biorremediacion
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PseudomonasTRANSCRIPT
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BIORREMEDIACIN.
ING. BIOQUMICA.
MARA AZUCENA MRQUEZ LUCIO.
Obtencin de Pseudomonas y evaluacin de su capacidad degradativa de
hidrocarburos que componen el aceite residual
Alumnos
Bernal Arroyo Beatriz Adriana
IS09110411
Gonzlez Bautista Claudia Ernestina
IS09110533
Fecha de entrega: 10/Julio/2013
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i
ndice
INTRODUCCIN .............................................................................................................................. 1
ANTECEDENTES .............................................................................................................................. 3
Hidrocarburos .................................................................................................................................. 3
Hidrocarburos Biognicos ........................................................................................................... 3
Hidrocarburos Antrpicos ........................................................................................................... 3
Aceites lubricantes .......................................................................................................................... 3
Aceites residuales ............................................................................................................................ 4
Caractersticas generales de los aceites residuales..................................................................... 6
Destino de aceites usados en Mxico .......................................................................................... 8
Consecuencias del mal uso del aceite residual ............................................................................ 9
Impacto en la salud y medio ambiente ...................................................................................... 10
Degradacin de los hidrocarburos ................................................................................................. 12
Microorganismo degradadores de hidrocarburos .......................................................................... 13
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .......................................................................................... 19
JUSTIFICACIN ............................................................................................................................. 20
OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................... 21
OBJETIVO PARTICULAR .............................................................................................................. 21
METODOLOGA ............................................................................................................................. 21
Esquema de trabajo ....................................................................................................................... 21
Muestreo ........................................................................................................................................ 22
Obtencin de Pseudomonas .......................................................................................................... 22
Aislamiento de cepas y pruebas bioqumicas ............................................................................... 22
Preparacin del inculo ................................................................................................................. 22
Prueba degradativa ........................................................................................................................ 22
RESULTADOS ................................................................................................................................. 23
Obtencin de Pseudomonas .......................................................................................................... 23
Aislamiento de cepas y pruebas bioqumicas ............................................................................... 23
Prueba degradativa ........................................................................................................................ 24
DISCUSIONES ................................................................................................................................. 25
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ii
CONCLUSIN ................................................................................................................................. 27
ANEXOS........................................................................................................................................... 27
Bibliografa ........................................................................................................................................ 32
ndice de tablas
Tabla 1 Valores tpicos de composicin de los aceites minerales, indicando la funcin de
los diferentes aditivos ............................................................................................................. 4
Tabla 2 Composicin de un aceite usado segn su procedencia ............................................ 7
Tabla 3 Composicin de un aceite usado segn su procedencia ............................................ 7
Tabla 4 Frmula (en gramos por litro) ................................................................................. 29
Indice de Ilustraciones
Ilustracin 1 Reaccin de oxidacin de hidrocarburos del aceite lubricante ......................... 5
Ilustracin 2 esquema de trabajo .......................................................................................... 21
Ilustracin 3 morfologa macroscpica tentativa de ............................................................. 23
Ilustracin 4 morfologa macroscpica de la cepa ............................................................... 24
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iii
RESUMEN
Una de los principales problemas hoy en da es el derrame de hidrocarburos provenientes
de los aceites en motores automotrices, como cambio de aceite y de filtros de los mismos.
Los derrames menores de combustible ocurren regularmente por la inconciencia de no
saber qu uso dar al trmino de la vida til del combustible, ms an cuando los equipos no
cumplen con los requerimientos tcnicos para la prevencin de los mismos. Las prdidas en
tanques y tuberas debido a fugas, derrames accidentales, han causado problemas
ambientales en el suelo superficial y en el subsuelo. En los ltimos aos se han
implementado una serie de tecnologas para remediar los suelos contaminados por
hidrocarburos, de estas, la biorremediacin ha mostrado mayor eficiencia en la degradacin
de los contaminantes hasta formas menos txicas, mitigando la polucin ambiental.
(Casanova, 1991). Se utiliz Pseudomonas con la finalidad de aprovechando su capacidad
para degradar hidrocarburos presentes en aceite automotriz usado, el cual se encuentra
como contaminante recalcitrante en suelos y aguas de la ciudad. Las pruebas aplicadas nos
arrojan resultados favorables con respecto al aislamiento tentativo de la cepa de
Pseudomonas con la que se pretende hacer las pruebas de degradabilidad en aceite residual
para corroborar que los hidrocarburos presentes en dicho aceite son utilizados como nica
fuente de carbono por las bacterias. La degradacin del contaminante no fue muy notoria en
cuestin de los resultados esperados.
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1
INTRODUCCIN
Uno de los problemas ambientales ms importantes de la actualidad es la contaminacin de
ecosistemas terrestres y acuticos por derrames de hidrocarburos de petrleo y sus
derivados. En el caso de los suelos, las principales consecuencias ambientales que se
presentan despus de un evento de contaminacin por hidrocarburos son: la reduccin o
inhibicin del desarrollo de la cobertura vegetal en el lugar del derram, cambios en la
dinmica poblacional de la fauna, de la biota microbiana y contaminacin por infiltracin a
cuerpos de agua subterrneos. Adems del impacto ambiental negativo, los derrames de
hidrocarburos generan impactos de tipo econmico, social y de salud pblica en las zonas
aledaas al lugar afectado. La reglamentacin nacional considera a los aceites usados como
residuos peligrosos y de otros compuestos de impacto al ambiente.
Comienzos de los aos ochenta, se empez a actuar sobre los espacios contaminados el
mtodo sola consistir en retirar los residuos y/o suelo contaminado a un vertedero o
cubrirlos con una capa impermeable (confinamiento). Hoy se plantea la necesidad de
desarrollar alternativas para solucionar de forma permanente y menos costosa el problema
de los espacios contaminados (Moreno & Ortiz, 2004)
La biorremediacin surge de la necesidad de disminuir el impacto ambiental negativo de
los derrames de hidrocarburos en los diferentes ambientes (agua y suelos) usando
microorganismos, plantas o enzimas, de manera estratgica con el fin de restaurar la calidad
ambiental, de acuerdo con las necesidades y dimensiones del problema (Pardo, 2004).
La contaminacin por hidrocarburos del petrleo es una problemtica de carcter mundial
y amplia distribucin geogrfica, teniendo en cuenta que independiente de la zona afectada
(lagos, suelos, zonas freticas, ros y playas) por procesos biolgicos y fsicos, los
hidrocarburos tienen como destino final los mares y ocanos (Shanidul, 2004). Con el fin
de contrarrestar los efectos nocivos causados por la presencia del petrleo en los
ecosistemas marinos se han desarrollado tcnicas fsicas, qumicas y biolgicas que buscan
remover el mayor porcentaje del contaminante y disminuir el impacto generado tras un
derrame o acumulacin progresiva. Entre las diversas tcnicas, la biodegradacin es
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2
considerada actualmente la alternativa menos costosa para transformar contaminantes
presentes en diversos ecosistemas, teniendo en cuenta que gran variedad de bacterias
cuentan con la maquinaria enzimtica para transformar los compuestos xenobiticos
persistentes y stas pueden ser aisladas de lugares donde haya existido una previa
exposicin al contaminante (Mrquez, 2001).
Entre las estrategias de biorremediacin se encuentran la bioestimulacin y la
bioaumentacin. La bioestimulacin se define como la adicin de nutrientes,
principalmente fuentes de nitrgeno y fsforo, para favorecer el crecimiento y desarrollo
microbiano, al igual que la estimulacin por medio de adicin de agua, oxgeno y otros
elementos que mejoren el desarrollo de los microorganismos. La bioaumentacin se
entiende como la adicin de microorganismos endgenos o exgenos en un lugar
especfico, en este caso los degradadores de hidrocarburos, para aumentar rangos de
reduccin orgnica o proporcionar la habilidad de degradar l contaminante. La utilizacin
o presencia en el medio contaminado de estos microorganismos es esencial ya que poseen
sistemas enzimticos capaces de fraccionar las molculas de hidrocarburo hacindolas
menos txicas y as poder asimilarlas e incorporarlas a sus procesos metablicos,
transformndolas en dixido de carbono y agua, en procesos aerobios, para procesos
anaerobios las transformaciones pueden llegar hacer de biomasa, entre otros (Boyer, 2000).
La industria qumica produce una gran cantidad de compuestos xenobiticos para distintos
fines, cuya estructura qumica difiere considerablemente de los compuestos orgnicos
naturales, por lo que resultan sustancias extraas o venenosas para el medio ambiente
(Atlas R. M., 2002). Varias especies del Pseudomonas contienen plsmidos en los que se
encuentran codificadas enzimas capaces de degradar compuestos orgnicos derivados del
petrleo o compuestos organoclorados u organofosfatados. Estas enzimas suelen ser
inducibles y la seleccin adecuada de las cepas puede permitir la reduccin de la
contaminacin de los compuestos xenobiticos mencionados (Madigal M. T., 2004).
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3
ANTECEDENTES
Hidrocarburos
Los hidrocarburos son compuestos formados por tomos de carbono e hidrgeno, de gran
abundancia en la naturaleza, presentes principalmente en el petrleo. El nmero de
carbonos y su estructura qumica determina su clasificacin. Los hidrocarburos alifticos
son de cadena lineal o ramificada y puede ser saturado (alcanos) o insaturados (alquenos y
alquinos). Los hidrocarburos de cadena cclicas, pueden ser saturados (ciclo alcano) o con
uno o ms anillos bencnicos (aromticos) (Morrison & Boyd, 1985).
Hidrocarburos Biognicos
Estos son sintetizados por casi todas las plantas, animales terrestres y marinos, incluyendo
la micro biota, bacterias, plancton marino, diatomeas, algas y plantas superiores. La sntesis
de este tipo de hidrocarburos est controlada por rutas metablicas, lo cual trae como
resultado mezclas de compuestos de limitada complejidad estructural relacionada
directamente con la funcin biolgica especfica (Bedair & Al-Saad, 1992).
Hidrocarburos Antrpicos
Son aquellos introducidos como resultado de cualquier tipo de actividad humana. Los
procesos de combustin industrial contribuyen con niveles altos, debido al humo generado
por carbn, combustibles fsiles y petrleo refinado, las descargas de aguas municipales,
las actividades de transporte y los derrames son algunas de las principales fuentes de estos
contaminantes (Bidleman, Castleberry, & Foreman, 1990).
Aceites lubricantes
Los aceites lubricantes estn constituidos por una base lubricante y una serie de aditivos.
Dependiendo del uso del aceite, la base lubricante ser mineral (proveniente del petrleo
crudo), sinttica o vegetal, siendo el uso mayoritario las bases lubricantes minerales.
El aceite lubricante para motores tiene como funcin primordial evitar el contacto directo
entre superficies con movimiento relativo, reduciendo as la fraccin, calos excesivo,
desgaste, ruido, golpes, vibracin, etc.
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Bsicamente son una mezcla de hidrocarburos parafnicos, naftenicos y aromticos
obtenidos por destilacin de crudos petrolferos (aceites minerales) o por sntesis a partir de
productos petroqumicos (aceites sintticos) (NDUSTRIAS GUAPN, 2007). La variacin
en la proporcin de los diferentes tipos de hidrocarburos en la mezcla determina las
caractersticas fsicas y qumicas de los aceites. Una alta fraccin de hidrocarburos
parafnicos confiere al aceite una mayor resistencia a la oxidacin, mientras que un algo
contenido de hidrocarburos aromticos favorece la estabilidad trmica. Para mejor las
caractersticas del aceite es comn aadir aditivos (tabla 1), en proporciones de un 15 y un
25% en volumen de producto terminado estos son de distinta naturaleza, y confiere al aceite
propiedades especficas (Ruiz, 1991).
Tabla 1 Valores tpicos de composicin de los aceites minerales, indicando la funcin de
los diferentes aditivos
(Ruiz, 1991).
Aceites residuales Los aceites lubricantes son productos de uso masivo, siendo consumidos por el sector
industrial, empresas de servicios y transporte. Los puntos de generacin, as como los
actores involucrados son muy diversos, destacndose en orden de relevancia por el
volumen de generacin las estaciones de servicio y talleres de mantenimiento de vehculos
y plantas industriales. En el caso de los vehculos se estima una vida til de aceite
lubricante equivalente a los 5000 km, mientras que en los usos industriales depende del uso
especfico.
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El parque automotriz mundial genera alrededor del 65% de total de aceite usado generado,
mientras que el restante 35% es de origen industrial (EPA, 1991).
La denominacin aceite usado comprende a los aceites de origen mineral, que durante el
uso perdieron sus propiedades caractersticas, volvindose inapropiados para continuar su
utilizacin con el mismo propsito. Comprende a los aceites lubricantes de motores (de
vehculos y mquinas industriales), los fluidos hidrulicos y de transmisin.
Despus de su uso, el aceite lubricante adquiere concentraciones elevadas de metales
pesados producto principalmente del desgaste del motor o maquinara que lubric y por
contacto con combustibles. Adems, se encuentran con frecuencia solventes clorados en los
aceites usados, provenientes principalmente por contaminacin durante su uso (reaccin del
aceite con compuestos halogenados de los aditivos). La presencia de hidrocarburos
aromticos, solventes clorados, junto con altas concentraciones de algunos metales pesados
constituye la principal preocupacin de los aceites usados (Benavente & Gonzalo, 1999).
La descomposicin de los aceites de motor se debe especialmente a una reaccin de
oxidacin. En todos los casos, como consecuencia de su utilizacin se degradan perdiendo
las cualidades que les hacan operativos y se hace necesaria su sustitucin, generndose as
un residuo que puede ser variable en cantidad y composicin, dependiendo de la
procedencia.
La oxidacin de los hidrocarburos en fase liquida algunas veces es una reaccin de
radicales en cadena. Esta reaccin se muestra en la figura (Benavente & Gonzalo, 1999) 1.
Ilustracin 1 Reaccin de oxidacin de hidrocarburos del aceite lubricante
(Benavente & Gonzalo, 1999)
La reaccin no se inicia hasta pasado un cierto periodo de induccin el cual corresponde al
intervalo necesario para la formacin de los perxidos, que actas como catalizadores,
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durante ste periodo la oxidacin del aceite es muy dbil. En el motor la oxidacin se
produce de forma muy rpida, en particular por la elevada temperatura que alcanzan las
piezas prximas a la cmara de combustin (Benavente & Gonzalo, 1999)
Caractersticas generales de los aceites residuales
El aceite de motor usado es insoluble, duradero y puede contener sustancias
qumicas txicas y metales pesados.
Su proceso de degradacin es lento.
Se adhiere a todo desde la arena de las playas hasta las plumas de las aves.
Es la principal fuente de contaminacin de las vas acuticas y puede resultar en la
contaminacin de fuentes de agua potable.
(LGEEPA, 2001)
Caractersticas Qumicas.
Los aceites, como consecuencia de su utilizacin se degradan perdiendo las cualidades que
les hacan operativos, llegado ste punto se hace necesaria su sustitucin por otros nuevos,
generndose un residuo que puede ser variable en cantidad y composicin, dependiendo de
la procedencia.
Las caractersticas del aceite usado pueden variar dentro de un amplio margen dependiendo
de la procedencia y aplicacin del aceite, en general las contaminaciones tienen su origen
en compuestos derivados de la degradacin de los aditivos en subproductos de combustin
incompleta, polvo, partculas metlicas o en contaminaciones exteriores por mal
mantenimiento o mal almacenamiento del aceite. (Woltron, 2002)
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Tabla 2 Composicin de un aceite usado segn su procedencia
(Woltron, 2002)
La concentracin de metales en un aceite usado se debe principalmente a la degradacin de
aditivos rgano-metlicos del aceite lubricante nuevo, adems de desgastes producidos por
rozamientos en las piezas mviles del motor.
La presencia del plomo en particular se debe en su totalidad a la degradacin del tetra-etilo
de plomo de las gasolinas. Estos contaminantes provocan importantes dificultades a la hora
de buscar destinos finales al aceite (PANTOJA, 1995).
En la siguiente tabla se muestra un ejemplo del contenido de contaminantes presentes en un
aceite de motor usado.
Tabla 3 Composicin de un aceite usado segn su procedencia
(PANTOJA, 1995)
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Destino de aceites usados en Mxico
Actualmente, los aceites usados generados se someten a distintos procesos de eliminacin
en instalaciones autorizadas, destinadas a la recuperacin de recursos, como:
Re-refinacin: consiste en la obtencin de aceite base restaurado, a partir de aceites
usados, mediante la eliminacin de contaminantes y aditivos, utilizando
tratamientos de destilacin y posterior refinacin
Valorizacin energtica: se basa en la utilizacin de los aceites usados como
combustible alternativo y para la fabricacin de explosivos del tipo agente de
tronadura para las faenas mineras con una recuperacin adecuada del calor
producido, realizada con la autorizaciones necesarias y previa comprobacin
analtica de su adecuacin para este uso.
Valorizacin energtica: se basa en la utilizacin de los aceites usados como
combustible alternativo y para la fabricacin de explosivos del tipo agente de
tronadura para las faenas mineras, con una recuperacin adecuada del calor
producido, realizada con las autorizaciones necesarias y previa comprobacin
analtica de su adecuacin para este uso.
(Dugan, 2004)
Algunos destinos ilegales de los aceites usados que presentaron riesgos sobre la salud
pblica y efectos nocivos sobre el medio ambiente, son:
vertido a la tierra, cursos de agua, alcantarillados o sistemas de drenaje.
Utilizacin como matapolvo (control de polvo en caminos).
Control de la vegetacin (disminucin de la maleza) y conservacin de la madera
(mediante pintado).
Entrega a la recoleccin municipal
Uso como combustible en quemas al aire libre y en general, en combustiones no
controladas.
Adulteracin para su posterior comercializacin.
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La Autoridad Sanitaria, SEREMI de Salud, debe fiscalizar y controlar que los aceites
usados sean eliminados mediante tcnicas de eliminacin autorizadas de acuerdo al
Reglamento Sanitario Sobre Manejo de Residuos Peligrosos (DS N. 148/03).
Consecuencias del mal uso del aceite residual
El aceite usado de motor puede ser recolectado para utilizarlo en varios campos industriales
y de comercio. Entre ellos los usos ms comunes en los que se utiliza el aceite quemado son
(BENAVENTE R, 1999):
Destilacin.
ste proceso es empleado para producir flux de asfalto, al comienzo del proceso se destila
el aceite usado para remover compuestos voltiles, agua, etc. El destilado final es la
separacin de los aceites pesados (destilado) de los contaminantes (fondos). El producto de
la destilacin es un aceite diesel de alta calidad (bajo en cenizas y contenido de azufre) y un
subproducto de flux de asfalto (RAMREZ, 2005).
Combustin.
Para el aprovechamiento energtico de los aceites usados se pueden seguir dos caminos
diferentes en funcin de las instalaciones en las que se va a realizar la combustin:
El primer camino.- El aceite quemado se destina como combustible en instalaciones con
alta potencia trmica, altas temperaturas, gran consumo de combustible y alta produccin
de gases. El mayor ejemplo de esto son los hornos de clinker en las cementeras, estos
hornos queman el aceite usado y los contaminantes de ste especialmente los metales
quedan incorporados al cemento, por lo que no representa problemas de contaminacin
atmosfrica.
El segundo camino.- Puede ser usado en la aplicacin de tratamientos fsico-qumicos ms
complejos con el fin de fabricar un combustible que pueda tener un espectro de utilizacin
ms amplio en instalaciones con menos potencia trmica o en motores de combustin y
calderas (FLOREZ PIEDRAHITA, 2001).
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El aceite es uno de los residuos con mayor potencial para ser empleado como combustible
por su elevada capacidad calorfica. La transformacin del aceite usado a energtico
requiere de la aplicacin de un tratamiento tendiente a adecuar las condiciones del aceite a
las caractersticas propias del proceso de combustin, consistente bsicamente en la
aplicacin de dos etapas: adecuacin del aceite usado mediante procesos de filtracin para
retirar partculas gruesas y remocin de partculas finas, mediante procesos de
sedimentacin y centrifugacin. Estas etapas involucran la adicin de desemulsificantes,
para el rompimiento de las emulsiones formadas con el agua (PANTOJA, 1995).
Regeneracin.
La regeneracin de aceites usados es la operacin mediante la cual se obtienen de los
aceites usados un nuevo aceite base comercializable. Casi todos los aceites usados son
regenerables aunque en la prctica la dificultad y el costo hacen inviable la regeneracin de
aceites usados con alto contenido de aceites vegetales, aceites sintticos, agua y slidos.
Biodegradacin.
Se refiere al proceso a travs del cual un ser vivo modifica un compuesto sin llegar a
mineralizarlo. En algunos casos el producto resultante puede ser incluso ms txico y
perjudicial que la sustancia de partida (Fernando., 1990).
Impacto en la salud y medio ambiente
En la actividad petrolera, las disposiciones y el manejo habitual de hidrocarburos y
combustibles, en algunos casos conlleva a la contaminacin del ambiente, cuando tanques,
oleoductos y diversas instalaciones sufren daos. Los lquidos migran hacia el suelo, subsuelo
(zona vadosa) y hacia el agua subterrnea (zona saturada acufero) o superficialmente hacia
un bajo topogrfico o curso de agua, y sus componentes voltiles a la atmosfera. No solo las
contaminaciones se producen por roturas de los sistemas de almacenaje o de transporte, sino
que el mal manejo del producto puede provocar impactos negativos en la ecologa regional
(Vasallo, 2002).
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El petrleo en el suelo, que pasa a considerarse como un contaminante, se convierte en un
riesgo para la salud humana y el ecosistema. En algunos casos, la contaminacin no solo
provoca problemas de toxicidad, sino que adems puede ocasionar grandes riesgos de
explosiones y/o incendios.
La industria petrolera en su conjunto ha tenido un gran impacto negativo en materia
ambiental. Debido a la amplia gama de productos derivados del petrleo que se manejan y
que no ha sido posible evaluar cuantitativamente la contaminacin involucrada desde la
fase de explotacin hasta la obtencin de los petroqumicos bsicos, ni del seguimiento a la
infraestructura petrolera, esta se integrada por:
Pozos de explotacin.
Bateras de separacin.
Complejos procesadores de gas.
Centrales de almacenamiento y bombeo.
Redes de ductos y piletas para el confinamiento de desechos slidos y lquidos
procedentes de la perforacin y mantenimiento de los pozos.
Transporte y distribucin en general.
Estaciones de servicio de combustible.
Los aceites son considerados potencialmente peligrosos para el ambiente debido a su
persistencia y su habilidad para esparcir en grandes reas de suelo y del agua, formando un
film que no permite el ingreso de oxgeno, lo que produce rpidamente una degradacin de
la calidad del ambiente. En el caso de los aceites usados existe el riesgo adicional de la
liberacin de los contaminantes txicos presentes como es el caso de los hidrocarburos
aromticos policclicos, metales pesados y compuestos clorados (EPA, 1991).
Los aceites vertidos en el suelo y de su contaminacin en s, puede infiltrarse contaminando
el agua subterrnea, o escurrir y ser arrastrado por el agua de lluvia y contaminar los cursos
de aguas.
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Si no se dispone adecuadamente, el aceite automotriz usado causa graves problemas al
ambiente:
Si se arroja al suelo, ste contiene una serie de hidrocarburos, metales y aditivos que
favorecen su penetracin y dispersin en el terreno, destruye el humus vegetal y
acaba con la fertilidad del suelo.
En el agua produce una pelcula impermeable, que impide la adecuada oxigenacin
asfixiando a los seres vivos que la habitan: un litro de aceite contamina un milln de
litros de agua. Asimismo. Por su bajo ndice de degradabilidad, afecta los
tratamientos biolgicos de las depuradoras de agua, llegando incluso a
inhabilitarlos.
Si el aceite usado se quema, sin un tratamiento y control adecuado, emite gases
txicos debido a la presencia de plomo, cloro, fsforo, azufre, entre otros. Se estima
que la quema de cinco litros de aceite, contaminan, 1 milln de m3 de aire, que es la
cantidad de aire respirada por una persona durante tres. Aos (Taylor, 2001).
Degradacin de los hidrocarburos
En la degradacin ocurren procesos fisicoqumicos entre la interaccin natural del
contaminante con el ambiente que incluyen la dispersin, dilucin, absorcin,
volatilizacin, estabilizacin qumica o la biodegradacin del contamnate
(Biorremediacin). En la mayora de los casos, la biorremediacin es la mejor alternativa
para el tratamiento de esta contaminacin (Arroyo, 2001). En los procesos de
biodegradacin que tienen lugar de forma natural en el medio, se les conoce como
atenuacin natural. La atenuacin natural Transforma el contaminante en formas menos
toxicas, por procesos fsicos (evaporacin, dispersin, dilucin), qumicos
(oxidacin/reduccin) y biolgicos (degradacin), que reduce la movilidad, la masa y la
concentracin del contamnate. Entre los factores que influyen en la eficacia y viabilidad de
la degradacin se destacan (Gideon, 2008):
Condiciones geolgicas y geoqumicas favorables.
Confirmacin de la existencia de los tipos y nmero de poblaciones de
microorganismos que puedan biodegradar los contaminantes.
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Produccin y conservacin en el medio de subproductos de carcter persistente o
ms txicos que los iniciales, durante y despus.
La no existencia de producto libre en flotacin sobre el nivel fretico.
Condiciones ptimas de concentracin de oxgeno disuelto.
Presencia de compuestos utilizados como aceptores de electrones en condiciones
anaerobias como nitrgeno, fosforo, sulfatos entre otros.
Existencia de un coeficiente de retardo favorable para que se produzcan los
fenmenos de sorcin con suficiente eficacia.
Que se produzca una dilucin suficiente para que la concentracin se vea
disminuida.
Los compuestos aromticos se degradan con ms dificultad, respecto a los hidrocarburos
alifticos, debido a la mayor estabilidad de los enlaces entre carbonos presentes en su
estructura. Como en los alcanos, la degradabilidad disminuye al aumentar el nmero de
carbonos o anillos aromticos (Prince, 2003). A pesar de su elevada estabilidad, la
capacidad de degradar compuestos aromticos se ha descrito en una gran variedad de
microrganismos, entre ellos, bacterias y hongos capaces de degradar compuestos de entre 1
y 5 anillos aromticos (Kanaly, 2000), debido a que es una de las estructuras qumicas ms
ampliamente distribuidas en la naturaleza, formando parte de compuestos mono y
poliaromticos, as como de compuestos ms complejos como la lignina (Dagley, 1981).
El metabolismo de los HAPs por parte de microrganismos ha sido un tema de gran inters
para varios investigadores (Bamforth, 2005).
Microorganismo degradadores de hidrocarburos
Los microorganismos son un componente muy importante del suelo, dada su alta
abundancia (cerca de 109 individuos por gramo de suelo), su alta diversidad aparente (un
mnimo de 6000 a 38000 genomas por gramo) (Curtis & Sloan, 2002) y la multiplicidad de
funciones metablicas implicadas en procesos ecosistmicos que incluyen: ciclos
biogeoqumicos, la transformacin y mineralizacin de materia orgnica y la degradacin
de compuestos xenobiticos, (Torsvik, Salte, & Srheim, 1990) funciones que en muchos
casos son realizadas exclusivamente por bacterias.
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La interaccin existente entre los productores primarios (i.e, plantas, microalgas,
cianobacterias) y los microorganismos descomponedores, la cual en muchos casos es
especie-especifica, contribuye a la estabilidad y fertilidad del suelo. La composicin de las
comunidades bacterianas no slo est determinada por las caractersticas fisicoqumicas del
suelo, sino tambin por las poblaciones vegetales que ste sustenta (Garveva & van Veen
J., 2003) siendo la rizsfera un ambiente propicio para la proliferacin de poblaciones de
hetertrofos. Dada esta estrecha relacin, los microorganismos han sido postulados como
indicadores de peturbaciones en la calidad del suelo producto del cambio en las coberturas
vegetales y por ende del uso del mismo.
El estudio de los microorganismos edficos est frecuentemente enfocado a las variaciones
de la densidad y diversidad de grupos funcionales implicados en ciclos biogeoquimicos del
carbono, nitrgeno y fosforo, como lo son los hongos y bacterias celuloliticas, proteolticas
y ligninoliticas, bacterias denitrificantes, bacterias fijadoras de nitrgeno y bacterias
solubilizadores de fsfatos (Roldn, 2009) Implicados en el ciclo biogeoquimico del
carbono, se encuentran los microorganismos degradadores de hidrocarburos (HC), los
cuales desempean un papel fundamental y exclusivo, en la mineralizacin de este tipo de
compuestos. A pesar de la creencia generalizada que los organismos degradadores de HC
solo pueden ser encontrados en lugares expuestos a contaminaciones agudas o crnicas con
derivados del petrleo, las bacterias degradadoras de HC son considerados
microorganismos cosmopolitas en ecosistemas edficos y acuticos (Ladygina &
Dedyukhina, 2006).
Las bacterias del suelo se encuentran formando colonias alrededor de partculas que se las
considera como fuentes de energa. Algunas bacterias pueden producir esporas como forma
de resistencia y sobrevivencia a las condiciones desfavorables para su desarrollo.
La riqueza en biodiversidad se presenta en las bacterias que incluyen un nmero elevado de
especies. Las bacterias que se encuentran de forma abundante en el suelo son pequeos
bastones de morfologa variable. La proporcin de bacterias Gram positivas en el suelo no
es elevada ya que predominan en nmero las bacterias Gram negativas (Atlas R. , 2001).
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Entre los gneros ms frecuentes de bacterias del suelo se encuentran Acinetobacter,
Agrobacterium, Alcaligenes, Arthorobacter, Bacillus (formadoras de esporas que
sobreviven en un rango de pH de 2 a 8 y poseen una habilidad de degradar compuestos
qumicos orgnicos), Brevibacterium, Caulobacter, Celullomonas, Clostridium,
Corynebactrium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas,
Staphylococus, Streptococcus y Xanthomonas. Entre las principales poblaciones de
bacterias fotos auttrofas se encuentran los gneros de cianobacterias Anabaena, Catohrix,
Chroococcus, Cylindrospermun, Lyngbya, Microcoleus, Nodularia, Nostoc, Oscillatoria,
Phormidium, Plectonema, Schizotbrix, Scytonema y Tolypothrix. Las bacterias de la especie
Azotobacter son importantes hetertrofos de vida libre, que puede fijar el nitrgeno
atmosfrico. Algunas especies anaerobias de Clostridium tambin pueden fijar nitrgeno
del suelo; Rhizobium es una especie de crecimiento lento, tambin fijan nitrgeno
atmosfrico dentro de ndulos de determinadas plantas (Atlas R. , 2001). Las bacterias
nitrificantes tambin se encuentran en la microbiologa del suelo, en especial del gnero
Nitrosomonas y Nitrobacter (Alexander M. , 1980). Del gnero Nostoc, aportan tanto
nitrgeno como carbono orgnico en algunos hbitats del suelo (Burges, 1971). Otras
bacterias tienen la capacidad de solubilizar compuestos ricos en fsforo, que no estn
disponible para las plantas, mediante su actividad fisiolgica de secretar cidos orgnicos y
enzimas denominadas fosfatasas, por lo que proporciona la liberacin de fsforo para que la
plantas puedan aprovecharlo (Ferrea, 2001). El gnero Bradyrhizobium es un gnero
bacteriano del suelo que tiene la capacidad de solubilizar compuestos de fsforo
inorgnico, como tambin la capacidad para fijar nitrgeno. Por su taxonoma, algunas
bacterias que se encuentran en el suelo, son las bacterias globiformes, como el gnero
Arthrobacter, en la familia Corynebacteriaceae, especies que descomponen la celulosa al
igual que las bacteria del genero Cellulomonas. Las Arthrobacter y Nocardia son
bacterias del tipo corniformes colonizan una gran variedad de micro ambientes. En el suelo,
tambin se encuentran en menor proporcin las bacterias del gnero Beijerinckia, Derxia,
Azomonas, y otros (Burges, 1971).
En investigaciones realizadas por Christon et al. (1997), se logr una disminucin de
hidrocarburos cercana al 95% con la adicin de microorganismos al rea de tratamiento,
mientras que en los campos no tratados la reduccin fue del 14%. En el caso del buque
-
16
petrolero Exxon Valdez, la adicin de nutrientes a travs de fertilizantes (INIPOL EAP 22
y Custombler) increment en una magnitud de tres veces la remocin de petrleo crudo. La
adicin de nutrientes promueve la biodegradacin al aumentar las poblaciones microbianas
y la formacin de microemulsiones agua-aceite, que reducen la viscosidad y tensin
superficial, lo cual a su vez aumenta la disponibilidad del sustrato (Swannell, 1996). En el
ambiente marino costero se ha trabajado en el campo del aislamiento y caracterizacin de
microorganismos degradadores de compuestos orgnicos en la Baha de Cartagena
(Salamanca-Pinzn, 1999).
Las bacterias pueden usar alcanos de cadena media como fuentes de carbono y energa
(Salgado-Brito, 1998). La oxidacin bacteriana de los alcanos es un fenmeno comn en
suelo y agua, y es un proceso muy importante en trminos de los ciclos geoqumicos. La
cantidad de alcanos que se puede encontrar en el ambiente por ao se estima en varios
millones de toneladas, debido a fugas y a derrames de petrleo, sin ser menos relevantes los
alcanos producidos por plantas, algas y otros organismos, ya que estos se encuentran
disponibles para las bacterias en toda la biosfera.
Los alcanos comprendidos entre 13 y 20 C han sido oxidados por bacterias de los gneros
Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter y Bacillus. Los gneros bacterianos que oxidan
parafinas con ms de 20 tomos de carbono reportados son muy pocos. Entre ellos estn
Acinetobacter sp. cepa H01-N (Micococcus cerificans), Acinetobacter sp. cepa M-1,
Arthorobacter nicotinae cepa KCCB35 Y Pseudomonas aeruginosa cepa MGP-1.
El petrleo con sus cuatro fracciones, hidrocarburos saturados, hidrocarburos aromticos,
resinas y asfaltenos, es un compuesto muy complejo, considerado el contaminante ms
extendido en la biosfera y en el ambiente marino, por lo tanto un problema global
(Alexander, 1999). Representa la mayor fuente energtica y la base para la obtencin de
materias primas para la industria. Su explotacin, transporte y refinacin generan
problemas ambientales, especialmente por derrames accidentales y de prcticas
inadecuadas de eliminacin de fuentes, como industrias y refineras de petrleo (Allsopp D,
2004).
-
17
La persistencia de estos contaminantes en el ambiente se ve influenciada por varios factores
como la naturaleza del contaminante, su concentracin y su capacidad para interactuar con
las condiciones qumicas, geolgicas, fsicas y biolgicas del sitio contaminado. La
fraccin aromtica del petrleo compuesta por di cclicos, tricclicos y heterocclicos
(naftaleno, antraceno, fenantreno y dibenzotiofeno), conlleva un problema ambiental en
aguas y suelos, con gran impacto ecolgico y efectos recalcitrantes y txicos en los seres
vivos, siendo los poliaromticos y los heterocclicos los ms remanentes, o persistentes,
generando como consecuencia efectos a largo plazo sobre las comunidades bentnicas en
sedimentos marinos, debido a que su remocin natural es muy lenta (Chaerun S, 2004).
Entre los factores biolgicos que constituyen un recurso importante en la eliminacin de
contaminantes se encuentran, la diversidad de especies microbianas y sus capacidades
metablicas (Martnez A, 2005); sin embargo, los ambientes marinos contaminados estn
habitados por microorganismos capaces de tolerar los contaminantes, dando lugar al
predominio de bacterias tolerantes. En el caso de los compuestos de hidrocarburos de
petrleo, son degradables a diferentes ritmos y en algunos casos son recalcitrantes a la
biodegradacin, lo que conllevan a un metabolismo por largos perodos de tiempo
(Mashreghi M, 2005).
Existen bacterias capaces de utilizar petrleo para su crecimiento y mantenimiento,
conocidas como bacterias degradadoras de hidrocarburos, dentro de las cuales se encuentra
el gnero Pseudomonas, que por su versatilidad metablica, son capaces de convertir
sustratos habitualmente no degradables, en metabolitos fcilmente asimilables o
susceptibles de ser catalizados enzimticamente. El xito de la biorremediacin consiste en
la seleccin de microorganismos que puedan degradar materiales contaminados a diferentes
temperaturas, pH, salinidad y concentracin de nutrientes. Muchos tipos de
microorganismos han sido aislados para mejorar procesos de biorremediacin de ambientes
contaminados con hidrocarburos de petrleo, por ejemplo Bacillus sp, Rhodococcus,
Mycobacterias, levaduras, Micromycetes y Pseudomonas, las cuales utilizan como fuente
de energa compuestos orgnicos simples y complejos y son productoras de enzimas
extracelulares, incluyendo la lipasa (Rolling W, 2003).
-
18
En los ltimos aos ha surgido un gran inters en la utilizacin de microorganismos para
aumentar la recuperacin terciaria de petrleo crudo, debido a las potencialidades que
diversas especies bacterianas presentan, como son:
1) La produccin de gas (CO2, H2, CH4, Y N2) que incrementa la presin reduce la
viscosidad del petrleo.
2) Produccin de cidos orgnicos que disuelven la roca, incrementando la
permeabilidad absoluta.
3) Produccin de agentes que disminuyen tensin superficial interfacial.
4) El rompimiento de hidrocarburos por accin enzimtica, con lo que se reduce la
viscosidad del petrleo.
Los hongos constituyen la segunda porcin ms elevada de la biomasa microbiana del suelo
y se presentan generalmente como finos filamentos. La distribucin de los hongos en el
suelo est determinada por la disponibilidad de carbono orgnico. Son considerados como
saprofitos, es decir que crecen en tejidos muertos y realizan la descomposicin de la
materia orgnica y generalmente se encuentran en la capa superior del suelo (Coyne, 2000).
Los hongos tienen la habilidad de descomponer residuos orgnicos como los azcares,
protenas, almidn y compuestos ms resistentes como hemicelulosa y lignina, lo que
permite mantener un equilibrio en los ecosistemas del suelo (Casanova, 1991). Los hongos
representan un gran depsito de nutrientes para el crecimiento potencial de
microorganismos, y subsisten en el suelo debido a los mecanismos de esporas y sus
estructuras de reposo. Los hongos del suelo metabolizan carbohidratos y pueden degradar
lignina; este tipo de microorganismos son cuantificables (Casanova, 1991). Las races de
las plantas con exudaciones radiculares estn pobladas de hongos, que movilizan los
nutrientes hacia las plantas y aumentan la capacidad de retener agua, fijar nitrgeno y
solubilizar fsforo. Adicionalmente, protegen a las races de patgenos, emitiendo
sustancias que inhiben su crecimiento.
Los grupos importantes de hongos que se encuentran en el suelo son Zygomycota,
Ascomycota, Deuteromycota y Basidiomycota. La mitad de los hongos que generalmente se
-
19
aslan del suelo pertenecen a los deuteromicetos, los gneros Penicillium, Geotrichum,
Aspergillus y Trichoderma. (Benzina & Verlag, 2001). El gnero Trichoderma est
compuesto por hongos que se encuentran en forma natural, en casi todos los suelos. Otros
gneros que se encuentran en el suelo, muy raramente ya que son considerados como
patgenos para las plantas son los Omicetos (Pythium y la Phytophthora) y hongos
complejos como Agaricus urenidales, estos ltimos causantes de la putrefaccin de la
madera.
La patogenecidad por hongos es una caracterstica que se origina en el suelo, las especies
que son saprofitas pueden invadir tejidos vivos y comportarse como agente patgeno. Solo
una pequea cantidad de hongos del suelo causan enfermedades a los vegetales y la
provocan con frecuencia los gneros: Armillaria, Helminthosparium, Ophiobolus,
Plasmodiophora, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticilium, Thielaviopsis, Phytium, Fusarium
(Snchez, 2001)
Las levaduras frecuentes en el suelo son hongos imperfectos (deuteromicetes). Los gneros
de levaduras que se encuentran en el suelo son los siguientes: Candida, Rhodotorula y
Cryptococcus y las especies como Lipomyces, Schuwanniomyces, Kluyveromices,
Schizoblastoporiom, Hansenula y Cryptococcus todas se han aislado nicamente del suelo
(Atlas R. , 2001).
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Una de los principales problemas hoy en da es el derrame de hidrocarburos provenientes de
los aceites en motores automotrices, como cambio de aceite y de filtros de los mismos.
Los derrames menores de combustible ocurren regularmente por la inconciencia de no saber
qu uso dar al trmino de la vida til del combustible, ms an cuando los equipos no
cumplen con los requerimientos tcnicos para la prevencin de los mismos. Las prdidas en
tanques y tuberas debido a fugas, derrames accidentales, han causado problemas
ambientales en el suelo superficial y en el subsuelo. Una vez que los combustibles penetran el
suelo, afectan las caractersticas fsicas y qumicas, daando su productividad y la poblacin
-
20
microbiana presente, adems de amenazar la salud pblica, como una consecuencia de su
migracin y contacto con los mantos fretico, aguas superficiales y subterrneas, que en su
mayora son la fuente de abastecimiento de agua en el departamento, para el desarrollo de
actividades agropecuarias, domesticas e industriales. Por otra parte, los combustibles tambin
pueden afectar la estructura, fertilidad y productividad de los suelos.
JUSTIFICACIN
Uno de los problemas en el contexto ambiental lo representan los residuos peligrosos, los
generados en mayor cantidad aproximadamente el 54% corresponde a derivados del
petrleo. De estos los aceites lubricantes que al terminar su vida til, en algunos casos su
manejo y disposicin son inadecuados de acuerdo a las normas existentes, que en
consecuencia son vertidos al ambiente y contaminando aguas, aire y suelo principalmente
este ltimo.
En una ciudad circulan alrededor de 180 mil vehculos los cuales generan aproximadamente
2 millones de litros de aceite automotriz usado de los cuales aproximadamente solo 240 mil
litros, tiene un uso adecuado siendo utilizado para la produccin de ladrillo, el resto tiene
un destino incierto, ya sea, para la produccin de ladrillo en la periferia de la ciudad o bien
en vertido en lotes baldos, drenaje y aceras entre otras, causando un grave dao al
ambiente de la ciudad y por consecuencia a la salud pblica (EPA, 1991).
En los ltimos aos se han implementado una serie de tecnologas para remediar los suelos
contaminados por hidrocarburos, de estas, la biorremediacin ha mostrado mayor eficiencia
en la degradacin de los contaminantes hasta formas menos txicas, mitigando la polucin
ambiental. (Casanova, 1991)
Por tal motivo el presente trabajo utiliz Pseudomonas aprovechando su capacidad para
degradar hidrocarburos presentes en aceite automotriz usado, el cual se encuentra como
contaminante recalcitrante en suelos y aguas de la ciudad.
Con base a esta investigacin se pueden plantear estrategias similares para la remediacin
de los sitios contaminados, tanto por desperdicio de aceites de motor usados de trilladoras,
-
21
entre otros, con similares condiciones, traducindose as en empresas que llevan a cabo
iniciativas de soluciones ambientales, que promueven el desarrollo y difusin de
tecnologas amigables y como consecuencia empresas ms competitivas y con mayor
responsabilidad social. (Atlas R. M., 2002).
OBJETIVO GENERAL
Obtencin de Pseudomonas y evaluacin de su capacidad degradativa de hidrocarburos
que componen el aceite residual
OBJETIVO PARTICULAR
Evaluar la resistencia que tiene pseudomona en medios de cultivo que contienen
aceite residual como nica fuente de carbono.
METODOLOGA
Esquema de trabajo
Ilustracin 2 esquema de trabajo
-
22
Muestreo
Se hace una extraccin de suelo a 20 cm de profundidad tomando como referencia las
especificaciones de la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003, la cual establece que se tomarn 4
puntos de muestreo por ser un rea con medidas cercanas a 0.1 y stas se homogenizan
para obtener nicamente 1 muestra.
Obtencin de Pseudomonas
Se realizan diluciones tomando un gramo de suelo de la muestra obtenida y se agrega a 9
ml de agua destilada estril, luego de agitar, se realizan las diluciones seriadas hasta 10-3
empleando para los recuentos las diluciones entre 10-2 y 10
-3. El recuento para las bacterias
se realiza en medio King A, a las cajas de Petri solidificadas se les adiciona 0.1 ml de la
dilucin por la tcnica de vaciado en placa y se exponen a 35C por 24 horas (Gmez et al,
2009). Se tomarn como colonias sospechosas aquellas que macroscpicamente presenten
una tonalidad verde-azulado.
Aislamiento de cepas y pruebas bioqumicas
Para la etapa confirmativa desde las muestras positivas, es decir, las colonias sospechosas,
se toma una a dos asadas y se siembran en Agar Cetrimida Base por agotamiento del
inculo. Las placas se incuban a 35C 0.5C durante 24 horas. La produccin de
pigmentos fluorescentes verdes en las colonias constituye la prueba confirmativa positiva
para la presencia de Pseudomonas, a partir de las cuales se realiza la identificacin
bioqumica a travs de la prueba de la oxidasa (Villegas et al, 2012), siendo positiva para
sta especie de acuerdo al cuadro 1 (Callic et al, 2004).
Preparacin del inculo
De las cepas obtenidas en el Agar Cetrimida Base confirmadas como posibles
Pseudomonas se coloca una asada en 100 ml de caldo LB (Luria Bertani) en un matraz
Erlenmeyer, para obtener un enriquecimiento de dicha bacteria (Samanez, 2008), se incuba
a 35C 0.5C durante 24 horas (Villegas et al, 2012).
Prueba degradativa
Colocar en placas de Petri 15 ml de medio mnimo (M9), una vez que solidifiquen se
adicionan 500 l de aceite residual y 500 l del caldo LB inoculado con Pseudomonas y se
expanden con ayuda de un asa de Drigalsky hasta formar una fina capa en el agar. Se repite
-
23
la operacin en dos placas ms con las mismas cantidades de inculo y aceite residual
respectivamente para corroborar la degradacin de la fuente de carbono (Salgado, 2008).
RESULTADOS
Obtencin de Pseudomonas
El conteo hecho para las placas en medio King A tuvo un total de 3 colonias
sospechosas, que presentaron un color verde-azulado a simple vista.
Ilustracin 3 morfologa macroscpica tentativa de
Pseudomonas en medio King At
Aislamiento de cepas y pruebas bioqumicas
Al hacer el conteo de colonias en las placas con Agar Cetrimida Base se obtuvo un
total de 38 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) en la dilucin correspondiente a 10-2
y de 3 UFC en la dilucin 10-3, quedando corroborados estos resultados por la inocuidad
presentada en la placa estipulada como control, a la cual no se le agreg carga microbiana.
Ahora bien, si multiplicamos el conteo resultante por el factor de dilucin, esto nos da un
total de 3800 UFC contenidas en la muestra inicial.
Las colonias se observaron con una tonalidad verde-azulado que indican la
produccin de piocianina, pigmento producido por posibles cepas del gnero Pseudomonas.
-
24
Ilustracin 4 morfologa macroscpica de la cepa
Pseudomona aislada en medio cetrimida
Prueba degradativa
Placa Control (500 l de aceite residual)
Placa de monitoreo 1 (500 l de aceite residual y 500
l de inculo)
Placa de monitoreo 2 (500 l de aceite residual y 500
l de inculo)
Placa de monitoreo 3 (500 l de aceite residual y 500
l de inculo)
-
25
La placa control muestra una tonalidad caf uniforme en la mayor parte de su
extensin; las placas de monitoreo tienen una variacin de color a un caf ms tenue luego
de 7 das de incubacin a 35C, adems presentan formacin de pequeos halos dispersos
en la superficie del medio.
DISCUSIONES
La importancia de la temperatura para el crecimiento bacteriano
La temperatura juega un papel importante para el crecimiento de las bacterias. Constituyen
microorganismos unicelulares poiquilotrmicos muy sensibles a los cambios de
temperatura debido a que la estabilidad de sus protenas de membrana y de la actividad
enzimtica interna depende de la temperatura del medio (Prescott ; Harley ; Klein, 1995). .
La temperatura influencia las velocidades de las reacciones fisiolgicas as como las
caractersticas fsico-qumicas que conllevan consecuencias sobre la actividad metablica
de los microorganismos y, de este modo, sobre las actividades de biotransformacin de los
sustratos (su velocidad se duplica por cada aumento de 10 C entre 5 y 30 C).
Importancia de la disponibilidad de la fuente de carbono y de energa para el
metabolismo y el crecimiento bacterianos
Una ltima condicin esencial para el crecimiento de los microorganismos es la
disponibilidad de la fuente de energa. Incluso si todas las condiciones anteriores son
ptimas, si el hidrocarburo no se encuentra disponible para los microorganismos, no se
observar ningn crecimiento (Hori, et al., 2002).
Las cepas se identificaron tentativamente como Pseudomonas, basado en las pruebas
preliminares.
El crecimiento de las poblaciones bacterianas depende en gran medida de los parmetros
fsico-qumicos. Por esta razn, fueron controlados diferentes parmetros durante los
ensayos en medio acuoso o semislido. Dan una idea de los eventos dominantes del cultivo
as como de las condiciones a las que se ven expuestas las bacterias (Prescott; Harley;
Klein, 1995).
-
26
En lo que concierne la interaccin entre el agente contaminante y el microorganismo,
deben de tomarse en cuenta varias posibilidades: si las molculas se encuentran demasiado
expuestas, pueden ser txicas para los microorganismos; por otro lado, si la contaminacin
est fuertemente adsorbida a las partculas del suelo, las clulas podran degradarla con
menos eficacia (Schwartz; Bar, 1995).
Medida de la viabilidad de las poblaciones
La viabilidad constituye un parmetro determinante para el estudio de la biorremediacin.
Descubrir cepas de bacterias que toleren la presencia de los contaminantes es casi igual de
importante que encontrar microorganismos que degradan los hidrocarburos. Sin embargo,
el objetivo de este trabajo fue utilizar cepas que toleraran y degradaran la contaminacin.
Lo ideal sera obtener una degradacin sin necesidad de agregar fuentes de carbono
suplementarias o inductores de degradacin y solamente los nutrimentos inorgnicos
necesarios para el metabolismo (Leahy ; Tracy ; Eley, 2003).
Las especies del gnero Pseudomonas son en general utilizadas para la degradacin de los
hidrocarburos (Al-Tahhan, et al., 2000) y reconocidas ms particularmente para sus
capacidades para degradar los hidrocarburos aromticos monocclicos como el benceno y
el tolueno debido a que presentan las oxigenasas que catalizan las etapas iniciales aerobias
de degradacin de estos hidrocarburos. Como mencionado, la falta de oxgeno es
probablemente responsable por la ausencia de resultados significativos en los cultivos de
las pruebas de degradabilidad (Allen, et al., 1999).
Otra explicacin podra ser que la metabolizacin de estos hidrocarburos necesita fases de
adaptacin ms largas para inducir la sntesis de la maquinaria enzimtica.
La actividad metablica de las bacterias sobre los hidrocarburos implica su degradacin as
como en parte tambin, su acumulacin en la clula. Cuando la concentracin de
hidrocarburos es demasiada elevada, estos podran resultar txicos incluso para los
microorganismos capaces de degradarlos debido a que los lmites de acumulacin celular
fueron sobrepasados. Es probable que la concentracin de hidrocarburos del medio haya
sido demasiado elevada con respecto a la capacidad de acumulacin de Pseudomonas y
-
27
que la acumulacin excesiva haya provocado una lisis casi inmediata, no mostrando
resultados muy evidentes (Hubert ; Shen ; Voordouw, 1999).
CONCLUSIN
Los microorganismos nativos del suelo muestreado, tienen la capacidad de degradar los
hidrocarburos que componen el aceite residual. La adicin de nutrientes proporciona
condiciones favorables a los microorganismos para que realicen las actividades
metablicas utilizando como nica fuente de carbono los hidrocarburos presentes en el
medio.
En general, la fertilizacin estimul el proceso de biodegradacin. Este tipo de cepa, una
vez propagada, podra ser empleada para acelerar los procesos de biodegradacin de
hidrocarburos en suelos contaminados.
ANEXOS
Medio King A
Frmula (en gramos por litro)
Peptona...20
Cloruro de Magnesio..1.4
Sulfato de Potasio10
Agar10
Cetrimida Agar Base
Frmula (en gramos por litro)
-
28
Peptona...20
Cloruro de Magnesio.1.4
Sulfato de Potasio..10
Cetrimida0.3
Agar..13.6
Medio M9
Frmula (en gramos por litro)
Cloruro de amonio.......1.0
Fosfato de sodio..6.0
Fosfato de potasio.3.0
cloruro de sodio..0.5
Glicerol5.0
Sulfato de magnesio 1N1 ml
Cloruro de calcio 0.01M.10 ml
Medio Luria Bertani (LB)
Frmula (en gramos por litro)
Bacto Triptona10
Extracto de levadura...10
Agar..5
-
29
Tabla 4 Frmula (en gramos por litro)
(Callic et al, 2004)
Medio King A
Casena hidrolizada cida
( ) ( )
( )
Peptona
( ) ( )
( )
Sulfato de Potasio
( ) ( )
( )
Cloruro de Magnesio
( ) ( )
( )
Agar bacteriolgico
-
30
( ) ( )
( )
Agar Cetrimida Base (Miller, 1972)
Cetrimida
( ) ( )
( )
Peptona
( ) ( )
( )
Cloruro Magnsico
( ) ( )
( )
Sulfato Potsico
( ) ( )
( )
Agar bacteriolgico
( ) ( )
( )
Agar motilidad
Triptena
( ) ( )
( )
Cloruro de sodio
( ) ( )
( )
Agar bacteriolgico
-
31
( ) ( )
( )
Medio M9
Fosfato de Sodio
( ) ( )
( )
Fosfato de Potasio
( ) ( )
( )
Cloruro de Sodio
( ) ( )
( )
Cloruro de amonio
( ) ( )
( )
Agar bacteriolgico
( ) ( )
( )
Medio LB
Extracto de levadura
( ( )
( )
Cloruro de Sodio
( ( )
( )
Bacto tristona
-
32
( ( )
( )
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INTRODUCCINANTECEDENTESHidrocarburosHidrocarburos BiognicosHidrocarburos Antrpicos
Aceites lubricantesAceites residualesCaractersticas generales de los aceites residualesDestino de aceites usados en MxicoConsecuencias del mal uso del aceite residualImpacto en la salud y medio ambiente
Degradacin de los hidrocarburosMicroorganismo degradadores de hidrocarburos
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMAJUSTIFICACINOBJETIVO GENERALOBJETIVO PARTICULARMETODOLOGAEsquema de trabajoMuestreoObtencin de PseudomonasAislamiento de cepas y pruebas bioqumicasPreparacin del inculoPrueba degradativa
RESULTADOSObtencin de PseudomonasAislamiento de cepas y pruebas bioqumicasPrueba degradativa
DISCUSIONESCONCLUSINANEXOSBibliografa