biología reproductiva de ceriodaphnia rigaudi richard 1894
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA
Biología reproductiva de Ceriodaphnia rigaudi Richard 1894 (Crustacea: Anomopoda) y efectos de
su exposición a petróleo crudo.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
M A E S T R O E N C I E N C I A SQ U I M I C O B I O L Ó G I C A S
P R E S E N T A :
B I Ó L O G O
CLAUDIA VENTURA LÓPEZ
DIRECTOR: Dr. Felipe Fernando Martínez Jerónimo
MÉXICO D.F. 2008
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AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) número de registro 217457 y al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) por el apoyo otorgado. Al Dr. Fernando Martínez- Jerónimo por permitirme pertenecer a su grupo de trabajo y por las facilidades para realización del mismo. Es una parte importante de mi formación profesional. A los miembros del comité para la evaluación del presente estudio, por sus valiosas aportaciones. Dra. Marcela Galar, Dra. Nandini Sarma, Dr. José Alberto Ocaña, Dr. Manuel Elías-Gutiérrez, Dr. Gerardo Zúñiga, Dr. Armando Vega-López. Ejemplos de integridad académica. A la M. en C. Sandra Guerra, por el apoyo y soporte durante la realización de este trabajo. Eres un claro ejemplo de superación personal y profesional. A mis compañeros de laboratorio por la ayuda y consejos ofrecidos durante la realización del presente estudio. Biol. Rosa Pineda, Biol. Jesús Rodríguez.
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INDICE Resumen��...�����������������������...
Abstract���.�����������������������..
1. Introducción��.����������������������
2. Antecedentes�����������������������... 15
3. Justificación..����������������������.�.
4. Hipótesis�.������������������������
5. Objetivos
5.1 Objetivos generales��������������������
5.2 Objetivos particulares�������������������
6. Material y métodos
6.1 Preparación de la dieta����������������..��
6.2 Aclimatación del cultivo de Ceriodaphnia rigaudi������......
6.3 Mortalidad y tiempo intercamada�����������...�......
6.4 Tabla de vida��������������������..�..
6.5 Medidas corporales de los neonatos ����������..��..
6.6 Pruebas de toxicidad aguda�������������.���.
6.6.1 Fracción soluble en agua�������..������..�..
6.6.2 Adsorción del petróleo crudo sobre caolín...................................
6.7 Pruebas de toxicidad crónica 21 días�������������
7. Resultados
7.1 Mortalidad y tiempo intercamada�����������..��
7.2 Tabla de vida���������������������..
7.3 Pruebas de toxicidad aguda�����������.����..
7.4 Pruebas de toxicidad crónica (21 días)
7.4.1 Mortalidad y tiempo intercamada������������
7.4.2 Tabla de vida��������������������
8. Discusión�������������������������.
9. Prospectivas������������������������
10. Conclusiones��������������������.�.�� 70
11. Literatura citada�..����������������.��..�...
12. Glosario�������������������������..
13. Anexos.�����..�������������������� 79
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Microalgas empleadas durante el trabajo experimental. Figura 2. Variables reproductivas de C. rigaudi mediante la evaluación de reproducción individual. Figura 3. Variación en la talla de los neonatos de C. rigaudi obtenidos mediante la evaluación de reproducción individual. Figura 4. Curvas de sobrevivencia de C. rigaudi obtenidas con tres tipos de alimento y dos temperaturas. Figura 5. Curvas de fecundidad de C. rigaudi obtenidas con tres tipos de alimento y dos temperaturas. Figura 6. Curvas esperanza de vida de C. Rigaudi obtenidas con tres tipos de alimento y dos temperaturas. Figura 7. Parámetros de historia de vida de C. rigaudi obtenidas con tres tipos de alimento y dos temperaturas.
Figura 8. Variación en la talla de los neonatos obtenidos mediante la evaluación de tabla de vida. Figura 9. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre las variables reproductivas de C. rigaudi. Figura 10. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre la talla de los neonatos de C. rigaudi obtenidos en la evaluación de reproducción individual.
Figura 11. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre la supervivencia de C. rigaudi.
Figura 12. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre la fecundidad de C. rigaudi.
Figura 13. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre los parámetros de historia de vida de C. rigaudi.
Figura 14. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre la talla de los neonatos de C. rigaudi obtenidos en la evaluación de tabla de vida.
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RESUMEN
Algunos microcrustáceos de la Familia Daphnidae han sido frecuentemente usados
como organismos de prueba en Toxicología Acuática y en la producción de alimento
vivo para la Acuacultura. Pese a que existen en diferentes regiones del mundo, y
particularmente en ambientes tropicales, otras especies que podrían también ser
empleadas para estos fines, su posible aplicación se limita por la carencia de
información sobre su biología reproductiva. A fin de contar con información biológica
sobre especies potenciales, en este estudio se seleccionó a Ceriodaphnia rigaudi
Richard 1894, un cladócero de talla pequeña distribuido principalmente en regiones
tropicales y subtropicales del mundo, y se evaluó el efecto de la alimentación y la
temperatura sobre su reproducción y ciclo de vida.
Es importante considerar que C.rigaudi se encuentra en la región sureste de México,
zona que se caracteriza por presentar una alta actividad petrolera, por esta razón esta
especie puede ser una buena opción para la evaluación del efecto tóxico del petróleo en
ambientes dulceacuícolas, por lo que se evaluó también el efecto de la fracción soluble
en agua (FSA) y la exposición total del crudo por medio de la adsorción por caolín
(APC).
Para la descripción de la biología reproductiva se suministraron tres especies de
microalgas (Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus, y Chlorella
vulgaris) como alimento en concentraciones equivalentes en peso seco (12 mg L-1), en
dos temperaturas (20 y 25°C), y se evaluaron, entre otras respuestas, la longevidad,
progenie total, supervivencia, esperanza de vida y fecundidad de C. rigaudi.
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Los organismos que fueron alimentados con las microalgas A. falcatus y P. subcapitata
presentaron mayores valores de longevidad (30.7± 5.91, 26.6 ± 3.59 días,
respectivamente) y progenie total (45 ± 13.80, 40.7 ± 0.66 neonatos hembra-1) que las
registradas en los organismos alimentados con C. vulgaris (13.5± 4.63 días y 17.6 ±
6.19 neonatos hembra-1). La temperatura afectó significativamente los parámetros
poblacionales de C. rigaudi, registrándose los máximos valores de longevidad (56.1 ±
9.41días) a 20ºC en individuos alimentados con A. falcatus. Sin embargo, la edad de la
primera reproducción y la progenie total fueron afectados negativamente por esta
temperatura, ya que la madurez del cultivo se retrasó hasta los 16 días de edad y el
número de neonatos generados fue menor (9.8 ± 3.45 con C. vulgaris; 24.7±6.01 con P.
subcapitata, y 35.5 ± 8.59 neonatos hembra-1 con A. falcatus). Las mejores condiciones
de propagación para C. rigaudi, se obtuvieron con la microalga A. falcatus a una
temperatura de 25ºC, ya que en estas condiciones se registraron las mejores respuestas
reproductivas.
La concentración letal media (CL50) para la FSA fue de 0.0143g L-1 y para la adsorción
por caolín se encontró un valor de 0.00053g L-1, demostrando que la APC tuvo un
efecto tóxico agudo mayor al que presenta la fracción soluble, ya que aparentemente no
limita la biodisponibilidad de los compuestos del petróleo. Por otro lado, la evaluación
crónica indicó que la biología reproductiva de C. rigaudi estuvo afectada por la
presencia del tóxico, presentando una menor y más rápida reproducción con el aumento
de la concentración del tóxico, teniendo que la menor concentración tóxica es de
0.0000212 g L-1, correspondiente al factor de aplicación 25.
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ABSTRACT
Some microcrustaceans of the Family Daphnidae have been used as test organisms in
aquatic toxicology and for the production of live food for aquaculture, but mainly with
aim on species distributed in temperate regions in the world. The proposal of other
cladocerans from tropical environments is limited because the lack of fundamental and
descriptive information about their reproductive biology. The use of standard species in
aquatic toxicology does not reflect the local or specific conditions of others
environments, especially those found in tropical and subtropical latitudes, and it is
necessary to have other options as test organisms for those environmental conditions. In
order to have biological information on potential species, in this study we selected
Ceriodaphnia rigaudi Richard 1894, a small size cladoceran ubiquitous in the tropical
and subtropical regions around the world.
It is important to considerate that C. rigaudi is distributed in the southeastern region of
Mexico, an area with high oil production activity, and for this reason this cladoceran
could be a good option for the assessment of the petroleum toxicity in freshwater
environments. In this study we evaluated the acute and chronic toxicity produced by one
crude oil sample, by means of two ways of exposure: as water soluble fraction (WSF),
and through the whole exposition (adsorption on kaolin).
For a description of the reproductive biology, three species of microalgae
(Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus, and Chlorella vulgaris),
were supplied individually as food at the same concentration in dry weight (12 mg L-1),
in test carried out at two temperatures (20 and 25°C). Longevity, total offspring,
survival, life expectancy at birth, and fecundity were assessed, among other
demographic responses.
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The organisms fed the microalgae A. falcatus and P. subcapitata showed higher
longevity (30.7 ± 5.91, 26.6 ± 3.59 days, respectively) and total offspring (45 ± 13.80,
40.7 ± 0.66 neonates female-1), than those fed with C. vulgaris (13.5 ± 4.63 days and
17.6 ± 6.19 neonates female-1). Temperature significantly affected the population
parameters of C. rigaudi, recording the highest values of longevity (56.1 ± 9.41días) at
20°C in individuals fed with A. falcatus, but the age of first reproduction and the total
offspring were adversely affected by this temperature, since the sexual maturity was
delayed until 16 days of age, and the number of neonates generated was lower (9.8 ±
3.45 to C. vulgaris; 24.7 ± 6.01 with P. subcapitata, and 35.5 ± 8.59 neonates female-1
with A. falcatus). The best conditions for the reproduction of C. rigaudi were obtained
with the microalgae A. falcatus at temperature of 25 º C.
The median lethal concentration (LC50) obtained for the WSF was 0.0143g L-1, and for
the oil adsorbed on kaolin was 0.00053g L-1, demonstrating that the whole exposition
produced a greater acute toxic effect than the soluble fraction. On the other hand, the
chronic exposition indicated that the reproductive biology of C. rigaudi was affected by
the crude oil, presenting a smaller and faster reproduction with the increasing
concentration of the toxic; the concentration that exerts the lowest toxic effect was
0.0000212 g L-1, corresponding to the Application Factor of 25.
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1. Introducción.
Los ecosistemas acuáticos son el centro de interacción de un gran número de factores
bióticos y abióticos que pueden ser modificados drásticamente por algún xenobiótico, la
presencia de contaminantes puede provocar la alteración del ecosistema modificando así
la composición y distribución de las comunidades bióticas, teniendo como consecuencia
la alteración de la dinámica trófica. Por ello, surge la necesidad de investigar y detectar
el impacto de la contaminación por compuestos químicos en la calidad de los cuerpos
de agua, evaluando los efectos biológicos de los contaminantes sobre los organismos
vivos (Bozo et al., 2007).
En la gran mayoría de los estudios ecotoxicológicos se emplean especies que tienen una
relevancia ecológica, para que a partir de los resultados obtenidos, se pueda realizar una
extrapolación a toda la comunidad y de esta manera establecer estándares de calidad
confiables. Bajo este contexto, sin duda uno de los grupos más importantes son los
organismos zooplanctónicos, ya que conforman una de las comunidades más amplias y
variadas dentro de los sistemas acuáticos, estando representados desde los protozoarios
hasta los vertebrados en sus diferentes estadios larvarios. Las comunidades
zooplanctónicas dulceacuícolas están constituidas en su mayoría por diversas especies
de rotíferos, crustáceos, protozoarios ciliados y flagelados heterótrofos. Dentro de los
crustáceos los más comunes son los braquiópodos y anomopodos comúnmente
conocidos como cladóceros.
Al igual que el resto de los organismos zooplactónicos, los crustáceos de la familia
Daphniidae (Orden Anomopoda), representan uno de los grupos más importantes, ya
que siendo los principales consumidores primarios interfieren en la transferencia de
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energía a lo largo de la cadena trófica, teniendo influencia sobre el crecimiento de las
poblaciones de protozoarios heterótrofos flagelados, bacterias, así como en el desarrollo
poblacional de microalgas como Ankistrodesmus falcatus, Chlorella vulgaris y
Chlamydomonas sp. (Pace y Vaqué, 1994; Arnold, 1971).
Los organismos de esta Familia han sido ampliamente utilizados en toxicología
acuática, debido a que poseen una serie de características favorables como la
reproducción asexual por partenogénesis. Los embriones producidos por este tipo de
reproducción se desarrollan en la cámara incubatriz sin fases larvarias y dan origen a
organismos morfológica y genéticamente idénticos a la madre (Pennak, 1989). A veces
únicamente el 5% de la población puede consistir de machos, y la presencia de éstos
parece estar inducida principalmente por la alta densidad poblacional de hembras,
acumulación de excretas, disminución de la disponibilidad de alimento, la temperatura
del agua y la intensidad de la luz. Si estas mismas condiciones continúan por un largo
periodo de tiempo, se puede inducir la aparición de huevos sexuales. Las hembras
producen huevos, morfológicamente similares a los partenogenéticos, pero solo se
producen 1 o 2. La fertilización de estos ocurre dentro de la cámara de incubación y la
cubierta comienza a engrosarse y a oscurecerse formando un efípio, el cual contiene
únicamente un huevo, o en ocasiones dos (Pennak, 1989), los efípios caen al fondo, o
bien pueden flotar en la superficie. Estas estructuras de resistencia son capaces de
permanecer secas por periodos prolongados y su producción es una clara adaptación a
condiciones ambientales adversas.
En cuerpos de agua pequeños los efípios se producen en pequeños porcentajes, y en las
poblaciones limnéticas de los grandes lagos la reproducción puede ser partenogenética a
lo largo de todo el año (Pennak, 1989). La reproducción partenogenética se presenta
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como consecuencia del alto nivel de depredación ya que mediante una tasa reproductiva
alta, se garantiza un incremento en la densidad poblacional (De Bernardi et al., 1987).
Otra característica general de los dáfnidos es la alta fecundidad que dependiendo de la
especie y de las condiciones ambientales, el número de huevos por camada varía
considerablemente. Usualmente son entre 2 y 40, y mas frecuentemente entre 10 y 20.
Generalmente el número de huevos está determinado por la cantidad de alimento y por
el tamaño de la hembra, estos no se producen cuando la concentración de alimento está
por debajo del umbral mínimo para la reproducción, mientras que el máximo se presenta
cuando se alcanza una concentración crítica.
La calidad del alimento ha sido objeto de varias investigaciones, la mayoría de ellas
enfocadas en la composición bioquímica, particularmente a la cantidad de ácidos grasos
poliinsaturados, nitrógeno y fósforo (Gulati y DeMott 1997; Sterner y Schulz 1998) y la
influencia de estos en el crecimiento de los cladóceros (DeMott y Müller-Navarra 1997;
Müller-Navarra et al., 2000; Wacker y von Elert, 2001). Adicionalmente se han
considerado otros aspectos de la calidad del alimento como son la forma y el tamaño de
la microalga, y la capacidad de los cladóceros para digerirla, ya que estos factores
pueden tener la capacidad de detener o retrasar el crecimiento del zooplancton (van
Donk et al., 1997; DeMott y Tessier, 2002; Fileto et al., 2007).
El éxito de la reproducción en los organismos de la Familia Daphnidae depende de
factores ambientales, aporte y cantidad de alimento, densidad poblacional, y
depredación, entre otros. De igual forma, la respuesta en fecundidad, crecimiento y
producción de efípios en una especie va a estar influenciada por las condiciones bióticas
y abióticas (Pennak, 1989).
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Sumado a la facilidad reproductiva, existen otras características que facilitan el empleo
de estos organismos como especies de prueba; fácil manejo y cultivo en condiciones de
laboratorio y ciclo de vida corto. La duración puede fluctuar dependiendo de la
temperatura entre los 13 a 15 días en Moina micrura Kurz, 1874 (Murugan, 1975) a más
de 60 días en Daphnia magna Straus 1820 (Martínez-Jerónimo et al., 1994). La especie
mas empleada en el campo de la toxicología es Daphnia magna, la cual ha funcionado
como organismo de prueba desde 1933 (Baudo, 1987). Es una especie sensible a una
amplia variedad de compuestos tóxicos; sin embargo, debido a la distribución
restringida de D. magna (región Holartica), existen otras especies de mayor
distribución que también son empleadas como organismos de prueba, tal es el caso de
Ceriodaphnia dubia Richard 1894, la cual es una especie pequeña de 1 mm de longitud
como máximo, es característica de cuerpos de agua somera y tiene una amplia
distribución a nivel mundial (Ceresoli y Gagneten, 2003).
A pesar del amplio uso de estas especies en el campo de la toxicología, se debe
considerar que el empleo de especies estandarizadas no siempre refleja las condiciones
locales o específicas de otros ambientes, por ello es importante conocer otras especies
que puedan también ser empleadas como organismo de prueba tomando en cuenta que
pueden existir mejores opciones para ambientes distintos, particularmente ambientes
tropicales, ya que la mayoría de los estudios con cladóceros están enfocados a los
ambientes templados y por consecuencia las estrategias de vida de dichas especies están
mejor conocidas (Sarma et al., 2005; Bunioto y Arcifa, 2007). Sin embargo, son pocas
las especies de cladóceros tropicales que se han descrito, en lo referente a biología
reproductiva (Nandini y Sarma, 2000).
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Una de las especies de las cuales se cuenta con muy poca información es Ceriodaphnia
rigaudi Richard, 1894. Esta se distribuye principalmente en zonas tropicales, tolera
amplios intervalos de temperatura de 17 hasta 35°C, y tiene la capacidad de formar
poblaciones numerosas (Alonso, 1996). En México, se tienen registros de C. rigaudi en
Nuevo León, Tamaulipas, Quinta Roo y Tabasco (Elías-Gutiérrez et al., 1999;
Rodriguez, 2002), este último se encuentra en una región que presenta una alta actividad
petrolera, de tal manera que, estudiar los efectos del petróleo sobre esta especie
permitirá en un principio determinar si ésta puede ser empleada como organismo de
prueba y en el futuro, obtener información valiosa para lograr el establecimiento de
normas de regulación de efluentes en esta región.
En su ambiente natural C. rigaudi al igual que muchos de los organismos acuáticos,
puede estar expuesta a los efectos del petróleo o alguno de sus componentes solubles, ya
que en su forma cruda o refinada (gasolina y otros productos obtenidos por destilación y
procesos químicos a partir del petróleo crudo), es accidental o deliberadamente liberado
al ambiente acuático (Olsen, 1998). Esto es un problema critico en México, dado que
los criterios biológicos para el control de la contaminación acuática están todavía en
desarrollo (Martínez- Jerónimo et al., 2005), a pesar de la enorme producción de crudo
(3.383 x 106 barriles de petróleo crudo/d en 2005).
La mayoría del petróleo presente en los ecosistemas proviene de descargas de industrias
y ciudades (Miller, 1993). Los efectos del petróleo dependen de varios factores, como:
tipo de aceite (crudo o refinado), cantidad descargada, temporada del año, condiciones
climáticas, temperatura promedio del agua, y corrientes.
Los hidrocarburos volátiles del petróleo, matan inmediatamente a un gran número de
organismos, especialmente las formas larvarias. La solubilidad y movilidad en el
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ambiente acuático determina su biodisponibilidad y biodegradabilidad; en aguas cálidas,
la mayoría de estos químicos tóxicos se evaporan en un lapso de 1 o 2 días, mientras
que en aguas frías, pueden permanecer hasta por semanas (Miller, 1993).
El petróleo crudo es una mezcla compleja de sustancias de diversa estructura molecular
que puede variar de manera significativa dependiendo de las condiciones de su
formación. Está compuesto principalmente por hidrocarburos alifáticos y aromáticos
que pueden clasificarse como parafinas (alquenos), olefinas (alcanos), naftenos
(cicloalquenos) y aromáticos (monocíclicos y policíclicos), además de contener
compuestos orgánicos de nitrógeno y azufre y pequeñas concentraciones de metales
como el níquel, vanadio y hierro (Laws, 1993).
Una vez que el crudo entra al ambiente acuático, sufre un proceso de �desgaste� durante
el cual se somete a diferentes procesos como evaporación, dilución, oxidación química
y biológica, sedimentación y bioacumulación (Laws, 1993; Guerra, 2005). Estos
procesos están determinados en gran medida por la naturaleza de los hidrocarburos
presentes en el aceite y se pueden describir de la siguiente manera:
Evaporación. Está determinada principalmente por la cantidad de compuestos volátiles;
a un mayor porcentaje de hidrocarburos ligeros, mayor será la evaporación.
Dispersión. Las corrientes y turbulencia actúan fraccionando al petróleo en pequeñas
partículas, éstas pueden sufrir degradación microbiológica o sedimentarse, o bien ser
transportadas a las costas.
Dilución. El grado de dilución depende de su composición, así mientras los
componentes más pesados son virtualmente insolubles, los más ligeros como los
aromáticos son ligeramente más solubles y volátiles. De forma tal se pierden por
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evaporación. La porción del petróleo, ya sea en forma cruda o refinada, que presenta la
capacidad de disolución en el agua se le conoce como fracción soluble en agua (FSA).
Fotooxidación. Los hidrocarburos reaccionan con el oxígeno transformándose en
productos solubles. Muchas de estas reacciones son promovidas por la radiación solar,
dando como resultado la producción de compuestos oxigenados tales como ácidos
carboxílicos, alcoholes, kerosenos y fenoles. Estos compuestos son generalmente más
solubles que sus precursores y en algunos casos más tóxicos.
Sedimentación. El hundimiento del petróleo se lleva a cabo por su adhesión a los
sedimentos y a la materia orgánica e inorgánica en suspensión. Las aguas someras que
por lo general tienen gran cantidad de sedimentos o sólidos suspendidos, propician
condiciones naturales para la sedimentación.
Acumulación. En los cuerpos de agua expuestos en donde hay aporte considerable de
petróleo se acumula al mezclarse con gran cantidad de sedimentos y llega a formar
breas.
Oxidación microbiana. Alrededor de 90 especies de bacterias y hongos son capaces de
subsistir sobre el petróleo y por ende transformarlo, pero ninguna especie de bacteria es
capaz de biotransformarlo en su totalidad, es decir no es capaz de metabolizar todos los
diferentes compuestos del petróleo. Hay alrededor de 70 géneros de microorganismos
distribuidos en el medio acuático que son capaces de degradar los componentes del
petróleo y utilizarlo como fuente de carbono.
Bioacumulación. Este proceso consiste la ingestión del petróleo y la incorporación de
hidrocarburos en el tejido adiposo. Al dispersarse petróleo se favorece la ingesta de éste
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por organismos filtradores, o bien pueden adherirse a los organismos e integrarse a la
cadena alimenticia (Guerra, 2005).
El petróleo tanto en su forma cruda como refinada, es uno de los xenobióticos
potencialmente tóxicos para la biota acuática, ya que ocasiona alteraciones metabólicas
en los organismos y repercute en última instancia en cambios estructurales y funcionales
en los ecosistemas (Guerra, 2005). Con respecto a los ecosistemas acuáticos, es el
ambiente marino al que se le ha dado mayor atención debido a la incidencia de derrames
de petróleo, sin embargo, la presencia de complejos petroquímicos y las actividades que
en éstos se realizan, ya sea extracción, transporte o petroquímica básica, proveen un alto
riesgo de contaminación tanto en tierra firme como en los diferentes cuerpos de agua
cercanos a estas industrias (Laws, 1993).
Los hidrocarburos aparentemente ejercen su efecto, en parte, por su incorporación a la
capa lipídica que recubre el interior de la membrana celular. Como resultado, la
membrana se rompe y cesa la regulación del intercambio de sustancias entre el interior y
el exterior de la célula. Se ha encontrado que los hidrocarburos interactúan con las
diferentes biomoléculas de plantas y animales, afectando tanto las enzimas como las
proteínas estructurales. Los productos de la refinación del petróleo, tales como gasolina
o queroseno, contienen virtualmente hidrocarburos de bajo peso molecular que los hace
más peligrosos que el petróleo crudo, dado que la toxicidad esta relacionada con el
tamaño molecular (Laws, 1993).
El efecto del petróleo sobre los organismos acuáticos se debe principalmente a los
hidrocarburos en solución o en forma dispersa en la columna de agua (Espino y
Venegas, 1996). La toxicidad y los efectos acumulativos, dependen directamente de su
solubilidad en el agua (Ratushnyak, 2002). Se ha mostrado que la fracción soluble del
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petróleo tiene efectos altamente tóxicos y depende entre otros factores, de la
distribución dimensional de las partículas del petróleo emulsificado y de la temperatura
(Ratushnyak, 2002). Esta variable afecta a otros factores como la redistribución de las
fracciones por evaporación, oxidación química y bioquímica, solubilidad,
emulsificación y absorción.
La mayoría de las pruebas toxicológicas con petróleo crudo se han enfocado a la
fracción soluble, debido a que ésta entra al ambiente acuático con mayor facilidad y
puede causar un daño inmediato en los organismos acuáticos. Sin embargo, el resto de
los componentes comienza a incorporarse a la columna de agua por medio de otros
mecanismos como la adsorción en sólidos suspendidos y sedimentos.
El material particulado tiene un papel importante debido a que proporcionan superficies
de captura y retención de materiales hidrofóbicos, modificando así la biodisponibilidad,
movilidad, segregación y destino de estos compuestos en los ecosistemas acuáticos
(Hodge et al., 1993; Bennet et al., 1999).
Los ambientes acuáticos generalmente contienen una cantidad significativa de material
suspendido conformado por una mezcla heterogénea de partículas tanto bióticas
(bacterias, protozoarios y microalgas) como abióticas (detritus, materia inerte y
minerales). Independientemente de que estas partículas afectan a los organismos
acuáticos de distintas maneras y en diferentes grados, pueden jugar un papel
fundamental en la retención y movilidad de los compuestos tóxicos, por lo que resulta
importante considerar la interacción de estos compuestos con los sedimentos y el
material suspendido (Van den Belt et al.,2000).
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La mayoría del sedimento y las partículas suspendidas poseen una superficie cargada
negativamente, de manera que pueden retener electrostáticamente contaminantes que
posean carga positiva (como los metales pesados), de esta forma se disminuye la
biodisponibilidad y el daño de los tóxicos sobre los organismos. Pero, la importancia de
los sedimentos y el material en suspensión es a menudo subestimado, ya que no se
considera que puedan aumentar el impacto de los contaminantes en los organismos
acuáticos como en el caso de algunos componentes del zooplancton que pueden
capturar, concentrar y consumir tóxicos adsorbidos en material suspendido. Cuando los
organismos filtradores ingieren estas partículas, los contaminantes pueden liberarse en
el tracto digestivo a través de varios mecanismos fisicoquímicos y pueden ejercer un
efecto tóxico (Weltens et al., 2000).
Considerando lo anterior, en este trabajo se evaluarán los efectos tóxicos de la fracción
soluble en agua y del petróleo crudo adsorbido sobre caolín, para estimar la toxicidad
sobre C. rigaudi con el fin de evaluar el impacto de este xenobiótico en condiciones
naturales y extrapolar con la debida precaución, a la comunidad zooplanctónica.
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2. Antecedentes
En la actualidad, el empleo de cladóceros se ha convertido en una práctica estandarizada
en pruebas agudas (Nikunen y Miettinen, 1985). Existen una gran cantidad de
publicaciones relacionadas no solo con problemas toxicológicos, si no con aspectos
como biología reproductiva y efecto de factores bióticos y abióticos sobre la
reproducción de estos organismos para encontrar las mejores condiciones de cultivo
(Dave et al., 1991). Un ejemplo de ello es el trabajo realizado por Martínez-Jerónimo et
al., (1994) en el cual se evaluó el efecto de la concentración del alimento
(Ankistrodesmus falcatus y Scenedesmus incrassatulus) sobre la longevidad de Daphnia
magna, y se encontró que concentraciones moderadas favorecen la longevidad, mientras
que altas concentraciones generan una baja longevidad promedio.
Entre los trabajos realizados con especies de cladóceros distintos a Daphnia magna, se
encuentra el realizado por Taylor (1985) quien mostró que bajas concentraciones de
alimento afectan negativamente el crecimiento y la reproducción de D. pulex Leydig,
1860 y D. pulicaria Forbes, 1893.
Schwartz y Ballinger (1980) observaron que las especies de microalgas empleadas
como alimento para D. pulex tienen influencia sobre la supervivencia, edad de
maduración y tamaño y número de camadas de esta especie. Otras publicaciones
también han demostrado que el suministro de alimento es un factor importante en
cultivos para la producción de neonatos de Daphnia empleados en pruebas
ecotoxicológicas estandarizadas (Cowgill et al., 1985; Naylor et al., 1993).
Nandini y Sarma (2000) estudiaron el efecto de la concentración de alimento sobre los
parámetros de tabla de vida de cuatro especies de cladóceros (Ceriodaphnia cornuta
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16
Sars 1885, Moina macrocopa Straus 1820, Pleuroxus aduncus Jurine 1820 y
Simocephalus vetulus Müller 1776) y encontraron que bajas concentraciones de
alimento tienen son favorables sobre la reproducción de estas especies. Por otro lado,
Cowgill et al. (1985) evaluaron el efecto de la temperatura sobre la fecundidad y
longevidad de Ceriodaphnia dubia, y hallaron que a una temperatura de 20°C esta
especie puede vivir hasta 125 días.
Para Moina macrocopa Martínez-Jerónimo y Gutierrez-Valdivia (1991) mostraron que
las microalgas Ankistrodesmus convolutus, Scenedesmus incrassatulus y Chlorella
vulgaris favorecen la reproducción de esta especie.
De los trabajos relacionados con aspectos ecológicos, está el realizado por Villalobos y
González (2006), en el cual resaltan aspectos biológicos y ecológicos de Ceriodaphnia
cornuta, como la preferencia que tiene esta especie por las diatomeas y algas verdes,
además de presentar mecanismos de defensa destacándose el polimorfismo, cambios en
algunos parámetros de historia de vida y la migración vertical que pueden ayudar a
entender la dinámica de cuerpos de agua tropicales y de la transferencia de energía a
través de la cadena trófica.
Hasta el momento, los trabajos realizados con Ceriodaphnia rigaudi, se han enfocado a
descripciones morfológicas y aspectos taxonómicos. Carruyo et al.(2004) estudiaron el
zooplancton de agua dulce de la cuenca del Lago de Maracaibo, Estado Zulia,
Venezuela, e identificaron siete especies de cladóceros. Estos autores consideran a
Ceriodaphnia rigaudi como una variedad de Ceriodaphnia cornuta, actualmente estas
dos especies se consideran independientes (Elías-Gutiérrez et al., 1999).
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17
Para el caso del petróleo, se han estimado los efectos tóxicos tanto de la fracción soluble
como del crudo mismo. En la mayoría de los trabajos se ha empleado a los crustáceos
como organismos de prueba, ya que han demostrado ser particularmente sensibles a un
amplio número de contaminantes (Barron et al., 1999).
Ponat (1988) evaluó el efecto de la fracción soluble del petróleo sobre la movilidad del
crustáceo cirripedio Balanus balanoides Linnaeus, 1767, y encontró que la actividad
cirrial, y por consecuencia el consumo de alimento, son inhibidos por los componentes
de la fracción soluble del petróleo.
Por su parte Khan y Kiceniuk (1989), trabajando con el poliqueto Johanssonia arctica
Johansson, 1898 (Anélido), estimaron los efectos subletales del petróleo crudo sobre la
reproducción y la supervivencia. Hallaron daños en ambos aspectos como resultado de
la bioacumulación, así como reducción de la viabilidad de los embriones y la
supervivencia de los juveniles.
Heras et al. (1995) realizaron la comparación de dos sistemas diferentes que permiten la
estabilidad de la fracción soluble del petróleo, empleando adultos de salmón del
Atlántico (Salmo salar Linnaeus, 1758) como organismos de prueba. En cada uno de los
sistemas empleados encontraron que la mayor parte de la fracción Soluble en agua se
compone en un 70% de compuestos aromáticos como el tolueno y el benceno, mientras
que los alcanos al ser menos solubles en agua, se encontraron en menor proporción
Por otro lado, con el fin de encontrar que grupo es más sensible a los efectos potenciales
del petróleo, Moles (1998) trabajó con diez especies pelágicas, principalmente peces,
crustáceos, equinodermos y moluscos, y documentó una mayor sensibilidad en
crustáceos y peces.
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Recientemente Martínez-Jerónimo et al. (2005) estimaron el efecto tóxico de dos
formas de exposición de varias muestras de petróleo sobre Daphnia magna, y
observaron la mayor toxicidad con el petróleo adsorbido sobre caolín.
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3. Justificación
En toxicología acuática, generalmente se emplean especies que presentan una alta
sensibilidad a un gran número de compuestos tóxicos, además de tener funciones
ecológicas relevantes. La especie más utilizada actualmente es Daphnia magna, sin
embargo, esta especie es característica de zonas templadas y no se encuentra de manera
natural en los cuerpos de agua de nuestro país. Por esta razón, es importante conocer
otras especies que puedan también ser empleadas con este fin, tomando en cuenta que
pueden existir mejores opciones para ambientes distintos, particularmente ambientes
tropicales.
Ceriodaphnia rigaudi es una especie con un papel importante en el ecosistema del cuál
forma parte, ya que al estar presente en el zooplancton es uno de los principales
trasmisores de energía a lo largo de la cadena alimenticia. Esta especie, sirve como
alimento de organismos superiores en la trama trófica y por tanto los posibles efectos de
los tóxicos causados a este nivel se reflejaran en los niveles superiores de la
organización biótica.
Hasta el momento, los trabajos realizados con C. rigaudi, se han enfocado a
descripciones morfológicas y aspectos taxonómicos (Carruyo et al., 2004), por lo que
resulta importante determinar algunas de las características poblacionales y de historia
de vida de este organismo, con el fin de aportar nueva información sobre la biología
reproductiva de especies poco estudiadas y con base en ello desarrollar métodos de
propagación controlada y masiva, que permitan el empleo de nuevas especies como
fuente de alimento vivo y en un futuro, como organismos de prueba en toxicología
acuática. Bajo este contexto, los estudios de tabla de vida resultan un factor importante
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20
en el aporte de información de nuevas especies, ya que estos permiten determinar las
características estructurales de la población y las tasas de mortalidad y de fecundidad
específicas por edades, las cuales son indispensables tanto para comprender los cambios
temporales en las características poblacionales, como para hacer inferencias aplicables a
la explotación y manejo de las poblaciones (Krebs, 1985).
C. rigaudi es una especie de la cual se cuenta con poca información tanto biológica
como ecológica, por lo que el aporte de nuevos datos al respecto puede servir de base
para la estandarización de bioensayos, y por tanto para el establecimiento de normas de
calidad ambiental. Además, es importante señalar que la zona en la cual se colectó esta
especie se caracteriza por ser una región petrolera (Tabasco, México) por lo que el
efecto de dicho compuesto sobre C. rigaudi puede proporcionar información ecológica
de gran importancia para esta región.
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4. Hipótesis
Si el éxito reproductivo de Ceriodaphnia rigaudi se ve influenciada por las condiciones
bióticas y abióticas, entonces, factores como el tipo de alimento y la temperatura
tendrán un efecto significativo en las respuestas reproductivas y por tanto, dicho efecto
permitirá determinar las mejores condiciones de cultivo para la especie.
Si la mezcla de petróleo contiene componentes volátiles y de fácil oxidación, entonces,
la fracción soluble en agua producirá daños a corto plazo en contraste con los efectos
más persistentes del petróleo crudo, y por tanto la exposición total del petróleo tendrá
un efecto letal mayor sobre los neonatos de Ceriodaphnia rigaudi.
5. Objetivos
5.1. Objetivos Generales
• Describir algunos aspectos de la biología reproductiva de Ceriodaphnia
rigaudi, tales como fecundidad, supervivencia y longevidad, a partir de su
cultivo bajo condiciones controladas.
• Evaluar el efecto tóxico agudo y crónico de dos formas de exposición de una
muestra de petróleo crudo (fracción soluble en agua y adsorción de petróleo
sobre caolín) sobre los neonatos de esta especie.
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5.2. Objetivos particulares
• Determinar cuales son las condiciones que más favorecen el cultivo de C.
rigaudi en el laboratorio, en términos de variables como temperatura (20 ±
1ºC y 25± 1ºC) y tipo de dieta (Pseudokirchneriella subcapitata,
Ankistrodesmus falcatus, Chlorella vulgaris), mediante la estimación de
parámetros poblacionales en estudios de tabla de vida y crecimiento
individual.
• Determinar si el tipo de alimento y la temperatura tienen algún efecto sobre
la talla de los neonatos de C. rigaudi
• Evaluar el efecto de la muestra de petróleo crudo sobre los neonatos de esta
especie, mediante pruebas de toxicidad aguda y determinar la concentración
letal media (CL50) de las dos formas de exposición de la muestra de petróleo.
• Evaluar el efecto tóxico crónico del petróleo sobre parámetros demográficos
como tasa reproductiva, tasa de incremento poblacional, tiempo
generacional, tamaño y número de camadas, tiempo intercamada y, edad de
la primera reproducción mediante estudios de tabla de vida y crecimiento
individual.
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6. Materiales y métodos
Para el presente estudio se utilizó una cepa de Ceriodaphnia rigaudi obtenida del
cepario de cladóceros del Laboratorio de Hidrobiología Experimental, Escuela Nacional
de Ciencias Biológicas, I. P. N., que fue aislada a partir de colectas realizadas en la
Reserva de la Biosfera Pantanos de Centla, Km 35 + 000 y 50 + 000 del corredor de
ductos �Atasta � Ciudad PEMEX� en el Estado de Tabasco, México.
6.1 Preparación de la dieta
Como alimento para C. rigaudi se seleccionaron a las microalgas clorofíceas
Ankistrodesmus falcatus, Pseudokirchneriella subcapitata y Chlorella vulgaris; estas
fueron obtenidas de la colección de microalgas del Laboratorio de Hidrobiología
Experimental, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, I. P. N. La elección de los
alimentos se realizó con base en la diferencia en forma y tamaño: A. falcatus es
fusiforme con una longitud promedio de 40 µm; P. subcapitata tiene forma de media
luna y un tamaño promedio de 10 µm, en tanto que C. vulgaris es esférica, con una
diámetro promedio de 5.5 µm. Las microalgas se cultivaron en medio basal de Bold
esterilizado en autoclave (Stein, 1973), con iluminación y aireación continua, esto para
la homogenización de los nutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. La
biomasa algal fue separada del medio de cultivo y se mantuvo en refrigeración por un
tiempo máximo de una semana, con el fin de proporcionar únicamente alimento fresco
para los experimentos (Martínez-Jerónimo et al., 1994). La concentración en la que se
suministraron fue la misma en peso seco para las tres microalgas (12.0 mg L-1), que fue
equivalente a 4.0 x 105, 1.3 x 106 y 1.35 x 106 células mL-1 de A. falcatus, P.
subcapitata y C. vulgaris, respectivamente.
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Figura 1. Microalgas empleadas durante el trabajo experimental: A) Ankistrodesmus falcatus, (B) Pseudokirchneriella subcapitata, y (C) Chlorella vulgaris
A B
C
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6.2 Aclimatación del cultivo de Ceriodaphnia rigaudi.
La cepa de C. rigaudi, se mantuvo en las condiciones de experimentación por más de
tres meses, a fin de lograr su aclimatación a los tres tipos de microalgas y las dos
temperaturas ensayadas (20ºC y 25ºC). Después de este periodo, se estableció un lote
reproductivo para cada condición experimental, a partir del cual se seleccionaron al azar
los neonatos, para realizar los experimentos.
La renovación tanto del medio de cultivo (agua dura reconstituida) como del alimento
se realizaron cada tercer día para evitar la acumulación de excretas, y la falta de
alimento y oxígeno. El cultivo se mantuvo con un fotoperiodo de 16:8 hrs (luz:
oscuridad), y la renovación del lote reproductor se realizó cuando la reproducción
comenzaba a disminuir.
Antes de utilizar el medio de cultivo se probó su estabilización colocando organismos
de C. rigaudi en vasos de precipitados de 50 mL de capacidad y 40 mL del medio. Si
después de 24 horas los organismos mostraban buena movilidad se procedió a
emplearla. Para resultados más adecuados el agua debe tener los siguientes parámetros:
Dureza: 160 � 180 mg de CaCO3 L-1; Alcalinidad 110 � 120 mg de CaCO3 L-1; pH 7.6 �
8.0, y oxígeno disuelto 5 � 7 mg L-1.
6.3 Mortalidad y tiempo intercamada
Se realizaron dos series experimentales. En la primera se dio seguimiento individual,
para evaluar respuestas reproductivas y de ciclo de vida con mayor precisión. En el
segundo experimento se utilizaron cohortes y se realizó un estudio de tabla de vida.
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26
En el primer caso, los experimentos se realizaron en vasos de vidrio de 50 mL con un
volumen de prueba de 30 mL de agua dura reconstituida, preparada de acuerdo a la
formulación de la U.S. EPA (2002), con 10 réplicas por cada tratamiento; en cada
recipiente se colocó un neonato de C. rigaudi. El medio y el alimento se renovaron cada
tercer día. Diariamente se revisaron todas las réplicas, separando y contabilizando la
progenie, además de registrar la longevidad de todas las hembras reproductoras, hasta la
muerte del último organismo en todos los tratamientos. Con esta información se
determinó la progenie promedio por camada, la progenie total, la edad de primera
reproducción y el tiempo intercamadas (Martínez-Jerónimo et al., 1994).
6.4 Tabla de vida
Para el estudio de tabla de vida se emplearon cohortes de10 neonatos de C. rigaudi para
cada uno de los tratamientos antes descritos. En este caso se emplearon vasos de
precipitados con capacidad de 100 mL y con un volumen de prueba de 80 mL. En cada
vaso se colocaron los 10 neonatos y se contó con 5 réplicas para cada tratamiento.
Diariamente se revisaron todas las réplicas, se cuantificó el número de adultos
sobrevivientes de la cohorte inicial, y se separó y contó toda la progenie. La renovación
total del medio de cultivo y del alimento se realizó cada tercer día. El seguimiento de
este experimento se concluyó hasta que todos los individuos de la cohorte inicial
murieron.
Para el análisis de estos datos se emplearon los métodos demográficos estandarizados
de tabla de vida reportados por Krebs (1985) y Pianka (1988). Las ecuaciones que se
utilizaron fueron las siguientes:
a) Supervivencia o
x
NN
lx =
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27
b) Esperanza de vida =
c) Tasa Reproductiva bruta ∑∞
=0
mx
d) Tasa Reproductiva neta ∑= xx mlRo
e) Tiempo generacional o
xx
RxmlT ∑=
f) Tasa intrínseca de incremento poblacional 10
==∑=
−xx
x
rx mler (Ecuación de
Euler).
Para el análisis de los resultados se empleó el análisis de varianza bifactorial (ANOVA-
II), y para las comparaciones post hoc se aplicó la prueba de Tukey (Sokal y Rohlf,
1981).
De manera general, el diseño experimental puede resumirse de la siguiente manera:
A) MORTALIDAD Y TIEMPO INTERCAMADA
ALIMENTO 20°C 25°C
A. falcatus 10 replicas 10 replicas
P. subcapitata 10 replicas 10 replicas
C. vulgaris 10 replicas 10 replicas
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B) TABLA DE VIDA
ALIMENTO 20°C 25°C
A. falcatus 5 replicas 5 replicas
P. subcapitata 5 replicas 5 replicas
C. vulgaris 5 replicas 5 replicas
6.5. Medidas corporales de los neonatos
Para ambos diseños experimentales, se realizaron mediciones tanto del largo como del
ancho de los neonatos obtenidos de cada camada, con el fin de determinar si el tipo de
alimento o la temperatura tuvieron un efecto en el tamaño corporal de los organismos.
El análisis de los datos se realizó mediante un análisis de variancia bifactorial y el
análisis post hoc mediante una prueba de LSD Fisher.
6.6 Pruebas de toxicidad aguda
Para la determinación de la concertación letal media (CL50) se trabajó con una muestra
de petróleo crudo proveniente del Estado de Tabasco. La zona de procedencia se ubica
al Norte del Municipio de Nacajuca, pertenece al activo de producción Luna, que esta
formado por 27 pozos y una batería de separación.
La toxicidad aguda fue determinada por el protocolo establecido por la norma mexicana
NMX-AA-087-1995-SCFI. Los especimenes fueron neonatos (menores a 24 horas) del
cladócero Ceriodaphnia rigaudi. Para obtener la CL50 de la muestra, la toxicidad del
petróleo fue evaluada empleando la fracción soluble en agua (FSA) y adsorción del
petróleo crudo sobre caolín (APC).
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29
Se realizaron pruebas preeliminares con las dos formas de exposición para establecer los
intervalos de prueba definitivos que incluyen por lo menos 6 concentraciones mas el
control. Muestras de 30 mL fueron adicionadas en recipientes de vidrio de 50 mL de
capacidad, las cuales fueron cubiertas con película selladora DuraSeal para evitar la
evaporación de los compuestos. En las pruebas con el petróleo crudo adsorbido en
caolín, se adicionó un control adicional, el cual contenía la cantidad de caolín empleada
en la máxima concentración, esto para distinguir posibles daños de la arcilla sobre los
neonatos de C. rigaudi. Todas las concentraciones y controles se realizaron por
triplicado.
La respuesta evaluada fue la inmovilidad o muerte de los organismos y las
observaciones se realizaron a las 24 y 48 horas, todas las pruebas se realizaron en una
cámara de 20°C y un fotoperiodo de 16:8 (luz: oscuridad). Finalmente se aplicó el
método Probit a los datos de mortalidad de 48 horas para determinar la CL50 y sus
intervalos de confianza, para ello se empleó el software LC50 (Stephan, 1977).
La muestra de petróleo se proceso de la siguiente manera:
6.6.1 Fracción soluble en agua (FSA)
La fracción soluble en agua se obtuvo por la adición de una parte de petróleo por nueve
partes de agua de dilución (1:10 v v-1) en matraces Erlenmeyer cerrados herméticamente
con tapón y cubiertos con papel aluminio para reducir la evaporación de los
hidrocarburos volátiles (Phatarpekar y Ansari, 2000). En este caso 20 g de petróleo se
aforaron a 200mL de agua dura reconstituida, la muestra se homogeneizó con un
agitador magnético por 24 horas a 200 rpm manteniendo la muestra a 4° C.
Posteriormente, se colocó en un embudo de separación por 2 horas para lograr la
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30
separación de la mezcla, la fase acuosa se recuperó y se mantuvo en refrigeración hasta
la realización de las pruebas.
6.6.2 Adsorción del petróleo crudo sobre caolín (APC)
En esta prueba se empleó caolín (una arcilla inorgánica pulverizada, impalpable, inerte e
inocua) para adsorber el petróleo crudo y de esta manera permitir que las soluciones
fueran estables y garantizar el contacto directo con los organismos de prueba. Una
muestra de caolín anhídrido grado analítico se llevó a peso constante en una estufa a
70°C, la muestra de petróleo se adicionó gota por gota al caolín a razón de 0.3 g de
petróleo por cada gramo de caolín. Esta proporción se determinó experimentalmente
como la adecuada para permitir la adsorción completa del petróleo sin excedentes que
puedan aglomerarse y posteriormente separarse de la fase acuosa en las diluciones
(Martínez-Jerónimo et al., 2005).
La mezcla se colocó en un matraz de 50mL herméticamente sellado y se mezcló
perfectamente con un agitador magnético para lograr una adsorción plena sobre las
partículas de caolín. La mezcla se dejó reposar 24 horas a 4°C para lograr la adsorción
completa de los hidrocarburos a la arcilla. Se resuspendió con agua dura reconstituida y
se aforo a 1 litro, esta solución se mantuvo en refrigeración hasta la realización de las
pruebas.
6.7 Pruebas de toxicidad crónica (21 días)
A partir de la CL50 determinada para la muestra de adsorción por caolín, se calcularon
las concentraciones subletales empleando factores de aplicación. De esta manera, fue
posible establecer concentraciones de seguridad que no generaran respuestas letales. El
valor del factor de aplicación (FA) puede variar de 3 a 25 para una amplia variedad de
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31
compuestos tóxicos inorgánicos y orgánicos (Martínez-Jerónimo et al., 1993; USEPA
2002). Para este estudio, además del control y el control más caolín (el cual contenía la
máxima concentración de caolín que se aplicó en los tratamientos) se ensayaron tres
concentraciones, establecidas con base a los factores de aplicación 25, 10 y 3; las cuales
equivalen a 0.0000212 g L-1, 0.000053 g L-1 y 0.00018 g L-1 respectivamente.
Se evaluó el efecto subletal de la muestra de petróleo durante un periodo de 21 días, el
número de replicas para cada tratamiento fue de 10 recipientes para la determinación de
la mortalidad y tiempo intercamada, y de 5 recipientes en el caso del análisis de tabla de
vida. Como alimento, se proporcionó la microalga con la cual se obtuvieron los valores
más altos en los parámetros poblacionales durante los experimentos de biología
reproductiva. La solución de prueba y el alimento se renovaron cada tercer día, y se
mantuvo a los organismos a una temperatura de 20°C, con un fotoperiodo de 16:8 horas
(luz: oscuridad). Se aplicó un análisis de varianza unifactorial y la comparación post hoc
se realizó empleando la prueba de LSD Fisher.
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7. Resultados
7.1 Mortalidad y tiempo intercamada.
Los valores más altos de longevidad promedio se registraron en los tratamientos con A.
falcatus en ambas temperaturas, mientras que los menores valores se observaron en los
individuos alimentados con la microalga C. vulgaris (fig. 2A). Con respecto a la
temperatura, de manera general se observó que aquellos organismos que se
desarrollaron a 20ºC fueron más longevos que los que crecieron a 25ºC, con registros de
43 hasta 69 días a 20°C, y de 17 a 44 días en la temperatura de 25ºC. El análisis de
variancia (ANOVA) bifactorial demostró que tanto la temperatura como el tipo de
alimento tuvieron un efecto significativo en la longevidad de C. rigaudi (P<0.001 para
ambos factores), mientras que la interacción Alimento x Temperatura no fue
significativa (P=0.745). La prueba de Tukey indicó que los tratamientos con C. vulgaris
en ambas temperaturas presentaron valores significativamente más bajos que los
tratamientos con A. falcatus (P<0.001) y P. subcapitata (P<0.001), los cuales no
difieren significativamente entre si (P=0.172).
Los valores más altos con respecto a la progenie total, se obtuvieron en los organismos
que fueron alimentados con A. falcatus, en ambas temperaturas (fig. 2B), mientras que
los organismos que consumieron C. vulgaris produjeron un menor número de neonatos.
Por otro lado, la progenie total fue mayor a 25ºC. El análisis de variancia bifactorial
(ANOVA) indica que tanto la temperatura como el tipo de alimento influyeron
significativamente en el número de neonatos que produjo cada hembra (P=0.004 y
P<0.001 respectivamente), mientras que la interacción Temperatura x Alimento no fue
significativa (P = 0.631). La prueba de Tukey indicó que los organismos a los que se
suministro la microalga C. vulgaris tuvieron una progenie total significativamente
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33
menor, con respecto a la obtenida en los tratamientos con P. subcapitata (P<0.001) y A.
falcatus (P<0.001).
Con respecto al número promedio de crías por camada que se produjo en cada
tratamiento, se obtuvo que en ambas temperaturas, el mayor tamaño de camada se
presentó en aquellos organismos alimentados con P. subcapitata, mientras que los
valores más bajos se registraron en los organismos que consumieron A. falcatus (fig.
2C). El ANOVA bifactorial demostró que solo la temperatura tuvo un efecto
significativo (P<0.001) sobre esta variable reproductiva, mientras que el alimento, así
como la interacción entre ambos factores, no fueron significativos (P= 0.5640 y
P= 0.6340, respectivamente). La prueba de Tukey indicó que aquellos tratamientos
sometidos a 25ºC tuvieron camadas significativamente más numerosas que los
tratamientos a 20ºC (P<0.001).
El menor número de camadas se presentó en los tratamientos con C. vulgaris, mientras
que los valores más altos se registraron con A. falcatus (fig. 2D). El ANOVA bifactorial
indicó que tanto la temperatura (P=0.001), como el tipo de alimento (P<0.001) son
factores con un efecto significativo en la frecuencia reproductiva de C. rigaudi. La
interacción entre estos dos factores no fue significativa (P=0.1702). De acuerdo con la
prueba de Tukey, hubo diferencias significativas en los efectos producidos por las tres
microalgas, en ambas temperaturas ensayadas.
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La edad de madurez sexual de C. rigaudi, que corresponde al tiempo de la primera
reproducción, se registró entre 4 y 7 días a 25º C, mientras que los organismos a 20ºC
lograron la primera reproducción hasta después del décimo día (fig. 2E). De acuerdo al
ANOVA II, la temperatura fue el único factor que influyó de manera significativa
(P<0.001) en la edad de primera reproducción, ya que el tipo de alimento y la
interacción entre ambos factores no fueron significativas (P=0.4332, P=0.3827). La
prueba de Tukey indicó que los organismos a 25ºC alcanzaron la madurez sexual
significativamente más rápido que los organismos que crecieron a 20ºC (P<0.001).
Con respecto a los resultados obtenidos de la medición de los neonatos, los organismos
de mayor tamaño se obtuvieron con las microalgas P. subcapitata y A. falcatus en
ambas temperaturas, mientras que los neonatos obtenidos a partir de organismos
alimentados con la microalga C. vulgaris, fueron significativamente mas pequeños
(fig.3). El ANOVA bifactorial mostró que la temperatura y la interacción entre los dos
factores no tuvieron una influencia significativa en el largo y ancho de los neonatos,
mientras que el tipo de alimento fue el factor que mas influyó en la talla de los neonatos
(P= 0.0013, P= 0.010).
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20ºC 25ºC
LON
GEV
IDAD
(dia
s)
0
10
20
30
40
50
60
70
20ºC 25ºC
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14
A. falcatusP. subcapitataC. vulgaris
TEMPERATURA TEMPERATURA
a
a
bc
c
d
a
a
b
c
c
da a
a
b
b b
a
b
c
d
e
f
a
a
bb
b
a
Figura 2. Variables reproductivas de C. rigaudi obtenidas con tres tipos de alimento (Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus y Chlorella vulgaris) y dos temperaturas. Las letras sobre las barras indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
A
B C
D E
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Figura 3. Variación en la talla de los neonatos de C. rigaudi obtenidos durante la evaluación de la mortalidad y tiempo intercamada, con tres tipos de alimento Pseudokirchneriella subcapitata (PS), Ankistrodesmus falcatus (AF) y Chlorella vulgaris (CV) y dos temperaturas. Las letras sobre las líneas indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
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37
7.2 Tabla de vida.
Con respecto a los resultados del análisis de tabla de vida, se observó que las curvas de
supervivencia (fig. 4) presentan tendencias distintas, aunque sólo es posible distinguir
diferencias claras con respecto a la máxima longevidad de los individuos en la cohorte.
Para los tratamientos a 20 ºC alimentados con A. falcatus sólo se registró mortalidad
hasta después del día 9, y a partir del décimo día la supervivencia comenzó a disminuir
gradualmente hasta la muerte de todos los organismos el día 63. En el caso de P.
subcapitata la supervivencia comenzó a disminuir a partir del día 8 con una tendencia
que se prolongó hasta el día 59. Con C. vulgaris se registró mortalidad a partir del día 8
y la máxima longevidad de la cohorte fue de 53 días. A la temperatura de 25º C la
supervivencia comenzó a disminuir antes, ya que para el tratamiento con A. falcatus se
mantuvo hasta el día 6 sin mortalidad y después disminuyó gradualmente hasta el día
51. Con P. subcapitata la mortalidad se inició a partir del día 4 y se prolongó hasta los
43 días, en que murió el último organismo. Finalmente con C. vulgaris el día 5 comenzó
la mortalidad de la cohorte, con una tendencia gradual hasta el día 35.
La fecundidad (mx) alcanzó los valores más altos a 25ºC (fig. 5). A 20º C se obtuvo un
pico de fecundidad a los 26 días, con una mx de 1.15 neonatos hembra�1 para los
organismos alimentados con A. falcatus, y la reproducción cesó el día 32. Para las
hembras alimentadas con P. subcapitata se obtuvo un valor máximo de 2.91 neonatos
hembra -1 el día 22, disminuyendo con el tiempo hasta el día 56. Con C. vulgaris al día
23 se presentó un valor máximo de 1.42 neonatos hembra-1 hasta el día 40 en el cual
cesó la producción de crías. A 25ºC los mayores valores de fecundidad se presentaron
los días 26 (4.05 neonatos hembra-1), 11 (3.45 neonatos hembra-1) y 9 (3.32 neonatos
hembra-1) para A. falcatus, P. subcapitata y C. vulgaris, respectivamente, mientras que
ENCB-IPN
38
la reproducción cesó al día 39 en A. falcatus, el día 32 para P. subcapitata y con C.
vulgaris el día 23.
La esperanza de vida al nacimiento fue más alta en los tratamientos a 20 º C (fig. 6); en
los individuos alimentados con P. subcapitata se obtuvo el valor más alto (44.24± 3.64
días), y con C. vulgaris el menor (28.95± 3.38 días). En lo que respecta a los
tratamiento a 25 ºC, con A. falcatus se registró el valor más alto (34.09± 9.47 días) y fue
nuevamente con C. vulgaris el alimento en el cual se obtuvo el valor más bajo de
esperanza de vida (28.95± 3.38). El análisis de varianza indicó que tanto el alimento
como la temperatura influyeron de manera significativa sobre este parámetro (P<0.001
y P= 0.007 respectivamente), y en este caso la interacción entre ambos factores también
fue significativa (P=0.006).
Los mayores valores de longevidad se registraron a 20°C (fig. 7A), y los organismos
que se alimentaron con P. subcapitata fueron los mas longevos (44.74±3.64 días),
mientras que los alimentados con C. vulgaris tuvieron una menor longevidad (29.45±
3.38 días). El análisis de varianza indicó una influencia significativa tanto del tipo de
alimento (P = 0.005) como de la temperatura (P<0.001) sobre la longevidad de C.
rigaudi, al igual que la interacción entre estos dos factores (P = 0.007).
Con respecto a la tasa reproductiva neta (Ro) de C. rigaudi (fig. 7B), a 25 º C el valor de
Ro fue mayor en los organismos alimentados con A. falcatus (42.67± 2.36 neonatos
hembra-1), mientras que a 20ºC los organismos que se alimentaron con P. subcapitata
presentaron el mayor valor de Ro (25.54± 4.57 neonatos hembra-1). El análisis de
varianza indicó que la temperatura, el tipo de alimento y la interacción entre los dos
factores fueron significativos (P<0.001).
ENCB-IPN
39
El tiempo generacional (T) de C. rigaudi a 20 ºC fue mayor que el determinado a 25 ºC
(fig. 7C). A 20°C los organismos alimentados con P. subcapitata tuvieron el valor de T
más alto (28.50 ± 1.69 días), mientras que a 25ºC fueron los que se alimentaron con A.
falcatus los que tuvieron el mayor tiempo generacional (17.17 ± 1.15 días). El análisis
de varianza indicó que el tipo de alimento, la temperatura y la interacción entre estos
dos factores fueron significativos (P<0.001).
Por último, los valores más altos de tasa intrínseca de incremento poblacional (r) se
registraron a 25ºC. De acuerdo al ANOVA II aplicado, la temperatura produjo un efecto
significativo sobre r (P<0.001), mientras que el tipo de alimento y la interacción entre
los factores no fueron significativos (P=0.055 y P=0.182, respectivamente). La prueba
de Tukey, mostró que los valores de r obtenidos a 25ºC fueron significativamente más
altos que los obtenidos a 20ºC (P<0.001) (Fig. 7D).
ENCB-IPN
40
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
SU
PER
VIV
ENC
IA(lx
)
TIEMPO (dias) TIEMPO (dias)
20ºC 25ºC
A. falcatus A. falcatus
P. subcapitata P. subcapitata
C. vulgaris C. vulgaris
Figura 4. Curvas de supervivencia de C. rigaudi alimentada con Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus y Chlorella vulgaris, bajo dos temperaturas
ENCB-IPN
41
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6A. falcatus
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6P. subcapitata
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6C. vulgaris
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6A. falcatus
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6P. subcapitata
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6C. vulgaris
FEC
UN
DID
AD
(mx)
TIEMPO (dias) TIEMPO (dias)
20ºC 25ºC
Figura 5. Curvas de fecundidad de C. rigaudi alimentada con Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus y Chlorella vulgaris, bajo dos temperaturas.
ENCB-IPN
42
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50A. falcatus
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50P. subcapitata
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50C. vulgaris
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50A. falcatus
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50P. subcapitata
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50C. vulgaris
20ºC 25ºC
TIEMPO(dias) TIEMPO(dias)
ESPE
RAN
ZA D
E VI
DA
(ex)
Figura 6. Curvas esperanza de vida de C. rigaudi alimentada con Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus y Chlorella vulgaris, bajo dos temperaturas.
ENCB-IPN
43
Figura 7. Parámetros de historia de vida de C. rigaudi obtenidos con tres tipos de alimento (Ankistrodesmus falcatus, Pseudokirchneriella subcapitata y Chlorella vulgaris) y dos temperaturas. Las letras sobre las barras indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
20ºC 25ºC
LON
GE
VID
AD
PR
OM
ED
IO (d
ias)
0
10
20
30
40
50
A. falcatusP. subcapitataC. vulgaris
20ºC 25ºCTASA
REP
RO
DU
CTI
VA N
ETA
(neo
nato
s he
mbr
a -1
)
0
10
20
30
40
50
60
TEMPERATURA
20ºC 25ºC
TIEM
PO
GEN
ERAC
ION
AL
(dia
s)
0
5
10
15
20
25
30
35
TEMPERATURA
20ºC 25ºC
TAS
A D
E IN
CR
EME
NTO
PO
BLA
CIO
NAL
(tie
mpo
-1)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
a
b
ac
c c
a
b
c
d
e
d
a
b
c d
ee
a aa
b
b
b
A B
C D
ENCB-IPN
44
Con respecto a la talla, en el caso de el largo de los organismos, es evidente que los de
menor tamaño se obtuvieron con la microalga C. vulgaris (fig. 8). El ANOVA II no
indicó una influencia significativa de ninguno de los factores evaluados.
Con respecto al ancho de los organismos, se observa que aquellos neonatos obtenidos
con la microalga P. subcapitata presentan un valor significativamente mayor al resto de
los tratamientos. El ANOVA II indicó que tanto la temperatura como el alimento, así
como la interacción entre ambos factores, tuvieron una influencia significativa
(P=0.0083, P< 0.001 y P=0.0123 respectivamente).
ENCB-IPN
45
Figura 8. Variación en la talla de los neonatos de C. rigaudi obtenidos en la evaluación de tabla de vida, con tres tipos de alimento (Pseudokirchneriella subcapitata, Ankistrodesmus falcatus y Chlorella vulgaris) y dos temperaturas. Las letras sobre las líneas indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
ENCB-IPN
46
7.3 Pruebas de toxicidad aguda
Los valores de concentración letal media estimados para las dos formas de exposición
de la muestra, determinadas por el método Probit con sus respectivos intervalos de
confianza, son los siguientes:
Tabla 1. Valores de concentración letal media (48 horas) estimados para las dos formas de exposición de la muestra de petróleo; adsorción por caolín (APC) y fracción soluble en agua (FSA).
Forma de exposición CL50 (g L-1) Limite inferior Limite superior
Adsorción por caolín 0.00053 0.00044 0.00061
Fracción soluble en Agua 0.0143 0.0067 0.0219
Al realizar la comparación entre las dos formas de exposición, se puede observar
claramente que la fracción soluble resultó menos tóxica que la adsorción por caolín
(tabla 1). En ninguno de los bioensayos realizados se obtuvo mortalidad en los
controles, lo que descarta un posible efecto negativo del caolín sobre los neonatos de
Ceriodaphnia rigaudi. El análisis de Kruskall-Wallis indicó que si existe una diferencia
significativa entre las formas de exposición (P = 0.024).
ENCB-IPN
47
7.4. Pruebas de toxicidad crónica 21 días.
7.4.1 Mortalidad y tiempo intercamada
Para la progenie total, se puede observar una disminución en el número de neonatos
generados conforme aumenta la concentración del tóxico (fig.9A). En el caso particular
del factor de aplicación 10 se observa un aumento en el valor promedio de la progenie
total con respecto al resto de los factores de aplicación evaluados, sin embargo, este
sigue siendo menor al obtenido en los dos controles (control y control + caolín). El
ANOVA indicó que existe una diferencia significativa entre los tratamientos (P=
0.000029), teniendo que el valor mas bajo se obtuvo con el factor de aplicación 3, el
cual difiere significativamente del resto de los tratamientos. Por otro lado, no se
observaron diferencias significativas entre la progenie total obtenida en los dos
controles.
Las camadas con mayor número de neonatos se presentaron en el control, observando
una disminución tanto en el control con caolín como en la concentración más baja del
tóxico (fig. 9B). A pesar de que el resto de las concentraciones presentan camadas más
numerosas que estos últimos, son de menor tamaño que el control. De acuerdo con el
ANOVA, existe una diferencia significativa entre los tratamientos (P=0.031) sobre el
número de neonatos por camada. La prueba de LSD Fisher indicó que el control tuvo
camadas significativamente más numerosas que el control con caolín y la concentración
más baja del tóxico (factor de aplicación 25), pero no difiere significativamente del
resto de las concentraciones evaluadas (factores de aplicación 10 y 3).
El menor número de camadas se presentó en la concentración más alta evaluada,
mientras que los valores más altos se obtuvieron en los controles (fig. 9C). El ANOVA
indicó que existe una diferencia significativa entre el número de camadas obtenidas en
ENCB-IPN
48
cada tratamiento (P<0.001). De acuerdo con la prueba de LSD Fisher, el número de
camadas obtenidas con la mayor concentración del tóxico es significativamente menor
que el obtenido con el resto de los tratamientos.
Para el caso de la edad de la primera reproducción, se obtuvo que los organismos de los
controles alcanzaron la madurez sexual entre el cuarto y quinto día; mientras que
aquellos expuestos a las distintas concentraciones del crudo comienzan a reproducirse
hasta después del sexto día. De acuerdo al ANOVA, la diferencia entre los tratamientos
no es significativa (P=0.1018), sin embargo se puede observar un aumento en la edad
para la reproducción conforme aumenta la concentración del tóxico (fig. 9D).
Con respecto al tiempo intercamada, se observó que en la concentración más alta del
tóxico el tiempo entre cada camada se reduce a un día en promedio, siendo este valor
significativamente mas pequeño que el resto de los tratamientos (fig. 9E). El ANOVA
indica una diferencia significativa entre los tratamientos (P=0.036), en general, se puede
observar una disminución del tiempo intercamada con el aumento de la concentración
del crudo.
Con respecto al tamaño corporal, el ANOVA indicó una diferencia significativa entre
los tratamientos (P <0.001). En relación al largo y ancho de los neonatos, se observa
que los organismos más pequeños se obtuvieron en la concentración más alta del tóxico,
siendo estos significativamente menores en talla que el resto de los tratamientos,
mientras que los organismos más grandes se presentaron en los controles (fig. 10).
ENCB-IPN
49
Figura 9. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo (FA= 25: 0.0000212g L-1; FA= 10: 0.000053g L-1; FA= 3: 0.00018g L-1), sobre las variables reproductivas de Ceriodaphnia rigaudi. Las letras sobre las líneas indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
ENCB-IPN
50
Figura 10. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo (FA= 25: 0.0000212g L-1; FA= 10: 0.000053g L-1; FA= 3: 0.00018g L-1), sobre la talla de los neonatos de Ceriodaphnia rigaudi, obtenidos durante el experimento de mortalidad y tiempo intercamada. Las letras sobre las líneas indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
ENCB-IPN
51
7.4.2 Tabla de vida
Las curvas de supervivencia (fig. 11) presentan tendencias distintas, observándose
diferencias entre los tratamientos. En el caso del control se registró una disminución
constante después del día 16, mientras que en el control con caolín se observa que la
supervivencia de la cohorte se mantuvo hasta el día 19. En el caso del los organismos
sometidos a la concentración más baja del tóxico (FA= 25), la supervivencia comenzó a
disminuir a partir del día 14 presentando una baja mortalidad hasta el final del periodo
de exposición. Con los factores de aplicación de 10 y 3 se registró mortalidad a partir
del día 11, con una disminución gradual hasta el final del periodo de exposición.
La fecundidad (mx) alcanzó un valor promedio máximo de 5 neonatos hembra�1 en
todos los tratamientos (fig. 12) y se registró entre los días 9 y 11. De manera general, se
observa una mayor actividad reproductiva, durante el periodo de exposición, en las
hembras sometidas a la máxima concentración del tóxico (FA= 3).
En el caso de la tasa reproductiva neta, el valor de Ro fue mayor en los controles
mientras que el valor más bajo se presentó en la concentración más alta (fig.13A). El
análisis de varianza no indicó una diferencia significativa entre los tratamientos
(P=0.275), sin embargo se observa una disminución en el valor de Ro conforme aumenta
la concentración del crudo.
Con respecto al tiempo generacional (T), se observó que el valor más alto se presentó en
el control con caolín, mientras que el valor más bajo se obtuvo con el factor de
aplicación de 3 (fig. 13B). El ANOVA indicó que existen diferencias significativas
entre los tratamientos (P= 0.0428), y de acuerdo al análisis LSD Fisher, el valor de T
ENCB-IPN
52
obtenido en el control con caolín fue significativamente mayor que el registrado para el
control y la mayor concentración del tóxico.
Finalmente, en el caso de la tasa intrínseca de incremento poblacional (r), el ANOVA
no indicó diferencias significativas entre los tratamientos (P=0.0718), sin embargo, se
observa una disminución en los valores obtenidos en el control con caolín y las dos
primeras concentraciones evaluadas con respecto del control. Por otro lado, el valor de r
obtenido con el factor de aplicación 3 es mayor al del resto de las concentraciones
ensayadas, pero no es mayor que el control (fig. 13C).
ENCB-IPN
53
Figura 11. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre la supervivencia de C. rigaudi. (A) Control, (B) control + caolín, (C) FA= 25: 0.0000212g L-1 ;(D) FA= 10: 0.000053g L-1;(E) FA= 3: 0.00018g L-1).
ENCB-IPN
54
Figura 12. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo sobre la fecundidad de C. rigaudi. (A) Control, (B) control + caolín, (C) FA= 25: 0.0000212g L-
1 ;(D) FA= 10: 0.000053g L-1;(E) FA= 3: 0.00018g L-1).
ENCB-IPN
55
Figura 13. Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo (FA= 25: 0.0000212g L-1; FA= 10: 0.000053g L-1; FA= 3: 0.00018g L-1), sobre los parámetros de historia de vida de C. rigaudi. Se observa la Tasa reproductiva neta (neonatos hembra -
1), tiempo generacional (días) y la tasa intrínseca de crecimiento poblacional (r).
ENCB-IPN
56
El análisis de las tallas indicó que los organismos de menor tamaño, tanto de largo
como de ancho, se obtuvieron con el factor de aplicación 3, mientras que los
organismos de mayor talla se obtuvieron en los controles. El tamaño de los neonatos
disminuye conforme aumenta la concentración del tóxico (fig.14). El análisis de
varianza indicó que tanto en el largo como en el ancho de los neonatos, hubo una
influencia significativa del tóxico (P<0.001).
Figura 14 Efecto de diferentes concentraciones subletales de petróleo crudo (FA= 25: 0.0000212g L-1; FA= 10: 0.000053g L-1; FA= 3: 0.00018g L-1), sobre la talla de los neonatos de C. rigaudi obtenidos durante el experimento de tabla de vida. Las letras sobre las líneas indican las diferencias significativas entre los tratamientos.
ENCB-IPN
57
8. Discusión
La reproducción y el ciclo de vida de C. rigaudi fueron afectados por la temperatura y
el tipo de alimento suministrado. Los organismos que consumieron las microalgas A.
falcatus y P. subcapitata tuvieron mayor longevidad, mayor número de camadas y
mayor progenie total que las registradas en los especimenes alimentados con C.
vulgaris. Esto podría indicar que C. rigaudi, pese a ser un cladócero de talla pequeña,
es un filtrador no selectivo en lo que se refiere al tamaño y forma de las partículas
alimentarias. A pesar de ser A. falcatus la microalga de mayor tamaño, junto con P.
subcapitata produjeron las mejores respuestas reproductivas y la mayor longevidad.
Este resultado contrasta con lo obtenido por Fileto et al. (2004), quienes observaron que
especies como Ceriodaphnia cornuta, Daphnia gesseneri y Moina micrura presentaron
mayor reproducción y mejor crecimiento poblacional cuando consumieron partículas
alimentarias menores a 20 µm; es importante señalar que C. rigaudi es de talla
semejante a C. cornuta y de menor tamaño que las otras dos especies, por lo que es
posible que algunos otros factores pudieran influir en los resultados aquí presentados.
Cabe señalar que la microalga A. falcatus, a pesar de ser la de mayor tamaño de las tres
empleadas (40 µm de longitud promedio), y cuya longitud es poco menos de una
décima parte de la talla de los adultos de C. rigaudi, pudo ser consumida de manera
adecuada y producir excelentes rendimientos en términos de reproducción y ciclo de
vida.
De manera particular, los bajos valores en los parámetros reproductivos observados con
la microalga C. vulgaris pudieran deberse, mas que a una deficiencia nutricional, a la
presencia de algún metabolito con efectos negativos sobre C. rigaudi. A este respecto
ENCB-IPN
58
se ha reportado la presencia de un compuesto conocido como �chlorellin� en los
cultivos de Chlorella vulgaris, principalmente en aquellos mayores a 15 días de
crecimiento, el cual puede tener efectos a nivel de membrana, cambiando la
polarización y estructura lipídica de la misma (Pratt y Fong, 1940; Klausner et al.,
1980; Ikawa 2004).
La biología reproductiva de C. rigaudi fue afectada por la temperatura, a 20°C los
organismos resultaron ser mas longevos pero la progenie total fue baja, con numerosas
camadas de pocos neonatos. A 25°C la longevidad fue menor y aunque el número de
camadas fue comparativamente reducido, el número de neonatos en cada una de ellas
fue mayor y por lo tanto la progenie total fue superior. Estos resultados pudieran
relacionarse con los efectos fisiológicos de la temperatura reportados para otras especies
de cladóceros, ya que se ha mencionado que altas temperaturas promueven una mayor
actividad natatoria y una mayor tasa de ingesta de alimento, que también se relaciona
con mayores ritmos metabólicos y una maduración mas rápida de los huevos (Watts y
Young 1980; Hardy y Duncan, 1994; Amarasinghe et al., 1997; Loiterton et al., 2004).
A bajas temperaturas, los procesos de maduración sexual y reproductivos se retardan,
como se observó en los organismos mantenidos a 20°C, en los que la edad de la primera
reproducción fue posterior. Resultados diferentes son reportados por Villalobos y
González (2006) para C. cornuta, una especie muy semejante en tamaño, ya que los
autores indican que la mayor fecundidad en esa especie se presenta a bajas
temperaturas, estas diferencias pueden deberse a factores como la localización
geográfica de las especies y las diferencias en las condiciones de cultivo empleadas para
la determinación de los parámetros reproductivos.
ENCB-IPN
59
De acuerdo al análisis de tabla de vida, C. rigaudi presenta una tasa de mortalidad
relativamente constante a lo largo de su ciclo de vida, por lo tanto, se obtuvieron curvas
de supervivencia tipo II en ambas temperaturas.
La mayor fecundidad en el caso de los organismos sometidos a 25°C, se registró
principalmente en el primer tercio del ciclo de vida teniendo una tasa reproductiva neta
(Ro) alta. La longevidad promedio fue baja respecto de los especimenes sometidos a
20°C, este fenómeno repercutió en tiempos generacionales cortos y con una tasa de
incremento poblacional alta.
En el caso de los organismos cultivados a 20°C la fecundidad fue menor y se registró en
la mayor parte del ciclo de vida, por lo que la tasa reproductiva neta fue baja. La
longevidad promedio fue alta, lo que conlleva un mayor tiempo generacional y una tasa
de crecimiento poblacional baja. Estos resultados confirman la relación inversa que
existe entre los parámetros reproductivos y la temperatura (Bunioto y Arcifa, 2007), ya
que el tiempo de desarrollo embrionario y el numero de camadas son mayores cuando la
temperatura disminuye.
Es difícil comparar los resultados obtenidos en el presente estudio con otros pre-
existentes para C. rigaudi, pues la información publicada es bastante reducida. Por lo
tanto, las comparaciones que se presentan a continuación corresponden a otras especies
de cladóceros. La longevidad de C. rigaudi (30 .7± 5.91dias ) alimentada con la
microalga A. falcatus, fue menor al reportado por Martínez-Jerónimo et al. (1994) para
Daphnia magna (74.2 ±13.5 días) con esta misma microalga, y al reportado para
Ceriodaphnia dubia (Cowgill et al., 1985) de 125 días a 20ºC; sin embargo, las
diferencia se pueden deber a las características de cada especie, que también se explican
ENCB-IPN
60
por las diferencias en talla, ya que de acuerdo a Gliwicz (1990), la talla es uno de los
principales factores que determina las estrategias reproductivas en el zooplancton.
En cladóceros de talla pequeña, como Ceriodaphnia cf. dubia, Rose et al. (2000)
registraron un valor de longevidad de 17 días empleando a P. subcapitata y A. falcatus
como alimento a una concentración de 15 x 104 células mL-1. Mientras que para Moina
micrura, Rodríguez�Estrada et al, (2003) reportan un valor de longevidad de 13.20 ±
0.72 días con A. falcatus como alimento. Por su parte, Fonseca y Rocha (2004) registran
un valor de longevidad de 29.8 ± 5.89 días para Ceriodaphnia silvestrii.
En todos los casos anteriores relativos a cladóceros de talla pequeña, la longevidad fue
menor que la observada para C. rigaudi en el presente estudio, esto es un dato relevante,
que parece indicar mejores condiciones para su mantenimiento y propagación.
En el presente estudio, la máxima progenie total registrada para C. rigaudi fue de 80
neonatos por hembra con la microalga A. falcatus, valor inferior al reportado para
Moina macrocopa (hasta 159 neonatos por hembra con las microalgas Ankistrodesmus
convolutus, Scenedesmus incrassatulus y Chlorella vulgaris a una concentración de 5
mg L�1, peso seco) (Martínez-Jerónimo y Gutiérrez-Valdivia, 1991). Sin embargo, esta
diferencia puede explicarse en función de las condiciones de cultivo de cada
experimento y de las distintas tallas que presentan estos cladóceros, aunque, la edad de
la primera reproducción fue semejante en ambas especies (4 días).
El valor más alto de tasa reproductiva neta obtenido en este trabajo fue de 42.67± 2.36
neonatos hembra-1, mayor al reportado por Nandini y Sarma (2002) para Ceriodaphnia
dubia y Moina macrocopa (36.6 y 17.4 neonatos hembra-1, respectivamente). Pese a
ENCB-IPN
61
tratarse de una especie de talla pequeña, los resultados del presente estudio indican que
esta especie tiene un alto potencial reproductivo.
Por otra parte, la máxima fecundidad promedio por camada para C. rigaudi fue de 4
neonatos hembra-1, que es menor al valor de 6 neonatos hembra-1.reportado por
Villalobos y González (2006), para C. cornuta, una especie de características muy
semejantes a C. rigaudi. Estos autores consideran a C. cornuta como una especie de
baja a moderada fecundidad. La fecundidad registrada para C. rigaudi tiene un valor
acorde con el tamaño de las crías, que si bien es cierto al considerarse baja, no llega a
ser inadecuada.
Al analizar el tamaño corporal de los neonatos, se observó que tanto la reproducción
individual como el derivado de las tablas de vida, los organismos de mayor talla
provinieron del cultivo con P. subcapitata y A. falcatus. Este resultado indica una
probable relación entre el tamaño corporal con el número y tamaño de camadas que
genera cada hembra. Basta recordar que también con estas dos microalgas se obtuvo el
mayor número de neonatos. En varios estudios se ha analizado la relación lineal entre el
tamaño corporal de algunos microcrustáceos con el número de huevos por camada que
además depende, entre otros factores, de la cantidad y calidad del alimento (Lynch,
1980; Gliwicz y Boavida, 1996).
Es importante mencionar que la calidad del alimento puede estar dada en función de
distintas características como son la morfología, la facilidad de digestión, la probable
toxicidad y la insuficiencia nutricional (von Elert, 2002). Con base en esas
consideraciones, se puede pensar que la microalga C. vulgaris tiene menor calidad para
Ceriodaphnia rigaudi.
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Las diferencias observadas sobre los efectos de los distintos alimentos empleados
podrían explicarse en términos de su contenido nutricional. Está demostrado que la
cantidad de ácidos grasos, proteínas, nitrógeno y fósforo de las microalgas afectan el
crecimiento de las poblaciones de cladóceros, ya que son elementos indispensables en la
síntesis de proteínas y hormonas involucradas en procesos de reproducción (Gulati y
DeMott, 1997; Vedre et al., 1999, Brett et al., 2000; Wacker y von Elert 2001; Persson,
2007).
Teniendo en cuenta que las condiciones de cultivo y el medio empleado fueron
exactamente las mismas para las tres microalgas, es posible inferir que el medio de
cultivo no fuera el mas adecuado para C. vulgaris, ya que los resultados tanto en
reproducción como en el tamaño corporal indican una posible carencia de los elementos
esenciales para la nutrición y desarrollo de C. rigaudi. Estos fenómenos posiblemente se
relacionan con la hipótesis de la tasa de crecimiento, donde se establece una conexión
entre la historia de vida, la composición elemental del cuerpo y los nutrientes que
requiere un organismo (Elser et al., 1996).
Es factible una limitación de ácidos grasos poliinsaturados de C. vulgaris como causa
de la menor talla registrada en los neonatos obtenidos con este alimento, ya que
VonElert (2002) ha mencionado que existe una relación entre la cantidad de ácidos
grasos y el crecimiento somático.
Las mejores condiciones de propagación para C. rigaudi, estimadas como respuesta
reproductiva, se obtuvieron cuando se alimentó con la microalga A. falcatus y el cultivo
se desarrolló a 25ºC. De acuerdo a los parámetros reproductivos obtenidos como
fecundidad, longevidad y supervivencia se puede inferir que, bajo estas condiciones C.
rigaudi podría ser producida en cultivos masivos como alimento para acuacultura,
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especialmente para consumidores de talla pequeña como larvas y juveniles de peces y
crustáceos.
Con respecto al efecto tóxico del petróleo, el efecto agudo de la muestra mostró una
clara diferencia de toxicidad en C. rigaudi, que fue mayor en el caso de petróleo crudo
adsorbido en caolín, hasta 20 veces más que la fracción soluble en agua. Este resultado
indica que para la evaluación toxicológica de muestras de petróleo, la fracción soluble
en agua subestima el daño, probablemente por la exclusión de hidrocarburos
hidrofóbicos que entran en contacto con los organismos acuáticos filtradores o
bentónicos. En un estudio previo, Martínez-Jerónimo et al. (2005) emplearon estas dos
formas de exposición con distintas muestras de crudo provenientes del estado de
Tabasco en neonatos de Daphnia magna y se encontró una respuesta similar a la del
presente estudio
La muestra de petróleo crudo tipo SEN empleada en este trabajo está conformada en un
92% por hidrocarburos aromáticos como el tolueno y xileno, que son virtualmente
solubles en agua y muy tóxicos, sin embargo son fácilmente perdidos por evaporación
(Guerra, 2005). Se ha determinado que la fracción soluble en agua tiene elevada
toxicidad en los organismos acuáticos pero ocurre en periodos de exposición cortos, ya
está constituida principalmente por hidrocarburos aromáticos que son altamente
volátiles (Phatapekar y Ansari, 2000). Mientras que el empleo del caolín posiblemente
permite una mayor incorporación del petróleo. Las diferencias encontradas en las dos
formas de exposición también pueden explicarse por la presencia de hidrocarburos
policíclicos aromáticos (HPA), los cuales son poco solubles en agua y se consideran
como el principal determinante de la toxicidad de este compuesto sobre los organismos
acuáticos (Payne et al., 1995). Debido a su baja solubilidad los HPAs entran al ambiente
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acuático por la adsorción a material particulado ya sea orgánico o inorgánico y al estar
adsorbidos en sedimentos pueden quedar disponibles para los organismos acuáticos,
principalmente para los filtradores (Bennet et al., 1999; Tolun et al., 2006).
Por otro lado, Bobra et al. (1989) menciona que la fracción soluble en agua produce un
menor efecto tóxico que el petróleo adherido a partículas ya que la interacción con
material inorgánico permite la formación de agregados (Omotoso et al., 2002). Debido a
esto es posible la estabilización de los hidrocarburos tanto en los sedimentos como en la
columna de agua (Martínez-Jerónimo et al., 2005).
Otro factor que podría explicar la diferencia de las dos formas de exposición es la
modificación química de los hidrocarburos. En la exposición total de la muestra de
crudo, la permanencia de los componentes quizás es mayor con respecto a la fracción
soluble. Basta recordar que en el la columna de agua se pueden presentar procesos como
la oxidación producida por la luz UV. Los compuestos aromáticos fácilmente se
fotooxidan y son transformados a compuestos como hidroperóxidos, los cuales a su vez
dan lugar por medio de una transformación fotoquímica a fenoles pesados que suelen
ser más tóxicos que los compuestos que les dieron origen (Phatapekar y Ansari, 2000).
Cabe señalar que durante la realización de los bioensayos, los especimenes tratados con
altas concentraciones se ubicaban en la superficie, este hecho demuestra de manera
empírica la liberación de materiales volátiles presentes en la fracción soluble. Estos
químicos se introducen en las valvas de los organismos que por su volatilidad los
pueden empujar hacia la superficie e impiden su incorporación dentro la columna de
agua por el fenómeno de tensión superficial (Martínez-Jerónimo et al., 2004).
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Otro factor a considerar, es la estandarización del método de obtención de la fracción
soluble en agua, ya que factores como la proporción crudo: agua, el método de mezcla,
tiempo de mezclado y tiempo de separación pueden variar dependiendo de cada
laboratorio, por lo que en muchas ocasiones los resultados no son comparables (Singer
et al., 2000). Es importante resaltar que la exposición total del crudo mediante el
empleo de alguna arcilla inorgánica permite, en primer lugar, la incorporación de la
mayoría de los componentes del petróleo y en segundo término, proporciona un método
estandarizado para la evaluación sobre los efectos del petróleo crudo.
Martínez-Jerónimo et al (2005), empleando la misma forma de exposición total por
caolín y la misma muestra de crudo (SEN), obtuvieron una CL50 de 0.0050g L-1 para
Daphnia magna, cantidad superior a la encontrada en este trabajo para Ceriodaphnia
rigaudi. Esto indica que esta especie presenta una mayor sensibilidad a este compuesto,
hallazgo que resulta importante ya que D. magna es una especie que no puede
encontrarse de manera natural en los cuerpos de agua de México, mientras que C.
rigaudi además de ser nativa en los sitios de posible contaminación por petróleo, ha
demostrador tener la suficiente susceptibilidad para ser usado como bioindicador.
Finalmente los resultados obtenidos pueden extrapolarse al resto de la comunidad
zooplanctónica y tener una idea más precisa de las consecuencias posteriores para
niveles superiores de organización biológica.
En la segunda parte del análisis de la muestra de petróleo, se evaluó el efecto subletal
sobre los parámetros reproductivos de la especie de estudio. Se encontraron variaciones
de las respuestas reproductivas en los tres factores de aplicación, siendo en la mayoría
de las respuestas evaluadas, menores que las observadas en los controles.
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En lo que respecta a la reproducción individual se observó que los parámetros evaluados
se ven afectados por la presencia del tóxico. La edad de reproducción se retrasa
conforme aumenta la concentración del crudo, de igual manera, la progenie total y el
número de camadas disminuyen. En el resto de las respuestas evaluadas, se pudo
observar un incremento en la actividad reproductiva en términos del tamaño y tiempo
intercamada con el aumento de la concentración del crudo. Es probable que estos
resultados se deban a una estrategia reproductiva especial a consecuencia del estrés
provocado por el tóxico, ya que los organismos comienzan a aumentar el tamaño de las
camadas disminuyendo el tiempo de formación entre cada una de estas.
El efecto negativo del tóxico a concentraciones subletales sobre la biología reproductiva
de la especie de estudio también se hizo evidente mediante el análisis de tabla de vida.
En lo que respecta a la tasa reproductiva neta, se observó una disminución del promedio
de descendientes producidos por individuo conforme aumenta la concentración del
tóxico. En cuanto al tiempo generacional se observaron variaciones sin un patrón
definido, ya que el valor más alto de este parámetro se obtuvo en el control con caolín.
Es importante mencionar que a pesar de que se comprobó la inocuidad de la arcilla tanto
en los bioensayos agudos como en los crónicos, cabe la posibilidad de efectos adversos
como la obstrucción de los apéndices torácicos, limitación en el intercambio de gases, y
modificación de la calidad del agua (Martínez-Jerónimo et al., 2005), que provocaron
un aumento en el tiempo de generación de los individuos.
Con excepción de lo registrado en el control con caolín, en el cual la supervivencia se
mantuvo hasta el día 19, los datos de supervivencia obtenidos no permiten distinguir un
efecto claro del tóxico, ya que a pesar de que en el resto de las respuestas reproductivas
evaluadas se observó un efecto crónico mayor en la concentración mas alta del tóxico,
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en el caso de la supervivencia, esta concentración parece tener una tendencia semejante
a la obtenida en el control. Es posible que efectos claros sobre este parámetro
demográfico se hagan evidentes durante un periodo de exposición mayor al empleado
en este estudio.
En cuanto al efecto del tóxico sobre los parámetros de tabla de vida, se detectó de
manera general que la reproducción estuvo afectada por el petróleo crudo ya que la
fecundidad, el tiempo generacional y el valor de r obtenidos indican que C. rigaudi
acelera su reproducción como respuesta al estrés.
En condiciones normales, es decir sin ningún efecto externo, existe una relación entre el
tiempo generacional, la tasa reproductiva neta (Ro) y la tasa intrínseca de incremento
poblacional (r) (Begon et al., 1999). Sin embargo en el presente trabajo se notaron
modificaciones en esta relación, probablemente a causa de una estrategia reproductiva
distintiva de la especie.
Por otro lado, el efecto nocivo del petróleo se hizo evidente en la talla de los
organismos, ya que tanto en la reproducción individual como en el análisis de tabla de
vida se observó que el largo y ancho de los organismos disminuye ante la presencia del
tóxico, teniendo que los organismos más grandes se obtuvieron en los controles,
mientras que los organismos de menor talla se observaron en la concentración más alta
del tóxico. Se sabe que el efecto tóxico del petróleo se debe a la acumulación de los
diferentes componentes del crudo en las membranas lipídicas, lo que provoca en primer
lugar, un daño fisicoquímico y fisiológico a este nivel estructural. Posterior a su ingreso
celular, los hidrocarburos policiclícos aromáticos (HPAs) pueden ocasionar daños en la
actividad enzimática y en sus receptores (Moore y Farrar, 1985; Lavarias et al, 2007). Si
las rutas metabólicas que involucran la síntesis de lípidos se afectan, entonces el daño
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repercute en la formación de fosfolípidos y triacilglicéridos que son precursores tanto de
los tejidos de adultos y como en la formación de los huevos. Estas alteraciones pueden
traer por consecuencia disminución o variación de la reproducción y del desarrollo
normal del organismo (Lavarías et al., 2007).
A pesar de que se advirtió un abatimiento en la reproducción con los tres factores de
aplicación, con el factor de aplicación 25 la respuesta tóxica fue menor, obteniendo un
valor cercano a los obtenidos en los controles con respecto al número de camadas, la
edad de la primera reproducción, el tiempo intercamada y la tasa reproductiva neta.
Estos resultados probablemente se deben a que la tasa metabólica es lo suficientemente
eficiente para detoxificar a los HAPs sin alterar mayormente los procesos reproductivos
(Lavarias et al., 2007).
La mayor sensibilidad de C. rigaudi frente a los efectos tóxicos del petróleo y con
respecto a Daphnia magna, su importancia ecológica en la transferencia de energía, la
elevada posibilidad de contacto con este tipo de tóxico, además de las características
reproductivas y la facilidad de manejo y mantenimiento en laboratorio, sin duda son
características que permiten ser considerado como organismo de prueba en ensayos
ecotoxicológicos. Aunque para que esto sea posible, es necesario comparar su
sensibilidad a diversos tóxicos de referencia. Sin embargo, el estudio de la biología
reproductiva mediante métodos como son el seguimiento manera individual y el análisis
de parámetros de tabla de vida, permitió obtener un panorama completo de las
estrategias reproductivas de C. rigaudi., un cladócero de amplia distribución en
diferentes ambientes, aunque poco estudiada experimentalmente. La información
obtenida no sólo permite ahora contar con un procedimiento para su cultivo y posible su
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empleo como organismo de prueba, sino que además contribuye a un mejor
conocimiento de la biología experimental de los cladóceros.
9. Prospectivas
Es importante mencionar que la evaluación de la toxicidad del petróleo sobre la
biología reproductiva de esta especie es solo una parte del amplio espectro de respuestas
que pueden ser evaluadas. Es necesario realizar estudios empleando diversos
biomarcadores para determinar los posibles cambios metabólicos que inciden sobre la
reproducción. Conocer si están involucradas enzimas de la detoxificación y cuáles son,
además de estimar cuál es la concentración mínima del tóxico que pudiera estar
desencadenando estas reacciones, si es que existen. En este trabajo no se pudo
determinar dicha concentración debido al planteamiento general del mismo; sin
embargo, se hizo evidente que el comportamiento de los componentes de la muestra de
petróleo varia dependiendo de la concentración. En este caso, en la reproducción
individua y con la concentración mas alta empleada, se observó mortalidad total al día
18 de vida, por lo que seria importante evaluar concentraciones intermedias para tener
una visión mas completa de la variación en las respuestas reproductivas. Por otro lado,
se ha mencionado que algunos hidrocarburos se acumulan en diferentes tejidos de
crustáceos y otros organismos acuáticos (Moore y Farrar, 1985; Weltens et al., 2000;
Lavarias et al, 2007), por lo que sería importante determinar, en el caso de particular de
C. rigaudi, que efecto tiene la bioacumulación en la reproducción así como en otros
miembros del zooplancton.
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10. Conclusiones
Las mejores condiciones de propagación para C. rigaudi se obtuvieron cuando se
alimentó con la microalga Ankistrodesmus falcatus y el cultivo se desarrolló a 25ºC,
mientras que la microalga Chlorella vulgaris, no es una buena fuente de alimento ya
que afecta la longevidad y reproducción de esta especie.
Ceriodaphnia rigaudi, presentó diferentes estrategias reproductivas que variaron
dependiendo de factores como la calidad del alimento y la temperatura, pero en general,
es una especie con alta capacidad de colonización y a pesar de ser una especie pequeña
puede alcanzar valores altos de longevidad, viéndose favorecida reproductivamente por
las altas temperaturas.
La talla de los neonatos de C. rigaudi se ve afectada por el tipo de alimento,
obteniéndose los organismos mas pequeños con la microalga Chlorella vulgaris.
La adsorción de petróleo crudo sobre caolín tiene un efecto tóxico agudo mayor al que
presenta la fracción soluble, ya que no limita la biodisponibilidad de los compuestos del
petróleo.
La biología reproductiva de C. rigaudi se ve afectada por la presencia del tóxico,
presentando una menor y más rápida reproducción con el aumento de la concentración
del tóxico. La concentración que ejerce un efecto tóxico menor es de 0.0000212 g L-1,
correspondiente al factor de aplicación 25.
El petróleo tiene un efecto negativo en la talla de los neonatos de C. rigaudi, siendo
estos más pequeños en concentraciones altas del tóxico.
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ENCB-IPN
78
12. Glosario
COHORTE: Grupo de individuos que nacen simultáneamente.
ESPERANZA DE VIDA (ex) Representa el tiempo que queda por vivir en promedio a un individuo que ha alcanzado el intervalo de edad �x�.
FACTOR DE APLICACIÓN: Cociente entre el que se divide la CL50 para obtener una concentración subletal.
FECUNDIDAD (mx): La media de individuos producidos por cada hembra superviviente.
SUPERVIVENCIA (lx). Proporción de organismos que viven al inicio de un intervalo de edad x
TASA DE INCREMENTO POBLACIONAL (r). Cambio del tamaño de la población por individuo y por unidad de tiempo.
TASA REPRODUCTIVA BRUTA. Media de descendientes producidos por cada individuo original durante un periodo reproductivo completo.
TASA REPRODUCTIVA NETA (Ro): Media de descendientes producidos por cada individuo original al final de la cohorte
TIEMPO GENERACIONAL (T). Número total de días de vida de los sobrevivientes que han alcanzado la edad x
ENCB-IPN
79
13. ANEXOS
Anexo 1. Formulación para a preparación del medio basal de Bold (Stein, 1973)
REACTIVO FÓRMULA CANTIDAD
1. Nitrato de Sodio (NaNO3) 250 g L-1
2. Sulfato de Magnesio (MgSO4 • 7H2O) 75 g L-1
3. Fosfato de Potasio dibásico (K2HPO4) 75 g L1
Fosfato de Potasio monobásico (KH2PO4) 75 g L-1
4. Cloruro de Sodio (NaCl) 25 g L-1
5. EDTA 50 g + 31 g KOH L-1
6. Sulfato de Fierro (FeSO4 • 7H2O) 4.89 g + 1 mL H2SO4
7. Ácido Bórico (H3BO3) 11.42 g L-1
8. Elementos traza:
• Cloruro de magnesio (MgCl2 • H2O) 1.44 g L-1
• Trióxido de molibdeno (MoO3) 0.71 g L-1
• Sulfato de cobre (CuSO4) 1.75 g L-1 |
• Nitrato de cobalto (Co(NO3)2) 0.49 g L-1
• Sulfato de zinc (ZnSO4) 8.82 g L-1
Los reactivos se disuelven en agua destilada y se deben de agreguen en orden
descendente.
ENCB-IPN
80
Anexo 2. Formulación del medio sintético (agua dura reconstituida) (U.S. EPA, 2002)
1. Bicarbonato de Sodio (NaHCO3) 192 mg L-1
2. Sulfato de Calcio (CaSO4) 120 mg L-1
Sulfato de Magnesio (MgSO4) 120 mg L-1
3. Cloruro de Potasio (KCl) 8 mg L-1
ENCB-IPN
81
Anexo 3. Método de prueba para la evaluación de la toxicidad aguda (48 horas) en cuerpos de agua dulce. Tipo de prueba Estática, sin renovación de la solución de
prueba Duración
48 horas (prueba definitiva)
Intensidad luminosa
600 � 1,000 Luxes
Fotoperiodo
16:8 (luz: obscuridad)
Temperatura
20 ± 1 °C
Aireación en los recipientes de prueba
No
Suministro de alimento
No
Volumen de los recipientes de prueba
50 mL
Volumen de prueba
30 mL
Edad de los organismos
Neonatos ( < 24 horas)
Concentraciones o diluciones ensayadas
5, mas control
Replicas por concentración
3
Organismos por replica
10
Agua de dilución Reconstituida dura (160 � 180 mg l-1 como CaCO3)
Respuesta evaluada
Mortalidad o inmovilidad a 24 y 48 horas
Criterio de aceptación de la prueba
Supervivencia en los controles mayor o igual al 90%
ENCB-IPN
82
Anexo 4. Método de prueba para la evaluación de la toxicidad crónica en cuerpos de agua dulce. Condiciones empleadas durante la evaluación de reproducción individual. Tipo de prueba Estática, con renovación de la solución de
prueba cada 48 horas Duración
21 dias
Intensidad luminosa
1,000 Luxes
Fotoperiodo
16:8 (luz: obscuridad)
Temperatura
20 ± 1 °C
Aireación en los recipientes de prueba
No
Suministro de alimento
Microalga (Ankistrodesmus falcatus)
Concentración alimentaria
400 000 céls. mL-1
Volumen de los recipientes de prueba
50 mL
Volumen de prueba
30 mL
Edad inicial de los organismos
Neonatos ( < 24 horas)
Concentraciones o diluciones ensayadas
3 factores de dilución más dos controles (prueba definitiva)
Replicas por concentración
10
Organismos por replica 1
Agua de dilución Reconstituida dura (160 � 180 mg l-1 como CaCO3)
Respuesta evaluada Fecundidad y mortalidad
Criterio de aceptación de la prueba Supervivencia en los controles mayor o igual al 90%
ENCB-IPN
83
Anexo 5. Método de prueba para la evaluación de la toxicidad crónica en cuerpos de agua dulce. Condiciones empleadas durante la evaluación de tabla de vida. Tipo de prueba Estática, con renovación de la solución de
prueba cada 48 horas Duración
21 dias
Intensidad luminosa
1,000 Luxes
Fotoperiodo
16:8 (luz: obscuridad)
Temperatura
20 ± 1 °C
Aireación en los recipientes de prueba
No
Suministro de alimento
Microalga (Ankistrodesmus falcatus)
Concentración alimentaria
400 000 céls. mL-1
Volumen de los recipientes de prueba
100 mL
Volumen de prueba
80 mL
Edad inicial de los organismos
Neonatos ( < 24 horas)
Concentraciones o diluciones ensayadas
3 factores de dilución más dos controles (prueba definitiva)
Replicas por concentración
5
Organismos por replica
10
Agua de dilución Reconstituida dura (160 � 180 mg l-1 como CaCO3)
Respuesta evaluada Fecundidad y mortalidad
Criterio de aceptación de la prueba Supervivencia en los controles mayor o igual al 90%
ENC
B-IP
N
84
Ane
xo 6
. Val
ores
pro
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io d
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(CV
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ratu
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20ºC
y 2
5ºC
). Lo
s val
ores
máx
imos
y m
ínim
os p
ara
cada
trat
amie
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o A
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PS20
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PS25
C
V25
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g l-1
12
12
12
12
12
12
C
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mL
-1 (x
106 )
0.4
1.3
1.3
0.4
1.3
1.3
Long
evid
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56
.1 ±
9.4
1 (1
6, 6
9)
48
.2 ±
6.6
0 (2
7, 6
3)
34
.8 ±
6.9
9 (1
9, 4
7)
30
.7 ±
5.9
1 (1
7, 4
4)
26
.6 ±
3.5
9 (1
7, 3
4)
13
.5 ±
4.6
3 (3
, 31)
Des
cend
enci
a to
tal
35.5
± 8
.59
(2, 5
0)
24.7
± 6
.01
(9, 4
1)
9.8
± 3.
45
(4, 2
1)
45 ±
13.
80
(8, 6
8)
40.7
± 0
.66
(23,
80)
17
.6 ±
6.1
9 (2
,30)
tam
año
de c
amad
a m
áxim
o 5.
5 ±
1.10
3 (2
, 9)
5.6
± 1.
25
(3, 1
0)
4.5
± 0.
786
(3, 6
) 12
.6 ±
2.7
7 (6
, 19)
15
.6 ±
2.9
8 (9
, 22)
9.
5± 4
.603
(2
, 27)
tam
año
de c
amad
a m
ínim
o 1.
5 ±
0.43
8 (1
, 3 )
1.1
± 0.
19
(1, 2
) 1.
4 ±
0.3
2 (1
, 2)
1.
4 ±
0.59
(1
, 4)
2.
7 ±
1.57
(1
, 6)
2.8
± 1.
65
(1, 1
0 )
tam
año
de c
amad
a pr
omed
io
2.96
± 0
.42
(2, 4
.17)
3.
11 ±
0.4
3 (1
.9, 4
.1)
2.79
± 0
.51
(1.6
6, 4
.2)
5.58
± 0
.98
(2.6
7, 7
.88)
6.
9 ±
1.34
(4
.6, 1
1 )
6.48
± 2
.68
(1.5
, 7)
num
ero
de c
amad
as
11 ±
2.4
4 (1
, 14)
7.
8 ±
1.23
(4
, 10)
3.
4 ±0
.78
(2, 5
) 7.
4 ±
2.25
(3
, 13)
5.
4 ±
0.78
(4
, 8)
2.
8 ±
0.76
(1
, 5)
prim
era
repr
oduc
ción
11
.9 ±
1.9
5 (6
, 8)
10.9
±1.
185
(9 ,
16)
10.4
±1.
78
(4, 1
5)
4.5
± 0
.438
(4
, 6)
4 ( 4
) 4.
7 ±0
.656
(4
, 7)
ENC
B-IP
N
85
Ane
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ratu
ras (
20ºC
y 2
5ºC
). Lo
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máx
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12
1.3
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)
34
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± 9.
47
(20.
3, 5
0.3)
44
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(3
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50.
1)
29
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3.3
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6.6,
35.
7)
26
.82±
2.7
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0.2,
22.
3)
21
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8, 2
4)
20
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2.0
2 (1
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23.
5)
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34
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83)
44
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3.6
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49.
6)
28
.95±
3.3
8 (2
6.2,
35.
2)
26
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2.6
3 (2
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, 29.
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21
.3 ±
2.0
6 (1
7.5
, 23.
5)
19
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2.0
2 (1
6.6,
22.
6)
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2.4
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, 19.
33)
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38.
3)
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2.64
(1
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, 49.
83)
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5.3,
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, 35.
13)
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3)
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44)
9.
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2.54
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42
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, 45.
67)
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1.5
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18.
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17
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38)