Avances sobre el estudio y caracterización de bacterias lácticas con potencial probiótico aisladas del

pulque y aguamielDr Adelfo Escalantea

MB Martha Giles Gómezb

aDepartamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM

bDepartamento de Biología, Facultad de Química, UNAM

Probióticos como alimentos funcionales

Los probióticos se definen como bacterias vivas que cuando son administradas en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud del hospedero

(FAO/WHO, 2001) (Tripathi and Giry, 2014. Journal of Functional Foods 9:225-241)

Fuente/producto Cepa

Chr. Hansen Lactobacillus acidophilus LA1/LA5L. delbrueckii ssp. bulgaricusLb12L. paracasei CRL431Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb12

Danisco L. acidophilus NCFMsL. acidophilus LaL. paracasei LpcB. lactis HOWARUTM/Bl

DSM Food Specialties L. aidophilus LAFTIs L10B. lactis LAFTIs B94L. paracasei LAFTIs L26

Nestlé L. johnsonii La1

Snow Brand Milk L. acidophilus SBT-20621Products Co. Ltd.B. longum SBT-29281

Institute Rosell L. rhamnosus R0011L. acidophilus R0052

Yakult L. casei ShirotaB. breve cepa Yakult

Foneterra B. lactis HN019 (DR10)L. rhamnosus HN001 (DR20)

Probi AB L. plantarum 299VL. rhamnosus 271

Danone L. casei ImmunitasB. animalis DN173010 (Bioactiva)

Fuente/producto Cepa

Essum AB L. rhamnosus LB21Lactococcus lactis L1A

Biogaia L. reuteri SD2112

Morinaga Milk Industry Co. Ltd. B. Longum BB536

Lacteol Laboratory L. acidophilus LB

Medipharm L. paracasei F19

Bact

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(Tripathi and Giry, 2014. Journal of Functional Foods 9:225-241)

Bacterias pertenecientes a dos grupos:

Lactobacillus sppBifidobacterium spp

Los prebióticos son carbohidratos de cadena pequeña, no digeribles por las enzimas digestivas del humano y que mejoran de forma selectiva la actividad de algunos grupos de bacterias benéficas

Prebióticos como alimentos funcionales

(Tripathi and Giry, 2014. Journal of Functional Foods 9:225-241)

Tipo de prebiótico Fuentes

Fructo oligosacáridos (inulina) Espárragos, remolacha, ajo, achicoria, cebolla, alcachofa de Jerusalén, trigo, miel, plátano, cebada, tomate, centeno

Fructo oligosacáridos (agavinas) Agave

Isomaltulosa Miel, jugo de la caña de azúcar

Xilo oligosaccharides Brotes de bambú, frutas, verduras, leche, miel y salvado de trigo

Galacto oligosacáridos Leche humana y la leche de vaca

Ciclodextrinas Glucanas solubles

Oligosacáridos de la rafinosa Semillas de legumbres, lentejas, guisantes, habas, garbanzos, compuesta malva, y mostaza

Oligosacárdios de la soja Soja

Lactulosa Lactose (Milk) Lactosa (leche)

Lactosacarosa Lactosa

Isomaltulosa, palatinosa Sacarosa

Malto oligosacáridos, isomalto oligosacáridos Almidón

Arabino xilo oligosacáridos Salvado de trigo

Dextrinas resistentes a hidrólisis enzimática Almidón de papa

Tipo

sy fu

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Al-Sheraji et al., 2013. Journal of Functional Foods 5:1542-1553

Tipo de prebiótico Fuentes

Fructo oligosacáridos Bacterias lácticas del género Leuconostoc

Dextranas Bacterias lácticas del género Leuconostoc

Tipos y fuentes de prebióticos ¿origen microbiano?

Los polisacáridos extracelulares (EPS) producidos por bacterias ácido lácticas han recibido particular atención debido a sus posibles aplicaciones comerciales como son:

-Aditivos naturales, -Reemplazar o disminuir el uso de hidrocoloides-Seguros para su uso en alimentos-Productos funcionales: fibra soluble y prebióticos

(Giraffa 2004; Tieking et al. 2005; Vu et al. 2009; Leemhuis et al. 2013) en Torres-Rodríguez et al., 2014.

Alimentos y bebidas lácteas tradicionalesBacterias lácticas + levaduras + otros microorganismos

Productos comerciales

cultivos puros

(cultivos mixtos)

Origen intestinal humano

Búsqueda de probióticos

Ellie Metchnikoff, 1900´s. Instituto Pasteur, París.

Simultáneamente, Tissier aisló las bifodobacterias (Lactobacillus bifidus) y especuló sobre su papel en la salud de infantes.

Promovió el uso de lactobacilos (Thermobacterium bulgaricum), en la dieta humana: promoviendo la teoría de la longevidad humana asociada a la bacterioterapia a través del consumo de yogurt de Bulgaria.

Funcionalidad de bebidas lácteas fermentadas

Rahe en 1915, demostró que los lactobacilos del yogurt no sobreviven el paso a través del estómago y del intestino.

M. Shirota, aisló el Lactobacillus casei Shirota e inicia (1935) la comercialización de Yakult.

Gurr , 1984: los microorganismos endógenos del tracto intestinal humano son aquellos con la mejor posibilidad de pasar a través del estómago, del intestino delgado y colonizarlo. → Investigación sobre Bifidobacterium

Búsqueda, aislamiento y caracterización de lactobacilos y bifidobacteriasnativas de humanos ¿y de otros ambientes?

Uso en la elaboración de nuevos productos probióticos.

Funcionalidad de bebidas lácteas fermentadas

Producto Microorganismo Substrato

Boza tradicional (bebida popular fermentada de los Balcanes)

Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc, levaduras

Cereales

Bushera(bebida fermentada tradicional de Uganda)

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus, Weissella

Sorgo y mijo

Hardaliye (bebida fermentadatradicional de Tracia)

Lactobacillus, levaduras yeast, mohos

Uvas rojas y semillas de mostaza

Kombucha (China, Rusia) Acetobacter, Gluconobacter, Lactobacillus, levaduras

Té verde o negro

Mahewu (Sudáfrica) Lactobacillus, Lactococcus Maíz

Pozol (México) Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, levaduras, mohos

Maíz y cacao

Pulque (México) Lactobacillus, Leuconostoc, Citrobacter, Zymomonas mobilis, levaduras

Savia de maguey (aguamiel)

Probióticos potenciales detectados/aislados en algunas bebidas tradicionalesfermentadas no destiladas no lácteas

Soccol et al. 2012. Probiotic nondairy beverages. In: Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology. CRC Press.

¿Aguamiel y pulque como un agente probióticoy prebiótico (simbiótico)?

Proceso espontáneo.Microorganismos naturalmente asociados al aguamiel,Incorporados durante el proceso de manipulación, semilla, contenedores.

Pulque: Bebida fermentada alcohólica no destilada elaborada a partir de a savia del maguey (aguamiel).

Oliver G. 2012. Los Dioses ebrios del Méxicoantiguo. De la transgresión a la inmortalidad.Arqueología Mexicana. 19 (114):26-33

Producción de pulque como suplemento de la dietay en prevención de enfermedades en Teotihuacanentre 150 años A.C. y 650 años D.C.

Evidencia de uso de vasijas de barro para almacenar pulque entre 200 – 550 años D. C.

¿Pulque como alimento funcional?

Propiedades funcionales del pulque I

Primer reporte sobre beneficios del consumo de pulque: tratamientoexitoso de escorbuto en internos de una penitenciaria en el estado de Puebla, 1887. Antes del descubrimiento de la vitamina C (RamírezRancaño, 2000).

Primer estudio sistemático sobre los efectos nutricionales del consumoregular de puque en población Otomí (Valle del Mezquital, Hidalgo). Análisis de 100 consumidores adultos, consumo diario de 1-2 L / 7 días(Anderson et al., 1946): Calorias 12 %, Proteína total 6 % Tiamina 10 %, riboflavina 24 %, niacina 23 %, vitamina C 48 % Cacio 8 %, hierro 51 %

Propiedades funcionales del pulque II

Sánchez-Marroquín and Hope, 1953. Reporta el contendio de vitaminas enpulque (µg/100 mL of pulque): 65.2 ácido pantoténico, 30.7 tiamina, 21.6 ácidoρ-amino benzoico, 23 pyridoxina y 19.6 (ng/ 100 mL of pulque) de biotina.

Backstrand et al., 2002. Demuestran que el pulque es la tercer fuente de hierro(forma no-hemo) después de las tortillas y legumbres. Fuente de ácido ascórbico, rivoflavina, vitamin, folato y saponinas esteroidales.

Tovar et al 2008. Pulque como Fuente de fitasa producida por Lactobacillus sp. y S. cerevisiae un incremento en la biodisponibilidad de hierro y zinc presentesen maíz.

Morales de León et al., 2005. Reportan contenido de proteína cruda: 0.27 g/100 g de pulque. Aminoácidos: (g/16 N), Ile (4.04), Leu (8.65), Lis (1.76), Cis (1.59), Fen (6.45), Tir (2.76), Tre (4.21), Trp (2.35), Val (5.12) y His (2.01).

Propiedades funcionales del aguamiel I

Aguamiel colectado de A. salmiana `Gentry` contiene(Silos-Espino et al., 2007): Baja cantidad fribra cruda (0.57 %), proteína cruda (0.69 %) y altos niveles de crabohidratos

digeribles (98.1 %) Minerales (mg/L de aguamiel) 100 de N, 200 de Ca, 200 de P, 200 de Mg, 21.5 de Fe, 14.1 de

Zn, 7.4 de Cu y 19.9 de B. El consumo de 850 mL de aguamiel satisface los requerimientos diarios de Fe y Zn.

Aguamiel colectado de A. mapisaga `Blanco` contiene (Ortiz-Basurto et al., 2008): Contiene 11.5 % materia seca compuesta por: 75 % de azúcares (sacarosa, fructose y FOS),

0.3 % de ainoácidos libres esenciales (excepto Met), 3 % de proteínas y 3 % de cenizas. Contiene 26 mg/L de ácido γ-aminobutírico (GABA).

Propiedades funcionales del aguamiel II

Presencia de agavinas (FOS con una mezcla de ramificaciones y diferentes grados de polimerización) (Velázquez-Martínez et al., 2014). Aguamiel considerado como fuente alternativa de jarabes prebióticos: Bajo índice glucémico, mejora absorción de calcio y hierro y prevención de

cáncer de colón (García-Aguirre et al., 2009; Santos-Zea et al., 2016).

Aguamiel de A. mapisaga `Blanco` contiene: Fructanos tipo inulina (10.2 % peso seco) y gluco-oligosacáridos: Fructo-

oligosacáridos ramificados; unidades de β-fructosil unidas por β12, β26 (Ortiz-Basurto et al., 2008).

Propiedades funcionales del aguamiel III

Diferentes extractos de A. angustifolia `Haw`: Posee fructanos ramificados de alto peso molecular con diferente grado

de polimerización: alto (3–60) medio (2–40) y bajo (2–22) unidades de fructosa (Velázquez-Martínez et al., 2014).

Los fructo-oligosacáridos de han demostrado función prebiótica promoviendo el crecimiento de diversos lactobacilos y bifidobacteriasprobióticos: L. acidophilus, B. lactis, B. infantis, B. animals y B. adolescentes (Castro-Zavala et al.,

2015; Tripathi and Giri, 2014; Velázquez-Martínez et al., 2014).

¿Aguamiel y pulque como un agente probiótico y prebiótico (simbiótico)?

A pesar de los beneficios ampliamente documentados del pulque y aguamiel como productos funcionales, la principal desventaja de estos productos radica en el contenido de alcohol que poseen lo cual restringe su promoción y consumo en este contexto (Backstrand et al., 2001, 2004; Narro-Robles and Gutiérrez-Avila, 1997).

Análisis de la diversidad bacteriana en aguamiel y pulque

Presencia de Leuconostoc sp.L. mesenteroidesL. citreumL. kimchii

Presencia de bacterias ácido lácticas.Lactobacillus casei, L. brevis, L. plantarumL. mesenteroides

Papel esencial durante la fermentación

Ambiente naturalmente enriquecido: acidez

Consumo tradicional Farmacopea tradicional

Análisis del potencia probiótico de LAB del aguamiel y pulque

Resistencia a las barreras antimicrobianas del tracto gastrointestinal: efecto de lisozima de saliva, pH ácido, solución gástrica y sales biliares (Castro-Rodríguez et al., 2015; Giles-Gómez et al., 2016; González-Vázquez et al., 2015; Reyes-Naya et al., 2016; Torres-Maravilla et al., 2016).

Actividad animicrobiana contra bacterias patógenas como Escherichia coli EPEC, S. enterica serovar Typhimurium, S. enterica serovar Typhi y Listeria monocytogenes(Castro-Rodríguez et al., 2015; Giles-Gómez et al., 2016; González-Vázquez et al., 2015; Torres-Maravilla et al., 2016).

Adherencia in vivo a mucosa intestinal de ratones (Castro-Rodríguez et al., 2015). Actividad ainti-inflamatoria in vivo en un modelo de ratón (Torres-Maravilla et al., 2016). Efecto anti-anticolesterolémico in vivo (Reyes-Naya et al., 2016). Efecto anti-infectivo in vivo Salmonella enterica serovar Typhymurium (Giles-Gómez et

al., 2016).

Propiedades funcionales de los polisacáridos extracelulares producidos por LAB del AM y pulque

Propiedades funcionales de EPS producidos por LAB del aguamiel y pulque

Dextrana, enlaces lineales α16 D-Glcp y ramificaciones en α13 D-Glcp. Producidos por una glucosiltransferasa (GTF) en fracción celular y

soluble de L. mesenteroides (Apan, Hidalgo) (Chellapandian et al., 1998).

Dextrana, enlaces lineales α16 D-Glcp y ramificaciones en α12 and α13: Producidos por una GTF en fracción celular y soluble de L. kinchii

EPSA (Huitzilac, Morelos) (Torres-Rodríguez et al., 2014).

Mezcla de levana enlaces lineales β26 (β-D-fructofuranosil) y ramificaciones en β21 (79 %) con dextrana Tipo I (21 %):

Producidos por la fracción cellular de L. kinchii EPSB (Huitzilac, Morelos) (Torres-Rodríguez et al., 2014).

Propiedades funcionales de EPS producidos por LAB del aguamiel y pulque

Los EPS y hetero-oligosacáridos producidos por LAB han Ganado gran atenciónpor su papel ocmo aditivos en alimentos y como ingredientes funcionalespotenciales: prebióticos o fibra soluble (Harutoshi, 2013; Patel et al., 2011) p.eLactobacillus reuteri, L. rhamnosus, L. acidophilus y Bifidobacterium bifidum(Helal et al., 2015).

Los EPS producidos por LAB com potencial probiótico se ha propuesto que pueden tener un efecto positive en la adherencia intestinal (García-Ruiz et al., 2014).

Ensayo in vitro con una cepa productora de EPS de L. mesenteroides productorade EPS contra E. coli EPEC, S. enterica serovar Typhimurium, S. enterica serovarTyphi y L. monocytogenes mostraron un efecto promotor de la actividadantimicrobiana célula-célula (Giles-Gómez et al., 2016).

Conclusiones:

Las evidencias científicas sobre los efectos promotores a la salud de las diferentes LAB presentes en el aguamiel y durante la fermentación del pulque (consumidas

por bebedores de la bebida), hacen de estos microorganismos importantes candidatos para el desarrollo de productos funcionales no-lácteos

Agradecimentos

Manuscrito en segunda revision

Frontiers in Microbiology

Pulque, a traditional Mexican fermented beverage. Historical,

microbiological and technological aspects.

Adelfo Escalante, David R. López Soto, Judit Eveling Velázquez Gutiérrez, Martha Giles-Gómez, Francisco Bolívar, Agustín López-

Munguía.