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UNIVERSIDAD DEL MARCAMPUS PUERTO ESCONDIDO

B i o l o g í a d e P r o c a r i o t a s

M. en C. Francisco G. Ruiz Ruiz.

Reporte de la práctica titulada:

ANÁLISIS DE AGUA PARA CONSUMO HUMANO

LIC. BIOLOGÍA

Realizado por:

Dalia Santos AltamiranoJ. Eduardo Ramírez Hernández

Puerto Escondido, Oaxaca, 24 de Junio del 2010

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

SESIÓN 1Preparación de diferentes medios de cultivos diferenciales.Esterilización de medios de cultivo.Práctica Día 1 (27 de Mayo del 2010)

SESION 2Esterilización de material sucioToma de muestra.Diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000Inoculación de cada dilución en diferentes medios de cultivos diferenciales.Incubación.Preparación de medios para realizar pruebas bioquímicas.Práctica Día 2 (03 de Junio del 2010)

SESION 3Preparación de agar nutritivo para resiembra de las cepas problemas.Preparación de agar nutritivo para la prueba bioquímica de la catalasa.Observación de bacterias macroscópica y microscópicamente.Aislamiento de bacterias. (Resiembra en medios de cultivo 0).Resiembra de las cepas I y II.Observación y captura de imagen con el microscopio de contraste. Tinciones

Tinciones simples Tinción de Gram

Práctica Día 3 (10 de Junio del 2010)

SESION 4Siembra en medios para realizar pruebas bioquímicasTincionesTinciones simplesTinciones diferenciales (verde malaquita)Tinción de GramCaptura de imagen con el microscopio de contraste y óptico.Práctica Día 4 (17 de Junio del 2010)

VISUALISACION DE LOS RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS Día 5 (21 de Junio del 2010)

ESTERILIZACION DE MATERIAL SUCIOENTREGA DE MATERIAL Día 6 (22 de Junio del 2010)

DIAGRAMA DE FLUJO GLOBAL DE ESTE ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO

Biología de procariotas 2

na de las mayores necesidades de la sociedad moderna es el de disponer de abundante agua para las actividades cotidianas y el consumo. Ante el aumento constante de la población, la enorme expansión de la industria y la falta de

protección al ambiente, la disponibilidad del agua en el planeta se ha ido disminuyendo, ya que la mayor parte se encuentra actualmente contaminada. El agua natural puede contener materiales visibles e invisibles, estos pueden ser: sustancias y minerales disueltos, materia orgánica y especies microbiológicas. Del total de agua disponible en los ríos y pozos de la República Mexicana, el 85% es para uso agrícola, 5% para uso doméstico, 5% uso industrial y 2% consumimos. Podemos asegurar que ese 2% que corresponde al consumo, se encuentra contaminado y por seguridad para ser usado en actividades domésticas o de consumo, es necesario que tenga tratamiento que haga que el agua se encuentre en óptimas condiciones. (http://webcache.googleusercontent.com)

U

El agua puede ser considerado como un disolvente universal, por lo tanto tiende a que todo con lo cual tiene contacto, también lo contamine o la afecte. Es una sustancia altamente reactiva con propiedades poco usuales y muy diferentes física y químicamente de otros líquidos. Así podemos hablar de propiedades físicas tales como: densidad, punto de fusión, punto de ebullición, tensión superficial, transparencia, color, olor y sabor. (http://webcache.googleusercontent.com)

La calidad del agua, se determina a partir de análisis físicos, químicos y bacteriológicos, los cuales pueden variar desde análisis sencillos donde se determinan los principales elementos, hasta análisis complejos que incluyen la determinación de una gran variedad de especies presentes en el agua. (http://webcache.googleusercontent.com)

Podemos considerar al agua potable, como aquella cuyo uso y consumo no causa efectos nocivos al ser humano ya que debe cumplir los requisitos del reglamento oficial, mientras que el agua purificada es agua sometida a un proceso físico y químico, es considerada óptima para el consumo humano, su ingestión no causa efectos nocivos a la salud, se encuentra libre de gérmenes patógenos y además cumple con los requisitos de la Norma Oficial Mexicana. (http://webcache.googleusercontent.com)

Existen una gran cantidad de sustancias químicas disueltas en el agua que no se observan a simple vista, pueden ser carbonatos, bicarbonatos, sulfatos de calcio y magnesio, cloruro de sodio o potasio, fluoruros, hidróxido de calcio, fierro, zinc, cloro libre, oxígeno disuelto, dióxido de carbono disuelto, etc. La gama de compuestos químicos presentes en el agua van desde compuestos muy conocidos hasta elementos como el plomo, mercurio, arsénico, que presentes a elevadas concentraciones ocasionan problemas muy grandes de contaminación y de salud en el ser humano. (http://webcache.googleusercontent.com)El enfoque microbiológico del agua ha sido de gran ayuda para analizar muestras del agua para consumo humano; esta ves se emplearan medios de cultivos selectivos para su análisis y encontrar las diversas especies de microorganismos que puede haber en ella. Puesto que el abastecimiento de agua para uso y consumo humano con calidad adecuada es fundamental para prevenir y evitar la transmisión de enfermedades gastrointestinales y otras, para lo cual se requiere establecer limites permisibles en cuanto a sus características microbiológicas, físicas, biológicas, químicas y radiactivas. El agua para uso y consumo humano es el que no contiene contaminantes objetables, ya sean químicos o agentes


http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:dQT47EE9TAsJ:redexperimental.gob.mx/descargar.php%3Fid%3D187+diferencias+agua+purificada/potable&cd=3&hl=en&ct=clnk&lr=lang_es%7Clang_en





infecciosos, y que no causa efecto nocivo al ser humano. También se denomina como agua potable. (http://biblio.upmx.mx)

En esta serie de prácticas uno de nuestros principales objetivos es analizar el agua de los despachadores que se encuentran en diferentes puntos de nuestra institución, y utilizando técnicas como medios de cultivo diferenciales y pruebas bioquímicas marcar un límite e identificar de las posibles bacterias que en ella se desarrollan. Por lo investigado las fuentes de agua embotellada contienen una microflora muy variada, que incluye las siguientes especies solo por nombrar las más comunes y a las que intentaremos detectar en esta práctica: (http://biblio.upmx.mx)

Coliformes totales* entre las cuales ubicamos a la Escherichia coli.Salmonella Typhi Estreptococos fecalis

De acuerdo con las normas oficiales mexicanas que nos serán útiles en esta práctica encontramos las siguientes:

NOM-014-SSA1-1993 Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano distribuida por sistemas de abastecimiento públicos y privados. (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/014ssa13.html)NOM-041-SSA1-1993 Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias. (http://www.rema.com.mx/041-ssa1-1993.pdf)NOM-092-SSA1-1994 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html)NOM-110-SSA1-1993 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis bacteriológico. (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/110ssa14.html)

NOM-112-SSA1-1994 establece el método microbiológico para estimar el número de coli-formes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más proba-ble (NMP) después de la incubación a 35 °C de la muestra diluida en un medio líquido. Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos pro-cesados térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la den-sidad esperada es como mínimo de una bacteria en 10 ml de producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido. (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/112ssa14.)

NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/127ssa14.html)

NOM-008-SCFI-1993 Sistema general de unidades de medida. (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html)

Para percatarse de la presencia bacteriana que puedan tener nuestras muestras es de gran utilidad para nuestro análisis utilizar medios selectivos, los cuales son medios que

Biología de procariotas 4* Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios. Existe poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html

favorecen el crecimiento de un género o de una especie concreta de microorganismos, son muy útiles para aislar ciertos microorganismos a partir de una población mixta. (Stanier Y. Roger et al., 1992)Está claro que no hay un medio ni un conjunto de condiciones que puedan favorecer el crecimiento de todos los tipos diferentes de organismos que existen en la naturaleza. Por el contrario, cualquier medio que es adecuado para el crecimiento de un organismo específico es, en cierto modo, selectivo para el mismo. En un medio inoculado con una variedad de organismos, solo aquellos que puedan crecer en él se reproducirán y todos los otros se extinguirán. Además, si los requerimientos de nutrición de un organismo son conocidos, es posible diseñar un conjunto de condiciones que favorezcan específicamente el desarrollo de este organismo en particular, permitiendo así su aislamiento a partir de una población natural mixta, aun cuando el organismo en cuestión sea un componente minoritario de la población total. (Stanier Y. Roger et al., 1992)

Los medios de cultivo a utilizar serán: Escherichia coli................Agar MacConkey. Salmonella Thypi.......................Agar Kigler. Streptococcus fecalis...................Agar VRB.

Otra técnica señalada arriba es el uso de pruebas bioquímicas para reducir nuestras alternativas sobre la identificación bacteriana. Las pruebas a utilizar son:

Fermentación de carbohidratos Catalasa Licuefacción de gelatina Pruebas motilidad Producción de H2S

OBJETIVOS

Se pretende:

Realizar buenas prácticas de trabajo en el laboratorio. Analizar el agua de los dispensadores del edifico de genética y del edificio de

profesores. Conocer los diferentes medios de cultivo y el uso de cada uno de ellos. Aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo. Recalcar los conocimientos obtenidos en sesiones pasadas sobre vertido en placa,

inoculación y siembra. Manipular material estéril utilizando las medidas correspondientes para evitar la

contaminación del medio. Familiarizarse con las técnicas empleadas para el cultivo y la manipulación de mi-

croorganismos en condiciones de esterilidad. Practicar las diluciones necesarias para tener un cultivo mas aislado. Adquirir conocimiento del registro e identificación de la morfología de las colonias

bacterianas.


Familiarizarse con el manejo del microscopio óptico para la visualización de microorganismos así como las tinciones más habituales en el laboratorio.

Determinar la existencia de los tipos de microorganismos establecidos con anteriori-dad, utilizando diferentes tipos de agares selectivos.

Interpretar resultados de pruebas bioquímicas.o Fermentación de carbohidratos

Determinar la capacidad que tiene un microorganismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio básico o acido con gas visible.

o Catalasa Comprobar la presencia de la enzima catalasa

o Licuefacción de gelatina Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolítico

(gelatinasas) que lisan la gelatina.o Prueba motilidad

Determinar si un microorganismo presenta motilidad.o Producción de H2S

Determinar si ha liberado acido sulfhídrico por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

MATERIAL

SESION 1Práctica Día 1 (27 de Mayo del 2010)

2 Matraz Erlenmeyer de 250 ml MATERIAL QUE EL ALUMNO DEBE DE TRAER

1 Gradilla para tubo de ensaye Papel estraza2 Matraz Erlenmeyer de 125 ml Gasas4 Tubos de ensaye Algodón8 Cajas petri de vidrio Masking tape8 Cajas petri desechables estériles Marcador indeleble1 espátula1 Pipeta graduada de 10 ml EQUIPOS1 Propipeta de llenado simple Autoclave2 Mecheros bunsen Balanza analítica1 Vaso de precipitados de 250 ml Parrilla eléctrica1 Frasco de vidrio de 250 ml1 Probeta graduada de 100 ml REACTIVOS1 Probeta graduada de 25 ml Agar macConkey1 Probeta graduada de 50 ml Agar VRB

Cinta parafilm Agar Kigler

SESION 2Práctica Día 2 (03 de Junio del 2010)

1 Jeringa 1 Gradilla para tubo de ensaye1 Varilla de vidrio MATERIAL QUE EL ALUMNO DEBE DE TRAER

8 Cajas de vidrio con Agar (sesión pasada) Papel estraza4 Tubos de la sesión pasada Gasas2 Asa bacteriológica de punta Algodón8 Cajas petri desechables de la sesión pasada Masking tape1 Frasco estéril Marcador indeleble2 Mecheros bunsen Cerillos


1 Asa acodada8 Tubos de ensaye con tapa REACTIVOS1 Matraz Erlenmeyer de 500 ml Caldo Rojo de Fenol con Manitol1 Probeta graduada de 100 ml Extracto de carne, peptona, gelatina1 Espátula Agar con sulfito de bismuto1 Vaso de precipitado de 500 ml1 Vaso de precipitado de 250 ml EQUIPOS6 Tubos de ensaye campana de flujo laminar2 Asa bacteriológica de aro Autoclave1 Matraz Erlenmeyer de 500 ml Balanza analítica4 Cajas petri desechables estériles Parrilla eléctrica

Incubadora


2 Matraz Erlenmeyer de 250 ml Gasas1 Gradilla para tubo de ensaye Algodón2 Matraz Erlenmeyer de 125 ml Masking tape4 Tubos de ensaye Marcador indeleble4 Cajas petri de vidrio2 Asa bacteriológica de punta EQUIPOS1 espátula Autoclave1 Probeta graduada de 50 ml Balanza analítica2 Asa bacteriológica de aro Parrilla eléctrica2 Mecheros bunsen Microscopio óptico1 Vaso de precipitados de 250 ml Microscopio de contraste6 Pipeta pasteur10 Porta objetos REACTIVOS10 Cubre objetos Extracto de carne, peptona, gelatina4 Vasos de precipitados de 50 ml Safranina1 Porta objetos cóncavo Lugol

Cinta parafilm Cristal violetaAlcohol etílico

MATERIAL QUE EL ALUMNO DEBE DE TRAER Peróxido de hidrogenoPapel estraza


10 portaobjetos Masking tape1 Gradilla para tubo de ensaye Marcador indeleble10 cubreobjetos13 Tubos de ensaye con medio de cultivo (sesión pasada) EQUIPOS4 Cajas petri de vidrio con agar (sesión pasada) Autoclave2 Asa bacteriológica de punta Balanza analítica1 Portaobjeto cóncavo Parrilla eléctrica2 Asa bacteriológica de aro Microscopio óptico2 Mecheros bunsen Microscopio de contraste4 Vaso de precipitados de 250 ml6 Pipeta Pasteur REACTIVOS

Cinta parafilm Extracto de carne, peptona, gelatinaMATERIAL QUE EL ALUMNO DEBE DE TRAER SafraninaPapel estraza LugolGasas Cristal violetaAlgodón Alcohol etílico


METODOLOGÍA

En este reporte general de prácticas, se redactara cronológicamente las actividades que se realizaron en las diferentes sesiones de prácticas. En total fueron cuatro sesiones las cuales se realizaron en las siguientes fechas:

Sesión 1. 27/05/10 la cual fue: Preparación de diferentes medios de cultivos diferenciales. Esterilización de medios de cultivo.

Las actividades que se realizaron fueron:1.- Se pesaron las cantidades de agar que se necesitaban para la elaboración del medio de cultivo.

Agar MacConkey.Agar Kigler.Agar VRB.

2.- Estas cantidades se diluyeron en un matraz Erlenmeyer con agua destilada, claro con las cantidades apropiadas previamente establecidas.3.- Una vez terminado, se preparo el matraz para su esterilización.4.- Se esterilizó el material en una autoclave durante 15 minutos, 15 lb a 121°C.5.- Una vez terminada la esterilización se vertieron los medios en cajas petri, se sellaron, etiquetaron y se guardaron en refrigeración para su posterior uso, que en este caso seria la siguiente sesión.

Sesión 2. 03/06/10. Esterilización de material sucio Toma de muestra. Diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000 Inoculación de cada dilución en diferentes medios de cultivos diferenciales. Incubación. Preparación de medios para realizar pruebas Bioquímicas.

1.- Al inicio de esta sesión se esterilizaron los materiales que se habían usado en sesiones pasadas de los parciales anteriores. 2.- Mientras se esterilizaban estos materiales, se procedió a tomar las muestras de los bebe-deros de agua de los edificios de genética y profesores para su análisis. 3.- Para poder sembrar, de estas muestras tomadas se realizaron diluciones (1:10, 1:100, 1:1000), las cuales se sembraron por la técnica extensión en placa las cuales se habían pre-parado en la sesión pasada.4.- Terminado el sembrado, se taparon y sellaron las placas, estas se pusieron en incubación a 37 °C para el crecimiento de los microorganismos.5.- En esta misma sesión se prepararon y esterilizaron los medios para las pruebas Bioquí-micas que se realizarían en las sesiones siguientes.

Sesión 3. 16/06/10. Preparación de agar nutritivo para resiembra de las cepas problemas. Preparación de agar nutritivo para la prueba Bioquímica de la catalasa.


Observación de bacterias macroscópica y microscópicamente. Aislamiento de bacterias. (Resiembra en medios de cultivo 0). Resiembra de las cepas I y II. Frotis simples Tinción de Gram Observación y captura de imagen con el microscopio de contraste

1.- Al inicio de esta sesión se prepararon los medios de cultivo para la resiembra de las ce-pas I y II.2.- También se realizo el medio de cultivo para la prueba Bioquímica de la catalasa. (Motivos en discusión)3.- Se realizó la identificación macroscópica y microscópica de las colonias crecidas en los medios, que se sembraron con las muestras de los bebederos de agua de los edificios de genética y profesores.Nota: solo crecieron dos colonias.4.- Estas colonias se resembraron, para aislar colonias bacterianas y poder realizar las pruebas bioquímicas.5.- En esta sesión también se realizo la resiembra de la cepa I y II.6.- Con las colonias crecidas, se realizaron frotis (en fresco) para observar, la estructura de estos microorganismos.7.- Se procedió a teñir estos frotis, con la tinción gram, para poder identificar que tipo de bacteria eran.8.- Se procedió a la toma de fotografía de esta muestra con un microscopio de contraste de fases, para ver mejor la estructura de estos microorganismos.

Sesión 4. 17/06/10. Siembra en medios para realizar pruebas bioquímicas Frotis Frotis (medio fresco) Tinciones diferenciales (verde malaquita) Tinción de Gram Captura de imagen con el microscopio de contraste y óptico

1.-En estas ultima sesión de prácticas, sembraron en los medios para realizar las pruebas Bioquímicas que se había programado para esta ocasión.2.- Terminado el sembrado se sellaron, taparon y se etiquetaron los tubos con las cajas petri, se encubaron a °C para observar los resultados de estas pruebas.


Imágenes: de izquierda a derecha, medios de cultivos diferenciales con crecimiento bacteriano, frotis, Eduardo haciendo tinción gram.

3.- En esta misma sesión se realizaron frotis y tinciones (gram), de las pruebas aisladas de las muestras obtenidas de los edificios de genética y de profesores. 4.- También se realizaron tinciones verde malaquita, a las cepas viejas que habían crecido de la muestra tomada en los edificios (profesores y genética) del campus. 5.- También se realizo tinciones gram para las cepas “x” I y II.5.- Posteriormente se tomaron fotografías de las tinciones en el microscopio de contraste de fases y óptico.

* 21 de Junio del 2010Visualización de los resultados de pruebas Bioquímicas (resultados)

*22 de Junio del 2010Esterilización de material sucio, entrega de material

RESULTADOS

SESIÓN 3Práctica Día 3 (10 de Junio del 2010)

Tabla 1. Al observar macroscópicamente el crecimiento en nuestras cajas Petri pudimos rescatar lo siguiente:

Cepas Imagen Forma Superficie Borde

E.de GenéticaDilución 1:100

A. Kigler

Circular Convexa Redondeado.

E. de profesores.

Dilución 1:1000 A. MacConkey.

Irregular Planoconvexa Ondulado

Tabla 2. Observaciones microscópicas obtenidas de las cepas de la tabla anterior pero ahora con tinción Gram y frotis.

Cepas Objetivo 4X. Objetivo 10 X. 40 X. 100 X.

E. Genética. (Frotis)


*Fuera de las sesiones de prácticas.

Tinción Gram

(E. Genética)

E. Profesores(Frotis)

En el caso de la tinción que fue la única que se realizo, ya que solo en esta cepa se mostraba una colonia bien definida, se observaron solo Gram negativas puesto que se tiñeron de rojo. El último frotis realizado de la cepa del edificio de profesores, en él se observaron microorganismos con movimiento y quizá esto se deba a que no se fijo bien la muestra, posiblemente también estos organismos presenten cilios o flagelos que le ayudan a desplazarse, debido a esto se traslado la muestra al laboratorio de biología para poder tomar una imagen con un microscopio de contraste de faces que se encuentra en ese lugar. Como la muestra se había secado por completo los microorganismos murieron observándose una imagen diferente a la que se avía observado en el microscopio óptico con el objetivo de inmersión mostrada en la tabla 2 de arriba.

Imagen tomada con el microscopio de contraste de fases.

SESIÓN 4Práctica Día 4 (17 de Junio del 2010)En esta sesión solo realizamos dos tinciones la tinción gram para identificar negativas o positivas y la verde malaquita para identificar esporas.Tabla 3. Muestra las imágenes obtenidas de la tinción verde malaquita.

Cepas Objetivo 4X. 10 X. 40 X. 100 X.


Cortesía de M. en C. J. Karina Cruz Vásquez.

E.de GenéticaDilución 1:100

A. Kigler

E. de profesores.

Dilución 1:1000

A. MacConkey.

En esta tinción solo hubo coloración rosa eso nos indica que la prueba de esporas es negativa.

Tabla 5. Observaciones de tinción gram

Cepas Objetivo 4X. 10 X. 40 X. 100 X. RESULTADOS

E. de profesores.

A. MacConkey

GRAM NEGATIVAS

E.de GenéticaResiembra

A. Kigler

GRAM POSITIVAS (COCOS)

Imágenes Biología de procariotas 12

Imagen de tinción verde malaquita, en donde se muestra una coloración rosa (por que la prueba fue negativa) de los bacilos encontrados en el edificio de profesores

Tabla 4. Resultado de las pruebas bioquímicas

Prueba MUESTRA OBSERVACIONESINTERPRETACI

ÓN DE RESULTADOS

Fermentación de carbohidratos

MacConkey (E. Profesores) Dilución 1:1000

Tiene siete burbujas una de ellas oscila en 3 mm, una mediana y las otras cinco son mas pequeñas de 1 mm, en medio del tubo.

Positiva para gas.Aerogénico: CO2

+ H2

Fermentación de carbohidratos

Kigler(E. Genética)

Dilución 1:100

Una sola burbuja en el centro del tubo, en medio de todo el crecimiento.

Positiva para gas.Aerogénico: CO2

+ H2

CatalasaMacConkey

(E. Profesores) Dilución 1:1000

Se observó inmediatamente la formación de burbujas.

Positiva. Formación inmediata de burbujas visibles (O2)

CatalasaKigler

(E. Genética)Dilución 1:100

Liberación de burbujas

Positiva. Formación inmediata de burbujas visibles (O2)

Licuefacción de gelatina

MacConkey (E. Profesores) Dilución 1:1000

Medio limpio.Negativo. El medio no se enturbió.

Prueba motilidadKigler


En la parte de arriba creció una manchita blanca y la picadura se dispersó.

Positiva. Mostró un crecimiento en estrías vellosas.

Producción de H2S MacConkey (E. Profesores) Dilución 1:1000

Una burbuja de 1 mm pegada en la pared de la caja. Negativa. No se desarrolla ennegrecimiento


Colonias bacterianas vistas macroscópicamente del edificio de profesores

Bacterias vistas macroscópicamente del edificio de genéticaImagen de tinción negativa con verde malaquita donde se distinguen cocos positivos teñidos de rojo por la safranina del edificio de genética.

ni reflejo metálico.

Producción de H2SKigler


Tres burbujas de 2 mm y una de 1 mm pegada a la orilla de la caja.

Negativa. No se desarrolla ennegrecimiento ni reflejo metálico.

Tabla 5. Resumen de los resultados

MUESTRA GRAM VERDE MALAQUITA

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS CATALASA LICUEFACCIÓN

DE GELATINAPRUEBAS

MOTILIDADPRODUCCIÓN

DE H2S

MacConkey (E. Profesores)

Dilución 1:1000

Negativa(bacilo) No se hizo

Kigler(E. Genética)

Dilución 1:100

Positiva(cocos) No se hizo

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

De los resultados obtenidos podemos deducir que:

Las bacterias encontrada en el edificio de profesores son bacilos gram negativos, que hasta ese momento la tinción con verde malaquita salió negativa a lo que deducimos 1) no había esporulado o 2) no eporula (quizá se deba a la aun existencia de nutrientes), además de la capacidad de fermentar carbohidratos, contener la enzima de la catalasa*, no licua gelatina y no produce H2O.Siento que estas características son demasiado escasas para poder hacer una identificación precisa, probablemente se apeguen un poco a Bergey, (1992) los Lactobacillus confusus, presentan colonias viscosas por excepción. Generalmente no presentan actividad proteolítica ni lipolítica que pueda apreciarse mediante halos claros formados en medios sólidos que contengan proteínas o grasas.Sin embargo, muchas cepas presentan ligera actividad proteolítica debido a proteasas y peptidasas ligadas a la pared celular o liberadas por ésta, así como una débil actividad lipo-lítica debido a la acción de lipasas intracelulares (Law y Kolstad, 1983; citados por Bergey, 1992).Normalmente no reducen los nitratos, pero esta reacción puede ocurrir en algunos casos, cuando el pH está por encima de 6,0. Los lactobacilos no licúan la gelatina ni digieren la


Imágenes de izquierda a derecha, pruebas Bioquímicas de fermentación de carbohidratos en agar MacConkey del edificio de profesores, prueba motilidad en agar Kigler del edificio de genética, fermentación de carbohidratos en agar Kigler del edificio de genética.

caseína, aunque muchas cepas producen pequeñas cantidades de Nitrógeno soluble. Tampo-co producen indol ni sulfídrico (H2S). Son catalasa negativos, pero algunas cepas producen la enzima pseudocatalasa que descompone el peróxido de hidrógeno. Son citocromo negati-vos, por la ausencia de porfirinas; presentan una reacción bencidina-negativa. La produc-ción de pigmentos por estas bacterias es rara y cuando ocurre, éstos pueden ser de color amarillo o naranja hacia un tono ferroso o rojizo.Su crecimiento en medio líquido se presenta a través de éste, aunque sus células precipitan rápidamente después que el crecimiento cesa; dando lugar a un sedimento suave y homogé-neo, sin formación de películas. En raras ocasiones este sedimento es granular oviscoso. (Law y Kolstad, 1983; citados por Bergey, 1992).

Mientras que en edificio e genética se observaron cocos gram positivos que fermentan car-bohidratos, que tienen motilidad, tiene la enzima de la catalasa y que no producen H2O.

CONCLUSIONES

Hacer una identificación bacteriana es sumamente complicado y por supuesto tardado, debido a que se tienen que elaborar muchas pruebas Bioquímicas, para así ir decidiendo a que bacteria pertenece e ir haciendo un filtro que nos lleve a un resultado e identificación verídica, por ese motivo no supimos como clasificar los cocos encontrados en el agua del bebedero de edificio de profesores.

En este caso nuestro énfasis era el análisis bacteriológico del agua, por lo tanto nuestro fuerte no es la identificación precisa, creo que uno de los puntos que no se debieron pasar por alto es el conteo bacteriano, sin embrago por la falta de tiempo y la carencia de equipo no se realizo, pero esperemos aprenderlo en el futuro.

OBSERVACIONES

En las prácticas realizadas en estas cuatro sesiones se realizaron las siguientes observaciones.1.- En el caso de la sesión 1, se tenía pensado preparar los siguientes medios para la identificación de las siguientes bacterias.

Escherichia coli………....Agar MacConkey. Vibrio Cholerae…………Agar TCBS. Salmonella Thypi……….Agar Kigler. Clostridios………………..Caldo Infusión Cerebro Corazón. Streptococcus fecalis.............Agar MacConkey (sin cristal V. y sin ClNa.)

Pero debido a que no se contaba en el laboratorio con los algunos medios de cultivo y de compuestos para prepararlos, se cambiaron algunos medios y se descartaron algunos microorganismos por los cual se prepararon para su identificación las siguientes.

Escherichia coli................Agar MacConkey.


Enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H 202) en oxígeno y agua.El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. (http://es.wikipedia.org)

Salmonella Thypi.......................Agar Kigler. Streptococcus fecalis...................Agar VRB.

De las cuales se consideraron que eran las más importantes.2.- Para la sesión 3, en la preparación de los medios de cultivo para la resiembra de la prueba “x” se tuvo que realizar dos veces por que se quemo la primera preparación. En ésta misma sesión se volvió a preparar medio para la prueba de la catalasa por que la preparada en la segunda sesión no solidifico.

3.- Como ultima observación, los resultados de las pruebas Bioquímicas se obtuvieron fuera de las sesiones antes mencionadas en la metodología.

CUESTIONARIO

1.- De acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, que otra norma aparte de las ya establecidas determinan la calidad o condiciones que se deben de tomarse en cuenta para la calidad del agua de consumo humano.

La Norma “International Bottled Water Association” (IBWA).

NORMA IBWA. La industria del agua embotellada normalmente emplea medidas adicio-nales para mayor protección de su producto empezando desde la fuente hasta el empaque. Estos requerimientos vienen escritos en el código de modelo IBWA. Los miembros de esta asociación son convocados para pasar por una inspección de planta improvisada; estas ins-pecciones son conducidas por una organización de tercer parte y hacen cumplir con todas las regulaciones aplicables. La IBWA actualmente contrata los servicios de la Fundación Internacional de Saneamiento, una auditoria técnica independiente altamente calificada y una firma de acuerdo para ejecutar estas auditorias otorgadas.

2.- Mencione que otro tipo de agar usaría para identificar estos tipos de microorganismos y ¿Por qué?

Agar E.M.B. Para E. Coli ya que este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Medio selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Grampositivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. (www.scribd.com)

Caldo infusión cerebro corazón. Para Streptococcus fecalis ya que los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, y que en esta infusión se desarrollan todas las especies de Streptococcus excepto los tiol y los piridoxal dependientes. Es un


medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas.La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balanceo osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. (www.scribd.com)

AGAR SULFITO DE BISMUTO. Medio selectivo para el aislamiento y diferenciación de Salmonella typhi y otras Salmonellas a partir de diversas muestras. Puesto que la peptona, el extracto de carne y la dextrosa proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. El sulfato ferroso actúa como indicador en la producción de sulfuro de hidrógeno que se manifiesta en el centro de la colonia por un precipitado negro y un halo negro grisáceo con brillo metálico por la reducción de los iones bismuto en presencia del sulfuro de hidrógeno. (www.scribd.com)

3.- Mencione que otros parámetros aparte del microbiológico se toman en cuenta para la purificación del agua para consumo humano.

Los parámetros del agua son características físicas, químicas, biológicas y radiológicas que permiten detectar cual es el grado de contaminación que presenta el agua, la razón principal de este problema es su estructura molecular que es dipolar, con una constante dieléctrica muy alta superior a cualquier otro líquido. Algunos de estos se utilizan en el control de los procesos de tratamiento realizando mediciones de forma continua o discreta. Los paráme-tros se pueden clasificar en cuatro grandes grupos: físico, químico, biológico y radiológico. (www.pnuma.org)

4.- ¿A que enfermedades estamos expuestos al consumir agua contaminada?

La enfermedad transmitida, los síntomas y su tratamiento dependen del tipo de microorganismo presente en el agua y de su concentración.Las bacterias más comunes seguidas por la enfermedad/infección causada y los síntomas son:

Aeromonas sp. Enteritis Diarrea muy líquida, con sangre y moco

Campylobacter jejuni Campilobacteriosis Gripe, diarreas, dolor de cabeza y estómago, fiebre, calambres y náuseas

Escherichia coli Infecciones del tracto urinario, meningitis neonatal, enfermedades intestinales Diarrea acuosa, dolores de cabeza, fiebre, uremia, daños hepáticos Plesiomonas shigelloides Plesiomonas-infección Náuseas, dolores de estómago y diarrea acuosa, a veces fiebre, dolores de cabeza y vómitos


Salmonella typhi Fiebre tifoidea Fiebre

Salmonella sp. Salmonelosis Mareos, calambres intestinales, vómitos, diarrea y a veces fiebre leve

Streptococcus sp. Enfermedad (gastro) intestinal Dolores de estómago, diarrea y fiebre, a veces vómitos

Vibrio El Tor (agua dulce) Cólera (forma leve) Fuerte diarrea(Contaminacion-purificacion-agua.blogspot.com)

5.- ¿Existe alguna enfermedad mortal dentro de las que se producen por tomar agua contaminada?

Si existen por ejemplo el cólera y la fiebre tifoidea, aunque actualmente estas enfermedades son controladas y pueden evitarse las muertes, pero en el caso de los de los países en vías de desarrollo prevalecen estas enfermedades siendo factores en los decesos en esos lugares, estas enfermedades pueden ser tratadas, siempre y cuando se diagnostique a tiempo.

6.- ¿Cual es la importancia que tienen las diluciones en este tipo de análisis?

Las diluciones tienen una gran importancia en el conteo de células, que presenta un medio de cultivo, ya que permite calcular la cantidad de células que contienen una determinada muestra, este método consiste en rebajar la concentración de una solución, por lo general añadiendo agua, tomando una porción de una solución (alícuota) y después esta misma disolverla en más disolventes. Hasta ir obteniendo pequeñas cantidades de la alícuota desde 1, 0.1, 0.01, 0.001 molar 1:100 (uno en cien) obteniendo la concentración final de 0.001 molar etc. haciendo mas fácil la cuantificación de los microorganismos. (González de Buitrago J. Manuel. 2da Edición)

7.- ¿cual es la metodología que se emplea para llegar al conteo de células en el caso de nuestro medio líquido empleando en patrón del NMP?

El NMP requiere la realización una serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo. Posterior-mente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparen-tes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de


que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede determinar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una tabla estadística. La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque cinco tubos por dilución se consideran como una relación apropiada entre la precisión y la economía. (http://dc129.4shared.com)

8-. Jerarquice de mayor a menor la importancia de los datos que debe contener una muestra en la etiqueta.

Lugar, fecha y hora. Es la más importante de todas ya que sin estos datos no podríamos reconocer o identificar las muestras.Sito de muestreo. También es importante ya que es indispensable para determinar los re-sultados y poder predecir el ambiente bacteriano ene ese sitio.Temperatura ambiente. Es importante en el sentido de que a través de esta se puede tomar la temperatura y encubar la muestras y estar mas seguros de que los organismos que crez-can en ese medio son realmente los que crecen en ese ambiente.Nombre de la persona que realiza el muestreo. También es indispensable, ya que ayudaría a reconocer de quien son los medios, mas cuando un mismo laboratorio es utilizado por una gran numero de personas.

BIBLIOGRAFÍA

REFERENCIAS ELECTRÓNICAS:

México. [Web en línea]. Disponible desde Internet en:

<http://www.rema.com.mx/041-ssa1-1993.pdf>[con acceso el 23 de mayo del 2010]

<http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html> [con acceso el 23 de mayo del 2010]

<http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html>[con acceso el 23 de mayo del 2010]




<http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/014ssa13.html> [con acceso el 23 de mayo del 2010]

<http://www.pnuma.org/recnat/esp/documentos/cap5.pdf> [con acceso el 23 de Junio de 2010]

<http://www.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas> [con acceso el 23 de Junio de 2010]

<http://dc129.4shared.com/download/322450642/e54c9f7d/numero_mas_provable_calculo.mht?tsid=20100623-230704-6c57dc2f> [con acceso el 23 de Junio de 2010]




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<http://contaminacion-purificacion-agua.blogspot.com/2005/09/enfermedades-producidas-por-la.html> [con acceso el 23 de Junio de 2010]http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa[con acceso el 24 de Junio de 2010]

http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:dQT47EE9TAsJ:redexperimental.gob.mx/descargar.php%3Fid%3D187+diferencias+agua+purificada/potable&cd=3&hl=en&ct=clnk&lr=lang_es%7Clang_en [con acceso el 22 de junio del 2010]Autor: IQ Silvia Angélica Sánchez Aguilarhttp://biblio.upmx.mx/Estudios/Documentos/adiccionpotomania021.asp [con acceso el 22 de junio del 2010]Autor: Cristóbal Chaidez Quiroz, Ph.D.

http://www.bibliociencias.cu/gsdl/collect/libros/index/assoc/HASH011d/e18c5081.dir/doc.pdf [con acceso el 24 de junio del 2010] Autor: Bergey, 1992.

LIBROS:

Stanier Y. Roger, John L. Ingraham, Mark L. Wheelis, Page R. Painter. MICROBIOLOGÍA. Segunda Edición. Editorial Reverte, S. A. 1992. Pp. 35

González de Buitrago J. Manuel. Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. 2da Edición. MASSON. Pp 37.


Esterilizar sucio.Toma de muestra para analizarHacer diluciones inoculaciónPreparar medios de cultivo para realizar pruebas Bioquímicas.

No

Si

Siembra en los medios para realizar pruebas BioquímicasTinciones (Gram y verde malaquita)Captura de imagen con el microscopio de contraste de fases y óptico.Incubación de los medios inoculados

Visualización de los resultados de las pruebas Bioquímicas

Esterilización del material sucioEntrega de material

INICIO

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Material completo

Preparar los diferentes medios de cultivo.Esterilizar medios.Verter en caja o tubos.Sellar y etiquetarMeter al refrigerador

Si

No

http://www.bibliociencias.cu/gsdl/collect/libros/index/assoc/HASH011d/e18c5081.dir/doc.pdf

http://biblio.upmx.mx/Estudios/Documentos/adiccionpotomania021.asp




SiPreparación de agar nutritivo para resembrar las cepas I y II.Elaboración de agar nutritivo para hacer la prueba de la catalasa.Observar macroscópica y microscópicamente las colonias y las bacterias encontradas.Aislamiento de bacteriasResembra en medios de cultivo 0Resiembra de las cepas I y II.Observación y captura de imagen en microscopio de contraste de fase.FrotisTinción Gram

FIN

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