“Cinetica enzimatica”

Objetivo:

1. Analizar algunos factores que modifican la velocidad de reaccion catalizada por la invertasa.

2. Demostrar la relacion lineal entre la velocidad de reaccion y la concentracion de la enzima presente.

3. Determinar como influye el pH del medio sobre la velocidad de reaccion enzimatica y su efecto sobre el caracter ionico de la enzima y del sustrato.

4. Demostrar que la temperatura afecta las reacciones enzimaticas.5. Observar el efecto de la concentracion del sustrato sobre la velocidad de la

reaccion enzimatica.

Hipótesis:

Conocer el comportamiento de la actividad enzimatica de la invertasa siendo esta afectada o alterada yha sea por el aumento de temperatura, diferentes pH, concentraciones diferentes tanto de sustratos como de la misma enzima. Ademas de que se determinara la velocidad de reaccion de los experimentos realizados e interpretar las graficas.

Resultados:

Efectos de la concentracion de la enzimaConcentrac

ion de enzima

(μg)

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Absorbancia

0.000 0.014 0.106 0.169 0.242 0.408

Curva estandar de azucares reductoresConcentrac

ion de azucares

reductores (μmol)

0 2.5 5 10 20 30 37.5

Absorbancia

0.000 0.220 0.270 0.432 1.181 1.322 1.939

Efectos del sustratoConcentraci

on de sacarosa (μmol)

7 17.5 42 59.5 87.5 175 350 437.5

Absorbanci 0.152 0.195 0.244 0.248 0.325 0.316 0.254 0.187

a

Efectos del pHRegulador

de pH 5 2.5 3.5 4.5 5 5.5 6.5 7Absorbanci

a0 0.003 0.015 0.085 0.475 0.349 ‘.191 0.090

Temperatura (°C) 0 25 37 50 75 92

Absorbancia

0.037 0.101 0.280 0.330 0.206 0.098

Nota: Los resultados se muestran en las graficas que se localizan despues del anexo.

Análisis de resultados:

1. En la grafica de velocidad vs temperatura se puede notar que al incremento de cada 10°C se duplica la actividad enzimática hasta que llega al punto donde se encuentra la llamada temperatura optima, después de esa temperatura la enzima se desnaturaliza porque es una proteína. Y es por eso que la curva disminuye porque pierde su actividad enzimática.

2. En la grafica de velocidad vs pH se puede notar que la velocidad de reacción incrementa considerablemente aunque después pierde su actividad enzimática debido a que el pH afecta las fuerzas ionicas y esta pierde su actividad enzimática y aquí se puede ver en que pH es optimo esta enzima.

3. En la grafica de velocidad vs concentración de substrato no se observa que la velocidad permanezca constante, pues aunque la concentración del substrato la velocidad permanece constante, sin embargo esta disminuye. En esta grafica se debe de calcular el km para conocer la concentración donde se obtiene la mitad de la velocidad máxima.

Lo que se debe realizar en esta práctica se debe de hacer muestras más cercanas en cuestión de temperatura, pH, concentración del substrato, para que su estudio y análisis sea más perceptible. En la grafica se puede observar que se obtuvo una km de 0.44 esto quiere decir que este valor muestra la afinidad que tiene la enzima por el sustrato. La velocidad a la cual la enzima reacciona con el sustrato según la grafica es de 0.89.

Conclusiones:

En esta práctica se estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, esta medida siempre se realiza en condiciones óptimas de pH,

temperatura y cofactores. Para tener un buen desarrollo de la actividad enzimática, donde se pueden calcular su km y su velocidad max

Bibliografía:

Holum J.R. Practias de quimica general, quimica organica y bioquimica. Limus Wiley. 1972.

Plummer D. Introduccion a la bioquimica ractica. McGraw-Hill. 1987.

Rendina G. Tecnicas de bioquimica aplicada. Interamericana. 1979.

Wynn C. Estructura y funcion de las enzimas. Omega. España. 1977.

Anexo:

Enzimas termorresistenetes:

La temperatura influye en la actividad enzimatica y al igual que la actividad enzimatica tiene un pH optimo, tambien hay una temperatura optima. Esto se debe a que, en el tramo inferior, la velocidad de reaccion aumenta con la temperatura (rama ascendente) pero a cierto punto la enzima comienza a desnaturalizarse (rama descendente). El habitat termico de las especies biologicas tienen relacion con la temperatura optima de sus enzimas. Se han encontrado enzimas que resisten temperaturas mayores a 100°C. Las enzimas termorresistentes se obtienen de bacterias termofilias que viven a temperaturas altas. Algunas enzimas termorresistentes aisladas tienen aplicaciones industriales importantes porque permiten procesos a temperaturas altas. Por ejemplo, la termolisina obtenida de Bacillus termoproteoliticus para sintetizar peptidos (el edulcoroante aspartama). Una α-amilasa obtenida de Bacillus stearotermofilus resiste a los 120°C y se utiliza para obtener glucosa apartir de la hidrolisis del almidon. Una glucosa isomerasa, obtenida de Bacillus coagulans, se utiliza para obtener una mezcla de glucosa y fructuosa en un proceso de 70°C.

K cat y Kcat / Km :

₪ Kcat : La ecuación de Michaelis-Menten, V = V max [S] / (K M + [S]), se puede reescribir como

V = Kcat [E] t [S] / ( KM + [S])

donde V max = Kcat [E] t . Kcat incorpora las constantes de velocidad de las reacciones entre ES y E + P en un proceso enzimático en varios pasos. Para una reacción de dos etapas, Kcat k = 2 . Para las reacciones más complejas, Kcat depende de qué pasos en el proceso son limitante de la velocidad.Kcat da una medida directa de la producción catalítica de producto en condiciones óptimas (enzima saturado). Las unidades de Kcat son segundos -1 . El recíproco de Kcat puede ser pensado como el tiempo requerido por una molécula de enzima para "entregar" una molécula de sustrato. Alternativamente,Kcat mide el número de moléculas de sustrato entregado por molécula de enzima por segundo. Por lo tanto, Kcat se llama a veces el número de recambio. Ejemplos:

₪ ₪ Kcat/Km : Esta relación es a menudo considerado como una medida de la eficiencia enzimática. Ya sea un valor grande de Kcat(rápida rotación) o un valor pequeño de KM (gran afinidad por el sustrato) hace Kcat/Km grande.Cuando [S] << KM (solución diluida), la ecuación se convierte en:

V ( Kcat/Km) [E] [S]Se comporta como una constante para la reacción entre el sustrato y la enzima libre de velocidad de segundo orden. Esta relación es importante, ya que muestra lo que la enzima y el sustrato puede lograr cuando los sitios de enzimas abundantes están disponibles, y que permite la comparación directa de la eficacia de una enzima hacia diferentes substratos. Cuando una enzima tiene una opción de dos sustratos, A o B, presente en la igualdad, concentraciones diluidas.

Como una constante de velocidad de segundo orden, Kcat / Km tiene un valor máximo posible, que es determinado por la frecuencia con la cual las moléculas de enzima y el sustrato pueden colisionar. Una reacción que alcanza una velocidad tal se dice que es "difusión limitada" porque cada encuentro conduce a la reacción. Si cada colisión como resultado la formación de un complejo enzima-sustrato, la teoría de difusión predice que Kcat / Km alcanzarán un valor de alrededor de 10 8 a 10 9 (mol / L) -1 s -1 . Ejemplos:

Medicion de actividades enzimaticas de reacciones muy rapidas:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostéricos). Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática. De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad.

La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su reacción correspondiente.

¿Que parametro es mejor para comparar las actividades enzimaticas?:

La cantidad de sustrato necesario para obtener una determinada velocidad de reacción también es importante. Este parámetro viene dado por la constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentración de

sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad máxima. Cada enzima tiene un valor de Km característico para un determinado sustrato, el cual puede decirnos cómo de afín es la unión entre el sustrato y la enzima. Otra constante útil es kcat, que es el número de moléculas de sustrato procesadas por cada sitio activo por segundo.

La eficiencia de una enzima puede ser expresada en términos de kcat/Km, en lo que se denomina constante de especificidad, que incorpora la constante de velocidad de todas las fases de la reacción. Debido a que la constante de especificidad contempla tanto la afinidad como la capacidad catalítica, es un parámetro muy útil para comparar diferentes enzimas o la misma enzima con diferentes sustratos. El valor máximo teórico de la constante de especificidad es denominado límite de difusión tiene un valor de 108-109 (M-1s-1). Llegados a este punto, cada colisión de la enzima con su sustrato da lugar a la catálisis, con lo que la velocidad de formación de producto no se ve limitada por la velocidad de reacción, sino por la velocidad de difusión.