MA DE LOS ÁNGELES PEÑARANDA1, FERNANDO ASENSIO2

1 Doctora en Veterinaria2 Doctor en VeterinariaHospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid

1. INTRODUCCIÓN

Desde el principio de los tiempos, el hombre haintentado modificar las características de los animalesdomésticos intentando incrementar aquellas que mejo-raban sus condiciones como anima-les de compañía, de producción, detrabajo o de abasto, mediante laselección de los más aptos y el cru-zamiento de los ejemplares que pre-sentaban mejores características:mayor producción de leche o carneo más fuerza y resistencia. Se selec-cionaban aquellos ejemplares concaracterísticas deseables, apareán-dolos entre sí y con su descenden-cia, para perpetuar los rasgos de inte-rés, recurriendo al mestizaje cuandose advertía la aparición de caracte-rísticas fenotípicas indeseadas debi-do a la consanguinidad.

Hoy en día, gracias a la reproduc-ción asistida y a la biotecnología, seplanifican y dirigen los procesosreproductivos, se transmiten los ras-gos deseados y se acelera la mejoragenética. El intervalo intergeneracio-nal puede reducirse sensiblementegracias a la combinación de la inse-minación artificial, que es la másantigua y utilizada de las técnicas dereproducción asistida, con las técni-cas más recientes como son: el estrosincronizado, la superovulación, laextracción de óvulos de hembrassexualmente inmaduras aun fuera dela época de cría, o la producción deembriones “in vitro” y la transferen-cia de embriones. Además, es posi-ble seleccionar el sexo de la proge-

nie con semen sexado para la inseminación; se puederealizar la selección genética de individuos mediantemarcadores moleculares asociados a caracteres deinterés. También se puede modificar el genoma de losorganismos: introduciendo genes de interés (organis-mos transgénicos); modificando los genes (organismostransgénicos “knockins”); o eliminando o silenciandogenes concretos (organismos transgénicos “knoc-kouts”). Y se puede llevar a cabo la clonación de ani-males por transferencia nuclear de células somáticas,germinales o embrionarias.

En este trabajo, y en su continua-ción que aparecerá en el próximonúmero, se pretende hacer una revi-sión de las técnicas de IngenieríaGenética que se emplean actual-mente para la obtención de OMGs(Organismos Modificados Genética-mente), con el objetivo de explicarde una manera sencilla y clara lasbases conceptuales de cada una deellas, sus ventajas e inconvenientesy su utilidad práctica.

2. LA INGENIERÍA GENÉTICA

El enorme avance de la investiga-ción biotecnológica en los últimosaños ha favorecido el desarrollo detécnicas que permiten introducir, eli-minar o modificar de forma especí-fica un gen, o determinados tipos degenes, en el genoma de un organis-mo para producir seres vivos (anima-les, plantas y microorganismos) connuevas y mejores características. Estetipo de técnicas, se encuadran den-tro de lo que se denomina Ingenie-ría Genética y los seres vivos que asíse obtienen son los llamados Orga-nismos Modificados Genéticamente.

La Ingeniería Genética incluye unconjunto de métodos que permitenaislar y fraccionar el DNA, y ensam-blar los fragmentos obtenidos conotras moléculas de DNA. El resulta-

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ANIMALES MODIFICADOSGENÉTICAMENTE:

(I) TÉCNICAS DE OBTENCIÓN

En ganadería, latransgénesis ofrece unmétodo más rápido demejora génetica que

las técnicas deselección y

reproduccióntradicionales

Figura 1: La oveja Dolly y suprimera cordera Bonnie.(Fuente: Roslin Institute).

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do de estas manipulaciones se conoce como DNArecombinante y es un DNA híbrido que contiene elfragmento de DNA de interés que se desea expresaren una célula, unido a un DNA vector mediante unenlace covalente. Los genes de interés (contenidos enfragmentos de DNA) se obtienen cortándolos de sucadena de DNA originaria mediante enzimas de res-tricción. Posteriormente, se unen al DNA que actúacomo vector mediante enzimas ligasas.

A continuación, se describen las técnicas utiliza-das para la generación de animales modificados gené-ticamente: la transgénesis y la transferencia nuclear.

3. TRANSGÉNESIS

La transgénesis es un procedimiento biotecnológi-co por el que se introduce un gen foráneo (transgén)en el genoma de un ser vivo. En la transgénesis sebusca que el transgén se integre en la línea germinal(gametos) de una manera estable, asegurando así queese nuevo gen incorporado pueda ser heredado por ladescendencia.

En los animales superiores, la información genéti-ca se transmite por reproducción sexual. Es lo que seconoce como transmisión genética vertical. Sin embar-go, en 1981, Gordon y Ruddle demostraron la inte-gración y transmisión estables (a través de la línea ger-minal) de genes inyectados en pronúcleos de cigotosde ratón obtenidos por fecundación “in vitro”. Eranlos primeros ratones transgénicos. Es decir, se tratabade una transmisión genética horizontal, que se deno-minó transgénesis.

El paso siguiente consistió en probar que tambiénse podían obtener ratones transgénicos que incorpo-raran en su genoma un gen (transgén) de otra especie.Así, en 1982, Palmiter y col. obtuvieron ratones trans-génicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de uncigoto de ratón el gen de la rata que codifica la hor-mona del crecimiento. Incluso, estos mismos investi-gadores, obtuvieron también ratones transgénicosgigantes cuando el transgén introdu-cido, que codificaba la hormona delcrecimiento, era de origen huma-no.

Los ratones fueron los prime-ros animales en los que se consi-guió la transgénesis

A los experimentos conratones, siguieron los mismosprocedimientos con conejos,ovejas y cerdos, en un inten-to de aumentar su tamaño(Hammer y col., 1985).Sin embargo, este avanceno tuvo aplicación zoo-técnica porque la presen-cia del transgén modifi-caba la fisiología delanimal transgénico, pro-duciendo efectos colate-rales perjudiciales para sudesarrollo.

En ganadería, la transgénesis ofrece un método másrápido de mejora genética que las técnicas de selec-ción y reproducción tradicionales. Permite la introduc-ción de genes nuevos y deseables en los animalesdomésticos sin tener que recurrir al cruzamiento entrelos mismos.

Un transgén es una construcción de ácido desoxi-rribonucleico (DNA) que contiene: una secuencia quecodifica una proteína específica que es la que aportala mejora genética deseada (exón); una región queconfiere a esta secuencia la capacidad de expresarsede forma ubicua o en tejidos específicos (promotor);y una serie de secuencias aisladoras y reguladoras queprotegen y modulan la expresión del gen introducido.Para conseguir una buena expresión del gen de inte-rés, es necesario incluir todas las secuencias quemodulan su expresión, de manera que se necesita unvector que admita grandes transgenes. Para ello, se handesarrollado los transgenes genómicos, basados encromosomas artificiales de levaduras y bacterias, queson capaces de transportar grandes fragmentos de DNA

en los que se pueden incluirtodos los elementos regulado-res del gen. Estos transgenesson los YACs y los BACs (cro-mosomas artificiales delevaduras y cromosomas

artificiales de bacterias, res-pectivamente)

De las técnicas utiliza-das para la producción

de animales transgéni-cos, es decir, paraintroducir el transgénen el genoma, desta-

can las siguientes: • Microinyecciónpronuclear de trans-genes en pronúcle-os de óvulos fertili-zados (cigotos). • Vectores virales,que transfectan lascélulas integrando

Los ratones fueron los primeros animales en los que seconsiguió la transgénesis

Ratón “nude” (desnudo), modificado genéticamente.

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en ellas su genoma previamente modificado(virus recombinantes).

• Transferencia de DNA exógeno mediada poresperma durante la fertilización (SMGT, “sperm-mediated gene transfer”).

• Inyección, en la cavidad de blastocistos, de célu-las madre embrionarias (ES “cells”, “embrionicstem cells”) y/o células germinales embriona-rias (EG, embrionic germ cells”), previamentemodificadas genéticamente mediante la técni-ca de “gene targeting”.

• Transferencia nuclear (NT, “nuclear transfer”) concélulas somáticas, ES o EG que previamente hansido modificadas genéticamente.

También se puede facilitar la entrada del trans-gén en las células mediante otras técnicas como eluso de liposomas y de la electroporación. Además,en la actualidad, están en desarrollo nuevas técni-cas para generar transgénesis, como el uso de trans-posomas (secuencias de DNA capaces de autorepli-carse e integrarse aleatoriamente en sitiosadicionales del genoma) y la tecnología del RNAinterferente (RNAs de doble cadena que inhibengenes endógenos). De esta última técnica hay unaanimación interesante en:

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/ani-mation/animation.htm

3.1 MICROINYECCIÓN PRONUCLEAR

En esta técnica, la introducción del transgén se rea-liza mediante la microinyección de esta construcciónde DNA en el pronúcleo de un ovocito fertilizado (figu-ra 2). El procedimiento sería el siguiente: • Se extraen óvulos de hembras en las que se ha indu-

cido una superovulación y han sido fertilizadas “invivo”, o bien se fertilizan posteriormente “in vitro”.

• Utilizando un microscopio, con una micropipeta, seinmoviliza el óvulo fecundado y se inyecta en unode sus pronúcleos una solución que contienemuchas copias del transgén.

• Posteriormente, estos óvulos fecundados y microin-yectados se introducen en madres receptoras, pre-viamente sincronizadas hormonalmente, para ges-tarlos, aplicando la técnica de la transferencia deembriones.

• Finalmente, los recién nacidos son examinados paraver si en ellos se ha producido la incorporación deltransgén. La microinyección es un método para generar ani-

males transgénicos muy ineficiente, debido a que con-lleva la integración aleatoria del gen foráneo en elgenoma receptor con las siguientes consecuencias: • El transgén se introduce en el genoma receptor de

forma aleatoria, por lo que sólo en un pequeñoporcentaje se sitúa en el lugar adecuado para con-seguir una buena expresión en el animal transgé-nico.

• No todos los animales que nacen han incorporadoa su genoma el transgén (no son transgénicos, portanto).

• El gen exógeno puede insertarse en un lugar erró-neo, por ejemplo en medio de un gen del genomareceptor, interrumpiéndolo y causando su muta-ción y, con ello, la muerte del embrión o alteracio-nes en el animal transgénico nacido.

• Se produce un patrón variable de expresión del genexógeno en la progenie transgénica, a menudo enmosaico.

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Figura 2. Microinyección de DNA en ovocito fertilizado.A) pipeta de sujeción; B) ovocito fertilizado en el que seevidencian los dos pronúcleos (rojo y verde); C) pipetade inyección, a través de la cual se inyecta la soluciónque contiene el DNA del transgén de interés en uno de

los pronúcleos.

Figura 3. Técnica de “gene targeting” sobre células ES de ratón. La explicación de esta técnica de modificación dirigidadel genoma viene en la página 19 del texto. El Nobel de Medicina y Fisiología de este año 2007 ha sido concedido aMartin Evans, Mario Capecchi y Oliver Smithies por sus trabajos de obtención, cultivo y manipulación genética de

células ES, que les permitieron obtener el primer ratón Knockout.

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• En ocasiones, el transgénmicroinyectado no es here-dable porque no se inserta enla línea germinal del animaltransgénico.

• No se pueden encontrar dosanimales transgénicos funda-dores con el transgén inserta-do en el mismo lugar, por locual, para conseguir anima-les homocigóticos para estegen exógeno sólo pueden serfabricados mediante el crucede los nacidos de un únicoanimal fundador (en el casode la vaca, la producción deuna línea homocigótica apartir de un único fundadorrequiere alrededor de 5años).

La microinyección de DNAen cigotos es una de las técnicasmás extendidas en la generaciónde ratones transgénicos. Sinembargo, esta técnica tiene unéxito limitado en mamíferossuperiores, debido a problemasespecíficos inherentes y a su bajaeficacia. Así, para producir unúnico animal fundador, sonnecesarios cerca de 1000 cigo-tos en el caso de los bóvidos, 300 cigotos en el de losóvidos y 200 en el de las cabras. Por ello, el coste deproducción de animales de granja mediante microin-yección pronuclear de DNA es altísimo y, en la prác-tica, inabordable.

3.2 VECTORES VIRALES

Un método alternativo es la transgénesis viral: eluso de virus recombinantes paraintroducir genes en el embrión. Losvectores retrovirales han sido estu-diados extensamente para terapiagénica humana. Estos vectores handemostrado transferir eficientemen-te genes en embriones murinos, bovi-nos y porcinos. Sin embargo, losretrovirus están sometidos a modifi-cación epigenética y la expresiónretroviral se corta durante la embrio-génesis o es breve después del naci-miento.

Se ha conseguido una mejora sus-tancial con el uso de vectores deri-vados de lentivirus, que proceden deuna familia de retrovirus complejos.Estos vectores tienen la capacidad deatravesar la membrana nuclear yalcanzar el genoma de las células,cualquiera que sea la fase del ciclo

celular en la que se encuentren, incluyendo célulasquiescentes y embrionarias, y cualquiera que sea eltipo celular. Los vectores lentivirales han demostradoque transducen células madre embrionarias humanasy embriones de ratón y rata pre-implantación. En elcaso de los cerdos, se ha conseguido la expresión ubi-cua de los genes portados por vectores lentivirales enlos distintos tejidos del animal y con una correlaciónlineal entre la expresión del transgén y el número de

provirus que se ha integrado en elgenoma.

En animales de granja, la eficien-cia de la transgénesis con vectoreslentivirales es 50 veces superior a laque se consigue con la microinyec-ción pronuclear de DNA. Su mayorlimitación es que no pueden trans-portar transgenes con más de 8-9 kbde DNA y, además, los sitios en losque se produce su integración deforma preferente son regiones codi-ficantes de los genes de las célulasque infectan.

El procedimiento podría ser así:embriones pre-implantación sonexpuestos “in vitro” a solucionesconcentradas de virus recombinan-tes (virus a los que previamente seles ha introducido el gen de interés),o son incubados sobre una monoca-

Figura 4. Producción de ratones modificados genéticamente mediante SMGT

La microinyección de DNA en cigotos

es una de las técnicas másextendidas

en la generación de ratones

transgénicos

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pa de células infectadas con estos virus. A continua-ción de la exposición a los virus, los embriones infec-tados “in vitro” son transferidos a hembras receptoraspara completar la gestación.

3.3 TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR ESPERMA(SMGT)

Hoy en día, los métodos más extendidos para laproducción de animales de granjatransgénicos son: la inyección direc-ta de DNA en uno de los pronúcle-os de ovocitos fertilizados; las cons-trucciones basadas en virus (sobretodo retrovirus) como vectores parala introducción de DNA exógeno enembriones; y la transferencia nucle-ar (descrita más adelante) utilizandocélulas somáticas o embrionariasmodificadas genéticamente. Todosestos métodos están afectados poruna baja eficiencia, un elevadomanejo y la necesidad de la mani-pulación de embriones en estadiostempranos del desarrollo. Además, eluso de retrovirus presenta dudas encuanto a su seguridad.

En 1989, se describió por pri-mera vez un nuevo método parala generación de animales trans-génicos: la transferencia degenes mediada por esperma(SMGT), que se basa en la capa-cidad intrínseca de los esperma-tozoides de unirse e internalizarDNA exógeno que, posterior-mente, podrá ser transferido alhuevo durante la fertilización.Esta habilidad de los espermato-zoides por capturar DNA exóge-no fue descubierta en 1971(Brackett, 1971), pero el hallaz-go, con sus importantes implica-ciones, fue ignorado durantecerca de 20 años.

El primer procedimiento deSMGT se realizó en un modelode animal pequeño, el ratón, ydemostró ser muy eficiente. Pos-teriormente, esta técnica seadaptó a grandes animales, sien-do exitosa en la generación dediversas líneas de cerdos trans-génicos. Se considera que laSMGT puede ser utilizada entodas las especies animales conreproducción sexual mediadapor gametos, siendo una técnicade aplicación potencialmenteuniversal.

En síntesis, la aplicación dela SMGT consiste en (figura 4):

• Obtención del eyaculado a partir de animalespreviamente seleccionados.

• Conversión de los espermatozoides del eyacula-do en células transgénicas mediante la incuba-ción conjunta del esperma con el plásmido quecontiene el DNA de interés. En este proceso sesuceden las siguientes etapas: a) la unión delDNA exógeno a la superficie del espermato-zoide; b) seguida de la internalización de este

DNA en el espermatozoide; c) y, pos-teriormente, la integración del trans-gén en el genoma del espermatozoi-de (hecho que se ha demostrado queno ocurre al azar, sino en lugaresconcretos del genoma). • Inseminación artificial, con elesperma transgénico, de hembraspreviamente sincronizadas (en cer-dos) o inyección intracitoplasmáticade esperma (ICSI, “intracytoplasmicsperm injection”) transgénico enovocitos para generar embriones queposteriormente sean transferidos ahembras sincronizadas para gestar-los (en ratones). • Obtención de las camadas, segui-da del estudio de la eficiencia de la

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26 Figura 5. Origen de las células madre (“stem cells”), basado en Wobus y col., 2005

La clonación es una tecnología

que puede serutilizada para laproducción de

un gran número de animales

genéticamenteidénticos entre si

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transgénesis en ellas, seleccionando los anima-les transgénicos fundadores que serán capacesde transmitir el transgén a las sucesivas genera-ciones.

3.4 “GENE TARGETING”

La mayoría de las técnicas utilizadas para la intro-ducción de DNA exógeno en células producen unaintegración aleatoria en el genoma celular del DNAintroducido, con los consiguientes inconvenientes quese han descrito en el apartado 3.1. La técnica de “genetargeting” evita esos problemas, al generar una modi-ficación genética dirigida, específica y controlada,basada en la introducción o en la eliminación de DNAen lugares precisos del genoma, utilizando la recom-binación homóloga de esas secuencias de DNA forá-neas con los genes autóctonos.

Esta técnica requiere la utilización de células madreembrionarias (ES “cells”, “embrionic stem cells”), queson pluripotentes y que, una vez modificadas genéti-camente, son inyectadas en blastocistos para generarembriones quimera.

En este punto, antes de seguir con el “gene targe-ting”, conviene aclarar algunos aspectos sobre el ori-gen de las células ES, siguiendo el esquema de la figu-ra 5:

• El cigoto y los estadios de división celulares tem-pranos, hasta el estadio de mórula, son defini-dos como totipotentes, porque pueden generarun organismo completo.

• En el estadio de blastocisto, sólo las células dela masa celular interna (ICM, “inner cell mass”)son pluripotentes, es decir, mantienen la capa-cidad de generar las tres capas embrionarias pri-marias (ectodermo, mesodermo y endodermo)así como las células germinales primordiales(PGCs, “primordial germ cells”) que son las célu-las precursoras de los gametos masculinos(espermatozoides) y femeninos (óvulos). Lascélulas ES derivan de la ICM del blastocisto ytienen la capacidad de diferenciarse “in vitro”en células de todos los linajes celulares somá-ticos y también en células germinales masculi-nas y femeninas.

• En tejidos y órganos adultos, existen célulasmadre multipotentes y células progenitoras parareemplazar las células perdidas o dañadas. Enla actualidad, se desconoce en qué medida lascélulas madre adultas pueden transformarse encélulas de otros linajes (transdiferenciarse) o quéfactores pueden aumentar su capacidad de dife-renciación.

La tecnología de “gene targeting” necesita el esta-blecimiento del cultivo de células ES. Estas células tie-nen, por una parte, la capacidad de autorenovarse encultivo manteniendo su pluripotencialidad y, por otra,la capacidad de diferenciarse en todas las células somá-ticas y germinales (gametos). Por ello, las modificacio-nes genéticas introducidas en células ES generan indi-viduos con gametos que llevan la modificacióngenética y que, por tanto, pueden generar descenden-cia que porte esa modificación. Una importante limi-tación para el uso de esta técnica es que estas célulasES no se han conseguido cultivar, hasta el momento,en animales de producción. Por ello, el “gene targe-ting” casi sólo se realiza de forma exclusiva en ratón,especie para la que sí existen líneas de células madreembrionarias establecidas.

La técnica de “gene targeting” tiene las siguientesfases (figura 3): a) Obtención de embriones de ratón en fase de blas-

tocistos. b) Aislamiento de células ES de los blastocistos. c) Cultivo “in vitro” de las células ES. d) Introducción de la modificación genética, median-

te “gene targeting”, en las células ES en cultivo. e) Selección de clones individuales de las células ES

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La segregación genética produce, a veces, diferencias enla capa. (Fuente: Roslin Institute).

Figura 6. Inyección de células ES en blastocistos. A)pipeta de sujeción; B) blastocisto en cuya cavidad se

inyectan células ES que previamente han sidomodificadas genéticamente (en el dibujo son las de coloramarillo); C) pipeta de inyección, a través de la cual se

inyectan las células ES.

Figura 7. Enucleación de un ovocito (Fuente: RoslinInstitute).

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en cultivo y realización de réplicas para mantenerstock congelado a -80ºC y para screening de DNAgenómico.

f) Screening de DNA genómico de los clones de célu-las ES, para comprobar cuál ha conseguido intro-ducir la modificación genética enel sitio deseado, así como análi-sis del cariotipo y de la presenciade micoplasmas.

g) Generación de los embrionesquimera: se inyectan las célulasES, que portan la modificacióngenética deseada, en la cavidadde un blastocisto (figura 6).

h) Transferencia de estos blastocis-tos resultantes, con ES modifica-das y ES originales, a hembras sin-cronizadas para gestarlos.

i) Estudio de las quimeras genera-das (animales con dos tipos decélulas: algunas con la modifica-ción genética, porque procedende las microinyectadas en losblastocistos, y otras no).

j) Realización de cruces entremachos y hembras heterocigotospara el gen modificado, con el finde obtener homocigosis en dichogen. Los tipos de modificaciones gené-

ticas que se pueden obtener por“gene targeting” son:

• “Knockouts” o inactivacióngénica. Si se bloquea la expre-sión de un gen concreto (eli-minando un fragmento delmismo o introduciendo unamutación en su secuencia que

impida su traducción), estamos pro-duciendo una inactivación génica ygenerando un animal knockout. Esteanimal permite estudiar qué ocurrecuando se elimina un gen concretoy, así, conocer su función. • “Knockins”: si se introduce unamutación en un gen o se sustituye ungen por otro.

En ocasiones, la modificacióngenética que introducimos puedecausar la letalidad del embrión. Paraevitarlo, se puede controlar la expre-sión de la modificación genéticaintroducida en lugar y tiempo: • “Knockouts” o “knockins” especí-ficos de tejido. En ellos la modifica-ción sólo se expresa en los tejidosque nos interesa, utilizando promo-tores específicos de tejido (por ejem-plo que el gen se exprese en hígadoy no en adipocitos). • “Knockouts” o “knockins” condi-cionales o inducibles. En ellos con-

trolamos el momento de la expresión de la modi-ficación genética. Por ejemplo, una vez que elanimal ya haya nacido (con lo que evitamos laposible muerte embrionaria por la modificaciónintroducida).

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Figura 8. Esquema de la generación de Dolly (basado en EIBE,1998)

Tabla 1. Animales clonados mediante transferencia nuclear a partir de núcleosde células donantes de naturaleza embrionaria, fetal o adulta (revisado por

Meissner y col., 2006).

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4. TRANSFERENCIA NUCLEAR

En la transferencia nuclear (NT)se utiliza el núcleo de una célula pro-cedente del animal que queremosclonar para introducirlo en un ovo-cito receptor previamente enuclea-do (figura 7). Este ovocito se activaeléctricamente, o por otros métodos,para que reprograme al núcleo y éstecomience la generación de unembrión que tendrá un 98-99% dela información genética procedentedel núcleo del animal a clonar y un1-2% procedente del DNA conteni-do en las mitocondrias y otras orga-nelas presentes en el citoplasma delóvulo receptor. Consecuentemente,el organismo resultante no será unclon exacto del animal donante delnúcleo.

Durante el desarrollo, el conteni-do genético de cada célula se man-tiene, con unas pocas excepciones,idéntico al que tenía el cigoto. Porlo tanto, las células diferenciadas(adultas) poseen en su núcleo todala información necesaria para gene-rar un organismo completo. Esto eslo que se conoce como totipotencianuclear. En sus inicios, la transferen-cia nuclear (NT) se desarrolló comoun medio de comprobar, de formaexperimental, este concepto de toti-potencia, mediante la clonación deanimales a partir de células adultas. Los núcleos deestas células adultas se reprograman con la informa-ción que hay en el citoplasma del ovocito, de mane-ra que se silencian algunos genes y comienzan a fun-cionar otros, produciéndose la parada de la fase adultapara encenderse la embrionaria. Esta reprogramaciónpermite que las células donantes de los núcleos parala NT puedan ser fetales, embrionarias o somáticas(tabla 1).

Como es posible obtener un número ilimitado decélulas somáticas a partir de un animal, la clonaciónconstituye una tecnología que puede ser utilizada parala producción de un gran número de animales genéti-camente idénticos entre sí (clonación reproductiva),aunque difieran en algo de su progenitor donante delnúcleo. Muchos animales de granja, tales como vacas,cerdos y ovejas, han sido clonados de forma satisfac-toria utilizando esta técnica. La oveja Dolly (figura 1),en 1996, fue el primer animal clonado a partir de unacélula somática adulta (célula de la glándula mamariade una oveja de 6 años, Wilmut y col., 1997, figura 8).

Las líneas celulares obtenidas a partir de célulassomáticas permiten la manipulación de los genomasde los animales de granja “in vitro”, lo cual permitecrear células transgénicas de ovejas, cerdos y vacascuyos núcleos, posteriormente, pueden ser transferi-dos a un ovocito enucleado para generar un animal

transgénico mediante transferencianuclear: clonación a partir de unacélula transgénica. Polly (figura 9) esla primera oveja transgénica produ-cida por transferencia nuclear (Sch-nieke y col. 1997). Fue generada apartir de fibroblastos fetales que fue-ron previamente modificados gené-ticamente mediante la adición delgen humano que codifica el factor IXde coagulación, introducido en unvector que portaba un promotor quedirigía la expresión a la glándulamamaria. Polly excretaba el factor IXde coagulación humano en su leche.

Por otra parte, si un embrión obte-nido por NT de células somáticas sedetiene en fase de blastocisto y de élse obtienen células ES, éstas puedencultivarse “in vitro” para diferentesusos potenciales (clonación terapéu-tica): terapias de reemplazo y rege-neración celular; investigaciónmédica; e, incluso, se puede realizarla modificación genética de estascélulas ES para corregir un defectogenético del individuo donante.

5. GLOSARIO DE TÉRMINOS

Alelo. Cada una de las formasalternativas de un gen dado concer-nientes al mismo carácter. En unacélula diploide, los miembros de unpar alélico ocupan posiciones

correspondientes sobre un par de cromosomas homó-logos. Si estos alelos son genéticamente idénticos(están en homocigosis), la célula o el organismo sonhomocigóticos; si son diferentes (están en heterocigo-sis), se trata de organismos heterocigoticos. Tres o másalelos de un gen dado constituyen una serie alelomór-fica.

Blastocisto. Blástula. Fase de diferenciaciónembriológica, originada a partir de la mórula, consis-tente en una esfera hueca formada por una sola capade células indiferenciadas que forman el blastodermo.

Célula diploide. Célula que tiene el número nor-mal de cromosomas característico del organismo alque pertenece (2n).

Célula germinal. Cada uno de los gametos o suscélulas formadoras.

Cigoto. Célula formada por fusión de los gametos.Sinónimo: huevo.

Clonación. Producción de individuos genética-mente idénticos

DNA recombinante. DNA híbrido obtenidomediante la unión covalente de un fragmento de DNA,que se desea expresar en una célula, a un DNA vec-tor.

Enzimas de restricción. Las enzimas de restricciónson endonucleasas que reconocen una secuencia entre4-8 pares de bases en el DNA. El sitio de reconoci-

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Figura 9. Polly (clonada ytransgénica) junto a sus hermanas

(Fuente: Roslin Institute).

El coste de producciónde animales de granja

mediantemicroyección

pronuclear de DNA esaltísimo y, en la

práctica, inabordable

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miento se llama sitio de restricción,y la enzima rompe un enlace fosfo-diéster en la hebra de arriba y otroenlace fosfodiéster en la hebra com-plementaria.

Enzimas ligasas. Cada uno de losmiembros de la clase enzimas quecatalizan la unión de dos moléculasde DNA por acoplamiento, con laliberación de pirofosfato a partir deATP.

Exón. Fragmento de DNA en losorganismos superiores, capaz deexpresarse en una proteína a travésdel sistema DNA–RNAm–proteínas.Los exones se localizan en los genes,separados por otros fragmentos queno se transcriben (intrones).

Fenotipo. Expresión o manifesta-ción externa de un genotipo en unambiente determinado.

Gen. Fragmento de DNA queconstituye la más pequeña unidadfuncional.

Genoma. Conjunto de genes queespecifican todos los caracterespotencialmente expresables de unorganismo dado, sin connotaciónalguna de la naturaleza alélica de losgenes integrantes.

Genotipo. Constitución genética contenida en loscromosomas de un individuo, referida a todos o a partede los caracteres diferenciales. Por lo general, se refie-re a la composición específica alélica de un gen par-ticular o serie de genes en cada célula de un organis-mo, aunque puede referirse al genoma total.

Haploide. Organismo, célula o núcleo con un juegosencillo de cromosomas. El número haploide se desig-na por n. Las células reproductoras, formadas comoresultado de la meiosis, son haploides. La fusión dedos de estas células restaura el número diploide nor-mal.

Línea germinal. Conjunto de las células de un indi-viduo que tienen la capacidad de llevar a cabo la meio-sis y dar origen a gametos.

Promotor. Secuencia de DNA situada en el comien-zo 5´-terminal de un gen, al que se une la RNA poli-merasa para la iniciación de la transcripción.

Pronúcleo masculino. Núcleo del espermatozoide,ya introducido en el citoplasma del óvulo, y antes deque tenga lugar su fusión con el núcleo de éste.

Transgénesis. Incorporación de genes foráneos algenoma de una célula receptora.

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Polly, la primera oveja transgénica

producida portransferencia nuclear,

excretaba en su leche el factor IX

de coagulaciónhumano

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