XVII CONCURSO UNIVERSITARIO FERIA DE LAS CIENCIAS

CARTULA DE TRABAJO

Biologa rea

Externa Categora

Investigacin Experimental Modalidad

Caracterizacin del perfil de ADN humano como herramienta de identificacin

forense Ttulo del trabajo

EcoR1 Pseudnimo de integrantes

1

NDICE

2

NDICE

Abreviaturas ---------------------------------------------------------------------- 4

Resumen -------------------------------------------------------------------------- 6

Marco Terico ---------------------------------------------------------------------8

Introduccin ----------------------------------------------------------------- 8 Gentica -------------------------------------------------------------------- 9 Medicina Forense ----------------------------------------------------------- 10 Enzimas de restriccin ------------------------------------------------------ 15 Electroforesis en gel de agarosa -------------------------------------------- 17 Planteamiento del problema---------------------------------------------------- 20 Objetivo General----------------------------------------------------------------- 22 Objetivos especficos ------------------------------------------------------------ 22 Hiptesis-------------------------------------------------------------------------- 22 Material y Mtodos---------------------------------------------------------------24

Digestin de ADN con enzimas de restriccin-------------------------------24 Electroforesis de las muestras de ADN--------------------------------------24 Metodologa --------------------------------------------------------------------- 25

Obtencin de muestras de ADN-------------------------------------------- 25 Digestin con enzimas de restriccin de las muestras de ADN------------- 25

Rehidratacin de las muestras-------------------------------------- 25 Electroforesis en gel de agarosa

Preparacin del tampn de electroforesis---------------------------- 26 Preparacin de la agarosa------------------------------------------- 26 Preparacin de los geles de agarosa--------------------------------- 26 Electroforesis y tincin de las muestras de ADN--------------------- 27 Tincin de los geles de ADN----------------------------------------- 27

Resultados ----------------------------------------------------------------------29

Anlisis de Resultados --------------------------------------------------------- 33

Conclusiones ------------------------------------------------------------------- 35

Referencias --------------------------------------------------------------------- 37

Apndices Apndice A Glosario de trminos------------------------------------------------ 40 Apndice B Escenarios alternativos de la tcnica de identificacin de ADN----- 47 Apndice C Fotografas----------------------------------------------------------52

3

ABREVIATURAS

4

ABREVIATURAS ADN.- acido desoxirribonucleico

DTT.- dithiothreitol

EcoRI.- E. coli restriction enzyme (por sus siglas en ingls)

EDTA.- cido etilendiaminotetraactico

HindIII.- marcadores con pares de bases que migran a distancias conocidas

MgCl2.- Cloruro de Magnesio

NaCl.- Cloruro de sodio

PCR.- reaccin en cadena de polimerasa

SEMEFO.- Servicio de Mdico Forense

TAE.- Tris-Acetate-EDTA

TC.- Tampn de carga

TSJDF.- Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal

5

RESUMEN

6

Caracterizacin del perfil de ADN humano como herramienta de identificacin forense.

RESUMEN Todos los das podemos observar como la gentica forma parte de nuestras vidas, ya que mediante sta es posible confirmar parentescos, conocer nuestra predisposicin a desarrollar determinadas enfermedades, y comprender con mayor profundidad el funcionamiento de nuestro organismo. Del mismo modo, desde sus inicios la gentica ha resultado ser una herramienta fundamental en el desarrollo de otras ciencias como la antropologa y la arqueologa, as como en el sistema judicial de una gran cantidad de pases, donde en muchas ocasiones las pruebas de ADN (cido desoxirribonucleico) prcticamente han resuelto casos criminales. La tcnica de tipificacin de ADN se utiliza en la medicina forense, en la antropologa y la biologa de conservacin no slo para determinar la identidad de los individuos sino tambin para determinar su relacin. Este proceso ha sido utilizado para liberar a sospechosos inocentes, reunir a nios con sus familiares, identificar animales robados y demostrar que la carne de ballena ha sido sustituida por el pescado en el sushi. Esta tcnica consiste bsicamente en llevar a cabo una digestin enzimtica del ADN en cuestin. De este modo se obtienen fragmentos de ADN de secuencias conocidas y por lo tanto pueden ser comparables con ADN proveniente de otras muestras. El ADN digerido enzimticamente se somete a un ensayo de electroforesis, el cual se basa en la separacin de dichos fragmentos por sus cargas elctricas y tamao molecular. De este modo es posible comparar los patrones obtenidos de cada muestra y establecer relaciones de parentesco, de identidad, o de contenido segn sea el caso. En esta investigacin se simula un caso criminal y se propone identificar dentro del escenario propuesto al sujeto responsable de un crimen basndose en la tipificacin del ADN de cada muestra comparndola con la muestra recogida en la escena de un crimen. El conocimiento de las tcnicas actuales de biologa molecular resulta un elemento bsico e indispensable en la educacin media superior. Reconociendo esta necesidad quisimos profundizar pero sobre todo llevar a la prctica los conocimientos adquiridos y poder transmitirlos a travs de la difusin en el XVII Concurso Universitario Feria de las Ciencias. Palabras clave: Gentica, ADN, Medicina Forense, PCR, Electroforesis, enzimas de restriccin, Gel de agarosa, huella gentica, secuencia de reconocimiento.

7

MARCO TERICO

8

MARCO TERICO Introduccin

Todos los das podemos observar como la gentica forma parte de nuestras vidas, ya que mediante sta es posible confirmar parentescos, conocer nuestra predisposicin a desarrollar determinadas enfermedades, y comprender con mayor profundidad el funcionamiento de nuestro organismo. Del mismo modo, desde sus inicios la gentica ha resultado ser una herramienta fundamental en el desarrollo de otras ciencias como la antropologa y la arqueologa, as como en el sistema judicial de una gran cantidad de pases, donde en muchas ocasiones las pruebas de ADN (cido desoxirribonucleico) prcticamente han resuelto casos criminalsticos. Sin duda alguna, adems de constituir una ciencia per se, la gentica posee mltiples aplicaciones, siendo un invaluable auxiliar en una variedad de campos de estudio.

La gentica ha tenido un importante desarrollo durante las ltimas dcadas; sin embargo, desde pocas tan antiguas como la cultura griega tenan ya ciertos conocimientos. Mientras que Aristteles propuso que exista la herencia entre abuelos y bisabuelos, los indios observaron que haba enfermedades que se repetan en las diversas generaciones de sus familias. Despus de la poca medieval, tambin hubo algunos avances al realizar estudios sobre el aparato reproductor llegando a la conclusin de que la herencia exista por unin.

En el siglo XIX, un monje austriaco llamado Gregor Mendel, observ las caractersticas que se iban transmitiendo y las que se rezagaban de una generacin de plantas a otra. En base a sus experimentos lleg a varias propuestas, entre ellas el hecho de que la informacin gentica proviene 50% del padre y el otro 50% de la madre. Asimismo, acu los conceptos de alelo, dominancia y recesividad. Gracias a sus avances y al ser el primero en estudiar formalmente ste campo, se le conoce como el Padre de la Gentica.

Despus de Mendel, otros cientficos han continuado la labor, descubriendo elementos fundamentales de esta ciencia como lo son los cromosomas, el factor hereditario, la estructura del ADN y su formacin, la sntesis de protenas, y ms recientemente el estudio del genoma humano, entre otros. Estos descubrimientos han dado paso al desarrollo de nuevas tcnicas que son de gran utilidad en otras reas.

La gentica juega un rol esencial en la medicina forense pues el ADN que se encuentra presente en los fluidos y las estructuras de nuestro cuerpo permite reconocer cadveres, conocer la identidad del emisor de algn fluido como saliva o semen, saber si un determinado sujeto estuvo presente en un lugar, etc.

9

Consecuentemente, la gentica y el ADN amplan en gran medida el horizonte de los sistemas judiciales, posibilitando la imparticin de justicia con un margen de error relativamente nulo.

Gentica

La gentica se define como el estudio de la herencia y de los genes. Aunque los primeros antecedentes de esta ciencia se remontan a varios siglos atrs, no surgi formalmente sino hasta el siglo XIX con las investigaciones de Mendel. En la actualidad la gentica se ha enfocado principalmente en el estudio de los factores hereditarios y el anlisis del cido Desoxirribonucleico (ADN). Igualmente, la gentica ha sido aplicada en diferentes reas de nuestras vidas.

En la medicina, la gentica se utiliza principalmente para el diagnstico y tratamiento de enfermedades o desrdenes hereditarios tales como sndromes y genes que predisponen el desarrollo de cncer. Estas pruebas pueden realizarse desde las etapas ms tempranas del desarrollo de una persona, incluso antes del parto. Se espera que en un futuro cercano, la ingeniera gentica pueda reparar genes con fines mdicos o modificarlos cuando definan alguna predisposicin patolgica (Solari, 1999)

Asimismo en la agricultura, la gentica se usa extensamente con el propsito de mejorar las distintas especies de plantas y animales para poder obtener un mejor aprovechamiento de sus recursos. Los campesinos aplican la gentica para la creacin de lo que comnmente se conoce como plantas transgnicas, las cuales son ms resistentes a los fenmenos naturales y las plagas, aunque todava son debatidos los efectos que puedan tener para la salud en el largo plazo.

La industria farmacutica recurre a la gentica para crear y/o mejorar diversas bacterias y otros microorganismos antibiticos. As, los medicamentos adquieren una mayor eficacia para tratar los padecimientos.

El ADN es definido como un compuesto bioqumico encontrado en todas las clulas procariotas y eucariotas, as como en varios virus. Los genes, el objeto de estudio de la gentica, son parte de la estructura del ADN y almacenan el cdigo gentico. El ADN est formado de nucletidos, los cuales son compuestos por una molcula de azcar desoxiribosa, un grupo fosfato y una de cuatro bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Timina o Citosina. La estructura del ADN es de una doble hlice formada por hebras de ADN que forman una espiral (Britannica online, 2009)

Todas las personas tienen un cdigo gentico diferente, siendo posible identificarlas teniendo como base una muestra gentica de la persona. De este

10

modo, a partir de una muestra de alguna clula se puede extraer ADN y encontrar la huella gentica de la persona, pudiendo compararla con otra muestra (Frankel, 1989). Debido a ello, la gentica es una de las reas ms tiles entre las que se integran y aplican a la medicina forense.

Medicina Forense

La medicina forense se define como un conjunto de conocimientos relacionados con la medicina cuyo objetivo es hacer una valoracin acertada sobre las causas del fallecimiento de una persona (TSJDF, 2009). Es una especialidad mdica cuyos conocimientos cientficos sirven para determinar los agentes que causaron la muerte de un individuo, ya sea natural o provocada. Su principal funcin es suministrar conocimiento al aparato legal para precisar la aplicacin de justicia (Trujillo, 2002)

En Mxico, la institucin que se dedica a la medicina forense es el Servicio Mdico Forense en Mxico. sta institucin tiene como objetivo proporcionar apoyo pericial a distintas instituciones jurdicas; est regulado por el Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal. El apoyo pericial que proporciona esta institucin es el de determinar las causas y la fecha de un deceso, as como dar sustento en incidentes referentes a balstica u otro tipo de lesiones en los que no necesariamente se registra algn fallecimiento. Esta institucin se conforma de especialistas en medicina forense, qumica, balstica, psicologa, deontologa y dactilologa, entre otros.

El Servicio Mdico Forense cuenta con los servicios de identificacin de cuerpos, toxicologa y patologa. El primero permite conocer la identidad de una persona fallecida comparando huellas digitales o radiografas dentales. La toxicologa ayuda a determinar si alguna sustancia (drogas) se involucr en la muerte de una persona. Finalmente, el departamento patolgico analiza rganos del cuerpo para determinar las posibles causas de muerte (Corporativo de servicios periciales, 2009)

Un mdico forense realiza actividades mdicas relacionadas con la identificacin de personas, certificacin de lesiones, sanidad y consecuencias de las mismas, as como valoraciones psiquitricas y psicolgicas, todas stas por orden de la autoridad judicial. El Servicio Mdico Forense presta apoyo a instituciones de salud y procuracin de justicia para la elaboracin de opiniones tcnicas de tipo mdico o para la determinacin de intoxicaciones por consumo de drogas de abuso, intoxicaciones por otras sustancias y estudios de histopatologa.

11

La medicina forense depende de la gentica ya que esta es la rama de la Biologa que trata de la herencia y de su variacin. La herencia se refiere a que la descendencia tiende a asemejarse a sus padres, basndose en el hecho de que el aspecto y funcin biolgica, es decir, el fenotipo, est determinado en gran medida por la constitucin gentica, es decir, el genotipo.

En el plano tcnico, los mdicos legistas del Distrito Federal estn agrupados principalmente en tres instituciones:

Servicio Mdico Forense, que en la capital depende del Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal, y se encarga de la prctica de autopsias medicolegales.

Direccin General de Servicios Periciales de la Procuradura General de Justicia del Distrito Federal. Sus mdicos asisten al escenario de la muerte, atienden casos de lesiones as como de delitos contra la libertad sexual.

Procuradura General de la Justicia de la Repblica, cuyos mdicos atienden a los casos de farmacodependencia y otros delitos federales.

En cada estado existe un servicio mdico forense que depende de la Direccin General de Servicios Periciales de la Procuradura General de la Justicia Estatal. (Negrete, 2009)

Los servicios con los que cuenta el Servicio Mdico Forense (SEMEFO) son:

Archivo.- El archivo del SEMEFO se encarga de atender los trmites en relacin a la solicitud de copias certificadas de dictmenes de necropsia, y ampliacin de la misma, resultados de estudios toxicolgicos e histopatolgicos, llenado de formatos de seguro de vida, as como oficios de fe de erratas.

Identificacin.- El departamento de Identificacin del SEMEFO cuenta con personal especializado en antropologa, dactiloscopa, odontologa y fotografa forense. El objetivo principal es el estudio de los cadveres que ingresan en calidad de desconocidos, para su probable identificacin.

La antropologa forense se encarga de realizar la cdula somatolgica de todo cadver de identidad desconocida que es ingresado a esta Institucin, con la finalidad de obtener y registrar todos los hallazgos presentes en el cuerpo, ya sean congnitos (malformaciones, manchas y lunares) adquiridos (tatuajes, cicatrices, amputaciones, deformaciones, modificaciones estticas). Permitiendo la elaboracin de un archivo que se utiliza para ser confrontado con la informacin de la persona extraviada o ausente, que es proporcionada por los familiares.

12

Otra actividad que realiza esta rea es la valoracin de la edad biolgica en personas involucradas en procesos legales, as como el anlisis morfocomparativo de la regin facial.

La odontologa forense realiza el estudio odontolgico completo de todos los cadveres que ingresan en calidad de desconocidos, la ficha que se elabora menciona las caractersticas naturales de los dientes como son resistencia, tamao, posicin, color, ausencia congnitas y caractersticas adquiridas como son las restauraciones dentales, amalgamas, resinas, prtesis fijas, removibles, totales tratamientos de ortodoncia ausencias por extracciones, etc. Con todas las caractersticas mencionadas se obtiene una base de datos, la cual se utiliza para compararla con la informacin proporcionada por los familiares y determinar la identidad de un cuerpo.

La dactiloscopa se encarga de realizar el estudio de las yemas de los dedos de ambas manos. Su participacin en el departamento de identificacin es importante ya que elabora una ficha conocida como decadactilar a todos los cadveres que ingresan como desconocidos al SEMEFO, en el caso de recin nacidos se toma la huella de ambas manos y de la planta de los pies. Con estas fichas se realizan confrontas con los documentos proporcionados por los familiares para la bsqueda de las personas ausentes o extraviadas.

La fotografa como disciplina forense forma parte importante del departamento de identificacin, tiene como objetivo fundamental, reforzar de manera grfica a las diferentes reas que la integran, elaborando una ficha fotogrfica de identificacin de individuos desconocidos, ampliacin fotogrfica de huellas dactilares, fotografa de cavidad oral, fotografa de seas particulares, seguimiento fotogrfico de exhumaciones y seguimiento de estudios postmortem.

Patologa.- El laboratorio de patologa es un auxiliar para el mdico forense debido a que diagnostica o ratifica los diagnsticos macroscpicos. Su actividad es la de llevar a cabo los estudios microscpicos de las muestras de los rganos que son enviadas del rea de necropsias del Servicio. En ocasiones los estudios histopatolgicos son determinantes para establecer la causa de muerte, sin el apoyo de dichos estudios algunas necropsias pueden resultar incompletas.

Toxicologa.- Realiza estudios qumico toxicolgicos del mbito forense en cadveres, a peticin expresa del mdico forense en muestras biolgicas retiradas del cadver.

En el caso concreto del laboratorio qumico su misin es auxiliar de manera directa al mdico forense, llevando al cabo anlisis qumicos toxicolgicos para

13

esclarecer la probable causa de muerte o en su caso establecer si la persona al momento del fallecimiento se encontraba bajo el influjo de alguna droga.

Los anlisis qumicos son llevados al cabo con tecnologa de punta iniciando stos con un screening por tcnicas presuntivas, de igual forma se corroboran estos resultados mediante tcnicas confirmativas para lo cual se utilizan anlisis inmunoenzimtico, cromatgrafo de gases con head space, cromatgrafo de gases acoplado a espectrometra de masas y espectrometra de absorcin atmica.

Los txicos y sustancias ms comnmente solicitadas para su bsqueda son alcoholes, sustancias voltiles, drogas de abuso, frmacos en general, plaguicidas, monxido de carbono, metales y fosfatasa cida.

En cuanto a muestras biolgicas las ms comunes tomadas del cadver corresponden en orden descendente y son la sangre, orina, contenido gstrico, rganos especficos y exudados.

Enseanza.- Esta rea se encarga de coordinar y programar grupos de alumnos de escuelas de medicina, sin embargo, debido al inters de algunas escuelas para observar estudios de necropsia se llega a autorizar su asistencia, para ello se requiere presentar solicitud escrita con anticipacin, una hoja membretada de la escuela, con sello y firma del Director, que la carrera o licenciatura sea afn a la medicina forense, indicar por la Institucin solicitante el grado acadmico y nmero de alumnos y la finalidad y metas de la visita.

Reclasificacin de Lesiones.- Es una accin necesaria para el Juez que lo solicita debido a que requiere que un especialista determine si la clasificacin mdico legal inicial permanece igual o esta cambia, adems le interesa establecer si el lesionado se encuentra sano de las lesiones que sufri y si existen consecuencias debido a ellas; esta actividad es indispensable para que el Juez tenga la posibilidad de resolver una situacin jurdica. (Tribunal Superior de Justicia del Distrito federal)

El ADN fue descubierto por los cientficos Watson y Crick en la dcada de los 50 y dicha hazaa cientfica revolucion el campo de la medicina especficamente la especialidad gentica, a partir de ah se comenzaron mltiples intentos de modificar enfermedades que hasta entonces solo tena tratamiento paliativo y no se podan prever, es importante sealar que precisamente la parte de la molcula de ADN que se utiliza con fines clnicos es la no variable ya que es la que consta con aminocidos que codifican a cada gen en cada tejido, sin embargo no fue hasta 1985 que Dr. Alec Jeffreys para la resolucin de un caso de

14

inmigracin de un joven procedente de Ghana lo aplica con fines forenses por primera vez y en segunda ocasin dos aos ms tarde, en la investigacin criminal, posibilitando identificar a Robert Melias, un pen de Bristol de 32 aos de edad, como autor de una agresin sexual a una mujer enferma de polio, y a Nigel Davis como autor del denominado "caso del condado de Leicestershire", en el que se produjo la violacin y muerte de dos mujeres del condado, la primera en 1983 y la segunda en 1985 y donde los mtodos serolgicos clsicos no pudieron lograr una individualizacin suficiente con los indicios biolgicos, su teora se basaba en el descubrimiento de regiones hipervariable que se extendan entre las codificantes, que no se repiten entre los individuos y que cada ciertos segmentos vuelven de forma exacta a la misma secuencia de aminocidos que present al principio lo que hacen identificar de forma absoluta a ese individuo.

La variabilidad de estas zonas radica en diferencias exhibidas por el material gentico, en la secuencia nucleotdica misma a travs de sustituciones de nucletidos, o en la distinta longitud generada por una misma secuencia que se repite un nmero diferente de veces. Cuando fue posible conocer su localizacin y desarrollar una metodologa adecuada para ponerlas de manifiesto comenzaron a ser estudiadas mediante sistemas de anlisis cada vez ms precisos y sencillos.

El descubrimiento de regiones hipervariables del genoma con localizacin especfica permiti el desarrollo de las sondas de locus nico que resolveran el problema, posibilitando el estudio de una zona conocida del genoma que se visualizaba como dos nicas bandas para la condicin heterocigota, correspondientes cada una a un alelo, heredado de cada progenitor.

Estas zonas estn constituidas por secuencias repetidas, que aparentemente carecen de funcin como codificantes de protenas. La menor variabilidad exhibida por estos sistemas de anlisis se solucionaba empleando un conjunto de cuatro o ms sondas unilocus que evaluaban otras tantas regiones del genoma.

La identificacin mdico-legal a travs del anlisis del ADN se realiza sobre regiones no codificantes del genoma que son aquellas que no contienen informacin alguna sobre las caractersticas fenotpicas de las personas. Es decir, que por medio del anlisis forense del ADN no se puede saber sin un individuo es rubio, alto, gordo, ni conocer si va a sufrir alguna enfermedad o si tiene tendencia a padecer determinados tipos de patologas, ya que el ADN no codificante no contiene esa informacin. Si disponemos un archivo con material biolgico (sangre o saliva) la muestra podra destinarse a otro tipo de anlisis, diferente a la identificacin mdico-legal, pero tambin es cierto que las muestras archivadas en esas bases de datos, al margen de las garantas que el sistema de cada pas

15

disponga para evitar el mal uso, no podrn ser utilizadas en otros estudios clnicos por la cantidad de material (que es mnima, suficiente para el estudio forense, pero difcilmente para un anlisis clnico) y por las condiciones y caractersticas del mismo, ya que este se guardan en forma de manchas secas, con lo cual la calidad del ADN se ver afectada.

Las caractersticas generales del ADN no codificante lo hacen especialmente til para su aplicacin a la identificacin en Medicina Forense. Como se puede deducir de su trascendente funcin, el ADN esencial est formado por secuencias altamente conservadas con muy pocas variaciones interindividuales e intergeneracionales, ya que de lo contrario se podran ver afectadas funciones bsicas para la vida de las personas. Los mnimos cambios que tienen lugar, cuando son viables, aumentan el polimorfismo de protenas y enzimas, aunque tambin pueden tener efectos negativos.

Por el contrario, el ADN no codificante presenta una gran variabilidad de unos individuos a otros, ya que estas secuencias no son conservadoras al no afectar sus cambios a la fisiologa del individuo. Las variaciones debidas a cambios de bases sencillos, procesos de insercin-deteccin o de intercambio de ADN (recombinacin) durante la formacin de las clulas germinales (meiosis), hacen que se modifiquen el nmero de repeticiones o el orden de las bases de un determinado fragmento repetitivo, pudiendo producirse en un locus sencillo o e mltiples loci, siendo este el origen de la variacin que hace que no haya dos personas, a excepcin de los gemelos univitelinos, que tengan la misma secuencia del ADN.

La repercusin prctica de lo anterior es la existencia de diferentes alelos, es decir la posibilidad de que encontremos entre la poblacin varias formas de presentarse un determinado carcter o fragmento de ADN no codificante.

Para lograr identificar los diferentes alelos se usan las enzimas de restriccin que son las que cortan el ADN haciendo dos roturas, una con cada uno de las espinas dorsales del fosfato de la hlice doble. La enzima hace esto sin daar las bases del ADN. Aunque la enzima rompe el ADN, los vnculos qumicos se pueden reformar por otras enzimas conocidas como ligases del ADN. Por lo tanto, los fragmentos de la restriccin del ADN de los diversos cromosomas o genes se pueden ligar, proporcionando a sus extremos secuencias complementarias.

Enzimas de restriccin Las enzimas de restriccin se sitan en la molcula de ADN y se desplazan

por la hlice hasta que reconocen unas secuencias especficas de pares de bases

que indican a la enzima que deje de desplazarse. Las enzimas entonces digieren o separan qumicamente la molcula de ADN en ese punto, llamado diana de restriccin, actuando como tijeras moleculares, cortando el ADN por secuencias especficas de pares de bases. Si existe ms de una diana de restriccin en una molcula de ADN, la enzima de restriccin cortar en cada uno de esos sitios, obtenindose mltiples fragmentos. As, si un fragmento lineal de ADN se corta con una enzima de restriccin cuya diana de restriccin se encuentra en dos puntos diferentes de la molcula de ADN, se obtendrn tres fragmentos de diferentes longitudes. La longitud de cada fragmento depender de la localizacin de las dianas de restriccin en la molcula de ADN. Cuando las enzimas de restriccin se usan para cortar cadenas de ADN plasmdico circular, se obtienen fragmentos de ADN de varios tamaos. El ADN cortado con enzimas de restriccin puede ser separado y observado utilizando una tcnica denominada electroforesis en gel de agarosa. El trmino electroforesis significa mover con electricidad.

Dado que cortan el ADN, las enzimas de restriccin son las tijeras qumicas de los bilogos moleculares. Cuando una determinada enzima de restriccin reconoce una secuencia de reconocimiento (de 4 o 6 pares de bases) en un fragmento de ADN, corta la molcula en ese punto. Las secuencias de reconocimiento de dos enzimas usadas habitualmente, EcoRI y PstI, aparecen a continuacin. El lugar exacto en que se corta la cadena de ADN se seala con unas tijeras como smbolo:

Para la enzima: Eco RI

Para la enzima: Pst I

Como todas las enzimas, las enzimas de restriccin funcionan mejor en un tampn (buffer) y a una temperatura especfica. El tampn apropiado para las enzimas de restriccin se incluye con la muestra de ADN, de manera que cuando el ADN rehidratado y las enzimas se mezclan, se crean las condiciones ideales para el ptimo funcionamiento de las enzimas. El buffer contiene Tris 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, DDT 1 mM, pH 8.0, que son las condiciones ideales para el funcionamiento correcto de las enzimas EcoRI y PstI.

16

17

Electroforesis en gel de agarosa

La tcnica de electroforesis se basa en la migracin de las molculas con carga neta de una muestra, cuando es sometida a un campo elctrico, hacia el polo opuesto de su carga. El mtodo no es tan sencillo: primero hay que saber con qu tipo de molculas se est trabajando y de acuerdo a esto se elige el procedimiento y los materiales necesarios.

Hay dos fuerzas que determinan la velocidad con que una molcula migrar: la fuerza elctrica y la de rozamiento. La primera es la responsable de que la molcula en cuestin, que en nuestro caso es el ADN, sea atrada hacia uno de los electrodos. Por esto es que cuanto mayor sea el cociente carga/masa de la molcula mayor ser la aceleracin con que se mueva. La fuerza de rozamiento tiene una accin opuesta: a mayor rozamiento, menor velocidad de migracin. Esta fuerza tiene que ver con el tamao y forma de la molcula que migra, y con las caractersticas del medio en que se mueve.

Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migracin adecuado, de modo que la separacin sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las molculas de distinto tamao se separen. Para ello se utiliza usualmente un gel que consiste en una red compuesta por un polmero orgnico llamado agarosa que es un derivado de un polisacrido de un alga el cual aumenta considerablemente la friccin, impidiendo a la vez la difusin de las molculas a travs del medio acuoso en todas las direcciones. Al colocar las muestras de DNA a travs de este gel y someterlo a un campo elctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas segn su tamao. La rapidez con que migren las molculas puede ser regulada por la concentracin de agarosa disuelta en la solucin amortiguadora que usemos: a mayor concentracin, mayor compactacin de la red y por tanto menor velocidad de migracin (Garrido, 2009).

El ADN es incoloro lo que provoca que los fragmentos de ADN no se puedan ver en el gel durante la electroforesis. Se utiliza entonces un tampn de carga, que contiene dos colorantes azules, y que se aade a la solucin de ADN. Los colorantes no tien el ADN, pero facilitan la carga de los geles y permiten ver el avance de la electroforesis. Los colorantes migran hacia el polo positivo situado al final del gel, al igual que los fragmentos de ADN. El colorante rpido migra con los fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pb, mientras que el colorante lento migra con los fragmentos de ADN de tamao aproximado de 5 kpb.

La tincin del ADN muestra su localizacin en el gel. Cuando el gel se sumerge en una solucin diluida de colorante, las molculas de ste se unen a las

18

molculas de ADN atrapadas en el gel de agarosa. Para aumentar el contraste y visualizar con facilidad las bandas de ADN, el exceso de colorante se puede eliminar del gel destindolo con agua. Cuando las bandas sean visibles, se podrn comparar los patrones de restriccin de diferentes muestras de ADN.

Los dos principales factores que afectan a la fiabilidad de la tecnologa del ADN en la medicina forense son la gentica de las poblaciones y la estadstica gentica. En los humanos hay miles de loci RFLP (Poimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin) o de segmentos de ADN que se pueden seleccionar y usar para analizar la huella gentica. En funcin de factores demogrficos como el origen tnico o el aislamiento geogrfico, algunos segmentos mostrarn ms variabilidad que otros.

Algunas poblaciones muestran mucha menos variabilidad en segmentos particulares de ADN que otras. El grado de variabilidad afectar a la probabilidad de que exista ms de un individuo con la misma secuencia. Si el 90% de una poblacin presenta el mismo patrn para un determinado segmento de ADN, poca informacin se podr obtener. Pero si la frecuencia de aparicin de un patrn de ADN para un determinado segmento en una poblacin, es extremadamente baja, entonces este segmento puede ser una herramienta muy til para discriminar entre los individuos de esa poblacin. Cada poblacin muestra diferentes patrones en sus genotipos debido a las distintas aportaciones realizadas a sus genes individuales a lo largo del tiempo.

Por eso, para determinar hasta qu punto incrimina una prueba de ADN, se necesita hacer la siguiente pregunta: Estadsticamente, cuntas personas en una poblacin presentarn un patrn idntico al observado en la muestra recogida en la escena del crimen? 1 de cada 10.000? o 1 de cada 10?

19

PLANTEAMIENTO DEL PROBELMA

20

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Todos los das podemos observar como la gentica forma parte de nuestras vidas, ya que mediante sta es posible confirmar parentescos, conocer nuestra predisposicin a desarrollar determinadas enfermedades, y comprender con mayor profundidad el funcionamiento de nuestro organismo. Del mismo modo, desde sus inicios la gentica ha resultado ser una herramienta fundamental en el desarrollo de otras ciencias como la antropologa y la arqueologa, as como en el sistema judicial de una gran cantidad de pases, donde en muchas ocasiones las pruebas de ADN (cido desoxirribonucleico) prcticamente han resuelto casos criminales. En este sentido consideramos esencial el conocimiento de las tcnicas de biologa molecular de las que hoy disponemos y que muy probablemente utilizaremos por lo menos alguna vez durante nuestras vidas. Este conocimiento nos permitir entender mejor el entorno en que vivimos y las diferentes situaciones a las que nos enfrentaremos. Esta investigacin se propone abarcar los aspectos tericos y metodolgicos similares a los que se emplean en la resolucin se casos criminales con el objetivo de esclarecer la identidad de una persona involucrada en un caso de homicidio comparando los patrones de ADN de diferentes sujetos con el hallado en la simulacin de una escena del crimen.

21

OBJETIVOS

22

OBJETIVO GENERAL Realizar una comparacin de patrones de ADN entre diferentes sujetos empleando una tcnica de separacin de fragmentos de ADN para encontrar similitudes y diferencias entre las muestras comparadas. OBJETIVOS ESPECFICOS 1. Llevar a cabo una digestin enzimtica de las muestras de ADN proporcionadas 2. Realizar una tcnica de separacin de fragmentos de ADN (electroforesis en gel de agarosa) para visualizar los fragmentos obtenidos de la digestin enzimtica 3. Comparar los patrones de separacin de las muestras corridas en gel mediante mediciones de las distancias recorridas, extrapolando dichos datos en la curva estndar de fragmentos con pares de bases conocidas. 4. Establecer si algn patrn encontrado en una o ms muestras coinciden con la muestra que se identific como ADN de una escena del crimen. HIPTESIS Si las enzimas de restriccin empleadas separan fragmentos de ADN en secuencias conocidas entonces ser posible la comparacin de dichos fragmentos en todas las muestras de ADN estudiadas. Si existe alguna muestra idntica a la identificada como ADN escena del crimen entonces el patrn de fragmentos de ADN ser idntico en ambas muestras.

23

MATERIAL Y MTODOS

24

MATERIAL Digestin del ADN con enzimas de restriccin Enzimas EcoRI/PstI: (80 l por muestra de ADN) 15 Puntas para pipeta 1 Micropipeta P-10 o P-20 Microtubos de colores: verde, azul, naranja, violeta, rojo, amarillo 1 Rotulador de tinta indeleble 1 Contenedor para residuos 1 Gradilla 1 Cubeta con hielo 6 viales de ADN recuperado de una escena del crimen (simulacin) y 5 ADNs de sospechosos, rehidratado con tampn 1 Bao de agua a 37 C Agarosa lquida (previamente disuelta) 1 Molde para preparar geles (cristales) 1 Cinta adhesiva

Electroforesis de las muestras de ADN 1 Gel de agarosa con 8 pocillos (preparado con anterioridad) 6 Muestras con ADN digerido 1 Colorante para ADN (Tampn carga) 2 Rotuladores 1 caja de Puntas para pipeta 1 Micropipeta P-10 o P-20 1 Contenedor para residuos 1 Gradilla 1 Cmara para electroforesis y fuente de alimentacin 1 Cubeta para tincin del gel Solucin tampn electroforesis (TAE 1x) 500 ml de Colorante para tincin del gel Marcadores HindIII (marcadores con pares de bases que migran a distancias conocidas)

25

METODOLOGIA

Obtencin de muestras de ADN

El desarrollo experimental de esta investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Inmunoqumica del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias el cual cuenta con un banco de ADN de donde se obtuvieron las muestras con las que realizamos nuestros experimentos. Se nos proporcionaron 6 muestras de ADN y se identific una como la muestra recogida en la escena de un crimen as como 5 muestras ms de distintas personas presuntamente vinculadas con la escena del crimen. El ADN de las personas involucradas se obtuvo por una tcnica estndar previamente descrita (Ried, 2002).

Digestin con enzimas de restriccin de las muestras de ADN

Rehidratacin de las muestras Todos los viales de ADN y de enzimas contenan un residuo blanco (se encontraban liofilizados previamente) y aparecer como un polvo suelto en los viales de ADN. La mezcla liofilizada de las enzimas EcoRI/PstI se conserv en un vial de color mbar.

A. Para rehidratar las muestras de ADN, aadimos 200 l de agua estril en cada vial de ADN liofilizado y lo agitamos para resuspenderlo. Despus, dejamos que las muestras se rehidrataran a temperatura ambiente, durante 5 minutos, hasta que se disolvieron. Las muestras rehidratadas de ADN estuvieron en una solucin tampn a una concentracin de 0.3g/l en Tris 100 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 20 mM, DTT 2mM, pH 8.0. Al aadir las enzimas de restriccin la concentracin final del tampn fue de Tris 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1mM, pH 8.0 .

B. Para rehidratar la mezcla de enzimas EcoRI/PstI, aadimos 750 l de agua estril y agitamos para resuspender las enzimas. Despus, dejamos que las enzimas se rehidrataran en hielo durante 5 minutos.

C. Preparacin de las alcuotas de la mezcla de enzimas. Transferimos 80 l de la mezcla enzimtica rehidratada a cada uno de los 8 microtubos de 1.5 ml marcados como ENZ.

26

D. Digestin con enzimas de restriccin. Dejamos que se digirieran las muestras introduciendo los tubos en una gradilla de plstico situada en un litro de agua a 37C y lo dejamos en incubacin toda la noche. Electroforesis en gel de agarosa

Preparacin del tampn de electroforesis El tampn de electroforesis TAE (Tris, acetato, EDTA) se encontraba en una solucin concentrada 50x. Usamos el tampn TAE 1x, necesitando un volumen total de unos 275 ml para cada cubeta de electroforesis. Fueron necesarios 3 litros de tampn TAE-1x para las cubetas de electroforesis y la preparacin de los geles de agarosa en las diversas repeticiones del experimento.

Preparacin de la agarosa

A. La concentracin que utilizamos para la preparacin del gel fue de agarosa al 1%. Para preparar agarosa al 1%, aadimos 1 g de agarosa a 100 ml de tampn TAE-1x.

B. Aadimos la agarosa en polvo a un matraz Erlenmeyer de 500 ml, para preparar 200 ml. Aadimos TAE-1x y agitamos para resuspender la agarosa en el tampn. Situamos otro matraz Erlenmeyer de 25 ml en la boca del primero y en posicin invertida, para que actuara como una cmara de reflujo, permitiendo una ebullicin prolongada o vigorosa sin que se produjeran muchas prdidas por evaporacin. Posteriormente fundimos la agarosa Dejamos el matraz 3 minutos a media intensidad en el horno de microondas. Paramos el horno cada 30 segundos y agitamos el matraz para disolver la agarosa, continuamos con este proceso hasta que se disolvieron todas las partculas de agarosa. Lo dejamos enfriar hasta los 60C antes de utilizarlo.

Preparacin de los geles de agarosa. Paso 1 Se sellaron los bordes del molde o soporte donde se prepar el gel con cinta adhesiva de laboratorio. Se apret la cinta firmemente a los bordes para formar un precinto hermtico. Paso 2 Se nivel el molde sobre una mesa usando el nivelador. Paso 3 Se prepar la cantidad de agarosa adecuada en tampn TAE. Paso 4 Se dej enfriar la agarosa hasta al menos los 60 C, y verterla sobre el soporte.

27

Paso 5 Mientras se enfriaba la agarosa, se coloc el peine en el molde a unos 2 cm del extremo del soporte. Paso 6 Se dej que el gel solidificara a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. Paso 7 Se retir el peine del gel con precaucin. Paso 8 Se retirar la cinta de los bordes del soporte. Paso 9 Se coloc el molde o soporte en la cubeta de electroforesis, situando los pocillos en el ctodo (negro). Las muestras de ADN migraron hacia el nodo (rojo) durante la electroforesis.

Electroforesis y tincin de las muestras de ADN 1. En este paso del experimento empezamos por alicuotar el tampn de carga:

A. Rotulamos un microtubo como TC (Tampn de carga), y alicuotamos 35 l del tampn de carga en el tubo.

B. Aadimos 20 l del tampn de carga al tubo que contena los marcadores HindIII y calentamos los marcadores 5 minutos a 65 C, y luego los dejamos enfriar en hielo para que las bandas de los marcadores se separaran. Despus Rotulamos un microtubo con una M y aadimos 15 l de los marcadores con el tampn de carga al tubo M. 2. Para preparar la solucin para la tincin de ADN diluimos 1 ml de la solucin 500x en 499 ml de agua destilada en un recipiente adecuado, el cual cubrimos y almacenamos a temperatura ambiente hasta que lo volvimos a utilizar. 3. Para llevar a cabo la electroforesis de las muestras eficazmente, dejamos correr el proceso durante 40 minutos. Se conectaron los cables a la cmara de electroforesis y sta a una fuente de poder y se hizo pasar una corriente elctrica de 100V. .

Tincin de los geles de ADN Una vez que termin el tiempo de corrida, se desconecto la cmara y se retiraron los geles de su contenedor. Lo situamos en un recipiente y lo cubrimos completamente con la solucin colorante y lo dejamos ah durante toda la noche. Al da siguiente, aclaramos los geles teidos con agua y luego los dejamos desteir en agua durante toda una noche.

28

RESULTADOS

RESULTADOS Con el fin de hacer ms precisa la comparacin entre el ADN de la escena del crimen y el ADN del sospechoso, algo que sea ms que una impresin visual, se necesita crear una medida cuantitativa del tamao de los fragmentos. Se realiz de la siguiente manera: 1. Usando la regla, se midi la distancia a la que migr cada banda. Se midi la distancia en milmetros desde el fondo del pocillo hasta el centro de cada banda de ADN (figura 1), y se recolectaron los datos en la tabla 1. Los datos de la tabla se usaron para construir una curva patrn y para estimar el tamao de los fragmentos de la escena del crimen y de los sospechosos. 2. Para hacer una estimacin exacta del tamao de los fragmentos tanto de la escena del crimen como de los sospechosos, se construy una curva patrn usando las distancias (eje X) y el tamao de los fragmentos (eje Y) de los marcadores de tamao Lambda/HindIII. 4. Para estimar el tamao de un fragmento de la escena del crimen o de un sospechoso, se midio la distancia a la que migr ese fragmento. Se localiz esa distancia en el eje X de la curva patrn, y desde esa posicin en el eje X, se sube hasta la curva patrn, y luego se sigue la lnea milimetrada del papel hasta el eje Y. El punto en el que la lnea se encuentra con el eje Y, indica el tamao aproximado del fragmento de ADN. 5. Se compararon los tamaos de los fragmentos de los sospechosos y de la escena del crimen (Grfica 1).

29

1 2 3 4 5 6 7 Carril Muestra 1 Marcadores Lambda/HindIII 2 ADN escena del crimen 3 sospechoso 1 4 sospechoso 2 5 sospechoso 3 6 sospechoso 4 7 sospechoso 5 Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de las muestras identificadas como sospechosos y escena del crimen. Representa un experimento representativo de 3. Las flechas sealan la identificacin de los patrones iguales.

1. Migracin de las bandas correspondientes a los fragmentos de ADN de las diferentes muestras

Marcadores de peso

molecular Lambda/Hind III

DNA RECUPERADO DE LA ESCENA DEL

CRIMEN SOSPECHOSO 1 SOSPECHOSO 2 SOSPECHOSO 3 SOSPECHOSO 4 SOSPECHOSO 5

BANDA DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb)1 DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb) DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb) DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb) DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb) DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb) DISTANCIA

(mm) Tamao

(pb)

1 11.0 23,130 19.0 4.010 21.0 2,985 21.0 2,985 19.0 4,010 21.0 3,110 21.0 2,985

2 13.0 9,416 20.5 3,334 23.5 2,134 25.0 1,879 20.5 3,334 29.5 1,356 24.0 2,027

3 15.0 6,557 32.0 1,698 30.5 1,789 28.5 1,646 32.0 1,698 30.5 1,235 29.5 1,478

4 18.0 4,361 31.5 1,534 31.7 1,123 35 1,345

5 23.0 2,322 35.5 1,325

6 24.0 2,027

Tabla 1. Patrn de pares de bases obtenido en el ensayo de electroforesis en gel de agarosa al 1.0%

1 pares de bases

30

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Paresd

ebases

Distancia,mm

Lambda/Hind III

Sospechoso1

Sospechoso2

Sospechoso3

Sospechoso4

Sospechoso5

ADNescenadelcrimenFragmentosdeADNdelaescenadelcrimenydelsospechoso3

Grfica 1. Migracin de los fragmentos (distancia en mm) de ADN encontrados en las 6 muestras estudiadas y su relacin con su tamao (pares de bases). Los fragmentos del ADN recuperado de la escena del crimen coinciden con la muestra recuperada del sospechoso 3. Es importante hacer notar que los fragmentos coinciden exactamente, no pueden existir variaciones en el patrn de migracin y por lo tanto tampoco en su tamao, si vara en un solo fragmento el ADN no correspondera al recuperado en la escena del crimen.

31

32

ANLISIS DE RESULTADOS

33

ANLISIS DE RESULTADOS

Se ha dicho que la huella gentica puede llegar a substituir a la huella dactilar. Esta idea es errnea. Cada una tiene sus aplicaciones especficas. Y si bien el estudio de la huella gentica ha sido un avance revolucionario en determinados casos como es el estudio del semen o la sangre para identificar a la persona a quien pertenece, no tiene nada que ver con el hallazgo de huellas dactilares sobre la superficie de un arma u otro objeto donde el criminal haya puesto sus manos.

Con esta idea llevamos a cabo una serie de experimentos que nos permitieran estandarizar una tcnica de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa.

Se llevaron a cabo una serie de 5 experimentos donde se probaron diferentes condiciones de concentracin de agarosa, tiempo de corrida y voltaje empleado, Los resultados de estos experimentos nos permitieron concluir que las condiciones ptimas de experimentacin fue utilizar un gel de agarosa al 1% y hacer la corrida del gel durante 45 minutos a 100V.

Con estas condiciones establecidas se repiti tres veces el experimento que dio origen a los datos que aqu se presentaron. Fue posible observar despus de la electroforesis y gracias a la tincin del gel la separacin de las bandas correspondientes a los fragmentos de los diferentes ADN de los sujetos estudiados.

Al comparar los fragmentos visualmente se pudo comprobar que la muestra del ADN identificado como sospechoso 3 coincida en nmero y posicin de bandas con el ADN identificado como escena del crimen.

Las enzimas de restriccin empleadas cortan fragmentos en secuencias idnticas lo que permite comparar los fragmentos de las diferentes muestras.

Si hay dos cortes en dos muestras de ADN en el mismo punto, significa que las secuencias coinciden y que por lo tanto pertenecen al mismo individuo.

34

CONCLUSIONES

35

CONCLUSIONES

1. Las enzimas de restriccin EcoR1/Pst1 cortan secuencias especficas (GAATTC) que permiten comparar las distintas muestras de ADN.

2. La electroforesis en gel de agarosa permite separar los fragmentos de restriccin en base su tamao (pares de bases) haciendo visibles los patrones de migracin de dichos fragmentos pudiendo compararlos entre s.

3. La muestra identificada como sospechoso 3 y ADN escena del crimen muestran un patrn idntico de migracin y nmero de bandas por lo que es posible concluir que se trata del mismo sujeto.

Lo anterior es posible sustentarlo cientficamente comparando las distancias a las cuales migraron ambas muestras y al tamao idntico de ambas muestras.

4. El desarrollo de las tcnicas de biologa molecular especficamente la tipificacin de ADN es una herramienta fundamental hoy en da en diversos campos de la vida humana, desde el campo mdico hasta el criminalstico pasando por la antropologa o la agricultura.

5. El conocimiento y desarrollo de dichas tcnicas permitir su comprensin y aplicacin adecuadas.

36

REFERENCIAS

37

REFERENCIAS

Corporativo de servicios Periciales S.C. 10 de Marzo de 2009. http://www.servicios-

periciales.com/servicios/medicinalegal.php Estacin Molecular. Digestin de la enzima de restriccin. 2006. Molecular Station. 28

de febrero de 2009.

Flores Negrete, Abril. Medicina Legal en Mxico. 8 de Agosto del 2008. Criminologa y

Criminalstica. 28 febrero del 2009.

Frankel, Edward. DNA, el proceso de la vida. Mxico D.F.: Siglo XXI, 1989 Garrido, Agustn. Electroforesis en geles de agarosa. Monografas. 28 febrero 2009.

http://www.monografias.com/trabajos916/electroforesis-geles/electroforesis-geles.shtml>

Genetics." Encyclopdia Britannica. 2009. Encyclopdia Britannica Online. 11 Mar.

2009 . Meja, Rafael. MEDICINA FORENSE, MS QUE AUTOPSIAS. 2007. Salud y

Medicinas. 11 de marzo de 2009.

Neufled, Peter and Nevelle Coleman. 1990 When Science Takes the Witness Stand,

Scientific American, Vol. 262: 5 Ried Thomas. 2002. Extract DNA from whole blood (EDTA, heparin, citrate) using

phenol/chloroform method. 10 febrero 2009.

Rodrguez Jorge, Ricardo y Jos Alberto Borges Lpez. La huella gentica en Medicina

Legal. ADN con fines forenses. Revista Electrnica de PortalesMdicos.com. 2007.

http://www.servicios-periciales.com/servicios/medicinalegal.phphttp://www.servicios-periciales.com/servicios/medicinalegal.phphttp://criminologiaycriminalistica.wordpress.com/2008/08/18/historia-medicina-legal/http://criminologiaycriminalistica.wordpress.com/2008/08/18/historia-medicina-legal/http://www.monografias.com/trabajos916/electroforesis-geles/electroforesis-geles.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos916/electroforesis-geles/electroforesis-geles.shtmlhttp://www.saludymedicinas.com.mx/nota.asp?id=1128http://www.riedlab.nci.nih.gov/publications/2438.2...http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/643/1/La-huella-genetica-en-Medicina-Legal-ADN-con-fines-forenses.htmlhttp://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/643/1/La-huella-genetica-en-Medicina-Legal-ADN-con-fines-forenses.html

38

Servicio Mdico Forense. 2005. Tribunal Superior de Justicia del Distrito federal. 11 de marzo de 2009.

Solari, Alberto Juan. Gentica humana : fundamentos y aplicaciones en medicina Buenos

Aires: Editorial Madrid, 1999. Thompson, William C. and Simon Ford 1990. Is ADN Fingerprinting ready for the courts?

New Scientist.

Trujillo, Gil. Medicina Forense. Mxico: Manual Moderno, 2002.

Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal. Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal. 23 January 2009. 11 March 2009 .

Universidad de Alicante. Conceptos bsicos en gentica. Universidad de Alicante. 28 febrero de 2009. http://www.ua.es/fgm/divgen/genetica/consuelo/conceptos_basicos.htm#

http://www.tsjdf.gob.mx/semefo/index.htmlhttp://www.ua.es/fgm/divgen/genetica/consuelo/conceptos_basicos.htm

39

APNDICES

40

APNDICE A

GLOSARIO DE TRMINOS

Acidos nuclicos: biomolculas formadas por macropolmeros de nucletidos, o polinucletidos. Est presente en todas las clulas y constituye la base material de la herencia que se transmite de una a otra generacin. Existen dos tipos, el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonuclico (ARN).

ADN. Acido Desoxirribonucleico: cido nucleico formado por nucletidos en los que el azcar es desoxirribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, timina, citosina y guanina. Excepto en los retrovirus que tienen ARN, el ADN codifica la informacin para la reproduccin y funcionamiento de las clulas y para la replicacin de la propia molcula de ADN. Representa la copia de seguridad o depsito de la informacin gentica primaria, que en las clulas eucariticas est confinada en la caja fuerte del ncleo.

ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta protenica o lipdica. Para la transferencia de genes, suele estar constituida por un plsmido bacteriano que contiene el gen a transferir. Se inyecta directamente en el tejido objetivo donde se expresa generalmente sin integrarse en el genoma de las clulas husped.

ADNr. ADN recombinante: molcula de ADN formado por recombinacin de fragmentos de ADN de orgenes diferentes. La (o las) protena que codifica es una protena recombinante. Se construye mediante la unin de un fragmento de ADN de origen diverso a un vector, como, por ejemplo, un plsmido circular bacteriano. El vector se abre por un sitio especfico, se le inserta entonces el fragmento de ADN de origen diverso y se cierra de nuevo. El ADN recombinante se multiplica en una clula husped en la que puede replicarse el vector.

ARN. Acido Ribonuclico: cido nucleico formado por nucletidos en los que el azcar es ribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, uracilo, citosina y guanina. Acta como intermediario y complemento de las instrucciones genticas codificadas en el ADN.

Existen varios tipos diferentes de ARN, relacionados con la sntesis de protenas. As, existe ARN mensajero (ARNm), ARN ribosmico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt) y un ARN heterogneo nuclear (ARN Hn). El ARN es normalmente el producto de la transcripcin de un molde de ADN, aunque en los retrovirus el ARN acta de plantilla y el ADN de copia.

ARNm ARN mensajero: molcula de ARN que representa una copia en negativo de las secuencias de aminocidos de un gen. Las secuencias no codificantes (intrones) han sido ya extradas. Con pocas excepciones el ARNm posee una secuencia de cerca de 200 adeninas (cola de poli A), unida a su extremo 3' que no es codificada por el ADN.

Alelos cada uno de los dos genes presentes en el mismo lugar (locus) del par de cromosomas homlogos. En general, uno de los diferentes estados alternativos del mismo gen.

Aminocido. molcula orgnica que contiene los grupos amino y carboxilo. Son los monmeros de las protenas. De su diversidad como del enorme nmero de combinaciones y longitudes resulta la enorme variedad de protenas existentes.

Biologa. ciencia que trata del estudio de los seres vivos y de los fenmenos vitales en todos sus aspectos.

Biologa Molecular: parte de la biologa que trata de los fenmenos biolgicos a nivel molecular. En sentido restringido comprende la interpretacin de dichos fenmenos sobre la base de la participacin de las protenas y cidos nucleicos.

Biomolculas. elementos arquitectnicos bsicos de los seres vivos, antiguamente llamados principios inmediatos. Las biomolculas inorgnicos son sobretodo agua, sales minerales y gases como oxgeno y dixido de carbono. Los grupos de compuestos orgnicos exclusivos de los seres vivos son cuatro: glcidos, lpidos, protenas y cidos nucleicos.

41

Biotecnologa: toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productos o procesos en usos especficos.

Carcter: rasgo distintivo como expresin de un gen.

Catalizador: sustancia que altera la velocidad de una reaccin qumica, acelerndola o retrasndola, pudiendo recuperarse sin cambios esenciales en su forma o composicin al final de la reaccin.

Clula: unidad de estructura y funcional de plantas y animales que consta tpicamente de una masa de citoplasma que encierra un ncleo (excepto en procariontes) y limitada por una membrana diferencialmente permeable. Es la unidad viva ms simple que se reproduce por divisin. Normalmente cada clula contiene material gentico en forma de ADN incorporado a un ncleo celular, que se escinde al dividirse la clula. Los organismos superiores contienen grandes cantidades de clulas interdependientes. Sin embargo, stas ltimas pueden tratarse independientemente como clulas libres en medios de cultivos apropiados.

Clulas sexuales: clulas que al unirse forman el huevo fertilizado. En la especie humana los gametos o clulas sexuales son el espermatozoide (masculino) y el vulo (femenino).

Cepa: en microbiologa, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo patrimonio gentico.

Clones: grupo de clulas o de organismos de idntica constitucin gentica entre s y con el antepasado comn del que proceden por divisin binaria o por reproduccin asexual.

Clonacin celular: proceso de multiplicacin de clulas genticamente idnticas, a partir de una sola clula.

Clonacin de genes: tcnica que consiste en multiplicar un fragmento de ADN recombinante en una clula-husped (generalmente una bacteria o una levadura) y aislar luego las copias de ADN as obtenidas.

Clonacin molecular: insercin de un segmento de ADN ajeno, de una determinada longitud, dentro de un vector que se replica en un husped especfico.

Cdigo del triplete: sucesin de tres bases de tres nucletidos en la molcula de ADN que cifra un aminocido.

Cdigo Gentico: cdigo cifrado por la disposicin de nucletidos en la cadena polinucletida de un cromosoma que rige la expresin de la informacin gentica en protenas, es decir, la sucesin de aminocidos en la cadena polipeptdica. La informacin sobre todas las caractersticas determinadas genticamente en los seres vivos gentica est almacenada en el ADN y cifrada mediante las 4 bases nitrogenadas. Cada sucesin adyacente de tres bases (codn) rige la insercin de un aminocido especfico. En el ARN la timina es sustituida por uracilo. La informacin se transmite de una generacin a otra mediante la produccin de rplicas exactas del cdigo.

Codn: secuencia de tres nucletidos consecutivos en un gen o molcula de ARNm determinada por sus bases nitrogenadas, que especificar la posicin de un aminocido en una protena.

Congnito: Cuya naturaleza depende de eventos ocurridos durante el embarazo y desarrollo embrionario y fetal de un individuo.

Conjugacin: uno de los procesos naturales de transferencia de material gentico de una bacteria a otra, junto con la transduccin y la trasformacin, realizado por contacto entre ellas.

Cromosoma: corpsculo intracelular alargado que consta de ADN, asociado con protenas, y constituido por una serie lineal de unidades funcionales conocidas como genes. La especie humana tiene 46 cromosomas (23 pares). Su nmero vara desde el mnimo de un cromosoma en las obreras de la hormiga Myrmecia pilosula hasta los 1.260 cromosomas (630 pares) del helecho Ophioglussum recitulatum.

Diagnstico gnico: tcnica de localizacin e identificacin de la secuencia de un determinado gen para establecer su normalidad o malformacin.

42

Permite predecir en ausencia de sntomas, en algunos casos la existencia de enfermedades congnitas, y, en otros, los factores ambientales de riesgo que las provocarn.

Dominante: referido a un gen, el que slo necesita una copia para expresarse por lo que enmascara la presencia de su alelo recesivo. La mayora de los alelos dominantes representan el estado evolucionado y completamente funcional del gen.

Enzima: catalizador biolgico, normalmente una protena, que mediatiza y promueve un proceso qumico sin ser ella misma alterada o destruida. Son catalizadores extremadamente eficientes y muy especficamente vinculados a reacciones particulares.

Enzimas de restriccin: enzimas bacterianas sintetizadas como reaccin defensiva frente a la invasin de ADN extrao, como, por ejemplo, bacterifagos ADN, a los que degrada mientras que el propio est protegido por metilaciones especficas. Cada una de estas enzimas escinden el ADN siempre en el mismo sitio, en loci especficos o secuencias objetivo. Son las tijeras de la ingeniera gentica que abrieron las puertas a la manipulacin gentica.

Especie: clasificacin taxonmica formada por el conjunto de poblaciones naturales que pueden cruzarse entre s real o potencialmente. Es decir, que se determina de forma emprica: dos individuos pertenecen a la misma especie si pueden generar descendencia reproducible; en caso contrario son de especies diferentes.

Evolucin biolgica: cambios primero molecular, despus celular, y por ltimo de organismos, a lo largo de la historia como resultado de mutaciones en el ADN, de su reproduccin y de procesos de seleccin. Los caracteres adquiridos en vida no se heredan. La especie humana comparte el 98'4% del ADN con el de dos especies de chimpanc, el comn y el pigmeo. La evolucin depende sobre todo de mutaciones en los genes reguladores de los genes estructurales, que hacen que se activen o desactiven, ms que de mutaciones en los mismos genes estructurales.

Exones: secuencias de ADN especficas de genes, que codifican secuencias de aminocidos en las protenas.

Expresin del gen: producto proteico resultado del conjunto de mecanismos que efectan la decodificacin de la informacin contenida en un gen, procesada mediante transcripcin y traduccin.

Fenotipo: conjunto de todas los caracteres aparentes expresados por un organismo, sean o no hereditarias.

Gen: unidad fsica y funcional del material hereditario que determina un carcter del individuo y que se transmite de generacin en generacin. Su base material la constituye una porcin de cromosoma (locus) que codifica la informacin mediante secuencias de ADN.

Gen estructural: el que regula la formacin de un enzima o de una protena estructural.

Gen hbrido: el formado por recombinacin in vitro de dos o ms fragmentos de ADN.

Gen operador: el que pone en funcionamiento el gen estructural.

Gen regulador: el que modifica la accin del operador.

Gen recesivo: el que necesita doble "dosis" para expresarse.

Gen represor: el que reprime el operador.

Gentica: ciencia que trata de la reproduccin, herencia, variacin y el conjunto de fenmenos y problemas relativos a la descendencia.

Genoma: conjunto de todos los genes de un organismo, de todo el patrimonio gentico almacenado en el conjunto de su ADN o de sus cromosomas.

Genotipo: constitucin gentica, de uno o ms genes, de un organismo en relacin a un rasgo hereditario especfico o a un conjunto de ellos.

43

Hereditario: que se transmite de generacin en generacin.

Hibridacin: proceso de generacin de una molcula, clula u organismo combinado con material gentico procedente de organismos diferentes. En las tcnicas tradicionales, los hbridos se producan mediante el cruzamiento de variedades distintas de animales y plantas por alineacin o apareamiento de bases de dos molculas de ADN de cadena sencilla que son homlogas o complementarias. La tecnologa de fusin celular y la manipulacin transgnica son las nuevas modalidades de hibridacin introducidas por la manipulacin gentica.

Hidratos de Carbono: biomolculas orgnicas formadas por polialcoholes con un grupo aldehdo o cetona. Debe su nombre, y el de carbohidratos, a que su frmula emprica es Cn(H2O)m aunque algunos compuestos pueden tener frmulas ligeramente diferentes de esta proporcin general. Tambin se les llama glcidos (dulces), glcidos, glicoles y azcares. Realizan funciones energticas, plsticas o estructurales formando parte de las estructuras celulares, y almacenan informacin como seales de la identidad celular.

Huella gnica: representacin grfica de determinadas secuencias del genoma que funcionan como un cdigo de barras de la identidad de un individuo.

Ingeniera gentica: conjunto de tcnicas utilizadas para introducir un gen extrao (heterlogo) en un organismo con el fin de modificar su material gentico y los productos de expresin.

Intrones: secuencias de ADN que no codifican genes y cuya funcin es desconocida. El 90% del genoma humano no es codificante.

In situ: referido a conservacin de recursos genticos, la que se realiza en su medio natural, y que para las especies domesticadas se verifica en el medio donde desarrollaron sus propiedades distintivas

In vitro: literalmente en el vidrio, en el tubo de ensayos del laboratorio, investigado y manipulado fuera del organismo vivo.

Kilobase (Kb): unidad empleada para medir la longitud de los fragmentos de ADN constituidos por una serie de bases. 1 Kb = 1.000 bases.

Lpidos: grupo de biomolculas orgnicas qumicamente muy diverso con las caractersticas comunes de la insolubilidad en agua, la solubilidad en disolventes orgnicos polares y de poco densidad. Sinnimo del trmino comn "grasas".

Loci: en latn, plural de locus.

Locus: en gentica, punto de un cromosoma ocupado por un gen.

Manipulacin gentica: formacin de nuevas combinaciones de material hereditario por insercin de molculas de cido nucleico, obtenidas fuera de la clula, en el interior de cualquier virus, plsmido bacteriano u otro sistema vector fuera de la clula. De esta forma se permite su incorporacin a un organismo husped en el que no aparecen de forma natural pero en el que dichas molculas son capaces de reproducirse de forma continuada. Al referirse al proceso en s, puede hablarse de manipulacin gentica, ingeniera gentica o tecnologa de ADN recombinante. Tambin admite la denominacin de clonacin molecular o clonacin de genes, dado que la formacin de material heredable puede propagarse o crecer mediante el cultivo de una lnea de organismos genticamente idnticos.

Mapa gentico: diagrama descriptivo de los genes en cada cromosoma

Material gentico: todo material de origen vegetal, animal, microbiano o de otro tipo que contenga unidades funcionales de la herencia.

Microinyeccin: tcnica que permite introducir en una clula un gen en solucin, gracias a una micropipeta y bajo microscopio.

Microorganismo: organismos microscpicos pertenecientes por regla general a virus, bacterias, algas, hongos o protozoos.

Monmero: compuesto de bajo peso molecular cuyas molculas son capaces de reaccionar entre s o con otras para dar lugar a un polmero

44

Mutacin: cambio del material gentico. Puede afectar a cambios en un par de bases del ADN, en un gen especfico o en la estructura cromosmica. La mutacin en la lnea germinal o relativa a las clulas sexuales, puede conducir a patologas genticas o a cambios substanciales de la evolucin biolgica. En relacin a las clulas somticas la mutacin constituye el origen de algunos cnceres y de ciertos aspectos del envejecimiento.

Nucletido: monmero de los cidos nucleicos, integrado por la combinacin de una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. Se obtiene como producto de la hidrlisis de cidos nucleicos por accin de nucleasas.

Operador: segmento especial del DNA adyacente al promotor que forma parte de la regin controladora de la transcripcin de un opern. El operador interacciona con la protena represora regulando de esta manera el proceso de la transcripcin sincronizada del opern correspondiente.

Opern: conjunto del gen operador con los genes estructurales que controla.

Organismo: entidad biolgica capaz de reproducirse o de transferir material gentico, incluyndose dentro de este concepto a las entidades microbiolgicas, sean o no celulares. Casi todo organismo est formado por clulas, que pueden agruparse en rganos, y stos a su vez en sistemas, cada uno de los cuales realizan funciones especficas.

Palndromos: fragmento de dos cadenas de ADN en que las bases complementarias de la doble hlice estn ordenadas segn una simetra rotacional. Constituyen el sustrato de las endonucleasas de restriccin que rompen la molcula en el entorno del eje de simetra y en ambas cadenas. Son segmentos capicas que resultan iguales vistos en uno u otro sentido. Como el capica alfabtico anilina, anitina.

Pptido: polmero o cadena de aminocidos.

Plsmido: forma no celular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que contienen unos cuantos genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias. Actan y se replican de forma

independiente al ADN bacteriano y pueden pasar de unas bacterias a otras. Igual que los provirus no producen enfermedades pero inducen pequeas mutaciones en las clulas. Se utilizan como vectores en manipulacin gentica.

Polmero: compuesto qumico formado por la combinacin de unidades estructurales repetidas (monmero) o cadenas lineales de la misma molcula.

PRINCIPIO CENTRAL DE LA BIOLOGA MOLECULAR: formulado por Crick, postula que la informacin gentica contenida en los cromosomas determina la sntesis de las protenas mediante la traduccin de un molde intermediario de ARN, formado anteriormente por la transcripcin del ADN. Tambin satisface la hiptesis formulada anteriormente por Beadle, Tatum y Horowitz de un gen = un enzima. Tiene dos casos que escapan a la regla: la transcripcin inversa como reaccin complementaria de doble sentido y, aparentemente, los priones.

Protena: biomolculas formadas por macropolmeros de aminocidos, o macropolipptidos. Actan como enzimas, hormonas y estructuras contrctiles que atribuyen a los organismos sus propias caractersticas de tamao, potencial metablico, color y capacidades fsicas.

Proyecto Genoma Humano: Programa de Investigacin consistente en determinar la secuencia completa de nucletidos de los cromosomas de la especie humana y de organismos modelo utilizados en experimentacin de laboratorio (la bacteria Escherichia coli, la levadura Bacillus subtilis, el nematodo Caenorhabditis elegans o la mosca del vinagre Drosofila melanogaster), para conocer todos y cada uno de los genes humanos, su localizacin y funcin. Liderado por James D. Watson y dependiente del Departamento de Energa y de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos, cuenta con un presupuesto anual de 200 millones de dlares, desde 1990 hasta 2005. Entre 1981 y 1995 se han concedido en todo el mundo 1.175 patentes sobre material gentico humano.

45

PCR Reaccin en cadena de polimerasa: tcnica de anlisis del genoma mediante la amplificacin ilimitada de porciones especficas del ADN, aunque sean minsculas. Es un mtodo revolucionario de amplificacin exponencial del ADN por la intervencin de una enzima termoestable, la Taq polimerasa, inventado por el americano Kary Mullis en 1985 por lo que se le concedi en 1993 el premio Nobel. Es el proceso fundamental para la secuenciacin del Proyecto Genoma Humano.

Recombinacin gentica: redisposicin gentica. In vitro entre fragmentos de ADN de orgenes diferentes o no contiguos. In vivo entre copias homlogas de un mismo gen (manipulacin cromosmica), o como resultado de la integracin en el genoma de un elemento gentico (trasposn, profago o transgn).

Replicacin: proceso por el que una molcula de ADN o ARN origina otra idntica a la preexistente. En general, duplicacin del cido nucleico.

Replicn: estructura de cido nucleico con capacidad de autoduplicacin. Son replicones los cromosomas de las clulas eucariotas, el ADN nuclear de los procariotas, los plsmidos y los cidos nucleicos de los virus.

Ribosomas: pequeas partculas donde se realiza la sntesis de protenas en todos los organismos vivos.

Secuencia de ADN: orden de encadenamiento de las bases nitrogenadas de los nucletidos que constituyen el ADN y que cifra toda la informacin gentica. Cuando es codificante (exn), define el orden de los aminocidos que forman la protena correspondiente.

Sonda de ADN: fragmento de ADN conocido que se utiliza para averiguar si los cromosomas investigados contienen la secuencia complementaria. La FDA americana ha autorizado 60 productos diagnsticos basados en sondas de ADN que determinan la predisposicin a padecer enfermedades.

Tcnica de recombinacin del ADN: conjunto de tcnicas de manipulacin gentica que emplea la recombinacin in vitro asociada a la insercin, rplica y expresin del AADN recombinado dentro de clulas vivas.

Terapia gnica: conjunto de los procesos destinados a la introduccin in vitro o in vivo de un gen normal en clulas, germinales o somticas, en las que el mismo gen, anormal, provoca una deficiencia funcional, origen de una enfermedad, o la de un gen codificador de una protena, por ejemplo, con una accin antitumoral en las clulas cancerosas, o antivrica en clulas infectadas por un virus patgeno.

Traduccin gentica: cambio de la informacin contenida en la secuencia de los cuatro nucletidos del ARNm por la debida al ordenamiento de los 20 aminocidos en la estructura de las cadenas polipeptdicas. Cada aminocido se une a una pequea molcula especfica de ARN que sirve para su identificacin, denominado ARN de transferencia. Esta molcula transfiere los aminocidos libres de la solucin al punto de formacin de las cadenas polipeptdicas cuando est indicado por las instrucciones contenidas en la molcula de ARN mensajero. El proceso tiene lugar en la interaccin de los codones del ARNm con la regin del anticodon de los aminoacil-ARNt. Se distinguen en ella las etapas de iniciacin, elongacin y terminacin en la que participan diferentes factores proteicos.

Transcripcin gentica: biosntesis de una molcula de ARN por polimerizacin de nucletidos complementarios a un ADN patrn. Esta molcula de ARN es un precursor de ARNm y representa una copia fiel de la secuencia complementaria de ADN de la que ha sido transcrita. Una secuencia especfica situada por delante del gen (promotor) acta identificando el sitio de inicio de la transcripcin. En el ARN, el uracilo (U) ocupa las posiciones que la timidina (T) tiene en el ADN. Es la copia de trabajo de determinados segmentos de ADN.

Transcripcin inversa: proceso de sntesis de ADN complementario a partir del ARN genmico de los retrovirus efectuado por la enzima transcriptasa inversa.

Transduccin: proceso natural de transferencia de material gentico, originalmente entre bacterias, como la conjugacin y la transformacin, que se efecta por medio de un bacterifago que transporta un fragmento cromosmico del husped a otra bacteria.

46

Transfeccin de ADN: introduccin en una clula en cultivo convertida en permeable al ADN, de molculas de molculas de ADN extraas (heterlogas) insertadas en un vector. Rene caractersticas comunes a la transformacin y a la infeccin por bacterifagos. La transformacin requiere la integracin del ADN exgeno en el cromosoma bacteriano mientras que la transfeccin usualmente no la requiere. El ADN extrao se asocia con el del cromosoma del husped y se expresa como un fenotipo identificable.

Transformacin bacteriana: uno de los procesos naturales de transferencia de material gentico de una bacteria a otra, junto con la conjugacin y la transduccin, que es una integracin directa del ADN. Experimentalmente consiste en hacer penetrar un fragmento de ADN en una bacteria para provocar en ella una recombinacin gentica. Por extensin (abusiva) se habla a veces de transformacin para designar un proceso idntico que afecta a las clulas eucariticas (levaduras, clulas animales y vegetales).

Transformacin celular: en una clula, adquisicin de ciertas propiedades de una clula tumoral bajo la accin de virus o de genes causantes de tumores (oncgenos).

Vector: portador, que transfiere un agente de un husped a otro. Sistema que permite la transferencia, la expresin y la replicacin de un ADN extrao en clulas husped para una posterior clonacin o transgnesis. Se trata de una molcula de ADN (plsmido bacteriano, microsoma artificial de levadura o de bacteria) o de un virus defectuoso. Por extensin, un vector designa todo sistema de transferencia del gen, por ejemplo, un sistema sinttico como el de los liposomas.

Virus: entidad acelular infecciosa que, aunque puede sobrevivir extracelularmente, es un parsito absoluto porque solamente es capaz de replicarse en el seno de clulas vivas especficas, pero sin generar energa ni ninguna actividad metablica. Los componentes permanentes de los virus son cido nucleico (ADN o ARN, de una o de dos cadenas) envuelto por una cubierta proteica llamada cpside.

47

APNCIDE B

Escenarios alternativos de la tcnica de identificacin de ADN

Tipificacin de ADN, perfil de ADN, e impresin de huella gentica son nombres para el mismo proceso, un proceso que utiliza el ADN para demostrar la relacin o identidad de cada uno de los seres humanos, plantas, o animales. La tipificacin de ADN se ha convertido en tema inters por su uso del anlisis forense en los casos penales importantes, como el de OJ Simpson. Las aplicaciones de la tipificacin de ADN sin embargo, son mucho ms amplios que solamente la ciencia forense y estn teniendo un profundo impacto en nuestra sociedad.

Esta tcnica se utiliza en la medicina forense, en la antropologa y la biologa de conservacin no slo para determinar la identidad de los individuos sino tambin para determinar su relacin. Este proceso ha sido utilizado para liberar a sospechosos inocentes, reunir a nios con sus familiares, identificar animales robados y demostrar que la carne de ballena ha sido sustituida por el pescado en el sushi. Se usa en tiempos de guerra para ayudar identificar los restos de soldados muertos en combate. Tambin se est utilizando para encontrar los vnculos genticos de enfermedades hereditarias. Adems, los cientficos estn aprendiendo mucho acerca de nuestra historia evolutiva gracias a los anlisis de ADN.

Cada uno de los siguientes prrafos describe un escenario en el que el ADN ha sido utilizado para mostrar cmo las personas estn relacionadas entre s o para demostrar que una persona es (o no) el autor de un delito. Estos escenarios proporcionan un contexto para el uso de la tipificacin de ADN, para su uso en la enseanza de biologa molecular, biologa de conservacin, y la biotecnologa.

Consideramos importante difundir los usos mltiples de la tcnica que hemos desarrollado como parte de nuestra investigacin por lo que describiremos a continuacin algunas posibilidades de aplicacin en diversos mbitos cientficos y de salud.

1. Identificacin de alimentos (identificacin de especies en peligro de extincin).

La pureza (o impureza) de la carne molida ha sido demostrada utilizando la identificacin del ADN. La hamburguesa ha demostrado ser una mezcla de carne

48

de cerdo y otras carnes que no sean de origen vacuno. Usando equipos de prueba porttiles las autoridades han utilizado este mtodo para determinar si el pescado servido en el sushi era realmente carne de ballenas y delfines. Estos son especies en peligro que estn protegidas por ley internacional.

2. Delincuentes acusados y condenados dejados en libertad a causa de la identificacin de su ADN

Un hombre encarcelado durante 10 aos fue puesto en libertad cuando las pruebas de ADN, las cuales no estaban disponibles en el momento de su encarcelamiento, fueron usadas para demostrar que l no poda haber sido el violador. Estadsticas demuestran que aproximadamente 1/3 de todos los sospechosos de asalto sexual son liberados como resultado de las pruebas de ADN.

3. La identificacin de restos humanos.

Los cientficos han utilizado la tipificacin del ADN para confirmar que el cuerpo en una tumba fue (o no) de la persona que se supona que deba estar all. Se cree que huesos encontrados en Rusia son de los Romanov, la ltima familia imperial de Rusia. El Zar Nicholas II y su familia fueron ejecutados por los bolcheviques en 1918. Expertos de todo el mundo han estado estudiando los huesos para ver que coincidan con los crneos, dientes, y otras caractersticas con fotografas. El ADN de los huesos se compar con el de los descendientes conocidos y se determin que los huesos pertenecan al zar y su familia ("Identificacin de los restos de la Familia Romanov por los anlisis de ADN "Nature Genetics vol 6, 130, 1994.)

4. Determinando la relacin de los seres humanos.

LA tipificacin de ADN ha demostrado que el hombre de hielo de 5000 aos de antigedad encontrado en un glaciar derretido est estrechamente relacionado con los europeos modernos. ("Hombre de Hielo se vuelve real." Ciencia, vol. 264:1669. 17 de junio de 1994.) Las pruebas de ADN tambin "eliminan todas las sospechas de que el cuerpo era un fraude y que haba sido colocado en el hielo ", dice Svante Paabo de la Universidad de Munich. (Science, vol. 264:1775. 17 de junio de 1994).

5. Estudiando la relacin entre los pueblos antiguos.

49

ADN encontrado en sitios arqueolgicos al oeste de Montana se est utilizando para ayudar determinar cuntos grupos de personas (familias) relacionadas haba en ese sitio particular. (Morell, Virginia. "Jalando pelo de la tierra." Science, vol. 265:741-745 de agosto de 1994.)

6. Pruebas de ADN de familias.

Las pruebas de ADN de familias se han utilizado en la Argentina y El Salvador para identificar los nios de al menos 9.000 ciudadanos de estos pases que desaparecieron entre 1975 y 1983, secuestrados por las unidades especiales de la milicia y la polica. Muchos de los nios nacidos de los desaparecidos adultos fueron secuestrados y adoptados por "padres" militares que afirman ser sus padres biolgicos. Despus de las pruebas genticas de una familia ampliada se revel la verdadera identidad de un nio, el nio fue colocado en la casa de sus familiares biolgicos. Se tema que el traslado de un nio de sus "padres" militares quienes eran secuestradores, pero que haban criado al nio durante aos, fuera agonizante. En la prctica, los nios transferidos se logran integrar en sus familias biolgicas con el mnimo trauma.

7. Identificando organismos que causan enfermedades.

Eva Harris, cientfico de la UCSF, ha ayudado a los cientficos en Nicaragua y Ecuador, para aprender a utilizar tecnologa de ADN para detectar la tuberculosis, e identificar el virus del dengue y diversas cepas de Leishmania. Otras pruebas disponibles causan la espera de varias semanas, mientras los organismos que provocan la enfermedad son cultivados y enviados a laboratorios extranjeros para ser identificados. (Marcia Barinaga, "Una Tecnologa Personal del Esfuerzo de Transferencia en diagnsticos de ADN. "Ciencia, vol. 266:1317-1318. Nov. 25, 1994.)

8. Identificando a los padres biolgicos (pruebas de paternidad)

Nias en Florida fueron descubiertas despus de haber sido cambiadas al nacer cuando una nia muri de una enfermedad hereditaria. La enfermedad no era de su familia, pero se saba que esa enfermedad estaba en la familia de otra nia, nacida en el mismo hospital y aproximadamente a la misma hora que naci.

9. Demostrar la paternidad

50

Una mujer violada por su jefe el 7 de enero de 1943, a sus 18 aos, qued embarazada. El nio saba quin era su padre, pero mientras l vivi, se neg a admitir que fuera su padre. Despus de que el hombre muri, las pruebas de ADN demostraron que era su hija y ella fue concedida la mitad de su patrimonio. (Un nio de Violacin Gana Premio de Estado de Su Padre. "New York Times, 10 de julio de 1994.)

10. Determinar la eficacia de los trasplantes de mdula sea "Huellas dactilares de ADN pueden ayudar a los mdicos a supervisar los trasplantes de mdula sea. La leucemia es un cncer de la mdula sea y la medula enferma debe ser eliminada. La medula sea crea nuevas clulas sanguneas, por lo que la persona que sufre de leucemia morir sin un trasplante de una mdula sea sana. Los mdicos pueden saber rpidamente si el trasplante ha tenido xito tipificando el ADN del paciente y del donante. Si el trasplante ha funcionado, una huella dactilar de la sangre del paciente muestra las bandas del donante. Pero si el cncer de mdula sea no ha sido destruido entonces las clulas cancergenas se multiplican rpidamente y las bandas del propio paciente predominan. ("Nuestra mejor tarjeta de identidad en salud y en la enfermedad " en" Dentro de la ciencia ", New Scientist, 16 de noviembre, 1991.)

11. Demostrando la relacin de los inmigrantes.

Las huellas dactilares de ADN se han utilizado como prueba de paternidad para fines de inmigracin. En 1986, la Oficina de Gran Bretaa recibi 12.000 solicitudes de inmigracin de las esposas y los nios de hombres de Bangladesh y de Pakistn que residen en el Reino Unido. La carga de la prueba recae sobre el solicitante, pero estableciendo la identidad de la familia puede ser difcil debido a las pruebas documentales incompletas. Las pruebas de sangre tambin pueden ser inconclusas, pero los resultados de la toma de huellas de ADN son aceptados como prueba de la paternidad por la Oficina de Gran Bretaa. (Huellas de ADN, fuente desconocida: Basado en Jeffreys AJ et al., "identificacin positiva de una prueba-caso de inmigracin usando huellas de ADN" Nature, vol. 317:818-819, 1985.)

12. Confirmando la relacin entre los animales.

Los cientficos que extrajeron ADN a travs de los cabellos de chimpancs en toda frica ahora tienen pruebas de que podra haber una tercera especie de chimpanc. Al mismo tiempo han aprendido cosas sobre el comportamiento del

51

chimpanc y patrones de parentesco que podran haber tomado aos para teorizar. Descubrieron un grupo de chimpancs viviendo en el oeste de frica, que son genticamente distintos de los chimpancs que viven en otras partes de frica, lo que sugiere que el grupo puede ser una especie en peligro de extincin. Los cientficos han descubierto que los chimpancs machos que viven en una zona determinada son a menudo tan estrechamente relacionados como medio-hermanos, y muchos de los as llamados sub-especies pueden ser parte de una sola especie. El parentesco de los chimpancs machos puede explicar por qu, a diferencia de otros primates, los machos son muy amigables el uno al otro.

13. Las pruebas de ADN de material vegetal ubica al asesino en la escena del crimen.

Dos vainas de semillas pequeas atrapadas en la cama de su camioneta pick-up ubica a un asesino acusado en la escena del crimen. Las pruebas genticas demostraron que el ADN en la vaina de semillas corresponde exactamente al ADN de una planta encontrada en la escena del crimen. El acusado haba admitido que le haba dado a la vctima un paseo, pero neg haber estado cerca de la escena del crimen.

APENDICE C

FOTOGRAFAS

e)

d)c)

b)a)

Serie 1. Condiciones de experimentacin y digestin de ADN a) La estacin de trabajo cuenta con una cmara horizontal de electroforesis para geles de ADN, micropipetas, puntas y los reactivos empleados b) En la estacin de trabajo se observa la fuente de poder con la que se hace pasar una corriente elctrica a la cmara de electroforesis c) La digestin enzimtica se logra aadiendo las enzimas de restriccin EcoR1/Pst1 a las diferentes muestras de ADN e d) incubando durante 45 minutos a 37C.

52

d)c)

b)a)

Serie2. Electroforesis en gel de agarosa a) Los geles de cargan en la cmara de electroforesis con cada muestra de ADN. En cada pocillo deben depositarse 20 l de muestra b) Se identifica cada carril y una vez cargado todo el gel se procede a c) conectarlo a la fuente de poder durante 45 min a 100 V d) Imagen del gel durante la corrida. Se observa que los colorantes que se aadieron a las muestras corren a lo largo del gel mientras se aplica una corriente elctrica.

53

f)e)

d)c)

b)a)

Serie 3. Tincin y desteido de geles a) Una vez terminado el tiempo de corrida, se retira con cuidado de la cmara de