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CORPORACIÓN AUTÓNOMA REGIONAL DEL CENTRO DE ANTIOQUIA
CORANTIOQUIA
AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO
ESPECIES FORESTALES EN LA ESTACIÓN
BIODIVERSIDAD DE PIEDRAS BLANCAS
INFORME FINAL
Medellín, Junio de 2006
AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO ESPECIES
FORESTALES EN LA ESTACIÓN BIODIVERSIDAD DE PIEDRAS
BLANCAS
PROGRAMA PARA LA BIODIVERSIDAD Y EL DESAROLLO
PROYECTO “MANEJO Y CONSERVACIÓN DE LA FLORA”
Contrato 6571/2005
Presentado por
OSCAR DARIO QUINTERO GARCÍA. Ingeniero Agrónomo
Interventor
Juan Lázaro Toro Murillo Ingeniero Forestal
Corporación Autónoma Regional del Centro de Antioquia Medellín, Junio de 2006
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
TABLA DE CONTENIDO
Pág. RESUMEN 6 INTRODUCCION 7 1. PROPAGACION in vitro del Caunce (Godoya antioquensis Planch). 9
1.1 Antecedentes. 9 1.2 Material vegetal 10
1.3 Establecimiento in vitro 10
1.4 Multiplicación 10
1.5 Enraizamiento 12 2. Propagación in vitro de yarumo blanco (C. telenitida) y yarumo común (C. angustifolia). 13
2.1 Antecedentes 13
3. Propagación in vitro de palma de chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.). 15
3.1 Antecedentes 15
4. Inducción de brotes sobre cotiledones inmaduros de Cedro Negro (Juglans neotropica).
17
5. Seguimiento a las palmas de chontaduro en el suroeste Antioqueño. 20 5.1 Antecedentes 20 6. Propagación asexual de Caunce (Godoya antioquensis Planch) 23 CONCLUSIONES 25 BIBLIOGRAFIA 28 ANEXO 31
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
LISTA DE FIFURAS
Pág.Figura 1. Cápsulas inmaduras (a) y maduras (b) del Caunce 11
Figura 2. Secuencia de la dehiscencia en cápsulas de Caunce y Semillas 11 Figura 3. Respuesta de acodos al ácido indol butírico (AIB). 24
Figura 4. Siembra de acodos en bolsas con tierra-arena (2:1)
24
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
LISTA DE TABLAS
Pág. Tabla 1. Micropropagación in vitro de G. antioquensis Diels. 12 Tabla 2. Micropropagación de C. telenitida y C. angustifolia. 14
Tabla 3. Micropropagación de palma chontaduro (B. gasipaes H.B.K.). 16
Tabla 4. Micropropagación de Cedro Negro (J. neotropica Diels) 18
Tabla 5. Evaluación de diferentes hormonas en brotes de J. neotropica 19
Tabla 6. Insectos plaga en palma de chontaduro. 21
Tabla 7. Recomendaciones realizadas para palma de chontaduro. 22
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Resumen
Con base en el trabajo realizado se demostró la utilidad de la técnica de
cultivo de tejidos vegetales, para obtener material de forma clonal masiva
vía organogénesis directa e indirecta, para las especies Bactris gasipaes,
Cecropia telenitida, Cecropia angustifolia y Godoya antioquensis. Para la
especie forestal cedro negro (Juglans neotropica Diels), se logró la
estandarización preliminar del protocolo de micropropagación in vitro, a
partir de frutos inmaduros, como una alternativa de propagación para esta
especie vulnerable a la extinción.
De otro lado, mostrar la importancia de transferir de condiciones in vitro
a ex vitro (campo o medio ambiente), y hacer seguimiento al material
vegetal de B. gasipaes, producido por vía embriogénesis somática, para
observar el crecimiento, desarrollo, producción de flores, frutos,
resistencia o susceptibilidad a plagas y enfermedades etc. Parámetros que
determinan que no se afectaron las características de la especie, al ser
producidas por técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro.
Palabras claves: Propagación in vitro, micropropagación, especies forestales, Bactris gasipaes, Cecropia
telenitida, Cecropia angustifolia, Godoya antioquensis, Juglans neotropica.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
INTRODUCCIÓN
Entre los avances y desarrollos de la ciencia, la biotecnología es
posiblemente el de mayor importancia para el sector agrícola. De las
técnicas mas utilizados en la biotecnología, específicamente en el área
vegetal, es el cultivo de tejidos, el cual es un método de micropropagación
in vitro, que ofrece un gran potencial como alternativa y complemento a
los métodos tradicionales de propagación y mejoramiento genético de las
plantas.
La técnica de micropropagación in vitro, es un proceso que se realiza en
laboratorio y consiste esencialmente, en aislar una porción de tejido
(explante) de una planta (hoja, yema apical, raíz, embrión, cotiledón,
meristemo, etc.) y proporcionarle artificialmente las condiciones
apropiadas de luz, humedad, temperatura (condiciones físicas), y
vitaminas, minerales, carbohidratos, hormonas (condiciones químicas), en
ambiente completamente aséptico, para producir una gran cantidad de
material vegetal idéntico al individuo de donde se extrajo tejido.
En especies forestales la micropropagación in vitro, se muestra como una
alternativa a los métodos de propagación convencional, para obtener
material vegetal, sobre todo en especies, que están en peligro de
extinción, que tienen problemas de germinación o que producen poca
semilla.
El objetivo general del presente trabajo de investigación, fue la utilización
de la técnica de cultivo de tejidos in vitro para micropropagar material
vegetal de las especies, yarumo blanco (Cecropia telenitida), yarumo
común (Cecropia angustifolia), Caunce (Godoya antioquensis) y palma de
chontaduro (Bactris gasipaes), especies con importancia ecológica y/o
económica, presentes en la jurisdicción de CORANTIOQUIA, y cuyos
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
lineamientos se enmarcan dentro del proyecto Manejo y conservación de
la flora.
Los resultados promisorios de este trabajo se muestran especie por
especie, cuyo manejo en laboratorio puede servir de modelo para
extrapolar a otras especies de características similares. Además será de
gran utilidad para proyectos dirigidos a la propagación y conservación de
árboles nativos cuyas poblaciones naturales se encuentran amenazadas.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
1. PROPAGACION in vitro de CAUNCE (Godoya antioquensis Planch)
1.1 Antecedentes
Especie endémica del departamento de Antioquia, se encuentra en las
cordilleras Central y Occidental, entre 1600 – 2600 m.s.n.m , en el parque
ARVI es una especie muy rara, crece en bosques secundarios, rastrojos
altos y áreas abiertas. Su madera fue utilizada para leña y la fabricación
de cabos de herramientas. En el área del parque ARVI se utilizó
ampliamente como leña, por sus facilidades para arder, aun en estado
verde, lo cual causó la casi desaparición de la especie en este territorio
(Toro, 2000).
A.G.S., (2004), al realizar una investigación en especies endémicas en la
jurisdicción de CORANTIOQUIA, encontró información sobre la existencia
en Ecuador y Perú de ejemplares de herbarios de G. antioquensis,
colectados en los años 1979 y 1997 respectivamente, y a pesar de ello, en
Colombia solo está reportada para el departamento de Antioquia; hasta el
momento. Los municipios dentro de la jurisdicción de CORANTIOQUIA
donde se encuentra la especie son: Medellín, Andes, Anorí, Caicedo,
Caldas, Copacabana, Envigado, Pueblo Rico, Santa Rosa de Osos e
Ituango.
La micropropagación in vitro del caunce, se plantea como un complemento
y alternativa potencialmente útil para la obtención de material vegetal, la
cual puede enmarcarse dentro de la estrategia Nacional para la
conservación de plantas, cuya misión se dirige a orientar las acciones de
conocimiento, conservación y uso sostenible, adelantada por el instituto
Alexander von Humboldt, la red Nacional de Jardines Botánicos, Ministerio
de medio ambiente y la Asociación Colombiana de Herbarios desde el año
2001.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
1.2 Material vegetal
Cápsulas indehiscentes o dehiscentes fueron recolectadas de árboles
localizados en Cerro Asturias (Parque regional ARVI), la madurez de las
cápsulas se caracteriza por el cambio de color de amarillo a café (fig. 1),
las cápsulas se lavaron con agua corriente para retirar el polvo, antes de
iniciar el proceso de desinfección.
1.3 Establecimiento in vitro
En la cabina de flujo laminar, las cápsulas indehiscentes se desinfectaron
sumergiendo en etanol al 70% durante 30 segundos y luego flameando,
operación que se repitió dos veces. Luego con ayuda de un bisturí y pinzas
se realizó un corte longitudinal en la cápsula para extraer las semillas y
sembrarlas en medio de germinación WG (tabla 1). Para el caso de las
cápsulas que ya estaban dehiscentes (fig. 2a y b), se sacaron las semillas
con ayuda de un pinza, y se desinfectaron mediante dos lavados, el
primero, con una solución de etanol al 70% durante 30 segundos, seguido
del segundo lavado con solución de hipoclorito de sodio al 0.25% por 30
min. Luego se retiraron los residuos de ambas soluciones, realizando tres
lavados consecutivos con agua destilada estéril, para sembrar también en
el medio WG.
1.4 Multiplicación
La germinación se inicio alrededor de los 30 días extendiéndose hasta los
70 días, pasado este tiempo las parte aérea (epicótilo), se cortó y se
subcultivó en medio WC (tabla 1), que estimula la brotación de yemas
preexistentes y su posterior elongación, luego cada tallo fue separado y
llevado a condiciones de enraizamiento.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
a b
Figura 1. Cápsulas inmaduras (a) y maduras (b) del Caunce.
eda b c
Figura 2. Secuencia de la dehiscencia en cápsulas de Caunce (a, b, c, d),
y Semillas (e).
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Tabla 1. Micropropagación de G. antioquensis Diels.
PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA
Material Vegetal: semillas maduras Procedentes de
cápsulas dehiscentes e indehiscentes.
Los frutos se recolectan al inicio de la madurez cuando se
tornan cafés, se secan al sol sobre papel periódico hasta
que liberen las semillas.
Desinfección
1. Cápsulas indehiscentes: sumergir en etanol al 70%
durante 30 seg y flamear (fig. a y b).
2. Cápsulas dehiscentes: lavar las semillas con NaOCl al
0.25%(v/v) durante 30 min, luego con etanol al 70%
por 30 seg. Enjuagar tres veces.
1. Abrir la cápsula, haciendo un corte longitudinal para
extraer las semillas y sembrar directamente en medio
WG.
2. Pesar 0,2 gr de semillas y envolver con papel filtro,
preparar 100 ml de solución de NaOCl al 0,25%(v/v),
suplementado con 2 gotas de tween-20, agitar a 150 r.p.m
durante 30 min.
Establecimiento
Colocar las semillas sobre medio WG, compuesto de
sales WPM ( Lloyd y Mccown, 1981) o MS (Murashige
& Skoog, 1962) a la mitad de la concentración original,
sin reguladores de crecimiento.
Composición WG
Sales MS/2 o WPM/2, Sacarosa 3% (p/v), Tiamina 1
mg/L, Piridoxina 0,5 mg/L, Ac. Nicotínico 0,5 mg/L,
Glicina 1 mg/L, Mio inositol 100 mg/L, Phytagel 0.2%
(p/v). pH ajustado a 5.7 antes de ser esterilizado a 121ºC
durante 20 minutos.
Multiplicación
Separar el epicótilo (parte aérea), de las plántulas y
sembrarlo sobre el medio WC, colocar en condiciones
de luz (8h) a temperatura 23±1°C
Composición WC
Sales MS, Sacarosa 3%(v/v), Adenina 2 mg/L, Tiamina 1
mg/L, Piridoxina 0,5 mg/L, Ac. Nicotínico 0,5 mg/L,
Glicina 1 mg/L, Mio inositol 100 mg/L, Biotina 1 mg/L,
Phytagel 0.2% (p/v). pH ajustado a 5.7 antes de ser
esterilizado a 121ºC durante 20 minutos.
ENRAIZAMIENTO
Sembrar los esquejes en medio CR, compuesto de sales
MS (Murashige & Skoog, 1962), a la mitad de la
concentración original (MS/2), suplementado con AIB,
sacarosa y vitaminas.
Composición CR
Sales MS/2, AIB 0.5 mg/L, Sacarosa 15g/L, Tiamina 0.5
mg/L, Piridoxina 0.25 mg/L, Ac. Nicotínico 0.25 mg/L,
Glicina 0.5 mg/L, Mio inositol 50 mg/L, Phytagel 1.8
g/L, pH 5.7; Esterilizar a 121ºC por 22 min.
1.5 Enraizamiento
Los tallos de aproximadamente de 1-2 cm de longitud, fueron sembrados
en medio RC (tabla 1), durante ocho días en condiciones de oscuridad,
posteriormente se pasaron a condiciones de luz (8h) y transcurridos otros
14 días se indujo los brotes radicales in vitro.
Al cabo de 45 días las plántulas enraizadas, se pasaron a condiciones ex
vitro, primero se retiro el agar y residuos de medio de cultivo con agua
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
corriente y sembradas en una mezcla de sustrato compuesto de tierra
negra, tierra amarilla y arena (1:1:1), las plántulas se colocaron bajo
condiciones de polisombra en el vivero.
2. PROPAGACION in vitro DE YARUMO BLANCO (Cecropia telenitida)
y YARUMO COMÚN (Cecropia angustifolia).
2.1 Antecedentes
Ambas especies forestales son de importancia ecológica, son muy
utilizadas en la protección de microcuencas, en la recuperación de suelos
y coberturas vegetales, los frutos son consumidos por las aves silvestres y
murciélagos (Toro, 2000), aunque son propagadas normalmente por
semilla sexual, presentan la dificultad de conseguir semilla viable por ser
muy apetecidas por las aves, además su recolección es muy dispendiosa
por tener que recolectar directamente los frutos de los árboles. La
propagación clonal masiva por medio de cultivos in vitro, ha mostrado
rápidas tasas de multiplicación y crecimiento en poco tiempo, frente a la
propagación sexual (Quintero, 2004). El protocolo de multiplicación que se
utilizo para la obtención del material vegetal de yarumo blanco y común
se resume en la tabla 2.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Tabla 2. Micropropagación de C. telenitida y C. angustifolia. PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA
Material Vegetal
Semillas sexuales
Los frutos maduros se dejan en remojo y luego se maceran
para extraer las semillas y secar a la sombra.
Desinfección
Sumergir las semillas en etanol al 70% durante 1 min.
Luego lavar con de hipoclorito de sodio al 3%
durante 30 minutos, se enjuagaron tres veces con
agua destilada estéril y sembrar.
Pesar 0,2 gr de semillas y envolver con papel filtro, preparar
100 ml de solución de NaOCl al 3%(v/v), suplementado
con 2 gotas de tween-20, agitar a 150 r.p.m durante 30 min.
Establecimiento
Sembrar las semillas en medio GY, en fase liquida y
en condiciones de luz (16h) y temperatura 23±1°C La
germinación en este medio inicia aproximadamente a
los 30 días.
Composición del medio GY
Sales Murashige & Skoog, 1962 (1/4) de concentración,
14,4 µM de ácido giberélico (GA3), 2,5% (p/v) de sacarosa.
El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes de ser esterilizado
a 121 ºC por 20 minutos.
Multiplicación
Las semillas que van germinando se subcultivan en
medio MY, donde se forman masas organogénicas
que se subcultivan cada 30 días en el mismo medio.
Cada tres meses se obtienen tallos diferenciados los
cuales son separados con ayuda de un bisturí y
subcultivados en medio para enraizamiento.
Composición medio MY
Sales WPM (Lloyd & Mccown, 1981) completo,
suplementado con 4,4 µM de BAP, 3% (p/v) sacarosa,
0.24% (p/v) gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5,8
antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos; las
condiciones de crecimiento temperatura 21 ±1°C,
fotoperíodo de 16 horas de luz.
Enraizamiento
Subcultivar los esquejes en medio R, e incubar en
condiciones de oscuridad durante 72 horas, después
sacar a condiciones de luz (16h) y al cabo de 24 días
están listas para ser transferidas a condiciones ex vitro
en bandejas de polipropileno.
Composición medio R
Sales WPM a la mitad de la concentración, suplementado
con 4,9 µM de AIB, 1,5% (p/v) sacarosa, 0,24% (p/v)
gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes de ser
esterilizado a 121ºC por 20 minutos
Aclimatación
1. Siembra en bandejas de polipropileno con sustrato
estéril, compuesto de compost mas arena (1:1), y
cubiertas con tapas transparentes.
2. siembra en bolsas negras de 1kg, para dejar en
condiciones de vivero.
1. Las plántulas con raíces bien formadas, se sacan de los
frascos y se lavan las raíces con agua corriente para retirar
los residuos de gel, para evitar contaminación. Permanecen
dos meses bajo este sistema, el primer mes cubiertas y
realizando riegos semanales con medio WPM diluido; el
segundo mes sin tapa y riegos con agua corriente.
2. Transplantar a bolsas con sustrato compuesto de tierra
negra y arena (2:1). Mantener en condiciones de luz
indirecta y riego nebulizado durante la primera semana.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
3. PROPAGACIÓN in vitro DE PALMA DE CHONTADURO (Bactris
gasipaes H.B.K.).
3.1 Antecedentes
La especie esta distribuida ampliamente en el Neotrópico, en Colombia se
cuenta con pequeños bancos de germoplasma, pero no cuentan con
suficiente caracterización que permita a los cultivadores disponer de
material de calidad (Reyes et al., 2002). Actualmente el cultivo se ha visto
limitado por los problemas de propagación por semilla sexual y por los
sistemas de propagación vegetativa vía hijuelos (Mora y Solis, 1980). Las
variedades más productivas son partenocárpicas (fruto sin semilla) y la
propagación por hijuelos es bastante limitada, por su bajo porcentaje de
prendimiento y problemas de anclaje (Blaak, 1980). Además los procesos
de autoincompatibilidad genera una alta variabilidad (heterocigocidad) lo
cual dificulta el establecimiento de plantaciones homogéneas, altamente
productivas y de gran rendimiento (Mora, 1981).
La mayor parte de las investigaciones realizadas sobre el cultivo in vitro
en esta especie se han realizado en Costa Rica y Ecuador (Arias y Huete,
1983; Arias, 1985; Valverde y Arias, 1985; Valverde et al., 1987;
Valverde et al., 1989; Stein y Stephens, 1991; Valverde et al., 1992),
indicando que es factible la producción masiva optimizando los métodos
desarrollados. La labor de micropropagación del material de chontaduro
procedente del suroeste antioqueño (Colombia), se hizo de acuerdo a los
protocolos establecidos por Garcés y Roldan, (1996) y Botero y Atehortúa,
(1999), (Tabla 3).
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Tabla 3. Micropropagación de palma chontaduro (B. gasipaes H.B.K.).
PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA
Material vegetal: meristemas apicales, sometidos a
doble esterilización con NaOCl al 2.3% (v/v) con
adición de 2 gotas de Tween-20 por cada 100 ml, durante
40 y 10 min en agitación constante.
Ápices caulinares, aislados de plantas de menos de un
año de edad.
Siembra in vitro: reducir los ápices hasta un tamaño de
0.2-0.5 cm de altura, sembrar los ápices en posición
vertical en medio M50 y mantener durante un mes en
condiciones de oscuridad a 24 ±1°C.
Composición M50
Sales Murashige & Skoog, (1962) completo,
suplementado con 1.0 mg/L de biotina, 5.7µM de AIA,
9µM de 2-4 D, 8.3µM de piclorám, 5.4µM de ANA,
0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de sacarosa y agua de
coco 15% (v/v), El pH del medio fue ajustado a 5,7
antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos
Composición M7
Murashige & Skoog, 1962) completo, suplementado con
1.0 mg/L de biotina, 22.8µM de AIA, 9µM de 2-4 D,
5.4µM de ANA, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de
sacarosa, y agua de coco 15% (v/v). El pH del medio
fue ajustado a 5,7 antes de ser esterilizado a 121ºC por 20
minutos.
Inducción de Embriones y multiplicación.
Posteriormente subcultivar en medio M7, retirar el
exceso de tejido foliar y cortar verticalmente, procurando
pasar por la mitad de la zona meristemática. Mantener en
condiciones de oscuridad a 24±1°C hasta que se formen
los embriones. En este medio se mantienen entre 8-10
meses, con subcultivos mensuales.
Bioconversión de los embriones en plántulas.
Los embriones formados son retirados del explante y
subcultivados al medio CH los explantes se mantuvieron
bajo condiciones de luz (16h) a 23 ±1°C durante un mes.
Luego son transferidos a medio B otro mes y subcultivar
al medio inicial CH hasta el desarrollo de las plántulas.
Composición medio CH
MS (Murashige & Skoog, 1962) completo, suplementado
con Biotina 1.0 mg/L, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v)
de sacarosa. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de
ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos,
Composición medio B
MS (Murashige & Skoog, 1962) completo a mitad de
concentración, suplementado con Biotina 1.0 mg/L, agua
de coco 15% (v/v), 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de
sacarosa. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de ser
esterilizado a 121ºC por 20 minutos
Enraizamiento: esta fase se realiza con palmas que no
desarrollan raíz durante la fase de bioconversión, las
palmas se siembran en medio R en medio haciendo
cambios de medio cada 30 días. La formación de raíces
en las palmas dura como mínimo 4 meses, al cabo de los
cuales se obtienen entre 2-5 raíces nuevas, que se
caracterizan por su grosor y de color crema.
Composición medio R
MS (Murashige & Skoog, 1962) diluido al 50% de su
concentración, con sus respectivas vitaminas y
suplementado con 2,5µM de AIB, 1.5% (p/v) de
sacarosa, 0.2 % (p/v) de fitagel a un pH de 5,7 y
mantenidos con un fotoperíodo de 12 horas a 23 ±1ºC.
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
4. Inducción de brotes sobre cotiledones inmaduros de cedro
negro (Juglans neotropica Diels).
4.1 Antecedentes
El Cedro Negro o Nogal (Juglans neotropica Diels), es una especie forestal,
que presenta problemas de latencia en la semilla (López y Piedrahita,
1999; Gómez, 2001); además el Nogal es vulnerable de extinción
(Calderón, 2001), por la extracción intensiva de su madera, utilizada en la
fabricación de guitarras, muebles, puertas, ventanas, armarios entre otros
(Ospina et al, 2003). Dando como resultado la desaparición progresiva de
la especie dentro del ecosistema (Humboldt, 1998).
Una solución alternativa y complementaria para la propagación y
producción de las especies maderables, es la aplicación de la
micropropagación in vitro, técnica, que permite rápidas tasas de
multiplicación Castro et al. (1994); Carrizosa et al, (1994), hecho que se
ha demostrado con éxito en otras especies del mismo genero como J.
regia L., J. nigra L., J. cinerea L., valoradas por su importancia ecológica,
maderable y nueces comestibles. (Driver y Kuniyuki, 1984; Tulecke y
McGranahan, 1985; Leslie y McGranahan, 1992; Pijut, 1992; Chenevard
et al. 1997; Saadat y Hennerty, 2002). En Colombia solo ha sido
reportado el protocolo parcial, para la inducción de brotes in vitro, vía
organogénesis directa para J. neotropica Diels; utilizando yemas apicales
obtenidas a partir de plantas de invernadero de 1-4 meses de edad (Cruz
y Cruz, 2003).
El procedimiento que se resume a continuación describe los pasos
preliminares de desinfección, establecimiento, multiplicación y
enraizamiento para J. neotropica, utilizando cotiledones en estado
inmaduro (tabla 4).
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Tabla 4. Micropropagación de cedro negro (J. neotropica Diels).
PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA MATERIAL VEGETAL: Frutos inmaduros, los cuales
presentan formación de la testa (cubierta).
Edad entre 20 y 28 semanas después de la polinización.
DESINFECCION -Lavar las semillas con Hipoclorito de sodio (NaOCl) al
2.5%, durante 20 min.
-Flamear con Etanol al 90%, tres veces, en cabina de
flujo laminar.
Retirar la cáscara de los frutos, con ayuda de un cuchillo
y lavar los restos de corteza con cepillo y agua corriente.
Extraer los cotiledones con la ayuda de pinzas y bisturí.
Explante Colocar las semillas desinfectadas sobre papel craft
estéril y envolverlas, para fracturar la semilla, con ayuda
de un martillo y poder extraer los fragmentos de
cotiledón.
Medio de establecimiento Colocar los fragmentos de cotiledón sobre el medio de
inducción de brotes (MI), en la oscuridad a 22ºC,
durante 30 días, para obtener la inducción de los brotes.
Composición del medio MI:
Sales Murashige y Skoog (1962), suplementado con 2
mg/L de kinetina, 1 mg/L de BAP, 0.5 mg/L de TDZ,
250 mg/L de L-glutamina, sacarosa 30 g/L, phytagel
0.22%, pH 5.7
Desarrollo y crecimiento de brotes Los brotes que se obtienen son transferidos a medio de
desarrollo (MD), libre de reguladores de crecimiento y
condiciones de luz (12h) para inducir la elongación.
Hasta el momento los porcentajes de desarrollo son
bajos (1%).
Composición del medio MD:
Sales Murashige y Skoog (1962), suplementado con 200
mg/L de caseína hidrolizada, sacarosa 30 g/L, phytagel
0.22%, pH 5.7
Enraizamiento Se cortan los esquejes (1cm) y se siembran en medio de
enraizamiento (MR1). Los explantes fueron sembrados
en el medio y colocados en condiciones de oscuridad por
7 días a temperatura 21 ±1ºC para la inducción de raíces.
Transcurridos siete días, los esquejes se transfieren a otro
medio de cultivo (MR2), a una temperatura 21 ± 1ºC y
un fotoperíodo de 12h. Al cabo de seis días se observa la
formación de un primordio radicular.
Composición medio (MR1)
Sales MS al 50% de su concentración, suplementado
IBA 2,5 µM, sacarosa al 1,5% (p/v), caseína hidrolizada
100 mg/L, gelrite 0,22% (p/v).
Composición medio MR2
sales MS al 50%, suplementado con 1.5% (p/v) de
sacarosa, gelrite 0.22% (p/v)
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Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Cabe mencionar que durante el desarrollo del procedimiento para la
multiplicación in vitro de cedro negro, se han obtenido otros resultados
satisfactorios, y que solo se mencionan de forma cualitativa, por que los
datos no se han analizado por métodos estadísticos; los resultados son los
siguientes: Inducción de los brotes adventicios en tres diferentes medios
de Cultivo MS (Murashige & Skoog, 1962), WPM (Lloyd y McCown, 1981),
DKW (Driver y Kuniyuki, 1984) (Anexo 1); inducción de brotes con tres
diferentes concentraciones (2.27, 1.4 y 0.5 µM de la hormona Thidiazuron
(TDZ), no hay diferencias al sembrar los fragmentos de cotiledón para
inducir los brotes, en el medio de cultivo por su cara interior (envés) o
exterior (haz), los embriones que se obtienen al abrir los frutos
inmaduros, tienen un 70% de germinación al sembrarse en medios de
cultivo (MS, WPM y DKW) libres de hormonas y en condiciones de
oscuridad durante 30 días.
También se evaluaron diferentes combinaciones de hormonas (Tabla 5),
para ayudar a la elongación de los brotes, pero sin ningún éxito. Los
ensayos que se realizaron fueron los siguientes:
Tabla 5. Evaluación de diferentes hormonas en brotes de J. neotropica.
COMPONENTE DB1 DB2 DB3 DB4 DB5
MS(Murashige & Skoog) 100 100 100 100 100
BAP(mg/L) 0.1 0.1 0.5 0.5 0.1 ANA (mg/L) 0.15 0.15 0.01 0.01 -- AIA (mg/L) - -- -- -- -- AIB (mg/L) -- -- -- -- -- GA3 (mg/L) -- -- -- -- 1.0 L-Glutamina (mg/L) -- 125 -- -- -- Caseina hidrolizada (mg/L) -- -- 200 200 -- Tiamina (mg/L) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Piridoxina (mg/L) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Ac. Nicotínico (mg/L) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Glicina (mg/L) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Mio inositol (mg/L) 100 100 100 100 100 Sacarosa (g/L) 30 30 30 30 30 Phytagel (g/L) 2.2 2.2 1.8 1.8 -- Gelrite (g/L) -- -- -- -- 2.4 pH 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7
*DB: Medio para desarrollo de brotes.
19
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
5. Seguimiento a las palmas de chontaduro en el suroeste
Antioqueño.
5.1 Antecedentes
Desde el año de 1999 se realizó un experimento para obtener palmas de
chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.) en convenio con la Universidad de
Antioquia, por cultivo in vitro mediante embriogénesis somática, el
material vegetal obtenido, de la multiplicación in vitro se adapto en los
viveros de Niquía, en convenio de CORANTIOQUIA-Secretaria de
Agricultura. Se escogieron las palmas mas adaptas a las condiciones
ambientales y se llevaron a la región del suroeste antioqueño (Hispania),
donde fueron sembradas 43 palmas.
A la fecha de las 43 palmas sembradas en el predio del Ingeniero Forestal
Benicio Uribe Escobar, solo crecieron 33 palmas de chontaduro,
aproximadamente de cinco años de edad, y una altura promedio de 7 m;
todas se encuentran en fase reproductiva (formación de flores y frutos).
Pero la perdida permanente de frutos inmaduros y las inflorescencias se
observo, inicialmente desconociendo el agente (s) causal (es).
Se recolectaron frutos del suelo para determinar la perdida, tanto de
frutos y palmas. Al realizar la disección de los frutos se encontró
perforaciones y ataques en forma de galerías, causadas por larvas de tipo
curculionidae, características del orden coleóptera, así como el ataque de
hongos saprofitos e insectos en fase adulta, que permitieron su posterior
identificación (tabla 6). Las recomendaciones como la captura de insectos,
control de insectos con biopreparados, plateo y fertilización recomendados
durante el periodo 10 de Noviembre de 2005 hasta 20 de Mayo de 2006,
se resumen en la tabla 7.
20
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Tabla 6. Insectos plaga en palma de chontaduro.
ESPECIE CARACTERISTICA DAÑO Picudo de la caña de azúcar (Metamasius hemipterus).
tomado de Peña et al, 2002
Como su nombre lo dice también ataca caña de azúcar, plátano y
banano por eso no es aconsejable tener cerca dichos cultivos. Su daño
consiste en la elaboración de galerías en la base de los racimos de las
flores, los cuales se debilitan y se secan. Su control se realiza con
trampas construidas con tarros que contengan rodajas de piña o partes
tiernas picadas de tallo de caña, banano y/o chontaduro como cebo,
para su posterior captura, utilizando 10 tarros/hectárea.
Barrenador del tallo
(Rhynchophorus palmarum)
tomado de Peña et al, 2002
Los daños son causados por las larvas que emergen de los huevos
ovipositados por la hembra en los tejidos frescos resultante del deshije.
Las larvas penetran en el tallo y como consecuencia el daño favorece el
desarrollo de pudriciones que pueden destruir La planta. Su control es
ante todo preventivo, es un insecto que es atraído por las heridas
frescas o que comienzan a fermentarse por lo cual se deben proteger los
cortes después del deshije con soluciones insecticidas o caldo bórdeles,
actualmente el insecto se captura mediante la localización de trampas
con feromona de agregación y trozos de material vegetal (rodajas de
piña, caña, banano o chontaduro) como cebo.
El Picudo negro
(Palmelampius heinrichi)
Actualmente es la plaga de mayor importancia económica que afecta los
cultivos de chontaduro. El insecto en estado adulto perfora el botón
floral femenino o el fruto para alimentarse u ovipositar. Los huevos
colocados por la hembra, eclosionan y la larva barrena (perfora) los
botones ó frutos provocando la caída. En inflorescencias recién abiertas
el insecto puede atacar acentuándose el daño. Cuando el ataque del
insecto ocurre en frutos desarrollados, estos pueden llegar a su
maduración, pero afectando su calidad tanto externa como interna. Su
control y manejo esta relacionado con el proceso de apertura de la
espata floral y polinización de las flores recomendando el método del
embolsado del racimo con bolsa plástica.
Cucharón marceño
(Cyclocephala sp.)
Antes que la espata abra (estructura que protege la inflorescencia), se
debe regar con extracto de ají-ajo (10 cc/L), para repeler a los adultos,
los cuales son atraídos por el olor que expelen las flores durante la
polinización,. Tumbando las flores y frutos pequeños.
21
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Tabla 7. Recomendaciones realizadas para palma de chontaduro.
LA URA
BOR DETALLE FIG
Em sar las
ncias y
Practica que se debe realizar preferiblemente entre 0 y 24 horas después de la apertura, para
protegerlo del pequeño insecto, el picudo negro us heinrichi: Curculionidae
bol
infloresce
racimos
Palmelampi
Deshoje Enterrar y aplicar cal agrícola a los tallos y hojas de las palmas que se cortan durante la limpia del
cultivo, muy importante para evitar que los insectos plagas se sigan multiplicando y afectando el
cultivo.
Plateo y
Fertilización
Realizar como mínimo cuatro fertilizaciones al año, de la siguiente manera: la primera aplicación,
agregar materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr), completar
la fertilización con 5 gr de elementos menores (AGRIMINS), revolver bien con tierra y agregar
alrededor de cada planta. La segunda aplicación, materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100
gr) y fosforita Huila (200 gr). En la tercera aplicación, materia orgánica 3 Kg/plant), cal
dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr). La cuarta aplicación, materia orgánica 3 Kg/planta,
cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr), 5 gr de elementos menores (AGRIMINS).
Trampeo eden
fabricar con tarros plásticos y residuos vegetales en proceso de fermentación (trozos de tallo de
Colocar trampas para la captura de M. hemipterus, R. palmarum, P. heinrichi ). Las trampas se pu
plátano, caña de azúcar, palma de chontaduro), posteriormente al capturar los insectos, se echan
en un recipiente con solución jabonosa para matarlos. Las mismas trampas se pueden utilizar
como cebos tóxicos, sumergir los trozos de material vegetal en melaza (150 cc + 850 cc de agua
+ 1cc de insecticida), y dejar remojando de un día para otro, luego colocar los trozos en el tarro.
Las trampas con cebos atrayentes se deben cambiar cada 8 o15 días.
Fumigar con
controladores
Aplicar a la base de los racimos ANISAFER (Metarhizium anisoplae) y BASSAR (Beauveria bassiana)
como controladores biológicos en dosis de 4 g/L, dejando en remojo 12 horas antes.
biológicos
Aplicación de
Materia orgánica
a materia orgánica se obtiene de desechos orgánicos como hojarasca, cáscaras, residuos de
cosechas, desechos de desyerbas, pulpa de café, estiércol de animales (bovinos, equinos, aves y
L
cerdos) no se deben aplicar frescos, es mejor prepararlos por medio de técnicas de compostaje.
Renovación s importante que siempre se deje crecer un tallo productor de racimos y un hijuelo para que lo
stituyan (el hijuelo no debe sobre pasar los 1.5 mt de altura, de lo contrario se deben cortar y de
E
su
dejar crecer otro de nuevo) cuando el principal esté muy alto o un ataque de plaga o enfermedad
lo dañe como se viene presentando.
22
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
6. Propa ación asexual de Caunce (Godoya antioquensis Planch).
Este ensayo se plantea como una alternativa para obtener material de
mayor altura en menor tiempo, debido a que hasta el momento las tasas
s
btenidas por semillas.
60 brotes básales (chupones), y proceder con
yuda de una navaja a efectuar un corte en forma de anillado, para
la
roducción de raíces adventicias. Encontrando un efecto positivo en los 35
antas independientes (fig.
).
g
de multiplicación in vitro no superan a las tasas de crecimiento de planta
o
En el sitio conocido como Cerro Asturias (parque ARVI), se realizó un
ensayo preliminar con la especie conocida como Caunce, el ensayo
consistió en seleccionar
a
realizar acodos aéreos y comparar el efecto de 5000ppm de ácido
indolbutírico (AIB) con 0 ppm (control), para inducir raíces adventicias.
De 60 acodos realizados 35 fueron con AIB y los 25 restantes sin
hormona. Después de tres meses de seguimiento, se procedió a
separarlos de las ramas y observar el efecto de la hormona AIB, en
p
acodos que se realizaron con AIB (5.000 ppm), al presentar abundante
formación de raíces, en comparación con los acodos a los que no se les
aplico la hormona, los cuales presentaban al momento de la evaluación
formación de callo en la base del corte (fig. 3).
Los acodos se sembraron en bolsas plásticas negras conteniendo tierra y
arena en proporción (2:1), para continuar con el proceso de prendimiento
de cada brote (chupón) y adaptación como pl
4
23
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
Figura 3. Respuesta de acodos al Ácido indol butírico (AIB). a. Form de tejido calloso en acodos sin AIB. presencia de AIB. c. Acodo
Figura 4
aciónb. Inducción de raíces adventicias en
s con AIB, listo para transplantar.
. Siembra de acodos en bolsas con tierra-arena (2:1).
a b c
24
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
CONCLUSIONES
-Aunque se logró el establecimiento y micropropagación clonal para G.
antioquensis Planch, las tasas de multiplicación no son lo suficientemente
in vitro de G. antioquensis Planch,
e la de obtener material de mayor altura que el propagado por semillas.
tras hormonas enraizadoras, como el
nch, en condiciones
e vivero y campo (parcelas demostrativas), es importante para observar si
ún, la ventaja de propagar
or la técnica de cultivo in vitro, se justifica por las altas tasas de
rápidas para obtener gran cantidad de material, indicando que se deben
evaluar nuevas combinaciones de hormonas, que aceleren las tasas de
división celular.
-La ventaja que mostró la propagación
fu
De otro lado la propagación por medio de acodos aéreos que se realizó en
árboles de la misma especie, se observa como otro método alternativo con
muy buenas perspectivas, al producirse material vegetal de muy buen
tamaño y características deseadas.
-Importante evaluar concentraciones mas bajas de ácido indol butírico
(AIB), e inclusive comparar con o
ácido indolacético (AIA) y ácido naftalenacético (ANA).
-Hacer seguimiento a los acodos de G. antioquensis Pla
d
hay crecimientos plagiotrópicos, como se ha observado en otras especies
forestales que son propagadas por este método.
-Para las especies yarumo blanco y yarumo com
p
multiplicación y de producción masiva, ya que se obtienen grandes
cantidades de plántulas listas para sembrar en condiciones de campo en un
periodo de 8 meses, situación que no se observa al producir el material por
semillas.
25
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
-Aunque hay reportes de la inducción de brotes in vitro en cedro (J.
neotropica Diels, utilizando yemas apicales, no se ha logrado producir
aterial a condiciones ex vitro (medio ambiente); de ahí la importancia de
y bajos
orcentajes de desarrollo de los brotes en plántulas (1%), faltando dilucidar
ios MS, DKW y WPM, ha mostrado
sultados muy positivos, si se observa como una labor de rescate de
o se ha
emostrado en otras especie como J. regia L., J. nigra L., J. cinerea L.
evo,
iciando desde el establecimiento de nuevos ápices, por las bajas tasas de
visto afectado por las condiciones climáticas de la
m
implementar un protocolo utilizando otro tipo de explante (cotiledones
inmaduros), permitiendo en un futuro cercano la obtención de plántulas de
cedro negro en épocas donde no hay producción de semilla sexual.
-Hasta el momento se obtienen grandes cantidades de brotes sobre la
superficie de los cotiledones de J. neotropica, pero se obtienen mu
p
los factores químicos y físicos que permitan obtener grandes cantidades de
plántulas, por medio de este protocolo.
-La siembra y germinación de los embriones inmaduros de J. neotropica, de
16-24 semanas de edad, sobre los med
re
embriones, y podría ser una práctica a utilizar, si en la especie se presenta
perdidas de frutos durante la etapa de formación y maduración.
-Los embriones se pueden evaluar bajo condiciones in vitro, para tratar de
obtener material vegetal vía embriogénesis somática com
d
-La producción de palmas de chontaduro, por el protocolo establecido por
Botero y Atehortúa (1999), no ha permitido obtener material nu
in
bioconversión de embriones a plántulas, el número de ensayos ha sido
grande pero sin éxito.
-El proceso de adaptación al medio ambiente, de las palmas que se sacan
del laboratorio, se ha
26
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
zona donde se realiza dicha labor, haciendo muy dispendioso y lento el
rmal; el inicio de la
roducción de flores y frutos tampoco se vio afectada. Las limitantes han
hasta donde la situación lo permita, la fertilización con abono
rgánico, suplementado con cal agrícola y elementos menores ha sido
inrich, para su posterior
estrucción. Pero no se obtenido éxito para el control de Metamasius
ausando pudrición del mismo, de
hí la importancia de mantener un hijuelo como mínimo por planta (para la
ha tenido una aceptación total por parte del propietario, ya
ue estos microorganismos actúan lentamente en el control de insectos
desarrollo y crecimiento de las palmas de B. gasipaes.
-El material que se encuentra establecido en campo de B. gasipaes, ha
presentado un crecimiento vegetativo y desarrollo no
p
sido la aparición de plagas relacionadas con el cultivo afectando la
producción.
-Las recomendaciones realizadas se han encaminado al no uso de
agroquímicos
o
suficiente para mantener una emisión constante de inflorescencias y frutos,
sin la manifestación de deficiencias minerales.
-El uso de trampas dentro del cultivo ha permitido la capturar una gran
cantidad de adultos de Palmelampius he
d
hemipterus y Rhynchophorus palmarum.
-El corte y tumba de algunas palmas se debió, a que fueron perforadas en
el tallo por Rhynchophorus palmarum, c
a
sustitución).
-El uso de controladores biológicos (Beauveria bassiana y Metarhizium
anisoplae), no
q
blanco (Metamasius hemipterus y Rhynchophorus palmarum, Palmelampius
heinrich).
27
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
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30
Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________
ANEXO 1. Composición química de los medios de cultivo MS, WPM y DKW.
COMPUESTO MS (mg/L) WPM (mg/L) DKW (mg/L)
Na2 EDTA 37,3 37,3 45.4
FeSO4.7H2O 27,8 27,8 33.8
NH4NO3 1650 400 1416
KNO3 1900 ----
Zn(NO3)2. 6H2O --- --- 17
H3BO3 6,2 6,2 4.8
KH2PO4 170 170 265
Ca(N 2O ---- 1968 O3).4H 556
CaCl2.2H2O 440 96 149
KI 0,83 ----
NaMoO 2O 0,25 4.2H ---- 0.39
CoCl2.6H2O 0 ,025 ---- ---
K2SO4 --- --- 1559
NiSO 2O --- 0.005 4. 6H ---
MgSO4.7H2O 370 370 740
MnSO4.4H2O 22,3 22,3 33.5
ZnSO 2O 8,6 4.7H 8,6 ---
CuSO4.5H2O 0 0,025 ,025 0.25
Mio inositol 100 100 100
Tiamina 0,1-1 0,1-1 2
Á cido nicotínico 0,5 0,5 1
Piridoxina 0,5 0,5 ---
Glicina 2,0 2,0 2
31