biología celular guia practicas 2015-ii

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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BÁSICAS

Guía de prácticas BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

2015-II

Responsable Blgo Lezama Vigo, Hélmer, MSc

Profesores Blgo. Nolasco Cárdenas, Oscar, MSc. (Asesor)

Blgo. Jerí Apaza, César (Coordinador prácticas) Méd. Amanzo López, César (Coordinador seminarios) Blgo. Murrugarra Bringas, Victoria (Coordinador tutorías).

Blgo. Alata Linares, Vicky, Mg Blgo. Mesía Guevara, Marco, Mg. Blgo. Quintana Cáceda, Milagros, MSc.

Blgo. Sánchez Dávila, Johanna, MSc. Q.F. Sifuentes Vásquez, Roxana, MSc. Biól. Vadillo Gálvez, Giovana, Mg.

QF. Barreto Yaya, Danilo Q.F. Ramírez Rojas, Luisa. Blgo. Velarde Vílchez, Mónica

Méd. Lapa Salinas, Yolanda, Mg Biól. Sandoval Peña, Gustavo, Mg. Méd. Gutiérrez Aures, Ysabel

Méd. Mena Navarro, Cecilia Blgo. Fujita Alarcón, Ricardo, Dr.

APELLIDOS, NOMBRES:_________________________________________

GRUPO:___________ DIA:____________ PROFESOR:______________

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INTRODUCCIÓN

La biología es la ciencia de la vida que estudia la estructura y función de los organismos vivos y sus

componentes. Las aplicaciones de la investigación básica en biología molecular son numerosas, desde la

tecnología para trasplantar corazones, manipular genes, diseñar fármacos contra microorganismos

patógenos hasta actividades como incrementar la producción mundial de alimentos.

La guía de prácticas del curso de Biología Celular y Molecular tiene como objetivo entrenar al

estudiante en los procedimientos de laboratorio y desarrollar su pensamiento científico, de manera que lo

lleve a comprender los términos básicos de la Biología Molecular.

El estudiante debe emplear esta guía en cada práctica de laboratorio y estar informado sobre la

práctica que se llevará a cabo en cada sesión, anticipadamente.

La guía se ha dividido en tres partes de acuerdo a cada capítulo. La primera parte comprende la

célula y componentes celulares. La segunda parte incluye procesos celulares como respiración,

permeabilidad, división celular y la visualización de organelas. En la tercera parte se analizara el proceso

de división celular, comprensión del código genético y técnicas de manipulación de ácidos nucleicos.

El alumno debe cumplir con los objetivos planteados al final de cada práctica. Así mismo debe

presentar su guía de práctica terminada la misma, con las actividades requeridas en la sesión de práctica,

debidamente desarrolladas.

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Normas para el trabajo adecuado en el desarrollo de los

experimentos en el laboratorio

1. No ingresar al Laboratorio con mochilas, carteras o cualquier material que no sea utilizado en la práctica.

2. Llevar puesto el mandil blanco y abotonado y zapatos cerrados antes de ingresar al laboratorio.

3. Los alumnos deberán llevar el cabello recogido o amarrado. 4. No consumir alimentos, ni bebidas gaseosas, durante el desarrollo del experimento. 5. En cada experimento de laboratorio, debe estar atento a las instrucciones del profesor sobre el

manejo y cuidado de los equipos y reactivos químicos.

EVALUACIÓN CONTINUA ASPECTO ACTITUDINAL

1. Asistencia y puntualidad 0 ó 5 puntos 2. Indumentaria adecuada 0 ó 5 puntos 3. Material requerido para práctica 0 ó 5 puntos

4. Participación 0 a 7 puntos

ASPECTO CONCEPTUAL 1. Evaluación escrita 0-20 puntos

ASPECTO PROCEDIMENTAL

1. Manipula adecuadamente el material de laboratorio 0 a 4 puntos

2. Sigue el protocolo establecido en la guía 0 a 4 puntos 3. Elaboración de Informe Practico (COMPLETO): 0 a 12 puntos

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PROGRAMACIÓN DE CONTENIDO

SEMANA CONTENIDO

1 Organización de grupos de práctica. Bioseguridad

2 I-1 Microscopía técnicas de manipulación y enfoque de muestras

3 I-2 Técnicas de coloración y observación de células Procariotas

4 I-3 Observación de células Eucariotas

5 I-4 Demostración experimental del fenómeno de difusión.

Permeabilidad celular

6 I-5 Observación de movimientos celulares: Ciclosis. Observación de

organelas celulares. Mitocondria, Cloroplasto, Vacuolas

7 II-1 Actividad enzimática

8 EXAMENES PARCIALES

9 II-2 Fermentación

10 REPASO

11 II-3 Mitosis

12 II-4 Fecundación

13 III-1 Extracción de DNA. Electroforesis

14 III-2 Código genético y traducción de proteínas

15 III-3 Estudio de rasgos genéticos en el hombre

16 EXAMENES FINALES

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PRÁCTICA I-1 (SEMANA 2)

BIOSEGURIDAD Y MICROSCOPIA

PRIMERA PARTE: BIOSEGURIDAD

El trabajo en el Laboratorio requiere de la observación de una serie de normas de seguridad que

eviten posibles accidentes debido al desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible

negligencia de los alumnos que estén en un momento dado, trabajando en el Laboratorio.

A continuación se enumeran una serie de medidas e indicaciones de seguridad que deben tomarse

durante las prácticas de laboratorio.

NORMAS PERSONALES

1. Lea con atención, antes de cada práctica, las indicaciones de su guía. Siga todas las instrucciones a

menos que el profesor realice alguna modificación.

2. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. Se trabajará con

cuidado y de manera organizada. Así mismo se mantendrá cada mesa de trabajo limpia, seca y

ordenada.

3. Es obligatorio la utilización de mandil que le cubra brazos, piernas y torso. Está prohibido el uso de

sandalias, pantalones y faldas cortos en el laboratorio. La persona inapropiadamente vestida para

trabajar en el laboratorio no podrá ingresar.

4. No se debe llevar las manos a la boca ni a la cara pues pueden estar contaminadas.

5. Toda persona con cabello largo, deberá sujetarlo y recogerlo, nunca debe de estar libre.

6. Está terminantemente prohibido fumar, tomar bebidas y comer en el laboratorio.

7. En caso de derrame, accidente o daño avise inmediatamente al profesor.

8. Al término de cada práctica limpiar el área de trabajo y lavar los materiales utilizados con agua de

caño. Lavarse las manos meticulosamente con agua y jabón. Finalmente cerciorarse que las llaves

de gas y agua estén cerradas.

REACTIVOS QUIMICOS

1. Usar lentes de seguridad cuando trabaje con reactivos químicos peligrosos que puedan salpicar o

derramarse.

2. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de su necesidad, fijarse bien en el rótulo.

3. Como regla general, no coger ningún producto químico. El profesor o profesora te lo proporcionará.

4. Nunca devuelva los sobrantes de los productos a los frascos de origen sin consultar con el profesor.

5. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe,

estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.

6. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos.

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7. No pipetear con la boca. Utilizar una bombilla de succión.

8. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos, siempre echaremos el ácido

sobre agua.

9. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben estar lejos de fuentes de calor. Si hay

que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama.

10. Manipule con precaución los solventes volátiles e inflamables como el éter, acetona y metanol.

Nunca evapore estos solventes en una hornilla al abierto. Utilice siempre un sistema de

condensación eficiente.

11. Si por accidente cae o se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente

con mucha agua y avisa al profesor.

12. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente.

13. Si fuera necesario durante la practica encender un mechero, encienda el fuego en el laboratorio solo

si no existen solventes inflamables en la vecindad. La persona que encienda el fuego debe primero

verificar que no exista otra persona que este trabajando con solventes inflamables en el laboratorio.

MATERIAL DE VIDRIO

1 Use material de vidrio limpio y no rajado. 2 El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras use guantes o

trapos.

3 Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas dos normas:

-Ten extremo cuidado y cerciórate que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente.

-Calienta por la pared lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente (mira la

figura).

EQUIPOS ELÉCTRICOS

1 Manipule cualquier equipo eléctrico con las manos secas y asegúrese que el área de trabajo también este seca.

2 Ningún cordón eléctrico debe colgar fuera de la mesa de trabajo. 3 Cuando desconecte algún equipo del tomacorriente, jálelo por el enchufe y no por el cordón.

UTILIZACION DE BALANZAS

1 Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel sobre los platos

de la misma y si el producto fuera corrosivo, se utilizará una luna de reloj.

2 Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc.

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MANIPULACIÓN DE ESPECÍMENES

1 Manipule los microorganismos crecidos en una placa petri o tubo de cultivo con cuidado extremo.

Siempre utilice técnicas de esterilidad (a la llama del mechero, guantes, palillos estériles, etc.). 2 Nunca llevar a la boca plantas o partes de ellas como semillas, frutos y hojas.

NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO EN UN LABORATORIO

Clasificación de microorganismos por grupos de riesgo para el trabajo de laboratorio:

Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo) Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales.

Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo) Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas

probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.

Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo) Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de

ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.

BARRERAS DE CONTENCION

Los laboratorios presentan diversas barreras de contención que previenen el escape y dispersión

de agentes biológicos de riesgo.

Barrera primaria: Es aquella que protege al personal y al ambiente inmediato del agente de riesgo (vestimenta de uso exclusivo, cabina de bioseguridad y equipos provistos de dispositivos de seguridad).

Barrera secundaria: Es aquella que protege el ambiente externo contra los agentes de riesgo (diseño del laboratorio e implementación de equipos de seguridad de acuerdo al nivel de Bioseguridad).

Barrera microbiológica: Es un dispositivo o sistema que evita o limita la migración de microorganismos entre los espacios situados a ambos lados del mismo y permite controlar la concentración de

microorganismos en el ambiente, dentro de límites prefijados. Tiene como objetivo proteger al operador o al operador y al proceso.

Barrera microbiológica parcial: Es un dispositivo o sistema que limita la migración de microorganismos entre los ambientes situados a ambos lados del mismo. En este tipo de barrera se recomiendan Prefiltros, Filtros HEPA (Filtros de alta eficiencia para el control de partículas en suspensión) así como cabinas de

bioseguridad clase I o II, lo cual dependerá del tipo de trabajo que se efectúa en un determinado laboratorio.

Barrera microbiológica absoluta: Es un dispositivo o sistema hermético, a prueba de filtraciones de aire o gas, que evita en forma total la migración de microorganismos entre el ambiente confinado por la barrera y el ambiente exterior de la misma. La barrera microbiológica absoluta puede confinar al producto

o proceso, dejando al operador fuera de la misma o viceversa. En este caso se recomienda una cabina de bioseguridad de tipo III.

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Barrera química: Son dispositivos o sistemas que protegen al operador del contacto con substancias irritantes, nocivas, tóxicas, corrosivas, líquidos inflamables, sustancias productoras de fuego, agentes oxidantes y sustancias explosivas. En este caso se recomiendan una cabina de seguridad química.

Barrera física: Son dispositivos o sistemas de protección individual o colectiva que protegen contra las radiaciones ionizantes, no ionizantes, ruidos, carga calórica, quemaduras y vibraciones excesivas.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

De acuerdo con el nivel de riesgo, el tipo de laboratorio, la barrera de contención requerida, los procedimientos y técnicas a usar, se han establecido los siguientes niveles de Bioseguridad.

Nivel de Bioseguridad I: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en un laboratorio básico, por personal adiestrado en los procedimientos que se ejecutan en él. En este nivel se trabaja con agentes clasificados en el Grupo de riesgo I por presentar un peligro mínimo para el personal del

laboratorio y para el ambiente. En el nivel de Bioseguridad I no se requiere equipo especial ni un diseño específico de las instalaciones. El personal de estos laboratorios es generalmente supervisado por un científico con entrenamiento en microbiología.

Nivel de Bioseguridad II: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en un laboratorio básico, por personal adiestrado en el manejo de agentes de riesgo del grupo II. Es similar al nivel I y en él

se manejan agentes de peligro moderado hacia el personal y el ambiente, pero difiere del nivel I en las siguientes características: 1. El personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el manejo de agentes patógenos.

2. El acceso al laboratorio es restringido cuando se está realizando algún trabajo. 3. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzo cortantes contaminados. 4. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o aerosoles se llevan a cabo en cabinas de trabajo microbiológico.

Nivel de Bioseguridad III: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en el laboratorio de contención. El personal debe contar con adiestramiento específico para el manejo de agentes de alto

riesgo clasificados en el grupo de riesgo III. En el laboratorio se realiza trabajo con agentes que pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como resultado de la inhalación o exposición a los mismos. El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales tendientes a proteger al operador y al

ambiente. Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección siguiendo protocolos rigurosos. Los laboratorios se mantienen con una presión de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al ambiente.

Nivel de Bioseguridad IV: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en el laboratorio de contención máxima. Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes biológicos clasificados en el

grupo de riesgo IV por representar un alto riesgo individual de contagio y que además son un riesgo para la vida. Los agentes nuevos que presentan características antigénicas, patogénicas u otras similares a agentes de nivel III y IV son confinados a nivel IV hasta que exista suficiente información científica para

establecer a cual grupo de riesgo pertenecen. El personal que trabaja en los laboratorios de nivel IV tiene entrenamiento específico y extensivo en el manejo de agentes infecciosos, y cuenta con entrenamiento para trabajar en el ambiente estéril y

controlado. El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales tendientes a proteger al operador y al ambiente. Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección de características superiores a las exigidas para el trabajo en un laboratorio de nivel III. Los

trajes están diseñados para cubrir la totalidad del cuerpo, presentan un sistema de respiración individual asociado y una leve sobrepresión interna para evitar así la entrada accidental de partículas infecciosas.

Los laboratorios se mantienen con una presión de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los

agentes nocivos escapen al ambiente.

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TIPOS DE LABORATORIOS

En relación con el grado de riesgo los laboratorios combinan las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo. De esta manera los laboratorios se

clasifican en 3 categorías: Laboratorio básico: Dividido en dos grupos, el de nivel de bioseguridad 1;y el de nivel de bioseguridad 2;

Laboratorio de contención: con nivel de bioseguridad 3, y Laboratorio de contención máxima: con nivel de bioseguridad 4.

TRABAJO GUIADO

1.-Complete los nombres de los distintos símbolos que se presentan a continuación. SEÑALES DE ADVERTENCIA

SEÑALES DE PROHIBICION SEÑALES DE OBLIGATORIEDAD

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1.- complete el recuadro:

NIVEL DE

BIOSEGURIDAD

CARACTERISTICAS TIPO

DELABORATORIO

EJEMPLOS DE

PATOGENOS

FECHA ACTITUDINAL MATERIAL PARTICIPACIÓN FIRMA/ SELLO

PROFESOR

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SEGUNDA PARTE:

MICROSCOPÍA Y ENFOQUE DE MUESTRAS

I. FUNDAMENTO

La invención del microscopio se atribuye a Johannes y Zacharias Jansen (1590) y el descubrimiento de la estructura celular de los organismos a Robert Hooke (1665). Posteriormente, en

1683 y con un microscopio muy rudimentario Leeuwenhoek descubrió un universo enmarcado sólo por decenas de micrómetros. Desde aquel entonces, el perfeccionamiento continuo al microscopio ha permitido a la Ciencia profundizar cada vez más en el conocimiento de la ultraestructura celular y de las

relaciones intercelulares.

MICROSCOPIO COMPUESTO

El microscopio es un instrumento óptico que se compone de una serie de lentes para conseguir imágenes aumentadas de objetos diminutos que por su extrema pequeñez no son visibles al ojo humano.

El microscopio compuesto está constituido de un SISTEMA OPTICO destinado a obtener una imagen aumentada del objeto, un SISTEMA MECANICO que sostiene los distintos elementos ópticos y

los objetos que se van a examinar y un SISTEMA DE ILUMINACIÓN.

CARACTERISTICAS DEL MICROSCOPIO

Dado que la imagen del microscopio no es real sino virtual, se han determinado algunos términos de medida microscópica:

En cualquier microscopio el poder de resolución define su rendimiento óptico, porque es su

capacidad para ver como separados dos puntos que realmente lo están pero que nuestro ojo sólo puede ver como una entidad única (es decir es su capacidad de entregar imágenes bien nítidas).

El máximo poder de resolución del microscopio óptico es de 0,2 micrómetros (0,2 µm), debido a que la longitud de onda de la luz utilizada (400-700 µm) es un factor limitante. El ojo humano tiene un poder de resolución de aproximadamente 100 micrómetros.

El límite de resolución puede definirse como la distancia mínima que debe existir entre dos puntos

para que se puedan distinguir como separados. El límite de resolución se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:

Kλ

L.R. = --------------- K = constante = 0.61

A.N

λ = longitud de onda de luz AN = apertura numérica de cada lente objetivo es su capacidad para captar la máxima cantidad de la luz difractada por el objeto. Depende del índice de refracción del medio.

Recuerda: A menor límite de resolución mayor será el poder de resolución Resolución y magnificación Máximas

Instrumento óptico Resolución Magnificación

Ojo humano 0,1 mm

Microscopio óptico 0,2 u 2500

Microscopio electrónico 0,1 nm 1000 000

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II. OBJETIVOS

Reconocer las partes del microscopio óptico.

-Conocer su utilización para la observación de distintas muestras biológicas.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

En el laboratorio encontrarás:

- Microscopio compuesto

- Aceite de inmersión

IV. PROCEDIMIENTO.

Se reconocerán las partes de un microscopio óptico. Señalar las partes del mismo en el dibujo adjunto.

1. SISTEMA OPTICO. El sistema óptico está constituido por:

Objetivos: sistema de lentes convergentes que actúa como una lente que se encuentran montados en el revolver. Lo usual es que cada microscopio tenga cuatro objetivos de diferentes aumentos ( 4x, 10x, 40x, 100x) los que se clasifican en:

Objetivos en seco: en los que el aire se interpone entre la lente y la preparación.

Objetivos de inmersión: en el cual un líquido (aceite) se interpone entre la lente y la preparación.

Ocular: El ocular es una lente convergente que recoge la imagen intermedia producida por el objetivo y forma una nueva imagen virtual, derecha, y amplificada un cierto número de veces (X veces, según se indica en el propio ocular). Los aumentos más comunes son 10X y 16X.

2.-SISTEMA DE ILUMINACIÓN.

Condensador: Sistemas de lentes convergentes que concentra el haz de luz sobre la preparación.

Diafragma: Sirve para regular la cantidad de luz que llega a la preparación.

Fuente de luz: Puede ser natural o artificial (ampolleta). Portafiltro: Opcional, sirve para colocar filtro de distintos colores para mejorar el contraste.

3.-SISTEMA MECANICO

Tubo óptico: Cilíndrico ahuecado destinado a llevar el ocular en su extremo superior y los objetivos montados en el revólver en su extremo inferior. La longitud del tubo debe ser siempre precisa.

Revólver: Pieza metálica situada en la parte inferior del tubo que por rotación sitúa los diferentes

objetivos en posición de trabajo.

Platina: Superficie plana con una perforación central para permitir el paso de la luz hacia preparación. Posee un carro que sostiene la preparación y que puede desplazarla hacia delante y hacia el

lado izquierdo o hacia el lado derecho.

Tornillo Macrométrico: Mecanismo de enfoque de avance rápido.

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Tornillo Micrométrico: Mecanismo de enfoque con precisión o ajuste fino.

Base o Pie: Estructura sólida y pesada que sostiene y da estabilidad a todo el instrumento.

Columna: Vástago vertical que se articula con la base y con el tubo del microscopio y lleva el mecanismo de movimiento del mismo.

NOTA IMPORTANTE. Presta mucha atención al manejo del microscopio que tienes a tu cargo. Debes

hacerlo cuidadosamente porque son aparatos muy delicados y dejarás a consigna tu documento de identificación.

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1 Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.

2 Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3 Comenzar la observación con objetivo de menor aumento. Si la preparación es de bacterias emplear el

objetivo de mayor aumento (objetivo de inmersión, ver punto 6).

4 Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto

debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el

objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación

con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener

un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover

un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino.

6 El empleo del objetivo de inmersión es siempre utilizando aceite de inmersión.

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TRABAJO GUIADO

1.- Indique todas las partes del microscopio

2.- MENCIONE LOS TIPOS DE MICROSCOPIOS QUE CONOCE

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3.- PRÁCTICA:

Use una hoja de papel milimetrado y escriba la letra “e” en un máximo de tamaño de 1 a 2 mm2

a. Corte aproximadamente 1 cm2 que incluya la letra que anoto, coloque el trozo de papel sobre la lámina

y humedezca el papel con una gota de agua y cúbrala con una laminilla.

b. Coloque la lámina sobre el microscopio con la letra y enfóquela con el objetivo de 4x.

c. Luego enfoque la lámina con los objetivos 10X y 40 X

LENTE OBJETIVO CARACTERISTICA DE

LA IMAGEN

OBSERVADA

DIAMETRO DEL

CAMPO DE VISION

EN MILIMETROS

AUMENTO TOTAL

4X

10X

40X


PROFESOR

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PRACTICA I-2 (SEMANA 3)

PRIMERA PARTE: TECNICAS DE COLORACION. PREPARACION DE MUESTRAS

I. FUNDAMENTOS

La coloración implica la penetración del colorante por fenómeno osmótico y su fijación se debe a fenómenos de absorción de partículas o iones. Químicamente la coloración es la unión de las moléculas del colorante con los elementos constituyentes de la célula. Algunas regiones celulares tienen pH alcalino

y se tiñen con los colorantes ácidos; otros tienen pH ácido y se tiñen con colorantes básicos. Sin embargo es necesario señalar que tanto el núcleo como el citoplasma tienen características anfótericas de manera que se pueden teñir, el núcleo con algunos colorantes ácidos y el citoplasma con algunos colorantes

básicos. El mecanismo de coloración de las muestras biológicas pueden ser afectados por:

Pureza del colorante Concentración del colorante pH de la solución del colorante

Temperatura del medio ambiente Sustancias adicionales (mordientes) Tiempo de coloración.

Los preparados microscópicos, constituyen una serie de preparados rutinarios de laboratorios

que tienen por objeto identificar en forma rápida el contenido de un determinado tipo de muestra, con la

con la finalidad de resolver algún problema de interés particular. Los preparados microscópicos más frecuentes en Biología son:

- Preparados “en fresco” - Preparados “en seco”

Los preparados “en Fresco” son preparaciones microscópicas acuosas, que se caracterizan por que la sustancia examen, no está adherida de un modo fijo a la superficie de la lámina portaobjeto y por lo tanto, al ser manipulada ésta en diferentes posiciones se corre el riesgo de perder u estropear el

preparado. Los preparados “en seco” son aquellos que sufren un procesamiento previo (extensión, fijación y

coloración), y se caracterizan porque la sustancia examen se halla adherida a la superficie de la lámina portaobjeto y por lo tanto, al ser manipulada ésta en diferentes posiciones no se estropea o pierde la muestra.

Es importante ejercitar al estudiante en el manejo y aplicación de estos factores que inciden

básicamente en la complementación del aprendizaje del estudio de estructuras celulares, identificación

de tejidos y microorganismo.

II. OBJETIVO.

1. Diferenciar y explicar el fundamento de las distintas coloraciones 2. Realizar coloraciones con muestras biológicas

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio. - Microscopio óptico - Pipetas pasteur - Goteros - Agua destilada

- Mechero - Azul de metileno Material de estudio:

- Agua estancada o agua de florero de al menos una semana de conservada - Muestra de epitelio bucal extraídas con hisopos

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IV. PROCEDIMIENTO

PREPARADOS EN FRESCO 1. Colocar una gota de agua estancada o agua de florero en un portaobletos 2. colocar una laminilla cubreobjetos

3. Observa al microscopio

PREPARADOS EN SECO

1. Colocar la muestra de epitelio bucal extraída con los hisopos en un portaobjetos 2. Fijar por desecación o suavemente a la flama del mechero 3. Realizar la coloración con azul de metileno por 3 minutos

4. Retirar el exceso de colorante y secar al medio ambiente 5. Observa al microscopio

1.- Dibuje lo observado en las muestras preparadas en la práctica. 2.- Diferencie entre el preparado en fresco de un preparado en seco

Muestra:_________ Muestra:_________ Coloración:_______ Coloración:_______

Aumento:________ Aumento:________

PARTE 2: OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS

PROCARIOTES,

I. FUNDAMENTO

La principal característica de la célula procariota es que carece de

núcleo celular. Las bacterias, los organismos procariotes más

representativos, comprenden por una parte, especies de

importancia médica puesto que producen una serie de infecciones

y padecimientos en el hombre y en los animales pero, por otra

parte, una gran mayoría representa beneficios para la agricultura,

la industria y la salud humana y animal.

Para observar este tipo de células se utiliza la Tinción Gram,

técnica diseñada por el médico danés Hans Christian Gram. Esta

consiste en poner en contacto las células bacterianas con

colorantes básicos como violeta de genciana, utilizando la solución

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de lugol como mordiente. Esto forma un compuesto yodado que se fija fuertemente en determinadas

bacterias. Según la coloración que adquieran, las bacterias se clasifican en: GRAM POSITIVAS: se tiñen fuertemente con violeta de genciana y adquieren una coloración violeta.

GRAM NEGATIVAS: se tiñen muy superficialmente por lo que fácilmente se decoloran con solventes orgánicos. Se utiliza adicionalmente la safranina o fucsina, que se emplea como colorante de contraste,

adquiriendo una coloración rosada.

La diferente tinción de bacterias se debe a la composición diferencial de sus paredes bacterianas. Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular con mureina y ácido teitoico. En cambio, las Gram

negativas tienen una pared mucho más compleja que contiene, además del peptidoglucano, una asociación de proteínas lípidos y lipopolisacáridos Además de la coloración esta técnica nos permite distinguir en las bacterias: a) morfología: cocos,

bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc) b) agrupación: pares, cadenas tétradas, racimos, sarcina A: forma de caña o bacilos B: Redondos en líneas: estreptococos

C: redondos en cúmulos: estafilococos D: Redondos en pares: diplococos E: Forma de espirales: espirilos

F: En forma de coma: vibrios

II. OBJETIVOS

Reconocer los distintos tipos de bacterias según se tiñan o no con la Tinción Gram.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio: Microscopio óptico - Alcohol acetona Soluciones para la tinción: - Fucsina o safranina

- Violeta de genciana - Aceite de inmersión - Lugol

- Mechero de alcohol Material de estudio:

- Yogurt - Vinagre casero (NO comercial) - Muestra de sarro dental extraída con mondadientes

IV. PROCEDIMIENTO

La tinción Gram se realizará sobre las muestras de yogur, sarro dentario y vinagre (no industrial) que los alumnos traerán.

Bacterias del yogurt

El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se

realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas

distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30µm de longitud) facilita la observación aunque no se tenga

mucha práctica con el enfoque del microscopio.

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Bacterias del vinagre

El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti, aunque también Gluconobacter. Se trata de

bacilos rectos con flagelos polares.

Bacterias del sarro dental

El sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Está constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos

metabólicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparación, pero suelen abundar bacterias saprófitas, pudiéndose

observar gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.

Realizar los siguientes pasos para la tinción Gram de cada una de las 3 muestras indicadas.

1 Realizar una extensión de la muestra de cultivo bacteriano sobre un portaobjetos 2 Secar ante un mechero. 3 Cubrir el preparado con violeta de genciana por 1 minuto.

4 Enjuagar la lámina con agua destilada 5 Añadir lugol por 1 minuto. 6 Lavar con agua destilada y decolorar con alcohol acetona.

7 Añadir fucsina o safranina y dejar que actúe por 1 minuto. 8 Lavar con agua corriente, secar 9 Coloque una gota de aceite de inmersión encima de la lámina cubreobjetos y observar al

microscopio con el objetivo de inmersión.

PARTE PRACTICA

1.- completar el grafico

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2.-Dibuje todas las muestras observadas en la práctica. Señale y mencione los tipos de bacterias observadas, por su clasificación según la tinción y su morfología

BACTERIAS DE YOGURT BACTERIAS DEL VINAGRE

Coloración:_______ Coloración:_______ Aumento:________ Aumento:________

BACTERIAS DEL SARRO DENTAL

Coloración:_______ Coloración:_______



PROFESOR

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PRACTICA I- (SEMANA 4) OBSERVACIÓN DE CÉLULAS EUCARIOTES

I. FUNDAMENTO

En 1939, en base a observaciones realizadas por los científicos alemanes Schleiden y Schwan, se plasmó la teoría celular, la cual produjo un cambio radical en las ciencias biológicas. Esta teoría postula que los “cuerpos de todos los animales y vegetales están formados de células y que solo pueden

aparecer nuevas células por división de las células preexistentes”. De ahí que los organismos por muy sencillos que sean están constituidos por unidades vivas denominadas células.

La célula eucariota es más compleja que la célula procariota y contiene, a diferencia de esta

última, núcleo celular. Los organismos más simples (protozoarios) están constituidos de una sola célula eucariota mientras que los más complejos o multicelulares están formados por un gran número de células

eucariota que se hallan organizadas en tejidos, órganos y sistemas.

II. OBJETIVOS

Observar y caracterizar células eucariotas de tipo vegetal (epidermis de cebolla ). Observar y caracterizar células eucariotas de tipo animal (epitelio bucal, tejido adiposo y sangre).

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio Microscopio óptico Cubeta de tinción Lugol Frasco lavador

Mechero de Alcohol Alcohol absoluto Lanceta estéril Hematoxilina Formol Eosina

Wright Sudan III Láminas portaobjeto y cubreobjeto Gotero

Material de estudio: Catafilo de Cebolla Hisopos

Tocino Agua estancada de 15 días guardada en frasco oscuro con trocitos de lechuga Levadura de pan

Gotas de sangre obtenidas por punción con lanceta hematológica en un dedo

Materiales de disección: tijera, pinza, estilete. Bisturí u hoja de afeitar

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Observación de células vegetales (Células epiteliales de Allium cepa)

Las células de la epidermis de las hojas internas del bulbo de la cebolla, son de forma alargada y

bastante grande. La pared celular celulósica se destaca muy clara teñida por el colorante. Los núcleos son grandes y muy visibles. En el citoplasma se distinguen algunas vacuolas grandes débilmente coloreadas.

1 Separe una de las capas del bulbo de la cebolla. Con ayuda de una pinza desprenda la membrana

epidérmica que cubre la parte interna de la cebolla (catafilo) y extiéndala en el portaobjetos. 2 Utilizando una hoja de afeitar obtenga una porción de medio centímetro cuadrado, cúbrala con una

gota de lugol, coloque cuidadosamente el cubreobjeto y observe en el microscopio.

3 Reconozca las partes de la célula vegetal.

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4.2. Observación de organismos unicelulares

1 Coloque una gota de agua estancada sobre un porta objeto y cubran con una laminilla. 2 Observe con el objetivo de menor aumento. 3 Ajuste el diafragma para incrementar el contraste.

4 Observe la forma, tamaño y movimiento de los organismos unicelulares (ver figura adjunta).

4.3. Observación de levaduras del pan

1 Diluya un trocito de levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) con agua destilada, en un tubo

de ensayo. 2 Observe con el objetivo de mayor aumento. 3 Ajuste el diafragma para incrementar el contraste.

4 Observe la forma y tamaño de estos organismos.

4.4. Observación de células animales (Epitelio bucal)

El azul de metileno tiñe intensamente el núcleo y con menos color el citoplasma de las células. Éste

suele ser algo granuloso.

1 Con un hisopo limpio extraiga suavemente la mucosidad de la cavidad bucal. 2 Deposite la mucosidad extraída en el centro de una lámina portaobjetos y extiéndalo con un frotis. 3 Agregue unas gotas de AZUL de metileno y espere 3 minutos.

4 Elimine el exceso de colorante utilizando agua y coloque un cubreobjetos. 5 Observe la muestra a menor aumento y localice: células asociadas y dobladas. 6 Luego visualice a mayor aumento y reconozca los componentes celulares.

5.5. Observación de células animales (Tejido adiposo)

El Sudan III es un compuesto que tiñe lípidos de color rojo intenso. En el tejido adiposo, que contiene

gran cantidad de grasas, se observarán los adipocitos teñidos por el Sudan III.

1 Con ayuda de un bisturí, cortar una fina capa de grasa de tocino

2 Colocarla en un portaobjetos y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4 minutos. 3 Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudán III. Dejar actuar unos 5 minutos. 4 Volver a lavar la preparación con agua, cubrirla con un cubreobjetos

5 Observar al microscopio.

4.6. Observación de células animales (Sangre)

Al microscopio las células sanguíneas se verán predominantemente los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por

los bordes. Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de

leucocitos:

Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa casi todo el glóbulo.

Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande, redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis.

Polimorfonucleares: núcleo fragmentado o arrosariado. Pueden ser eosinófilos, neutrófilos y basófilos.

Los eosinófilos, con granulaciones abundantes de color rojizo y el núcleo teñido de color azul marino. Estos glóbulos aumentan su número en caso de parasitosis o procesos alérgicos.

Los basófilos presentan un núcleo teñido de rojo y las granulaciones del citoplasma de color muy oscuro. Las plaquetas no son visibles ya que precisan una técnica especial de tinción.

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Efectúa los siguientes pasos para ambas coloraciones, Wright y Hematoxilina-Eosina:

1 Con ayuda de una lanceta desechable, realice una punción del pulpejo del dedo anular de la mano

izquierda, previa desinfección con algodón y alcohol. 2 Tome una gota de sangre y haga un frotis fino sobre el portaobjeto 3 Colocar el frotis extendido ya seco, sobre una base plana en posición totalmente horizontal.

Para la coloración de Wright:

1 Coloree con unas gotas de colorante Wright, inmediatamente agregar sobre el colorante el mismo

número de gotas de agua destilada y mezclar rápidamente, soplando suavemente hasta que se

forme una capa plateada. 2 Dejar reposar la mezcla por 8 - 10 minutos, observando la intensidad de color. 3 Lave con agua corriente y dejar secar al medio ambiente, si es posible con la lamina en forma

vertical. 4 Observe al microscopio. Utilice el objetivo de 100X para la observación de las células y núcleos. 5 Diferencie las diferentes formas de núcleo en los neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos y

linfocitos. 6 Dibuje cada forma de núcleo.

Para la coloración de Hematoxilina-Eosina:

1 Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tinción y añadir unas gotas de alcohol absoluto y

dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparación. 2 Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecación del

colorante agregando más líquido.

3 Lavar la preparación y añadir unas gotas de eosina dejándola actuar 1 minuto. 4 Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante. 5 Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero.

6 Observar al microscopio. Utilice el objetivo de 100X para la observación de las células y núcleos.

DESARROLLO

1.- ¿Por qué los eritrocitos se tiñen con Eosina?

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- ¿De que color y porque se tiñe el núcleo de los leucocitos? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________

3.-¿Para qué sirve el FORMOL en la coloración de adipositos? ______________________________________________________________________

____________________________________

4.-¿Cuál es el proceso de fijación para la observación de las células de la sangre ? ______________________________________________________________________

____________________________________

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5.- Dibuje las distintas muestras observadas en la práctica:



Muestra:_________ Muestra:_________


Muestra:_________ Muestra:_________ Coloración:_______ Coloración:_______ Aumento:________ Aumento:________


PROFESOR

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PRACTICA I-4 (SEMANA 5) PERMEABILIDAD CELULAR

I. FUNDAMENTO

La membrana celular permite el transporte de sustancias de manera selectiva. Muchas sustancias, además del agua, entran a la célula y salen de ella por efecto de los gradientes de concentración, aunque

sólo unas cuantas (CO2 y O2) puedan hacerlo tan fácilmente como el agua. Si una membrana celular se deja atravesar por una sustancia, se dice que es permeable a dicha sustancia.

El volumen celular cambia cuando el agua penetra o sale de la célula por un proceso denominado

osmosis.

En términos osmóticos las soluciones o medios separados por una membrana se pueden clasificar

como hipertónicas, isotónicas e hipotónicas; se dice que un medio es hipertónico, cuando la concentración del soluto en la solución es mayor en relación con otro medio de solución. Por ejemplo, si tenemos dos

soluciones, la solución 1 con agua destilada y la solución 2 con una solución de azúcar al 10%, se dice que la solución 2 de azúcar es hipertónica en relación a la solución 1. Por el contrario, la solución 1 es hipotónica en relación a la solución 2 azucarada, es decir que la concentración del soluto es menor en

relación con el otro medio. Y una solución isotónica, se cuando la concentración de soluto es igual a la concentración de soluto de la otra solución.

II. OBJETIVO.

2.1 Observar y describir los fenómenos de difusión y ósmosis y su importancia en el intercambio de

sustancias en la célula.

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III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio. - Microscopio óptico - Agua destilada - Tubos de ensayo - Algodón

- Gradillas - Marcador de vidrio - Solución hipotónica NaCl 0.065 M - Ligadura - Solución hipertónica NaCl al 2 % - Alcohol corriente

- Solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico) - Azul de metileno - Tres Beaker y tres placas petri

Material de estudio:

- Tres huevos que han permanecido totalmente sumergidos por 5 días en vinagre

- Gotas de sangre obtenidas por punción con lanceta hematológica en un dedo IV. PROCEDIMIENTO

Parte A 1 En tres tubos de ensayo numerados coloque:

-1 ml. de solución hipotónica NaCl 0.01 % -1 ml. de solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico) -1 ml. de solución de hipertónica NaCl al 2%.

2 Realizar una punción con la lanceta hematológica en un dedo previamente desinfectado con alcohol . 3 Dejar caer 1 a 2 gotas de sangre en cada uno de los tubos. 4 Agite los tubos y dejar en reposo durante 2 ó 3 minutos.

5 Con un gotero coloque en una lámina portaobjeto una gota de cada uno de los tres tubos. 6 Luego examine en el microscopio su aspecto. Observar qué efecto ha tenido las distintas soluciones

sobre la morfología del eritrocito y explicar por qué.

Parte B

1. Colocar los tres huevos en un vaso de precipitación de 1 litro y verter el vinagre hasta cubrir completamente los huevos. Debe realizarse este proceso 5 días antes de la práctica .

2. Al momento de la práctica lavar con mucho cuidado con agua de caño. 3. Frotar cuidadosamente con los dedos para sacar la cáscara. Realizar este proceso hasta tener casi un

tercio del huevo libre de cáscara.

4. Coloquen agua de caño en uno de los vasos de precipitación de 100ml y ubiquen allí uno de los huevos. El agua debe cubrir al huevo.

5. En otro vaso de precipitación colocar un huevo en la mezcla muy concentrada de sal en agua y colocar

allí otro de los huevos. 6. Llenar el tercer vaso con agua destilada y poner allí el tercer huevo. 7. en cada frasco se adicionó unas gotas de azul de metileno

8. Dejar por una hora y observar membrana y el contenido interno del huevo. NOTA: En todos los vasos de precipitación, los huevos deben quedar sumergidos en el líquido.

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DESARROLLO 1. Mencione y dibuje las diferencias encontradas en cada uno de los huevos sometidos a cada proceso. TABLA: Observación de resultados

2. Dibujar todas muestras observadas en la práctica



Muestra:_________

Coloración:_______ Aumento:________ CONCLUSIONES:

Solución de Sal Agua de caño Agua destilada

Esquema o

dibujo

Descripción

Conclusión:


PROFESOR

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PRACTICA I-5 (SEMANA 6) PRIMERA PARTE: OBSERVACIÓN DE MOVIMIENTO CELULAR. CICLOSIS

I. FUNDAMENTO

El citoplasma celular esta formado por el hialoplasma y el morfoplasma. El hialoplasma es un medio

acuoso, con un 85% de agua en el cual esta disuelta gran cantidad de moléculas formando una solución

coloidal; prótidos (AA, enzimas, proteínas estructurales), lípidos, glúcidos (polisacáridos, metabolitos), ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos, ADN, ARN, ARNt, ARNr) sales e iones.

El hialoplasma es un medio dinámico, ya que puede pasar del estado de sol a gel acumulando moléculas que establecen enlaces entre si y aumentando la viscosidad; pueden invertirse el proceso de gel a sol diluyéndose o separando las moléculas, esto permite la creación de corrientes internas o Ciclosis

y algunas células pueden emitir prolongaciones del citoplasma o SEUDOPODOS como órganos de desplazamiento.

II. OBJETIVOS

2.1. Explicar los movimientos citoplasmáticos III. MATERIALES

Encontraras en el laboratorio - Microscopio compuesto

Material de estudio: - Hoja de Elodea

IV. PROCEDIMIENTO 4.1. Movimientos Citoplasmáticos: Ciclosis

1. Colocar una hoja de Elodea sobre una lamina portaobjetos 2. Agregar una gota de agua y colocar la laminilla 3. A menor y mayor aumento observar las células e identificar los cloroplastos

4. Con abundante luz observar el desplazamiento del citoplasma conjuntamente con los Cloroplastos

Observaciones:

Que elementos citoplasmáticos participan en el movimiento Celular citoplasmático?

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SEGUNDA PARTE: OBSERVACIÓN DE ORGANELAS E INCLUSIONES

CITOPLASMATICA

I. FUNDAMENTO

Todas las funciones intracelulares (síntesis de proteínas, replicación de DNA y rutas metabólicas en general) son realizadas gracias una compleja organización de las organelas. Una célula eucariota

típica contiene organelas membranosas (retículo endoplasmático, aparato de golgi, peroxisomas, mitocondrias, etc.) y organelas no membranosas (ribosomas, proteosomas, etc.). Todas ellas efectúan una función puntual en la célula que le permite su supervivencia y replicación.

La supervivencia de la célula depende, entre otros factores, de la obtención de energía neta. Dicho proceso está a cargo de las mitocondrias y/o de los cloroplastos. Las mitocondrias se encuentran

en mayor número en células animales pero también pueden presentarse en células vegetales, mientras que los cloroplastos son exclusivos de células vegetales y algunas bacterias fotosintéticas. Las mitocondrias oxidan moléculas orgánicas utilizando oxígeno del aire como aceptor de electrones y forman

ATP. Los cloroplastos capturan energía de la luz y la transforman en ATP mediante el proceso denominado fotosíntesis.

II. OBJETIVOS

2.1Observar y diferenciar orgánulos de células vegetales: cromoplastos y cloroplastos. -Reconocer y diferenciar mitocondrias.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio: - Microscopio óptico

- Verde de Janus - Agua destilada

- Lugol - Gotero

Materiales de estudio:

- Pulpa de Tomate - Hojas de Elodea - Muestra de células epiteliales humanas tomadas con un hisopo

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Observación de cromoplastos en células de pulpa de tomate

La pulpa del tomate nos muestra las células generalmente bastante sueltas unas de otras. En el

citoplasma se percibe una serie de gránulos rojizos-anaranjados que son los cromoplastos. El núcleo puede llegar a observarse por su típico aspecto y tamaño. Es frecuente la presencia de gránulos de almidón de forma arriñonada. En las células menos alteradas por la compresión se ven grandes

vacuolas incoloras.

1 Cortar con el bisturí un pequeño trozo de uno o dos milímetros de grosor, de la parte pulposa del tomate.

2 Llevarlo sobre un portaobjeto, sin poner agua. 3 Poner el cubre-objeto y comprimir suavemente la preparación. 4 Observar al microscopio

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4.2. Observación de cloroplastos en células de Elodea

1 En un portaobjetos coloque una porción pequeña de hoja de Elodea y agregue una gota de agua. 2 Cubrir la muestra con una lámina portaobjetos. 3 Aprecie la forma de los cloroplastos y el movimiento de estos.

4.3. Observación de mitocondrias en células epiteliales humanas

1 Preparar un frotis de epitelio bucal con un hisopo.

2 Secar al medio ambiente. 3 Agregar unas gotas de Verde de Janus y dejar reposar por 3 minutos. 4 Elimine el exceso del colorante con agua destilada.

5 Observe al microscopio y describa la forma de las mitocondrias en la célula.

PARTE PRACTICA

1. Dibuje y coloree las distintas muestras observadas en la práctica. Mencionando el aumento total.






DESARROLLO: Diferencie una organela de una inclusión citoplasmática :


PROFESOR

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PRACTICA II-1 (SEMANA 7)

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

PRIMERA PARTE: CATALASA

I. FUNDAMENTO

Las enzimas son proteínas cuya función es acelerar (catalizar) reacciones químicas que ocurren dentro de la célula y que en ausencia de ellas no se llevarían a cabo o de lo contrario tomarían muchísimo tiempo. Como se aprecia en la siguiente figura, las enzimas son específicas para sus

sustratos, los cuales quedan unidos complementariamente al sitio de unión de la enzima donde son modificados enzimáticamente, liberándose al final de la reacción los productos respectivos.

La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La

función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo

descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

II. OBJETIVO. 2.1 Detectar la presencia de la enzima catalasa en un tejido animal.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio

- Gradillas - Pipetas-tubos de ensayo

Material de estudio

- Hígado de pollo

- Agua oxigenada

IV. MÉTODOS

1 Colocar en dos tubos de ensayo unos trocitos de hígado en diferentes cantidades. 2 Añadir 3 mililitros de agua oxigenada. 3 Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno.

4 Discutir la formación de burbujas en distintas mesas, relacionándolo con la concentración de catalasa.

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SEGUNDA PARTE: HIDROLISIS DE LA AMILASA

I. FUNDAMENTO

Mediante esta experiencia vamos a ver la actividad de otra enzima, la amilasa o ptialina, presente

en la saliva. Esta enzima actúa sobre el polisacárido almidón, hidrolizando el enlace O-glicosídico, por lo

que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa. Es importante que recuerdes las reacciones características de glúcidos para comprender esta experiencia.

II. OBJETIVOS. Comprobar que sólo bajo ciertas condiciones las enzimas funcionan óptimamente catalizando una reacción enzimática con su sustrato.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio.

- tubos de ensayo - Baño maría -gradillas - Vaso de precipitados

-solución diluida de almidón y sacarosa - Lugol

IV. MÉTODOS

1. Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4. 2. Proceder a llenar los tubos como lo indica la figura. 3. Agregar 3 gotas de lugol a cada tubo

4. Aparecerán diferencias entre los 4 tubos dependiendo de si hay o no almidón en el medio. Recuerda: reacción positiva de reconocimiento de almidon es una coloración violeta, hay almidón. Reacción negativa, no cambia color, no hay almidón.

En la actividad enzimática, el almidón se degrada por lo que la coloración con lugol es de menor intensidad.

Nota: Para ayudarte y formar más saliva, piensa en un limón o en algo que te apetezca mucho comer... Así favoreces que se forme más saliva.

DESARROLLO 1.-¿En qué parte de las células encontramos la enzima catalasa y cuál es la función de dicha enzima?. ____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

2.- ¿Qué factores, además de la temperatura, podrían afectar la actividad de una enzima?. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________ 3.- ¿Cómo se clasifican las enzimas?.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________

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. Dibuje las reacciones observadas en la práctica.

ACTIVIDAD DE CATALASA

Anote sus observaciones y Relacione la actividad con la concentración de la enzima ________________________ ________________________

________________________

ACTIVIDAD DE AMILASA

Anote sus observaciones y Defina control de reacción y temperatura óptima

________________________

__________________________

__________________________

__________________________

__________________________


PROFESOR

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PRACTICA II-2 (SEMANA 9) METABOLISMO ANAEROBIO: FERMENTACIÓN

ALCOHÓLICA

I. FUNDAMENTO

La respiración celular es el proceso mediante el cual se oxidan moléculas energéticas (glucosa,

principalmente), empleando al oxígeno como aceptor final de electrones, y obteniendo gran cantidad de

energía para la realización de las funciones celulares básicas. La fermentación, por el contrario, es un proceso anaeróbio que implica la ruptura de alimentos por

un proceso de degradación química que no requiere oxígeno. Los al imentos no son degradados

completamente hasta CO2 y H2O (como ocurre en la respiración), sino hasta compuestos intermedios tales como ácido láctico (fermentación láctica) o alcohol (fermentación alcohólica). Esta ruptura

incompleta de los alimentos significa que menos energía es disponible durante la fermentación que el liberado durante la respiración.

Ambos procesos pueden tomar lugar en las células a la vez. Además, los primeros pasos en la

ruptura de la glucosa en la respiración, son anaeróbicos. Anaeróbica

Glucosa Ácido láctico

Aeróbica Glucosa CO2 + H2O

Ciertas bacterias y hongos derivan todo sino parte de su energía de la fermentación y los

productos finales son frecuentemente el alcohol y CO2, el proceso en este caso es denominado fermentación alcohólica. Las levaduras y bacterias, las cuales conducen a la fermentación son capaces de emplear sus sistemas enzimáticos para liberar energía anaeróbicamente a partir de carbohidratos,

particularmente almidón y azúcar.

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II. OBJETIVOS

2.1 Comprobar que ante la presencia de oxígeno, el azúcar es oxidado hasta CO2 y agua.

2.2 Comprobar que en ausencia de oxígeno, el azúcar es convertido en etanol y CO2 por las levaduras, mediante el proceso de fermentación alcohólica.

2.3 Comparar cualitativamente un proceso fermentativo vs. Respiración.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio -Tubos de ensayos -Reactivo de Fehling A y B

- Gradillas - Baño Maria - Probetas -Algodón -Tiras de medidas de pH -Dicromato de potasio -Soluciones al 2% de fructosa, glucosa, almidón y sacarosa

-Acido sulfúrico diluido Material de estudio:

- Levadura - Globos No. 5 para generar la aneerobiosis -

IV. MÉTODOS

Fermentación alcohólica 1. Preparar los tubos como lo indica la tabla:

REACTIVO 1 2 3 4 5 6

Agua Destilada .... .... .... ..... .... ....

Sol. de levadura 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL

Solución de Glucosa 5mL

Sol. Sacarosa 5mL

Sol. Almidón 5mL

Sol. Fructosa 5mL

Sol. Glucosa 5mL

2. La muestra con glucosa sola nos servirá para realizar la reacción de Fehling y comprobar que es glucosa por su poder reductor.

3. Para colocar la levadura en el tubo, previamente se tiene que disolver la levadura

(Sacharomyces cerevisae) en un poco de agua. 4. Llenar los tubos cuidando que no queden burbujas de aire, para conseguir un ambiente de

anaerobiosis. Colocar un globo en la boca de los tubos para que el sistema quede cerrado

herméticamente. 5. Llevar todos los tubos a 37ºC por 30 min. 6. Anotar la formación de CO2 para cada tubo (La fermentación se evidenciará por la presencia de

burbujas en el tubo y el globo hinchando, debido a la producción de CO2. 7. Detectar la presencia de glucosa aplicando reactivo de Fehling A y B, llevando a Baño Maria por

8 minutos

8. Medir el pH del medio. 9. Opcionalmente, el profesor del grupo detectará cuidadosamente la presencia de etanol en las

muestras. Hay que tener mucho cuidado porque hay que manipular Ácido sulfúrico y puede ser

peligroso el manejarlo. Se tomarán 2 ml. de la solución del tubo herméticamente cerrado y la ponemos en otro tubo de ensayo. Añadimos unos cristalitos de dicromato potásico y a continuación 2 ml. de acido sulfúrico diluido. Al calentar al baño María debe formarse un

compuesto aromático característico, y se pone de manifiesto porque cambia de color de amarillento a verdoso. Es una reacción que nos indica que existe etanol.

10. Observar, comparar y discutir los resultados de los experimentos planteados.

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DESARROLLO

1.- Complete el dibujo y la tabla.

Observaciones y/o Conclusiones: _____________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CO2

glucosa

pH

etanol


PROFESOR

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PRACTICA II-3 (SEMANA 11)

DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS

I. FUNDAMENTO

El ciclo celular es un proceso que consiste en la replicación de material genético y formación de células hijas. Compromete dos etapas: La primera llamada interfase, donde no ocurre división celular

propiamente dicha y la segunda de división celular (ver figura). Dependiendo del tipo de células donde se lleve a cabo, la división celular toma el nombre de Mitosis (si ocurre en células somáticas) o Meiosis (si ocurre en células germinales).

La mitosis implica cuatro etapas: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. En las dos primeras ocurre la condensación y ordenamiento de los

cromosomas y en las dos últimas se lleva a cabo la distribución de los cromosomas. El resultado final son dos células hijas diploides (2n).

II. OBJETIVOS

Reconocer las distintas fases del ciclo celular en células somáticas de raíz de cebolla.

III. MATERIALES


- Placa Petri - Orceína acética - Pinza de madera - Microscopio - Mechero de alcohol - Acido Acético

- Etanol

Material de estudio:

Ápices frescos de raíces de cebolla

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IV. PROCEDIMIENTO

Con 8 días de anticipación a la práctica preparar el cultivo de cebolla de la siguiente manera: En un vaso con agua, de preferencia de borde oscuro, colocar una cebolla mediana de tal manera que haga contacto la parte terminal de la cebolla con el agua y dejar en lugar semioscuro.

Preparación de la Muestra

1 Disponer de gran número de raíces de cebolla, haciendo cortes de la parte terminal

(aproximadamente de 0.5cm.) y depositar en una placa Petri. 2 Colorear con orceína por 10 minutos: contiene orceína A que interrumpe el proceso si se está dando

en ese momento y reblandece la unión de las células muertas, así como orceína B que tiñe la

cromatina o material hereditario. 3 Luego calentar la muestra sólo hasta que emane vapores por 2 veces consecutivas con intervalos de

enfriamiento.

4 Trasladar las raíces a diferentes portaobjetos, separar solo el ápice (parte terminal de la raíz) y agregar una gotita de orceína y cubrir con el cubreobjeto.

5 Apretar la muestra suavemente con la yema de los dedos.

6 Secar el exceso de colorante con papel secante y llevar al microscopio para su observación a menor y mayor aumento.

Interfase Profase Temprana Profase Tardía Metafase Anafase Temprana

Anafase Tardía Telofase Temprana Telofase Tardía Citocinesis

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DESARROLLO

1.- Dibuje las muestras observadas.









PROFESOR

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PRÁCTICA II-4 (SEMANA 12)

FECUNDACIÓN

I. FUNDAMENTO

La fecundación es el proceso de unión del óvulo y el espermatozoide, y en virtud de la cual se origina el cigoto o célula huevo. La fecundación en la especie humana es interna, pues se lleva a cabo en el interior del aparato reproductor de la hembra, concretamente en las trompas de Falopio.

En esta práctica se observará el proceso de fecundación entre un gameto masculino (espermatozoides) y un gameto femenino (ovulo), de erizo de mar. Se podrán observar los gametos o Células reproductoras masculina y femenina, cuyo núcleo sólo contiene uno de cada par de cromosomas

homologos en una célula somática. El óvulo es una célula redonda de gran tamaño. Posee un núcleo donde se alojan los

cromosomas portadores de la información genética materna, y un c itoplasma que posee sustancias nutritivas para alimentar al embrión en sus primeras etapas, en el caso de que ocurra la fecundación.

El espermatozoide, o gameto masculino, es una célula pequeña con capacidad de movimiento para poder alcanzar al óvulo.

Según donde se encuentren el espermatozoide y el óvulo, existen dos tipos de fecundación:

a) Fecundación EXTERNA, cuando tanto el macho como la hembra liberan sus gametos al medio externo, que es el agua, de manera que los espermatozoides nadan en el agua hasta encontrar a los

óvulos. Es lo típico de todos los animales invertebrados acuáticos, y en los vertebrados se da en los peces y en los anfibios.

b) Fecundación INTERNA, cuando el macho deposita sus espermatozoides en el interior de la hembra, y se mueven por el organismo de la hembra hasta encontrar al óvulo. En el erizo de mar no hay dimorfismo sexual de modo que externamente no se les puede diferenciar a las hembras de los

machos. Las gónadas femeninas son de color rojo vinoso y las gónadas masculinas son de color

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amarillo grisáceo. En ambos casos se encuentran en las zonas interambulacrales (celoma) ubicado en el interior del hemisferio superior. A través de las glándulas genitales (5), las gónadas se comunican al exterior mediante el poro genital, por donde son derramados los huevos. La

fecundación es externa porque los gametos se encuentran fuera de la cavidad genital y el óvulo se fecunda externamente.

II. OBJETIVOS

- Identificar gametos masculinos y femeninos en erizo de mar.

- Evidenciar el proceso de la fecundación.

III. MATERIALES


- Microscopio - Placa Petri - Pipeta - Bagueta Traer el alumno - Portaobjetos

- Cubreobjetos - Goteros - Materiales de disección: tijera, pinza,estilete.

Material de estudio: - Erizos de mar VIVOS en baldes con tapa y con agua de mar

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Obtención de Óvulos y Espermatozoides

1. Usando el material de disección, cortar las púas del erizo a nivel del ecuador todo el contorno radial e introducir la punta de la tijera para perforar y cortar transversalmente el caparazón por la zona cortical, obteniendo 2 mitades: el aboral y el ventral; en el aboral (lado superior) en las placas

interradiales (5) del celoma es donde se encuentra las gónadas en sus respectivas masas genitales de color crema para los MACHOS y rojo vinoso para las HEMBRAS.

2. Luego echar las gónadas en un petri con agua de mar y con la ayuda de una bagueta se trozan los ovarios para liberar los óvulos. En otro cristalizador, se hacen exactamente lo mismo con los testículos

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4.2. Montaje y observación de gametos

1. Colocar en un portaobjeto, una gota de la muestra con óvulos y observar su forma y color 2. Colocar en un portaobjeto, una gota de la muestra con espermatozoides y observar su forma, tamaño,

flagelo, etc.

3. Después de observar esta preparación coloque una gota del colorante cristal violeta sobre los

gametos masculinos y observe nuevamente

4. Observar a mayor aumento ambos gametos.

4.3 Fecundación 1. De las muestras obtenidas, coloque en un portaobjeto una gota con óvulos y otra con

espermatozoides y mezclar. 2. Observar a mayor y menor aumento

3. Observar con detenimiento los cambios que sufre el óvulo una vez fecundado.

DESARROLLO

1. Dibuje y coloree las distintas muestras observadas en la práctica. Mencionando el aumento total.






PROFESOR

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PRACTICA III-1 (SEMANA 13)

PRIMERA PARTE: EXTRACCIÓN DE ADN

I. FUNDAMENTO

El ADN es un polímero de desoxiribonucleótidos, que en eucariotes es el componente de la cromatina o material genético. En la cromatina el ADN se encuentra asociado a proteínas conocidas como nucleoproteínas de tipo histonas, protaminas y en menor proporción con proteínas de tipo ácidas.

Para extraer el ADN sin arrastrar sus proteínas asociadas se podría emplear soluciones ácidas. Sin embargo, éstas soluciones podrían dañar la estructura de la hebra, de modo que se prefiere emplear

solventes orgánicos como cloroformo, el cual extrae proteínas dejando insoluble al ADN.

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son

atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene

ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción.

Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más

pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de es a mezcla de tampón y detergente.

La secuencia general de extracción es la siguiente:

1 Liberación del ADN en forma soluble por medio de la destrucción de los sistemas membranosos de los tejidos (membrana celular y nuclear).

2 Separación de los complejos de nucleoproteína por denaturación de la parte proteica. 3 Separación del ADN de las otras macromoléculas por solubilidad diferencial. 4 Precipitación del ADN por insolubilidad en alcohol y bajas temperaturas.

II. OBJETIVOS

1 El objetivo fundamental de esta práctica es utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN

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de un tejido animal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar. 2 A partir de la longitud enorme de las fibras también se confirma que en el núcleo el ADN se encuentra

replegado.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio:

- 2 Tubos de prueba de 20 ml - Vaso de precipitación de 500ml. - Baguetas - 1 embudo - Etanol helado - Baño María

- 5 Pipetas de 10ml - Mortero con pilón - Gasa esteril - Hielo

- Medio de homogenización: - Lauril Sulfato de Sodio (SDS) 50 g - Cloruro de Sodio 8. 770 g

- Citrato de Sodio 4.110 g - EDTA 0.292 g

Material de estudio: Choros frescos o Hígado fresco de pollo

IV. PROCEDIMIENTO

Para la extracción DE ADN del manto de choro, con etanol, seguiremos los siguientes pasos.

4.1. Homogenización del Tejido

El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para

grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un MORTERO y un pilón.

Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos

especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un

mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de enzimas endógenas que pudieran degradar el

material de interés.

En esta práctica se empleará un método de ruptura con mortero (sin congelamiento). La principal ventaja de este método es que se adapta bastante bien a tejidos muy diversos. Asimismo, dado que se opera a temperatura ambiente, las ribonucleasas celulares pueden degradar parcialmente las moléculas

de ARN. Para ayudar a la solubilización de los componentes celulares, a la ruptura de membranas y de complejos protéicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecilsulfato de sodio, SDS).

Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas.

La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes, EDTA. Esto

impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg2+ ), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte

de las ribonucleasas.

Seguir los siguientes pasos:

1 Las células se homogenizarán en un mortero empleando el medio de homogenización. ES

OBLIGATORIO el uso de guantes en todo momento para evitar la contaminación de la muestra con DNAasa proveniente del sudor de las manos que pueda degradar nuestras muestras de ADN.

2 Se lisarán las células agregando 10 ml de la solución de homogenización por cada gramo de tejido

con que se inició el proceso. Los componentes como el SDS, permitirá por una parte la separación de las proteínas asociadas a la cromatina y por otra parte la ruptura de membranas. El NaCl produce el

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estallido de los núcleos para liberar así las fibras de cromatina. El EDTA es un agente quelante que inactiva a las DNAasas.

3 Incubar la mezcla en un Baño María a 60°C por 15 minutos exactos. El calor ablandará el tejido

permitiendo que los componentes de la solución homogenizadora ingrese a la célula. Además, esta temperatura denatura muchas enzimas que interfieren con el procedimiento.

4 Filtrar el homogenizado empleando la gasa esteril

5 Enfriar rápidamente la preparación filtrada en una cubeta con hielo, por 10 minutos a fin de detener cualquier proceso degradativo del ADN.

4.2. Precipitación del ADN

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas y deshidratación de la molécula, lo cual posibilita su

agregación y precipitación.

La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la resuspensión en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación

(irreversible) de los mismos.

Efectuar los siguientes pasos:

1 Lentamente, agregar etanol helado por el borde interno del recipiente hasta que comience a aparecer una consistencia blanca que significa que el ADN ha precipitado.

2 Suavemente, a medida que se agrega el etanol helado, girar enrollando a la vez con una bagueta de

vidrio. 3 Reconoce 3 fases en tu solución: la del alcohol (que flota en agua), la de tu tejido triturado (abajo del

todo) y la interfase entre los 2 que contiene ADN precipitado.

4 Poco a poco haciendo estos movimientos en una sola dirección, se logrará apreciar el ADN en la bagueta, asemejando una madeja de un hilo sumamente fino o como copos de algodón.

Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción especifica se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN (protocolos de PURIFICACIÓN de ADN).

SEGUNTA PARTE: ELECTROFORESIS

I. FUNDAMENTO

El problema de realizar separaciones de biomoléculas grandes es enfrentado frecuentemente en

las ciencias de la vida, tanto para análisis cuali- como cuantitativos de mezclas o de preparaciones individuales. En la mayoría de casos es deseable causar el mínimo de daño a las moléculas de manera

que sus propiedades no cambien de manera significativa. Los métodos actuales para la separación de biomoléculas descansan por lo tanto en procesos físicos que causan el mínimo de desnaturalización, lo cual resulta en la máxima retención de cualquier actividad biológica. Un gran grupo de métodos de

separación están basados en algunas propiedades químicas o biológicas, o en interacciones de la molécula que se investiga, y algunas otras están basadas en diferencias en pesos moleculares o cargas

netas, o a veces una combinación de las dos propiedades. Los métodos electroforéticos pueden diseñar se para explotar cualquiera de los dos, o ambos parámetros, aunque las diferencias en tamaño son las principales en el caso de las separaciones de ácidos nucleicos.

La electroforesis en geles de agarosa es una técnica común en los laboratorios de Biología Molecular. El proceso consiste en la aplicación de una diferencia de voltaje a una muestra de ADN que se encuentra inmersa en un gel de agarosa, y esta a su vez en bañada por un buffer determinado. La

generación de polos opuestos provoca la migración del ADN del polo cargado negativamente (Cátodo) al polo cargado positivamente (Anodo), debido a que el ADN tiene una carga neta negativa.

Los geles de agarosa son el medio más popular para separaciones electroforéticas de ácidos

nucleicos de mediano y gran tamaño. Las concentraciones más típicas de agarosa van de 0.3 hasta 2.5

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%, y esta concentración depende de los tamaños de los ácidos nucleicos a separar. Aunque los geles de agarosa carecen de fuerza mecánica (especialmente los más diluidos), la manipulación se facilita por el uso de geles horizontales, los cuales pueden ser soportados por lámina de vidrio o de plástico

El gel resultante es fotografiado en un aparato llamado transiluminador, presencia de bromuro de

etidio, para poner en evidencia los fragmentos de ADN en el gel. En la presente práctica analizaremos la fotografía de un gel de agarosa y observaremos las distintas bandas de ADN que en él aparecen,

discutiendo la razón por las que unas aparecen más arriba que otras. Realizaremos un análisis como el que se hace en ensayos de diagnóstico molecular y de clonación.

II. OBJETIVOS

-Comprobar la movilidad del ADN en un gel de agarosa

-Analizar la utilidad de esta técnica en ensayos de biología molecular aplicada

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Analizaremos la siguiente Lámina de un gel de agarosa y discutiremos cuál es el significado y la interpretación de esas bandas en el gel.

DESARROLLO

1.- Dibuje sus resultados

2.-Discuta y resuelva los siguientes enunciados

M 1 2

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En el gel aparecen 3 carriles o calles, cada uno con una muestra distinta (M, 1 y 2). Los pocillos son hechos en el gel para introducir ahí la muestra de ADN.

1 ¿qué hay en el primer carril? ______________________________________________________________________ ______________ 2 en la muestra 1, qué tamaño aproximado tienen las bandas de ADN?

_______________________________________________________________________________ 3 ¿por qué aparece RNA en algunas nuestras y por qué aparece tan abajo, comparado al ADN? _______________________________________________________________________________

4 ¿qué significado tiene que algunas bandas sean más gruesas que otras? _______________________________________________________________________________ 5 ¿qué hubiera esperado encontrar si corría un gel con su ADN recién extraído? Dibujelo.

______________________________________________________ ______________________________________________________

______________________________________________________

______________________________________________________


PROFESOR

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PRACTICA III-2 (SEMANA 14) CÓDIGO GENÉTICO Y TRADUCCIÓN DE PROTEÍNAS

I. FUNDAMENTO

El proceso de traducción, es decir, síntesis de novo de proteínas, ocurre en el citoplasma y en el

retículo endoplasmatico realizada por los ribosomas (en humanos). La síntesis de una proteína requiere que previamente el ARNm de ese gen haya sido transcrito en el núcleo y exportado al citoplasma. Aquí el ARNm, que contiene la información genética necesaria para codificar la proteína, se asociará a los

ribosomas del RER y con la intervención de una compleja maquinaria proteica así como de los ARNt específicos para cada aminoácido, se llevará a cabo la traducción.

El ARNm porta los codones, tripletes de nucleótidos, que codifican para un aminoácido. Mientras

que los ARNt portan los anticodones, que le indican qué aminoácido van a portar y llevar hasta el

complejo ARNm-ribosomas-enzimas. El código genético es la combinación de tripletes que tienen la información necesaria para codificar un aminoácido. Existen 64 codones en el código genético, que codifican para los 20 aminoácidos que forman las proteínas y que además contiene 1 codón de inicio de

la traducción y 3 codones de finalización de la misma. En esta práctica analizaremos la degeneración del código genético, discutiremos por qué no es

realmente universal y realizaremos la traducción de algunos genes en sus respectivas secuencias de aminoácidos.

II. OBJETIVOS - Reconocer los codones y anticodones posibles para los aminoácidos que forman las proteínas.

- Analizar posibles mutaciones en los codones que alteren la secuencia de una proteína y con ello su función.

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III. MATERIALES

- Lámina de la tabla del Código Genético - Lámina de la tabla de las alteraciones del Código Genético en mitocondrias y otros organismos.

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IV. MÉTODOS 4.1. Antes de solucionar los problemas planteados, determine:

a. número de codones de inicio ____________________________ b. número de codones de finalización _______________________ c. aminoácidos codificados por 1 sólo codón __________________

d. aminoácidos codificados por 2 codones ____________________ e. aminoácidos codificados por más de 3 codones ____________________________ f. ¿qué cambios se han producido en el código genético de mitocondrias en humanos?

____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ g. Lista de aminoácidos esenciales y no esenciales

____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

4.2. Discuta con su profesor y responda: ¿Por qué algunos aminoácidos son codificados por 1 sólo codón mientras que otros son codificados por

2 o más codones? ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

4.3- Complete:

4.3. Los siguientes problemas deberán ser solucionados en clase con ayuda del profesor:

Primer problema: Transcripción y traducción Se tiene la siguiente secuencia de ADN (cadena codante) que es parte del gen de

transferrina. 5´ ATGGCATCCTACGATCAGTATCCTATACGC 3´ ……… (EL GEN CONTINÚA)

Determine:

1. la secuencia no codante del respectivo trozo del gen ___________________________________________________________________________________

2. la secuencia del ARNm respectivo, transcrito a partir del trozo de dicho gen ___________________________________________________________________________________

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3. Utilizando la tabla del código genético, deduzca la secuencia de aminoácidos que codificará dicha

cadena (considerando que se incubó el ADN en un extracto crudo de células de reticulocitos de

conejo que contenía los respectivo ARNt, enzimas, ATP, GTP, etc.) ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________

Segundo problema. Mutaciones en la secuencia de nucleótidos

La secuencia de ADN del gen de transferrina, del problema 1, ha sufrido mutaciones por el efecto de radiaciones UV. Se secuenció el gen mutado y la secuencia obtenida fue la siguiente:

5´ ATGGCATCGTACGAACAGTAGCCTATACGC 3´ ………..(EL GEN CONTINÚA) Determine:

1. la secuencia del ARNm respectivo, transcrito a partir del trozo de dicho gen ____________________________________________________________________________________

2. la secuencia de aminoácidos que, tras esas mutaciones, se codifica ____________________________________________________________________________________

3. qué mutaciones han sido conservativas y cuales no. ____________________________________________________________________________________

Tercer problema. Traducción en mitocondrias

Se cuenta con parte de la secuencia del gen de la proteína de Fe-S, que participa en la cadena transportadora de electrones en la mitocondria, y que es codificada dentro de la misma. La secuencia es de la cadena de ADN codante:

……. 5´ CCGTGAGAACTCGAAGCTCCGGACA TAGCT 3´ …… Determine:

1. la secuencia de aminoácidos codificada en la mitocondria, a partir de dicha cadena nucleotídica __________________________________________________________________

2. ¿cuál serían los aminoácidos cambiados si dicho gen se codificara en el citoplasma? __________________________________________________________________

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PRACTICA III-3 (SEMANA 15)

ESTUDIO DE RASGOS GENÉTICOS EN EL

HOMBRE

I. FUNDAMENTO

Las características de un organismo son el resultado de la herencia y de la interacción de los

genes. Los principios de la genética establecidos por Mendel y Morgan y otros investigadores se aplican a todos los organismos vivientes, incluido el hombre.

De la misma manera que en otros, algunos rasgos humanos son determinados por genes dominantes y otros por genes recesivos. Lo rasgos dominantes generalmente se encuentran con mayor frecuencia que los que se deben a genes recesivos. En la transmisión de la mayoría de los caracteres

hereditarios, están involucrados varios genes, pero a menudo la variación de un solo gen, produce la variación de una sola característica lo que da lugar a dos formas distintas de expresión.

Algunos genes (y su manifestación) están ligados al sexo, es decir que la característica respectiva sólo se expresa en uno de los sexos. Frecuentemente el masculino (hemofilia por ejemplo). En este caso el gen en cuestión se encuentra localizado en el cromosoma X (el cromosoma Y se considera

“genéticamente vacío”). En otros casos la manifestación genotípica es influenciada por el otro sexo (p.e. calvicie, es dominante en el varón y recesivo en la mujer).

En este caso los genes respectivos están localizados en un cromosoma autosómico, pero su expresión esta condicionada a la acción secundaria de genes ubicados en el cromosoma X.

II. OBJETIVOS

1. Determinar el fenotipo (expresión de las características) y su probable genotipo (Información genética en el cromosoma respectivo) tanto como sea posible.

2. Estimar la distribución de los genes dominantes y recesivos para cada rasgo genético observado en el

grupo.

III. MATERIAL Deberás traer de casa.

-Espejo -Lupa

IV. PROCEDIMIENTO

1. Con la ayuda de un espejo o de un compañero determine un fenotipo para cada uno de los rasgos

genéticos descritos a continuación. Haga sus anotaciones en su cuaderno de trabajo.

2. Cuando se trata de una característica dominante, no es posible determinar con certeza el genotipo, pues pueden estar presentes dos genes dominantes para esta característica (homocigosis) o un gen dominante y uno recesivo (heterocigosis). En consecuencia utilizaremos un guión (-) para representar

el alelo desconocido. En cuanto al carácter recesivo, no hay dificultad en establecer el genotipo, los dos genes alelomórficos son recesivos. Anote su genotipo en la hoja de trabajo.

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3. Tabule en la hoja de trabajo el número de alumnos con cada rasgo genético estudiado DONDE SE INCLUYA: rasgo estudiado, genes involucrados, dominancia o recesión, estado del gen expresado (homocigoto o heterocigoto), etc.

RASGOS GENETICOS A SER ESTUDIADOS

INDEPENDIENTES DEL SEXO

1. Enrollar la lengua: algunas personas tienen la aptitud de enrollar la lengua en forma de U. Esto es causado por un gen dominante (E). La gente que no posee este gen sólo puede curvar la lengua ligeramente hacia abajo.

2. Lóbulos separados: un gen dominante (L) determina que los lóbulos de la oreja estén separados, es

decir que no estén adheridos directamente a la cabeza. En otras personas los lóbulos de las orejas

están adheridos directamente al costado de la cabeza. 3. Pico de viuda: algunas personas muestran la característica de que la línea de pelo baja hasta un

punto definido en la mitad de la frente. Esto se conoce como “pico de viuda”, este rasgo resulta de un gen dominante (V). El gen recesivo determina la característica de una línea continúa en el pelo.

4. Meñique doblado hacia adentro: Un gen dominante (B) hace que la última falange del meñique se flexione hacia el dedo anular. Descanse ambas manos tendidas sobre la mesa, relaje los músculos y observe si su meñique está flexionado o recto.

5. Iris pigmentado: Cuando una persona es homocigota para cierto gen recesivo (p) no hay pigmento en

la parte anterior de los ojos y en cambio se muestra una capa azul detrás del iris. Esto determina que

los ojos sean azules. Un alelo dominante de este gen (P) hace que el pigmento se deposite en la capa anterior del iris y enmascara el color azul en grado variable. Otros genes determinan la naturaleza y densidad exactas de este pigmento, originando los ojos pardos, violeta, verde y otros

colores. Nota: Algunas veces la capa detrás del iris es gris y esto deberá considerarse como no pigmentado.

6. Pelo de la falange media: algunas personas tienen pelo en la segunda falange de la mano mientras otras personas no. La ausencia completa del pelo en todo, se debe a un gen recesivo (m) y su presencia se debe a su alelo dominante (M). Parece que hay un número variable de es tos alelos que

determinan si el pelo debe crecer en uno, dos, tres o cuatro dedos. Este pelo puede ser muy fino y será necesario usar una lupa y mirar cuidadosamente en todos los dedos, antes de decidir si está ausente en alguno de los dedos.

7. Músculo palmar largo: Cuando una persona es homocigota para cierto gen recesivo (l), presenta un

músculo palmar largo, el cual puede ser detectado examinando los tendones que corren en la cara

interna del antebrazo (altura de la muñeca) cierre el puño fuertemente y doble la mano hacia delante. Palpe los tendones. Si hay tres, usted tiene el músculo palmar largo. Si solo hay dos (el medial más grande no existe) usted no tiene este músculo. Examine ambas muñecas pues a veces está presente

en un brazo y no en el otro, a causa de las variaciones en la expresión de los genes. Si lo encuentra en uno o ambos brazos, posee dos genes recesivos. Si no está presente en ambas muñecas tiene el gen dominante (L).

8. Forma del cabello: la forma natural del cabello de una persona puede ser lacia, ondulada o crespa,

con variantes intermedias. El mecanismo por el cual se origina la forma del cabello es algo complejo,

pero puede asumirse que los responsables de esta característica son un par de genes con dominancia incompleta. Asumiendo que la forma de su cabello no ha sido modificada por tratamiento artificial, anote el genotipo respectivo según el siguiente código:

CC= cabello crespo Cc= cabello ondulado

cc= cabello lacio. 9. Pulgar desarticulable: algunas personas tienen la habilidad de desarticular las falanges de sus dedos

pulgares, a causa de que los ligamentos de esta articulación son sumamente flojos, característica que

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es dominante sobre ligamentos firmes. Esta circunstancia permite retirar el dedo pulgar hacia atrás sacándolo de su articulación. Ensaye la posibilidad de desarticular el pulgar de cualquiera de sus manos SIN ayuda de la otra mano e identifique su genotipo respectivo así: JJ o Jj = pulgar

desarticulable jj = pulgar no desarticulable. 10. Color del cabello: el color del cabello es determinado por la interacción de un gran número de

factores; sin embargo, si consideramos solo las mayores categorías de color capilar, estas pueden explicarse por la interacción de dos pares de genes (herencia dihibrida): (D_) pigmento pardo presente, (dd) pigmento pardo ausente, (rr) pigmento rojo presente. De acuerdo con la ley de la

distribución independiente, un individuo cualquiera puede tener alguna de las siguientes combinaciones de genes y color:

DDRR, DDRr, DdRR : cabello oscuro (negro) DdRr, Ddrr, DDrr : cabello castaño u oscuro con tintes rojizos ddRr : cabello rubio

Dr. : cabello claro (color arena)

INFLUENCIADOS POR EL SEXO 11. Segundo dedo más corto que el cuarto: mantenga sus dedos juntos y ponga sus manos sobre una

hoja de papel, de modo que sus dedos descansen en ángulo recto con una línea horizontal, que usted ha trazado antes sobre el papel. Mueva su mano hacia arriba o hacia abajo hasta que el extremo del cuarto dedo (anular) toque escasamente la línea. Mire su segundo dedo (Indice) y vea si

toca la línea.si no lo hace el segundo dedo es más corto que el cuarto. Se cree que este segundo dedo más corto es el resultado de un gen influenciado por el sexo del individuo. Según esto el gen es dominante en lo varones y recesivo en las mujeres. Sc para el gen correspondiente al segundo dedo

corto Sl para el gen correspondiente para el segundo dedo largo. 12. Voz para el canto: el tono de la voz para el canto es determinado por un solo par de alelos V y v que

muestran dominancia incompleta y están influenciados por el sexo. Clasifique su voz par el canto según el siguiente cuadro:

Genotipos Fenotipos Varón Mujer

VV Bajo Contraalto Vv Barítono Meso soprano vv Tenor Soprano

13. Calvicie: esta es otra característica influenciada por el sexo y es controlada también por un par de

alelos. Aunque esta característica no suele manifestarse antes de los 30 años, sus posibilidades

personales de calvicie pueden presumirse por la presencia o ausencia de esta característica entre los miembros mayores de su familia tanto por la línea materna o paterna. Establezca su probable genotipo guiándose por el siguiente cuadro:

Genotipos Fenotipos

Varón Mujer

HH calvo calva Hh calvo normal

hh normal normal

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LIGADOS AL SEXO

14. Ceguera para el color (daltonismo): tipo más común de daltonismo es heredado como carácter recesivo ligado al sexo. Puesto que el gen es portado solamente por el cromosoma X es necesario indicar el cromosoma al especificar el genotipo. Son posible genotipos y fenotipos:

Fenotipos Genotipos

Mujer Varón

Normal XNXn XNY

Daltónico XnXn XnY

DESARROLLO

NOMBRE:______________________________ GRUPO:___________ MESA:___________ FECHA:_________

PROFESOR:_____________________________

1.- Anote su genotipo y fenotipo de cada característica evaluada.

biología celular guia practicas 2015-ii

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