ESTEQUIOMETRIA Y CINETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

ESTEQUIOMETRA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

La conversin microbiolgica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de inters industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulacin de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operacin de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo inters poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energa resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha extendido ampliamente en ciencias bsicas y aplicadas.

La aparicin en el mercado de sensores que permiten medir importantes variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicacin de balances de materia y energa. la produccin de biomasa (biomasa = concentracin de microorganismos expresada en gramos de clulas secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y energa, de nitrgeno y Oxgeno y las produccin de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas en el planteo y clculo de balances de materia y energa.

En primer lugar se ha encontrado que la composicin elemental de un importante nmero de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se mantiene prcticamente constante; as podemos definir un microorganismo promedio (composicin standard) como aquel cuya composicin es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el aproximadamente 5 % restante est representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composicin elemental promedio de la biomasa se mantiene prcticamente constante, la concentracin intracelular de protenas, RNA y dems constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estadas del cultivo de un mismo microorganismo.

Teniendo en cuenta esta composicin media, podemos escribir lo que sera la frmula mnima de nuestro m.o. promedio como C H1,79O0,5N0,2 (en la que est representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prcticos definir 1 C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene 1 tomo gramo de C. As pues tenemos que:

EMBED Equation.2

Para conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de biomasa debemos conocer su composicin elemental y en base a dicha composicin, el peso de 1 cmol. En trminos generales la masa resulta ser:

EMBED Equation.2

EMBED Equation.2 de biomasa.

De forma anloga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1 C-mol de sustrato (entindase por sustrato fuente de carbono y energa, FCE), 1 C-mol de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 C-mol de glucosa estar representado por CH2O y pesar 30 g, y para el etanol, 1 C-mol de etanol (CH3O0,5) pesar 23 g.

Cintica deL crecimiento

Hasta aqu hemos visto las relaciones estequiomtricas que existen en los cultivos microbianos, y cmo a travs de ellas es posible obtener informacin del destino que tiene la fuente de carbono y energa. Las ecuaciones (2) y (4), resumen toda la informacin que es posible obtener mediante los balances de materia y energa, pero nada dicen acerca de la velocidad, r, con que transcurre el proceso; por lo que ahora centraremos la atencin en este aspecto.

Convendr antes definir la forma en que expresaremos las distintas velocidades. De este modo llamaremos a:

rx =

velocidad de crecimiento microbiano (o, brevemente, velocidad de crecimiento) y las unidades sern: del mismo modo:

rs = = velocidad de consumo de sustrato

rp = = velocidad de formacin de producto.

r= velocidad de consumo de O2r= velocidad de produccin de CO2Estas velocidades tambin pueden ser expresadas en ; y en este caso, para diferenciarlo del anterior, las denotaremos con R. Por ej.:

Rx =

Anlogamente tendremos: Rs, R

, etc.

La conversin entre rx y Rx estar dada por:

Rx = 25,8 . rxAnlogamente:

Rs =

R

, etc.

Velocidades especficas:

Corresponden alas anteriormente definidas pero referidas a la unidad de biomasa, es decir:

= ( ; velocidad especfica de crecimiento.

= qs ; velocidad especfica de consumo de sustrato (s puede ser la fuente de carbono y energa o cualquier otro componente del medio)

; velocidad especfica de consumo de O2.

; velocidad especfica de formacin de producto.

etc.

Las velocidades especficas suelen brindar informacin acerca de cul es la actividad metablica del microorganismo (o de la biomasa) durante el cultivo, ya que el estar referidos a la unidad de biomasa cualquier modificacin en el valor de (, qs, etc. estar indicando que "algo" est ocurriendo en el metabolismo del microorganismo en cuestin.

De hecho es frecuente que las velocidades especficas varen durante el cultivo, y es muy comn que por ej. el valor de ( al principio del cultivo difiera del que se encuentra en estadios posteriores. Lo mismo vale para qs,

, etc.

Cultivo en Batch

La evolucin del cultivo en el tiempo, sigue una curva tpica la cual recibe el nombre de curva de crecimiento en batch. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente diferenciables. En primer lugar existe una fase donde prcticamente no hay divisin celular pero s aumento de la masa individual de los microorganismos (fase lag o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento ocurre a velocidad especfica (() mxima y constante = (m (fase exponencial). Al final de esta fase se alcanza la mxima concentracin microbiana. Posteriormente hay un rpido perodo de desaceleracin donde ( ( 0 y se entra en la fase estacionaria la cual es causada por agotamiento de algn nutriente (el sustrato limitante) o bien por acumulacin de inhibidores. Durante esta fase la concentracin microbiana (o de biomasa) permanece constante. Finalmente se llega a una ltima etapa donde la concentracin de biomasa disminuye por autolisis o como consecuencia del metabolismo endgeno (fase de decaimiento).

La duracin de cada una de estas fases es funcin del microorganismo en estudio y de la composicin del medio de cultivo. En particular la fase lag depende adems de la fase de crecimiento en que se encuentran las clulas en el momento de ser sembradas y de la composicin del medio de cultivo en que fueron crecidas. Si ste es igual a la composicin del medio en que se van a sembrar y las clulas estn en fase exponencial, la duracin de la fase lag, en general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que constituye tiempo perdido.

La descripcin matemtica (modelado) de las cuatro fases descriptas es sumamente compleja y escapa a los fines de esta gua, por lo que slo veremos una ms simple que slo contempla la fase exponencial y la estacionaria.

De la definicin de ( obtenemos

rx = ( . x

donde x = concentracin de biomasa. Hemos visto que ( vara durante el cultivo, siendo un valor constante y mximo en la fase exponencial ((m) y nulo en la estacionaria. Monod ha propuesto una relacin muy simple entre el valor de ( y la concentracin de sustrato limitante, S, entendindose por ste al componente del medio de cultivo que est en menor proporcin respecto de las necesidades del microorganismo. Por tanto S puede ser la fuente de N, de C, algn aminocido, etc. La ecuacin es:

( = (m

A KS se la conoce como Constante de Saturacin, y da una idea de la afinidad que tiene el microorganismo por el sustrato en cuestin. A menor KS mayor afinidad. Normalmente KS tiene valores muy pequeos (10-2 - 10-3 g/l) por lo que concentraciones relativamente pequeas de S son suficientes para hacer que:

( = (m

Reemplazando la ecuacin anterior en esta queda:

rx = (m

. x

Al principio del cultivo todos los nutrientes estarn en exceso, y en particular el sustrato limitante tambin, por lo que la ex. se reduce a (fase exponencial)

rx = (m x ; o bien:

= (m . x

La ec. es fcilmente integrable y si hacemos a t = 0; x = xo (concentracin inicial de microorganismos) queda:

Consumo de Sustrato

Hemos visto que el rendimiento se defina como yx = -

por tanto

rs =

(1)

reemplazando en la ec. (1) la ec.

rs =

(2)A medida que S tiende a cero, rs tambin.

En fase exponencial ser S(( ks y adems x estar dado por la ec. Del tema anterior por tanto:

(3)

Si a t = 0 es S = So implica:

S = So -

(4)

La ec. (4) da la variacin de S en funcin de t durante la fase exponencial.

Si se conoce de antemano el rendimiento yx (o Yx) y las concentraciones iniciales de sustrato y biomasa, es fcil estimar el valor de xf ya que:

(x = -Yx . (S

(5)

x - xo = Yx (S - So)

(6)

Si S es el sustrato limitante, se tendr que para x = xf ser Sf = 0, por tanto:

xf = xo + Yx. So

(7)

La ec. (6) permite calcular S para un x dado (o viceversa) en cualquier parte de la curva de crecimiento, siempre y cuando Yx (o yx) se mantenga constante. Alternativamente la ec. (6) puede emplearse para verificar si tal supuesto se cumple ya que la grfica de (x - xo) en funcin de (So - S) deber ajustarse a una recta. De todos modos siempre es posible calcular un rendimiento global, independientemente de las variaciones que pueda tener durante el cultivo, empleando slo valores iniciales y finales:

Yx = -

(8)

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