BIORREACTORES

En la actualidad se encuentran desarrollados aescala industrial de produccin los procesos paraobtencin de shikonina por cultivo de clulas deLithospermun erythrohizon, puesto a punto por laIndustrias Petroqumicas Mitsui,

as como la produccin de berberina

y biomasa de ginseng en otras industrias.

O

O

OCH 3

OCH3

Glc-Glc-O

O-Glc-Glc

OH

In order to cultivate plant cells in a large-scale, fermentors with different sizes are useful.

Pero no siempre ha sido fcil

Various types of fermentors have been designed by many researchers since the end of 1950's.

Los procesos industriales requieren de tres puntosfundamentales:

Crecimiento eficiente en grandes volmenes

Acumulacin de metabolitos secundarios en el cultivo

Si el proceso implica bioconversin o produccin deenzimas, que esto ocurra en las condiciones deoperacin del proceso

Es necesario ajustar algunos parmetros :

tensin de oxgeno

dixido de carbono

pH

Agitacin

Mezclado

densidad del cultivo

Caractersticas clulas microbianas

clulas vegetalesdediferenciadas

consecuencias en el biorreactor

Tamao 2-10 mm 10-200 mm Rpida sedimentacin, mayor sensibilidad al corte

Clulas individuales

pueden obtenerse

forman agregados Rpida sedimentacin

Velocidad de crecimiento

Altatd 1-2 horas

Bajatd 2-5 das

Largos procesos, problemas para mantener

esterilidadDensidad del

inculopequeo 5-20 % Problemas de manipuleo.

Dificulta la posibilidad de escalado

Sensibilidad al esfuerzo de

corte

no sensitivo sensitivo/tolerante Disminucin de la velocidad de agitacin

Aireacin alta baja Baja demanda de oxgeno, bajo KLa

Diseos bsicos de biorreactores para mltiples propsitos

aireaire aire

Tanque agitado Columna de air lift burbujas

transferencia de oxgenoagitacin

Aumenta el rea de transferencia de oxgeno por laformacin de pequeas burbujas

Retarda el escape de burbujas desde el lquido

Previene la coalescencia de las burbujas de aire

Disminuye el grosor de la interfase gas/lquido al crearun flujo turbulento

Asegurar el suministro de nutrientes a nivel celular

Prevenir la sedimentacin

Asegurar la transferencia de callos

Solubilizar componentes menos solubles de los medios

La agitacin como factor de transferencia de masa

Dalton en 1978 dise un reactor de bajo esfuerzo de corte denominado air lift

Aire

Draft tubeBubble

Airlift - uses air sparging to pneumatically mix the media

Bolsas descartables

Wagner, F. In "Plant Tissue Culture and Its Bio-technological application"Ed. Barz, W. et al., p. 250 (1977). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.t reactor

Comparison of Yield and Productivity for Cell Mass and Anthraquinones in Varoius Reactor Systems

1. Shake flask

2. flat blade turbine

3. perforated disk impeller

4. draft tube reactor

5. air-lift reactor

PROCESS MONITORING AND CONTROL

PROCESS MONITORING AND CONTROL

Que parmetros controlar?

Temperatura

pH

Presin parcial de O2Formacin de espuma

Ej. Produccin de alcaloides monoterpenoindlicos con cultivos celulares de Uncaria Tomentosa ua de gato en tanque agitado

Batch

Reactor

Bioreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las races

Biorreactores para el cultivo de races

Adicin de nutrientes

Bomba

Salida de aire

AireAire

Entrada de medio

Reservorio

Malla de inmovilizacin

Bioreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)

Biorreactores para el cultivo de races

Bomba de aire

Bom

bape

rist

ltica

Generador de niebla

Cmarade cultivoControlador Controlador

On Off

Intensidad

Filtro de aire

Condensadorde niebla

A nutrient mist reactor is substantially the same as aeroponic growth of plants as proposed by botanists

Growth of hairy roots in the 3 L MTR on the 16th day

Biorreactores para cultivo de otros rganos

Para cultivo de rganos

Centaurium erythraea shoot culture in mist trickling bioreactor after 21 days.

MTB

Modelos para clulas inmovilizadas

Operacin de Biorreactores

1.Batch:Son sistemas cerrados que se caracterizan por cambiar lascondiciones fisiolgicas y ambientales.

No hay entrada ni salida de medio de cultivo.

Operacin de Biorreactores

2.Batch alimentado:

Estos sistemas operan adicionando medio fresco,pero sin remocin del existente.

Son muy tiles cuando se requiere una elevadadensidad celular en la etapa de iniciacin delproceso que implica un alto consumo de nutrientes,especialmente de fuente hidrocarbonada que suelefuncionar como sustrato limitante.

2.1-Draw-fill o semicontnuo:

Consiste en remover, al final de la operacin entreun 80 y un 90 % del cultivo y reemplazarlo pormedio fresco.

De esta manera puede eliminarse el perodo lag,satisfacerse sencillamente la necesidad decontar con inculos de gran tamao y a su vezevitar la esterilizacin del reactor entre dos ciclos.

Variante del batch alimentado:

Operacin de Biorreactores

3.Continuo: el caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida de medio

utilizado.

Son utilizados en cultivos donde la velocidad de crecimiento celular esconstante por lo que existe un suministro constante de nutrientes o parala remocin permanente de producto sobre todo en sistemasinmovilizados.

Este tipo de operacin presenta grandes inconvenientes con respecto almantenimiento de las condiciones de asepsia del proceso, y se dificultadebido a la tendencia a formar agregados de las clulas vegetales encultivo, la formacin de merengue y el lento crecimiento celular.

Para su buena aplicacin se requiere del diseo de sistemas quepermitan suplementar continuamente el medio de cultivo evitando laremocin de las clulas y as minimizar lo que se denomina lavado delcultivo.

Una variante es la Perfusin que implica la remocin y suministro demedio dejando la biomasa ocluda en una malla.

Continuous Culture

Batch Culture

Time (days)

Growth

0 5 10 15 20 25

Lquido-lquido:

Compuestos inmiscibles en agua, como solventesorgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Slido-lquido:

La segunda fase es un material slido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

Requerimientos:

- Autoclavables- No txicos- Fcil separacin del producto de inters de la segunda fase

- No modificacin del medio de cultivo- Permanencia de las clulas en la fase acuosa

Remocin de producto in situ

Diagrama de un tanque de agitacin mecnicamodificado para operar con remocin in situdel producto.

1: tanque;2: malla de acero inoxidable para inmovilizarraces;3: sensor de oxgeno;4: malla acero inoxidable;5: medidor DO; 6: agitador;7: lana de vidrio;8: resina XAD-2;9: filtro de vidrio;10: generador de aire;11: condensador;12: marco de la malla

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Adaptaciones para la extraccin in situ del producto

Un bioreactor de agitacin por lquidocon loop externo

Adaptaciones para la extraccin in situ del producto

Ejemplo integrado

Ejemplo integrado

Shikonina

Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.

Suspensiones celulares- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducenla produccin de shikonina.

Produccin de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon

Yamasaki Plant Photo Gallery

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Secuencia en laoptimizacin de un proceso para la produccinde metabolitos secundarios

Seleccin de la planta por su contenido demetabolitos secundarios para iniciar cultivos invitro

Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilizacin y seleccin de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles deproducto, liberacin al medio

Optimizacin de medio de cultivo para produccinpor diseo factorial: nutrientes, precursores,elicitacin, liberacin y remocin in situ

Optimizacin en bioreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch,perfusin, en dos etapas.Extraccin y purificacin del producto

Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales