, la hipfisis secreta aproximadamente 1 pulso de LH/FSH cada 60 min. El incremento en la frecuencia de pulsos de LH/FSH estimula el desarrollo de un folculo grande, que secreta cantidades crecientes de E2. El E2 se secreta en forma de pulsos, que son detectados en la vena cava (SCHAMS, 1987), concomitantes o inmediatamente despus de los pulsos de LH. El grado de desarrollo folicular al momento de la lutelisis determina el tiempo que transcurre hasta que un folculo completa su crecimiento y es capaz de producir cantidades suficientes de E2 como

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para iniciar el celo y la onda preovulatoria de LH (IRELAND y ROCHE, 1987). DIELEMAN y col. (1986) determinaron que un folculo con un dimetro

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