BIOSÍNTESIS COMBINATORIA PARA LA OBTENCIÓN DE NUEVOS FÁRMACOS ANTITUMORALES DE TIPO INDOLOCARBAZOL

César Sánchez, Alfredo F. Braña, Aaroa P. Salas, Carmen Méndez y José A. Salas.Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (I.U.O.P.A.) - Obra Social Cajastur,

y Departamento de Biología Funcional, Universidad de Oviedo.

Los indolocarbazoles son una familia de productos naturales aislados de diferentes organismos (bacterias, hongos, invertebrados marinos) y que poseen interesantes actividades farmacológicas. En particular, la rebecamicina y la estaurosporina son dos indolocarbazoles producidos por varias cepas bacterianas del grupo de los actinomicetos. Actualmente existen varios derivados de ambos compuestos que se encuentran en ensayos clínicos para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson) y ciertas patologías asociadas a la diabetes. Las actividades terapéuticas de estos compuestos se basan en su acción inhibitoria sobre ADN topoisomerasas (los derivados de rebecamicina) o sobre diversas proteína quinasas (los derivados de estaurosporina).

La biosíntesis combinatoria es una nueva estrategia, dentro de la ingeniería metabólica, que tiene como objetivo la producción de compuestos químicos de interés que sean inaccesibles o difíciles de obtener por métodos de síntesis química convencional. Para ello, se parte de un conjunto de genes (procedentes de diferentes organismos), cada uno de los cuales es responsable de una determinada reacción metabólica. La biosíntesis combinatoria consiste en la co-expresión de diferentes combinaciones de dichos genes en un organismo huésped, para crear nuevas rutas metabólicas que darán lugar a los compuestos de interés.

INTRODUCCIÓN RESUMEN

En primer lugar, necesitábamos identificar los genes responsables de la biosíntesis de los dos compuestos que queríamos modificar: rebecamicina y estaurosporina. Esto fue realizado mediante el empleo de sondas heterólogas y mediante la expresión (en cada caso) del conjunto completo de genes en la bacteria huésped S. albus, con la consiguiente obtención de nuevas cepas productoras de rebecamicina y de estaurosporina (Refs. 2, 3). Los genes de biosíntesis de pirroindomicina en S. rugosporus y de tienodolina en S. albogriseolus fueron suministrados por otro laboratorio (Prof. Karl-Heinz van Pée, TU Dresden, Alemania).

Genes responsables de la biosíntesis de rebecamicina (reb)y de estaurosporina (sta). El código de colores es el mismo que en la Figura 1.

1. Sánchez C, Zhu L, Braña AF, Salas AP, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2005. Combinatorial biosynthesis of antitumor indolocarbazole compounds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 461-466.

2. Sánchez C, Butovich IA, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2002. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin: characterization and generation of indolocarbazole derivatives. Chem. Biol. 9, 519-531.

3. Salas AP, Zhu L, Sánchez C, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2005. Deciphering the late steps in the biosynthesis of the anti-tumourindolocarbazole staurosporine: sugar donor substrate flexibility of the StaG glycosyltransferase. Mol. Microbiol. 58, 17-27.

Algunas de las combinaciones de genes que fueron expresadas en S. albus, y productos obtenidos.

Gracias a Obra Social Cajastur por el apoyo financiero a C.S. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (BIO2000-0274, BMC2003-00478) y por el Plan Regional de Investigación del Principado de Asturias (GE-MED01-05). Agradecemos también el apoyo de la Red Temática de Investigación Cooperativa de Centros de Cáncer (Ministerio de Sanidad y Consumo). El estudio de compuestos mediante NMR fue realizado por el laboratorio del Prof. Jürgen Rohr en la Universidad de Kentucky (EE.UU.).

AGRADECIMIENTOS REFERENCIAS

Biosíntesis de Moléculas Antitumorales

Universidadde

Oviedo

En este póster, presentamos algunos resultados de nuestro trabajo en el campo de la biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles antitumorales (recientemente publicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (Ref. 1). Para ello, expresamos en un microorganismo huésped (Streptomyces albus) diferentes conjuntos de genes implicados en la biosíntesis de rebecamicina, estaurosporina, pirroindomicina y tienodolina (todos estos compuestos son metabolitos derivados de triptófano, producidos por Lechevalieriaaerocolonigenes, Streptomyces longisporoflavus, S. rugosporus y S.albogriseolus, respectivamente). La colección de cepas generadas fue analizada en busca de derivados o precursores de tipo indolocarbazol. El resultado fue la obtención de más de 30 compuestos diferentes, cuya actividad antitumoral está siendo ensayada actualmente. El número de compuestos derivados podrá ser ampliado mediante métodos biológicos (manipulaciones genéticas adicionales) o químicos (modificaciones químicas de los compuestos obtenidos), con el objetivo de generar compuestos con actividades antitumorales mejoradas.

ESTAUROSPORINAREBECAMICINA

Derivados en ensayos clínicos contra el cáncer: Becatecarin (DEAE-

rebeccamycin), Edotecarin (J-107088)

Derivados en ensayos clínicos contra el cáncer: Midostaurin (PKC412),

CEP-701, UCN-01

BIOSÍNTESIS COMBINATORIA: ESTRATEGIA

BIOSÍNTESIS COMBINATORIA: RESULTADOS

rebO rebD 1rebO rebD rebP 2 3 4, ,

rebO rebD rebC rebP 2rebO rebD rebC rebP rebG 5rebO rebD rebC rebP rebG rebM 6, 5rebO rebD rebH 7, 8, 1 26 27 30/ , ,

rebO rebD rebC rebP rebT rebG rebH 11 31 /

rebO rebD rebC rebP rebT rebG rebHrebM 12 32 /

rebO rebD staP 2 3 4, ,

rebO rebD rebC staP 2rebO rebD staC staP 3rebO rebD staC rebP 3rebO rebD staC rebP rebG 13rebO rebD staC rebP rebG rebM 14, 13rebO rebD staC rebP rebH 15 16, 8,

rebO rebD staC rebP rebG rebH 17 18, 8,

rebO rebD staC rebP rebG rebHrebM 19 20, 8,

rebO rebD pyrH 21 22, 1,

rebO rebD rebC rebP pyrH 23, 2rebO rebD staC rebP pyrH 24, 3rebO rebD thal 25, 1

9 28, / , 10, 2 29rebO rebD rebC rebP rebH

Combinaciones de genes Productos

N N

HN O

OHH3C

ONH

CH3

CH3

NH

N

HN OO

O

OOH

OH

HO

Cl Cl

H3C

1 kbG O D C P M R F U H Treb

sta G O D CP MAR EJ K I MBNAB

Formación del indolocarbazol

Unión del azúcar

Cloración

Formación del azúcar

Resistencia / Secreción

Regulación

IDENTIFICACIÓN DE GENES

L. aerocolonigenes rebecamicina

G O D C P M R F U H T

O

D

CP

staC

thal

BANCO DE GENES

GH

MpyrH

1. Extracción y purificación de compuestos (HPLC).

2. Caracterización estructural (MS, NMR).

3. Ensayos de actividad antitumoral.

Combinaciones de genes(diseñadas racionalmente)

S. rugosporuspirroindomicina

pyrH

S. albogriseolus tienodolina

thalestaurosporinaS. longisporoflavus

staC

Colección de cepas recombinantes

Actividad antitumoral de algunos de los compuestos obtenidos en este trabajo.

GI50 a (μM)

Tumor cell lines Sta b 12 6 2 3 9 1 7 Prostate DU-145 0.004 0.444 0.339 3.07 2.39 8.09 18.5 18.5 LN-caP 0.011 0.438 0.291 >30.7 13.0 12.6 >25.9 >25.9 Ovarian IGROV 0.008 0.426 0.168 8.76 7.10 12.4 14.4 14.4 IGROV-ET 0.006 0.777 0.461 16.1 6.20 7.25 15.1 15.1 Breast SK-BR3 0.013 0.845 0.279 0.162 1.90 1.48 7.08 7.08 Melanoma SK-MEL-28 0.025 0.906 0.201 >30.7 10.1 14.1 17.1 17.1 NSCL c A549 0.008 0.761 0.512 >30.7 10.6 6.98 14.3 14.3 Leukemia K-562 0.641 0.470 0.383 >30.7 29.0 14.0 12.2 12.2 Pancreas PANC1 0.008 1.23 0.668 13.6 8.25 8.76 10.8 10.8 Colon HT29 0.076 1.55 1.11 >30.7 15.6 2.54 >25.9 >25.9 LOVO 0.014 0.144 0.479 1.57 1.32 3.20 7.99 7.99 LOVO-DOX 0.058 6.08 6.08 >30.7 11.3 15.2 >25.9 >25.9 Cervix HELA 0.007 0.314 0.758 0.959 0.652 2.49 7.71 7.71 HELA-APL 0.022 0.996 0.630 6.15 4.53 15.1 25.5 25.5

a GI50, 50% growth inhibition. b For comparison, values for staurosporine (Sta) are also shown. c NSCL, non-small cell lung.

NH

NH

HN COOHHOOC

1

HOOC

NH

NH

HN OO

2NH

NH

HN O

3

NH

NH

HN OHO

4

5

NH

N

HN OO

O

OHOH

OH

HO 6

NH

N

HN OO

O

OCH3OH

OH

HO 78

262730

R1=R2=Cl

R1=R2=BrR1=Cl, R2=Br

R1=Cl, R2=H

R1=Br, R2=H

NH

NH

HN COOHHOOCHOOC

R1 R2

NH

NH

HN OO

R1 R2

9102829

R1=Cl, R2=HR1=R2=ClR1=Br, R2=HR1=R2=Br

11

NH

N

HN OO

O

OHOH

OH

HO

R1 R2

R1=R2=Cl31 R1=R2=Br

NH

N

HN OO

O

OCH3OH

OH

HO

R1 R2

12 R1=R2=Cl32 R1=R2=Br 13

NH

N

HN O

O

OHOH

OH

HO

14

NH

N

HN O

O

OCH3OH

OH

HO

R1=Cl, R2=HR1=R2=Cl

1516

NH

NH

HN O

R1 R2

R1=Cl, R2=HR1=R2=Cl

1718

NH

N

HN O

O

OHOH

OH

HO

R1 R2

R1=Cl, R2=HR1=R2=Cl

1920

NH

N

HN O

O

OCH3OH

OH

HO

R1 R2

2122 R1=R2=Cl

R1=Cl, R2=H

NH

NH

HN COOHHOOCHOOC

R1 R2

NH

NH

HN OO

Cl

23

NH

NH

HN O

Cl

24

25

NH

NH

HN COOHHOOCHOOC

Cl

S. albus