Biología Celular y Molecular1ª Unidad Académica Departamento de Histologia, Biología Celular,

Embriología y Genética

Taller 4

1-Los pacientes con xerodema pigmentoso sufren una incidencia altísima de cáncer de piel aunque no se ha encontrado la misma incidencia en cánceres de órganos internos (por ej. cáncer de colon). ¿Qué sugiere esto acerca de los daños del ADN responsable de la mayoría de los cánceres internos?

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2- EL CILIO PRIMARIO: CENSOR DEL MEDIO EXTRACELULAR Y CENTRO DE VÍAS DE SEÑALIZACIÓN

Introducción: Nuestra comprensión de la función del cilio primario ha cambiado sustancialmente en la última década. De ser una estructura ignorada y considerada vestigial ha pasado a ser una organela de importancia creciente por la información que brinda a la célula sobre medio extracelular y como receptor de señales. Hoy contamos con evidencias firmes sobre su papel en la organogénesis y también en la homeostasis de órganos del adulto. A diferencia de los cilios que se encuentran en el epitelio de la vía respiratoria y en las trompas de Falopio, el cilio primario es único e inmóvil y está presente en casi todas las células de los vertebrados. Por sus múltiples funciones receptoras ha merecido el mote de “antena” de la célula.Hemos aprendido mucho de su función a partir de estudiar las patologías producidas cuando está alterado o ausente. Entre otras, está involucrado en enfermedades como la poliquistosis renal, la polidactilia que es presencia de dedos extras en manos y pies, en algunos tipos de sordera y ceguera y en un grupo de las displasias esqueléticas conocidas como Costillas Cortas-Polidactilia. Otros síndromes genéticos producidos por el mal funcionamiento del cilio primario son el síndrome de Joubert, Oro-Facio-Digital tipo I, Sensembrener, Meckel-Gruber y Bardet Biedl. A todas estas patologías se las ha englobado bajo nombre de “ciliopatías”.

La estructura del cilio primario La estructura central del cilio primario es un axonema de nueve pares de microtúbulos que están anclados en un cuerpo basal formado por un centríolo y constituido por nueve microtúbulos triples. El cuerpo basal, mediante apéndices laterales, se pone en contacto con los microtúbulos citoplásmicos. A diferencia de los cilios móviles o secundarios, el cilio primario carece del par de central de microtúbulos por lo cual se dice que su estructura es 9+0. Tampoco posee brazos de dineína. Mide desde pocas μm hasta 100 μm dependiendo del tipo celular y protruye hacia el espacio extracelular cubierto por la membrana plasmática. En cada ciclo celular, el cilio primario aparece al comienzo de G1 y se desensambla antes de cada mitosis.

El crecimiento del axonema se lleva a cabo mediante un proceso de transporte intraflegelar (IFT) y este determina el largo final del cilio. Este transporte lleva una carga diversa hacia el extremo del cilio y también en sentido retrógrado mediante complejos IFT unido a las proteínas motoras quinesina 2 y la dineína citoplasmática 1B.

Circundante al cilio existe una zona de delimitada del citoplasma que funciona como barrera selectiva para el tráfico de proteínas llamada zona de transición. Un esquema con la estructura del cilio primario se muestra en la figura 1.

Figura 1: Esquema de la estructura del cilio primario. El axonema del cilio primario tiene 9 pares de microtúbulos, cerece del par central, y está anclado en el cuerpo basal y tiene relación con el centrosoma. Los apéndices laterales lo conectan con los microtúbulos citoplásmicos. La membrana que cubre al cilio es muy especializada y está en continuidad con la membrana plasmática.

Las funciones del cilio primario Una de las principales funciones del cilio primario es censar el ambiente extracelular. Como ejemplo de organela sensorial las células ciliadas de la retina y del bulbo olfatorio reciben y transmiten el estímulo de la luz y de los olores, respectivamente. Mas recientemente se comprobó que permite censar químicos, la osmolaridad, la temperatura y la gravedad (Satir, Pedersen, y Christensen 2010). También participa en la migración y colocación de interneuronas corticales y en la formación de algunos tipos de memoria (Einstein et al. 2010). La membrana que engloba al cilio primario es altamente especializada y posee receptores para Shh (Sonic hedghog), Pdgf (Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas), serotonina y somatostatina (SST3). Esto hace que el cilio primario actúe como un centro de señalización para moléculas que se encuentran en el medio extracelular. En el cuerpo basal del cilio se encuentran proteínas especializadas que median esa información como Smoothened (Smo), Patched (Pth), NEK1 y varios complejos de proteínas asociados a microtúbulos que forman familias como Nphp (nefronoptisis), Invs (inversina) y BBS (síndrome de Bardet Biedl). El complejo BBS,

Núcleo

Centrosoma

Cilio primario

CélulaCuerpo basal

Axonema de microtúblos

Centríolo

Membrana plasmática

9+0

Material pericentriolar

por ejemplo, se encarga de asegurar la colocación de receptores de somatostatina en los complejos de tráfico intraflagelar para ser subidos a la membrana del cilio.

En definitiva, y como resultado de todas las señales que permite transducir, el cilio primario está involucrado en la regulación de procesos como el ciclo celular, la organización del citoesqueleto y el transporte intraflagelar.

Los procesos ciliares y las enfermedades humanas Una propiedad bien conocida del cilio primario es la de ser un mecanoreceptor. En las células epiteliales del riñón censa el flujo urinario y mediante la inclinación en el sentido del flujo induce un proceso que controla del ciclo celular. En los túbulos de la nefrona, la deflexión ciliar es captada por dos proteínas de membrana, Pc1 (Policistina 1) y Pc2 (Policistina 2), que inducen el influjo de calcio hacia el interior de la célula lo que favorece la regulación de la proliferación celular. En ausencia de flujo, o por la falta del cilio mismo, se reduce este influjo produciendo la degradación de Pc1 y la liberación de dos proteínas con las que forma un complejo que son STAT6 y P100. Esta proteínas se translocan al núcleo y activan la transcripción, Se estabiliza Invs, y la β-catenina activa la vía de Wnt canónico que conduce a la desregulación del ciclo celular y la formación de los quistes tubulares. En este proceso contribuye también Wnt no-canónico afectando la polaridad celular y la orientación del huso mitótico. Esta vía también puede ser activada por la ausencia de Pc1 y Pc2. La Poliquistosis Renal Autosómica Recesiva (ARPKD) es una enfermedad por formación de quistes tubulares que comprometen todo el riñón en forma bilateral. Los riñones se ven agrandados de tamaño y no son funcionantes por lo que resulta en una patología letal del desarrollo renal.

Otra propiedad del cilio primario es la de ser un área especializada de la membrana plasmática que concentra receptores moleculares. Una vía de señalización bien conocida mediada por el cilio es la de la familia Hedgehog. Sonic es uno de los ligandos de esa familia en los mamíferos y la señalización se realiza por medio de la secreción de factores de crecimiento. Hoy sabemos que Sonic es crítico durante el desarrollo embrionario y participa en la neurogénesis, la formación de los miembros y de los dedos. En el adulto está asociado al cáncer. El complejo receptor de Sonic hedghog (Shh) está formado por dos proteínas de membrana: Smoothened (Smo) y Patched (Pth). En ausencia de Shh, Ptc reprime a Smo, pero cuando Sonic está presente se liga a Ptc y Smo se libera de la inhibición y activa la transcripción de los genes blancos de esa vía. Lo que ocurre exactamente en el cilio está aún siendo dilucidado. Hay evidencias de que en ausencia de Shh, Pth ocupa la membrana del cilio desalojando a Smo de esa estructura. Entonces, y en razón de que Pth funciona como receptor de Sonic, su presencia hace que el cilio primario sea receptáculo de cualquier secreción de Shh en la vecindad. Cuando Shh se une a Ptc, Ptc abandona la membrana y esto permite en cambio que Smo se acumule allí y ejerza su acción. Se presume que interactúa con la proteínas Gli para promover activadores transcripcionales que van al núcleo. De esto se puede deducir que cualquier mutación que altere el tráfico ciliar también va a producir una disrupción en la señalización de Sonic hedghog. Sabemos Sonic está involucrado en múltiples malformaciones especialmente las del SNC, fisuras faciales, algunos defectos cardíacos y en la aparición de la polidactilia.

Otro aspecto del desarrollo en el que está involucrado el cilio primario es en la esqueletogénesis. Como sabemos, el esqueleto óseo ejerce una fuerza antigravitacional fundamental que permite la locomoción y proteje órganos nobles pero sus alteraciones pueden causar discapacidad y a veces son incompatibles con la vida. Existe un grupo de displasias esqueléticas llamadas Costillas Cortas-Polidactilia que está causado por mutaciones en la maquinaria ciliar principalmente del transporte intraflagelar. Otras son producidas por proteínas que se encuentran en el cuerpo basal y actúan como segundos mensajeros. El transporte intraflagelar depende de los complejos IFT A y B y de las proteínas motoras quinesina 2 y la dineína citoplásmica 1B que se encargan del transporte anterógrado y retrógrado de cargas como los receptores de membrana que son “subidos” al cilio para ser expuestos a sus ligandos. Ya se han identificado alrededor de 10 mutaciones de proteínas ciliares y las más frecuentes son de la dineína citoplásmica 1B (DYNC1B) y las proteínas del complejo IFT (IFT 80), así como también proteínas del cuerpo basal como NEK1, EVC1 y EVC 2. Este grupo de displasias comprende seis entidades con un patrón de herencia autosómico recesivo de las cuales cuatro tienen polidactilia y son invariablemente letales al nacimiento.

Figura 2: Esquema simplificado del funcionamiento del cilio primario.En la membrana se hallan proteínas como Pc1, Pc2 y también otras que actúan de receptores de señales: Pdfgr, SST 3r Ptc y Smo. Los complejos IFT y las proteínas motoras quinesina 2 y dineína citoplásmica 1B son los responsables del transporte intraflagelar. Las proteínas del cuerpo basal actúan como moléculas transmisoras que participan en las diferentes vías de señalización (algunas participan en mas de una vía).

Las ciliopatías y sus rasgos fenotípicos En general se puede decir que las ciliopatías producen una constelación de rasgos fenotípicos por la multiplicidad de roles que cumple el cilio primario. La mayoría de estos los rasgos se superponen en las distintas entidades. Es decir, un mismo defecto ciliar puede tener múltiples expresiones y una misma enfermedad puede estar causada por diferentes defectos. Un ejemplo son las displasias esqueléticas nombradas

NhptInvsDvl1Β catenina

Ptc

Smo

Pdfgr

Pc1Pc2

Shh

IFT

Gli

BBS NEK1EVC2

Smo

Regulación delciclo celular

Vía señalización Wnt

Vía señalización Shh

SST3 r

anteriormente que se acompañan muy frecuentemente de poliquistosis renal, polidactilia y defectos cardíacos. En los síndromes genéticos pasa lo mismo. Además de los rasgos cardinales que identifican a cada uno, se encontran asociaciones con obesidad, ceguera, polidactilia, retardo mental, malformaciones cerebrales, anomalías de miembros y poliquistosis renal.

Por último, el campo del conocimiento de las ciliopatías está en plena expansión y nos permite ir comprendiendo algunos mecanismos de respuesta de la célula y a adentrarnos en la patogenia de ciertas enfermedades humanas que hasta hace poco no tenían en apariencia nada en común.

Nota: La palabra cilio proviene del latín cilium (plural: cilia) y es de género masculino. El uso muy frecuente del plural en la literatura en inglés provoca confusión sobre su género en castellano.

Ejercicios

1) De la siguiente lista, indique cuales corresponden a elementos presentes en la estructura del cilio primario.

a) microtúbulosb) láminac) membrana plásmática d) mitocondriase) receptores de membranaf) quinesinag) filamentos de actina

2) Escriba 4 características que diferencian al cilio primario de los cilios secundarios del epitelio respiratorio.

a-b-c-d-

3) La siguiente es una lista de proteínas de membrana que se concentran en el cilio primario Hay una sola excepción, márquela.

a) Pdgfr f) serotoninab) BBS g) Ptc d) Pc1 h) somatostatina e) Pc2 j) Smo

5) Relaciones correctamente los siguientes conceptos

a) dineína citoplásmica 1B 1- receptor de Sonic hedghog

b) Ptc 2- transporte retrógrado en tráfico ciliarc) cuerpo basal 3- centríolod) quinesina 2 4- activa Wnt cuando se degradae) Pc1 5- transporte anterógrado en tráfico ciliarf) complejo IFT Ay B 6- proteínas de carga del tráfico ciliar

6) Indique verdadero (V) o falso (F) sobre las siguientes afirmaciones.

a) El cilio primario es un compartimento especializado del citoplasma de la célula, que protruye al exterior y funciona como censor mecánico, químico y físico y que en su membrana concentra receptores de señales.

b) La inclinación del cilio en el túbulo renal por el flujo urinario inhibe la captación de calcio y determina la activación de la proliferación celular.

c) En la vía de señalización de Sonic hedghog, Ptc inhibe a Smo. Pero cuando Ptc se une a su ligando abandona la membrana y Smo se libera y aumenta su concentración en la membrana.

d) La señalización de Sonic hegdhog puede alterarse si se afecta el tráfico intraflagelar.

e) El axonema del cilio primario tiene una estructura de microtúbulos 9+2

f) Las displasias óseas Costillas Cortas-Polidactilia se producen más frecuentemente por mutaciones en proteínas del complejo IFT (IFT 80) y de la dineína citoplasmática 1B (DYNC1B).

g) La poliquistosis renal se produce por la activación última de la vía de señalización de Wnt

h) Las proteínas motoras del tráfico intraflagelar son la serotonina y la somatostatina

i) En las cicliopatías, una única alteración en la maquinaria ciliar puede tener consecuencias fenotípicas diversas, y lo contrario, un mismo fenotipo puede deberse a distintas alteraciones.

j) Las proteínas de membrana Pc1 y Pc2 intervienen en la captación de calcio en el túbulo renal y sus alteraciones puede resultar en la aparición de quistes renales.

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3- Fecundación. Reacciones cortical y acrosómica. Procesos de fusión de membranas. Regulación del proceso de exocitosis.Durante la fecundación se producen las reacción acrosómica en la gameta masculina y la reacción cortical en la femenina ya fecundada. Ambos implican eventos de fusión de membranas regulados, similares a la exocitosis. Los procesos de exocitosis involucran las siguientes etapas: (a) la fijación de las vesículas de secreción a la membrana plasmática,

(b) el acoplamiento entre ambas membranas y (c) la fusión entre ambas membranas. Consignas.-Revise el proceso de formación de vesículas de secreción en el aparato de Golgi.-Revise el proceso de direccionamiento de vesículas de transporte en el citoplasma.-Revise el rol del Ca+2 como segundo mensajero Elabore una hipótesis acerca de cómo se podrían producir los fenómenos de exocitosis (secreción constitucional y mediada por señales). Incorpore en la misma mecanismos que expliquen: 1. Cómo se podría regular y ejecutar cada una de estas etapas (a,b y c) citadas más arriba.2. El rol que juegan las proteínas SNARE, Rab y complexinas en cada unoa de estas etapas? 3. Qué rol regulatorio posee el rol de las variaciones en la concentración de Ca+2 sobre la actividad de estas proteínas.