ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (I)

INTRODUCCIÓN

La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.

Este conocimiento ha permitido cruzar barreras naturales entre especies y colocar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética. Una de las consecuencias importantes derivadas, fue la producción de fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes.

Cronológicamente podemos citar una serie de hitos que contribuyeron decisivamente en su desarrollo: la historia de su conocimiento comienza en el año 1866 cuando Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregación y clasificación independiente de los genes. En 1869 el científico suizo Frederick Miescher descubrió en el núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleina. En los años 20, el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una tinción específica, descubrió que el DNA estaba situado en los cromosomas. A partir de este descubrimiento todo sucedió muy rápidamente. En 1944 Avery, McCleod y McCarty comprueban que el DNA es el portador de la información genética. En 1953 Watson y Crick revelan la estructura del DNA como una doble hélice complementaria que recuerda la estructura de una escalera de caracol. A partir de entonces y de manera exponencial, se suceden los descubrimientos (enzimas de restricción, polimerasas, etc...) que conducirán a lo que se conoce como tecnología del DNA recombinante.

¿Qué es el DNA?

Podemos considerar el DNA o ácido desoxiribonucleico, como el }cerebro~ celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y composición celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la estructura de las proteínas, que a través de enzimas determinará el resto de funciones celulares.

A finales del siglo pasado se descubrió también la existencia de una segunda clase de ácido nucleico, denominado ácido ribonucleico (RNA). El RNA se encuentra tanto en el núcleo (concretamente en el nucleolo) como en el citoplasma de las células de manera abundante.

Ambos tipos de ácido nucleico, DNA y RNA, se encuentran simultáneamente en organismos eucariotas (con células de núcleo diferenciado) y procariotas (bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus.

COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos polímeros de alto peso molecular constituidos por unidades elementales denominadas }nucleótidos~, los cuales están formados por tres componentes:

1. Molécula de azúcar

ð Ribosa, en el caso del RNA

ð Desoxirribosa, en el caso del DNA

2. Base orgánica nitrogenada

ð Adenina, guanina (bases púricas), citosina y timina (bases pirimidínicas) en el caso del DNA.

ð Adenina, guanina (bases púricas), citosina y uracilo (bases pirimidínicas) en el caso del RNA.

3. Grupos fosfato

Los nucleótidos se unen formando cadenas cuyo esqueleto está formado por la unión entre un azúcar de un nucleótido y el fosfato del siguiente, quedando las bases nitrogenadas en la parte central, unidas cada una al C1 del azúcar. Estas bases son las que rinden especificidad al ácido nucleico.

ESTRUCTURA DEL DNA

Estructura primaria

La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:

5'-ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3'

Esta secuencia representa un oligonucleótido con 20 bases, de las cuales 6 son adeninas (A), 3 son timinas (T), 8 son citosinas (C) y 3 guaninas (G).

El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5' à 3' ó 3' à 5'; el 5' representa el extremo terminal del fosfato y el 3' el extremo final del átomo de carbono de la desoxirribosa.

Estructura secundaria

Edwin Chargaff analizando las bases del DNA mediante métodos cromatográficos descubre, que éstas no se encuentran en la misma proporción y que el número de adeninas es igual al de timinas y el de citosinas, al de guaninas.

En 1953 James Watson y Francis Crick construyeron un modelo tridimensional del DNA con la configuración más favorable energéticamente combinando los datos obtenidos hasta entonces sobre él, los descubrimientos de Chargaff y la interpretación tridimensional de los espectros de difracción de Rayos X; esto último fue de gran importancia para la consecución de tal modelo, el cual consiste en una doble hélice antiparalela cuyo esqueleto fundamental está formado por las cadenas de azúcar-fosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las de una cadena con las de la otra complementaria y formando entre sí puentes de hidrógeno, factor que da estabilidad a la doble hélice. El enfrentamiento de bases es constante; la adenina siempre se enfrenta con la timina y entre sí se forman dos puentes de hidrógeno, y la guanina con la citosina, formándose entre ambas tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5' à 3' y la otra lo hace en sentido 3' à 5'. Por eso hablamos del DNA como una doble hélice antiparalela.

Disposición de la unión entre bases formando dos puentes de hidrógeno entre adenina –timina y tres puentes de hidrógeno entre citosina - guanina.

Estructura de doble hélice a derechas del DNA.

Estructuras terciaria y cuaternaria

Teniendo en cuenta que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior celular. Estas estructuras, terciaria y cuaternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado seudocromosoma.

ESTRUCTURA DEL RNA

El RNA generalmente está formado por una sola cadena de nucleótidos, aunque existen algunos virus que poseen RNA de doble cadena.

Los ácidos ribonucleicos no sólo pueden tener información propia, sino que constituyen la herramienta para la conversión de la información contenida en el DNA en proteínas específicas.

PROPIEDADES DEL DNA

Las hebras del DNA que forman la hélice tienen orientaciones opuestas: una va en la dirección 5´-3´y su complementaria en la 3´-5´. La ruptura de los puentes de hidrógeno por calor, álcali o diversos compuestos químicos, produce la separación física de las dos hebras del DNA en un proceso denominado desnaturalización. La desnaturalización por calor es total a los 90°C y por álcali a pHs superiores a 11,3. En ambas casos el proceso es reversible, y al desaparecer el agente desnaturalizante se produce la renaturalización de la molécula, esto es, la re-adquisición de la estructura helicoidal perdida. ´

El proceso de desnaturalización va seguido por un aumento de la absorción de luz ultravioleta (260 nm) denominado efecto hipercrómico.

Otro concepto interesante de definir es el de temperatura de fusión (Tm), que es la temperatura a la que la mitad de las moléculas de una solución de ácido nucleico, han pasado a estado desnaturalizado. Esta temperatura depende del número de pares G-C que existan en la molécula de ácido nucleico. Cuando mayor sea este mayor será la Tm.

FUNCIONES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

· DNA

Su función principal consiste en la conservación de la información de la célula u organismo que lo contiene y la transmisión de esta información al replicarse.

· RNA

En algunos virus su función es contener y transmitir información. Pero, como hemos citado anteriormente, su función más importante consiste en la conversión de la información contenida en el DNA en proteínas específicas. Para ello existen varios tipos de RNA: RNA mensajero (RNAm), RNA transferente (RNAt) y RNA ribosómico (RNAr).

DOTACIÓN GENÉTICA DE LOS VIRUS Los virus pueden tener DNA duplex, DNA monocatenario, RNA monocatenario o RNA duplex. En algunas ocasiones, el genoma vírico dispone de la información biológica necesaria para que la maquinaria de la célula a la que parasita trabaje para él, y en otras posee la información para realizar por sí mismo las diferentes funciones para su replicación.

DOTACIÓN GENÉTICA DE LAS BACTERIAS

Las bacterias, al igual que los organismos eucariotas poseen los dos tipos de ácidos nucleicos antes citados: DNA, componente de su único cromosoma, y los diferentes ácidos ribonucleicos (RNAr, RNAt, RNAm). Además, las bacterias también tienen cierta cantidad extra de DNA que suele encontrarse circularizado y repetido varias veces, denominado DNA extracromosómico o DNA plasmídico y, aunque puede no contener una información específica (plásmido críptico), normalmente codifica factores de resistencia a los antimicrobianos, como b-lactamasas, etc.

Bacteria DNA plasmídico DNA cromosómico

DNA plasmídico

Dotación genómica de una bacteria.

CROMATINA Y CROMOSOMAS

El DNA nunca está desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de proteínas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas.

Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se pueden visualizar al microscopio óptico. La unidad estructural por debajo del cromosoma es la fibra de cromatina que se puede visualizar al microscopio electrónico. Esta fibra está compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta. Cada nucleosoma es un disco formado por un octámero de proteínas básicas denominadas histonas, donde exteriormente se enrolla el DNA.

REPLICACION DEL DNA

Como dijimos anteriormente, el DNA está formado por dos hélices complementarias unidas por enlaces débiles de puentes de hidrógeno que pueden romperse y volverse a formar simplemente calentando y enfriando. A estos procesos se les llama respectivamente desnaturalización y renaturalización del DNA.

Partiendo de este concepto y de manera muy esquemática, la replicación del DNA en la naturaleza consiste en:

1. Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan enzimas y proteínas que se encuentran en la célula eucariótica.

2. Unión de los cebadores ('primers' o iniciadores) de RNA en una de las hebras separadas. (3'®5')

3. Unión de la polimerasa a los lugares donde se encuentra el 'primer' para comenzar a copiar de manera progresiva la hebra de DNA, ya que la polimerasa necesita un cebador que le indique dónde empezar, por ser incapaz de copiar DNA monocatenario.

El sentido de la síntesis es siempre 5' à 3'.

4. Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra hija, por lo que al proceso se le denomina replicación semiconservativa del DNA.

De esta forma, de un DNA parental, tras su replicación, se obtienen dos moléculas hijas exactamente iguales.

Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas en la síntesis. Es necesaria la existencia de un 'primer' para que la DNA polimerasa de E. coli inicie cadenas de novo. Este 'primer' es proporcionado por una RNA polimerasa llamada primasa, la cual en asociación con un complejo de proteínas llamado primosoma sintetiza una cadena corta de RNA. La DNA polimerasa III puede utilizar este 'primer' para continuar la síntesis de DNA. Una proteína llamada helicasa (originalmente llamada rep) es necesaria para desenlazar y abrir la hélice de DNA para permitir la replicación. Las proteínas de enlace a ssDNA se encargan de estabilizar las regiones de simple cadena que se forman transitoriamente durante el proceso de replicación. La DNA polimerasa puede sintetizar DNA en la dirección 5´ ® 3´, por lo que una de las hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formación de cortas cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la acción de la DNA polimerasa I y unidos por la acción de una DNA ligasa.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

¿Cómo hace una molécula de DNA para codificar una proteína?

transcripción traducción

DNA RNA PROTEINA

Transcripción: La información del DNA es transferida al RNAm, que es sintetizado utilizando como molde el DNA original y dirigido por la holoenzima RNA polimerasa. Este RNAm será transportado desde el núcleo a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma.

Traducción: La factoría celular responsable de la síntesis de proteínas es el ribosoma. La molécula especifica que va a trasladar los aminoácidos (componentes elementales de las proteínas) siguiendo las pautas dictadas por el RNAm es el RNAt. Cada RNAt tiene un anticodon especifico (formado por tres bases).

Una proteína cargada denominada aminoacil tRNA sintetasa es la encargada de unir el aminoácido correcto correspondiente al anticodon a una posición de anclaje. De esta manera a partir de una señal de iniciación en el RNAm (codon ATG) comienza la síntesis, y el primer aminoácido transportado por el RNAt y correspondiente a este codon es la metionina. Este primer paso se denomina iniciación de la traducción y tiene lugar en una posición concreta del ribosoma denominada aminoacil (A). Posteriormente este RNAt junto con su aminoácido correspondiente salta a una posición contigua denominada peptidil (P)y llega un nuevo RNAt con el correspondiente aminoácido para anclarse en su codon y se sitúa en la posición A que ha quedado libre. Entre ambos aminoácidos se establece una unión peptídica y el RNAt de la posición P es liberado, comenzando el proceso de nuevo. Este proceso de elongación continua hasta llegar a un codon de parada.

Una vez sintetizada la proteína pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por enzimas proteolíticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc...

LA BELLEZA DE LAS MUTACIONES

Sabemos que cada gen es una secuencia de ácido nucleico que transporta información representando un polipeptido particular. Un gen es una entidad estable, pero puede sufrir un cambio en su secuencia. A ese cambio se le llama mutación. Sin embargo las mutaciones son importantes ya que nuestro medio sufre cambios constantes y nosotros debemos cambiar con ellos o quedaremos obsoletos y moriremos.

Uno de los mecanismos de cambio es a nivel del DNA. Las mutaciones pueden dar lugar a nuevos genes y funciones que adapten nuestro organismo a los cambios del medio ambiente en el que vive.

Hay distintos tipos de mutaciones: Mutaciones cromosómicas: Translocaciones: Implican un intercambio de grandes fragmentos de DNA entre dos cromosomas diferentes.

Inversiones: Aparecen cuando una región del DNA cambia su orientación respecto al resto del cromosoma.

Delecciones: Perdida de algún fragmento del cromosoma

No disyunción de los cromosomas

Mutaciones puntuales: Consiste en un simple cambio de una base. Mutación sin sentido: Crea un codon de parada donde antes no existía.

Mutación de sentido perdido: Cambia el código del RNAm, implicando un cambio en el aminoácido codificado y por tanto en la proteína correspondiente.

Mutación silente: No tiene efecto en la proteína codificada.

ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (II)

Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería Genética y referidas indistintamente como clonaje, DNA recombinante o manipulación genética. Antes del desarrollo de la Ingeniería Genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto.

LAS ENZIMAS

Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos procesos de la Biologia Molecular. Entre ellas podemos destacar:

Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos del interior de la cadena. Las endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces

fosfodiester del esqueleto de DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las más útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura.

Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.

Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario.

Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3´ o 5´ monocatenario, de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.

Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA “in vitro”. La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa). La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.

Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5´ de los ácidos nucleicos, quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5´ que han dejado las fosfatasas) etc...

LA CLONACION

Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés.

LA ELECTROFORESIS

Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos.

El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande. Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares (Aaij y Borst). La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para

valorar la migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la molécula.

El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

· DNA: en pares de bases o bp.

· RNA : en nucleótidos o nt.

· Proteínas: en Daltons o Da.

LA HIBRIDACION

Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.

¿Qué es una sonda?

Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación.

Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos:

· Fragmentos de DNA

· Fragmentos de RNA

· Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.

¿Qué son las moléculas reporter?

Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina).

¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reacción de hibridación?

Concentración del ácido nucleico diana

Complementariedad sonda-ácido nucleico diana

Concentración de la sonda.

Longitud de la sonda

Actividad específica de la molécula reporter.

Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, ...)

Tm

Acceso al ácido nucleico diana.

Formato de hibridación

¿Cuales son los formatos de hibridación?

· Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La velocidad de

formación del duplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado, empleándose entre otros métodos la nucleasa S1-precipitación con tricloroacético o la hibridación protection assay.

· Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución.

Actualmente también se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación.

Existe un tipo de hibridaciones en fase sólida que son muy empleadas en Biología Molecular: los Southern blot (DNA cortado con enzimas de restricción e hibridado con una sonda de DNA) y Northern Blot (RNA separado e hibridado con sondas de DNA o RNA). Estas técnicas consisten en una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis , trasferencia capilar de estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección.

Hibridación in situ

Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. El empleo de proteasas, que facilitan el acceso de la sonda al ácido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no provocar el desmantelamiento de la morfología celular. Se recomienda el empleo de oligosondas.

Sondas de PNA (Peptide Nucleic Acid)

Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses (Buchardt, Berg, Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas híbridas entre ácido nucleico y proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Su estructura esta formada por una cadena de aminoácidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick. Las bases (A,T,C,G) están colocadas a la misma distancia que en el DNA

Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales:

· Son moléculas de simple cadena

· No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible.

· Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles.

· Presentan una especificidad y sensibilidad mas elevada que los oligomeros DNA/RNA

· Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede.

· Enlaces más fuertes

· Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.

SECUENCIACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

La introducción de métodos rápidos de secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los estudios sobre el DNA Existen dos métodos de secuenciación de los ácidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico.

En el método químico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada.

Especificidad

Base Reactivo

G Dimetil sulfoxido

G+A Acido fórmico

T Permanganato Potásico

C Hidroxilamina

Posteriormente se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes.

El método enzimático es el más utilizado en la actualidad. Se prepara un DNA circular lineal (clonando en el fago M13). Se introduce un cebador que va a servir para el inicio de la síntesis del DNA que vamos a marcar y a secuenciar. El cebador es específico a

una secuencia complementaria del fago M13. Una polimerasa (enzima de Klenow o secuenasa) se encarga de polimerizar. Se establecen cuatro alícuotas. La síntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso el cebador se alarga unos cientos de nucleótidos utilizando para ello los cuatro nucleótidos, pero uno de ellos está marcado. En el segundo paso se produce la terminación de las cadenas por la adición de una pequeña cantidad de un dideoxinucleótido distinto en cada alícuota. El dideoxido es un nucleótido trifosfato que por carecer de grupos OH tanto en el carbono 2´como el 3´de la ribosa lo que imposibilita el crecimiento de la cadena paraliza la síntesis. El resultado en cada tubo de ensayo es una colección de fragmentos, de tantos tamaños como unidades de la base existan en la secuencia. Los distintos fragmentos se analizan por electroforesis en geles de acrilamida.

Actualmente para el marcaje se utilizan cuatro fluorocromos distintos: fluoresceina, NBD(4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol), tetrametilrodamina y rojo texas, uno para cada base. . Una vez conjugados a cuatro alícuotas del cebador, se procede a la extensión del iniciador e interrupción con dideoxis.

Geles de secuenciación

TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Se reúnen con esta denominación una serie de técnicas que nos van a permitir un aumento considerable en la detección de secuencias específicas de los ácidos nucleicos

Amplificación de la diana

· PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

· 3SR (Self sustaining sequence replication)

· NASBA (Nucleic acid sequence based amplification)

· SDA (Strand displacement amplification)

Amplificación de la diana

· Qb replicasa

· LCR (Ligase chain reaction)

Amplificación de la señal

· Branched probe

· Gen point (hibridación in situ)

EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO

Muestra Þ Extracción de A.N. Þ Amplificación de zona interés Þ Secuenciación

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FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Dr. D. Antonio Martínez

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in vitro de secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biología Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla, consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada DNA polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación exponencial del número de

copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrán 230 moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas.

La gran ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros componentes.

La PCR se aplicó inicialmente como una técnica de laboratorio de investigación, pero su gran especificidad y sensibilidad ha permitido el desarrollo de técnicas específicas basadas en la PCR en muchos campos de la investigación y el análisis. Así, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigación (clonado de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de individuos, identificación sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades).

La PCR fue desarrollada por Kary Mullis (Saiki et al, 1985; Mullis, 1990) en 1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC (desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la PCR en una técnica tediosa y costosa. La PCR mejoró vertiginosamente como herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la técnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercialización de la enzima denominada Taq polimerasa (Saiki et al, 1988) que es un enzima termoestable, por lo que permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran revolución que ha producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha supuesto para su descubridor la concesión del Premio Nobel en el año 1993.

A lo largo de la clase se repasarán los aspectos críticos que afectan a la reacción, sus componentes, así como la optimización de un protocolo de PCR.

RAZONES PARA LA UTILIZACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.

Dr. D. Julio Velasco.

1. INTRODUCCIÓN

Los laboratorios de anatomía patológica se han enriquecido de una manera notoria con los avances en la inmunología y en la biología molecular, los cuales, han puesto un auténtico arsenal de técnicas novedosas para realizar diagnósticos que, hasta hace bien poco, eran exclusivamente morfológicos.

El uso de las técnicas de biología molecular es un hecho en muchos de nuestros laboratorios y tiene el mismo significado que tuvo la aplicación de la microscopía electrónica o la inmunohistoquimia en un pasado aún cercano. Al igual que ocurrió con con estas técnicas los inicios son confusos y la proporción de escépticos y de profesionales contrarios a su implantación como técnicas de rutina va disminuyendo con el paso del tiempo y con los crecientes logros de las mismas.

Es necesario que una disciplina de la importancia de la anatomía patológica no languidezca, que se impregne de los nuevos conocimientos y que los aplique adecuadamente, que con la mayor premura comencemos a escudriñar los formidables secretos que nos depara el ADN.

Las aplicaciones actuales de la biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:

Genética

· Diagnóstico prenatal

· Tipaje de HLA

· Reordenamientos genéticos

· Detección de esperma aneuploide

· Creación de mapas genéticos

Diagnóstico Microbiológico · Diagnóstico rápido de infecciones víricas

· Detección de microorganismos en células infectadas/transformadas

· Determinación de la relación génetica entre varios tipos de microorganismos similares

· Correlacionar la presencia/expresión de agentes virales/infecciosos en tejidos neoplásicos.

· Determinar la resistencia a los antibióticos de las bacterias.

· Epidemiología de las infecciones

· Detectar y cuantificar microorganismos difíciles de cultivar o para los que no existen reactivos serológicos.

· Detectar regiones transformantes específicas en virus

Diagnóstico y clasificación de neoplasias y establecimiento de un pronóstico · Detectar reordenamientos de genes

· Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalías consistentes cariotípicas

· Detectar reordenamientos moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo

· Estudio de la estructura/expresión de oncogenes

· Detección de amplificación genética/resistencia a drogas

· Diagnóstico de cell lineage en base a la expresión genética

Laboratorio clínico/endocrinología

· Detectar la producción de hormonas ectópicas

2. MATERIAL Y MÉTODOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA A LA ANATOMÍA PATOLÓGICA

sondas de nucleótidos

ADN o ARN diana

aparatos

nucleótidos, tampones y otros reactivos

2.1. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN UTILIZADAS EN ANATOMÍA PATOLÓGICA.

Hibridación in situ con filtro

Hibridación Southern blot

blot invertido

dot/spot blot

Hibridación sandwich

Hibridación in situ

Hibridación Northern

Hibridación en fase líquida

Sistema de captación de hibridos

FISH

HGC

MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN GENÉTICA PCR

PCR in situ

1.2. OTRAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADAS A LA ANATOMÍA PATOLÓGICA. Técnicas de secuenciación

Técnicas de clonación

1.3. LA EXPERIENCIA DEL SERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA DEL HOSPITAL SAN AGUSTÍN EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR.

En nuestro servicio comenzamos a utilizar técnicas de biología molecular desde finales de los 80. Inicialmente trabajamos con hibridación in situ en biopsias con sondas de ADN con marcaje enzimático, actualmente solamente realizamos hibridación in situ para detectar virus Epstein-Barr por medio de sondas PNA. En 1989 incorporamos a nuestro laboratorio, con material adquirido con una beca DGCYT, las técnicas de hibridación con sondas radioactivas con las que empezamos a realizar de forma sistemática el tipaje de los diferentes virus del papiloma humano. En 1991, con ayudas del Fondo de Investigación Sanitaria, pusimos los primeros ladrillos de lo que ya se puede considerar como un laboratorio de PCR. En este laboratorio se realizan anualmente mas de 200 pruebas de PCR, fundamentalmente detección y tipaje de virus del papiloma humano y, en menor medida, detección de la t(14;18) en procesos linfoproliferativos. Para la detección y tipaje de virus del papiloma humano tras algunas

pruebas con diferentes reactivos nos inclinamos por utilizar primers que amplifican un fragmento de unos 450 pb localizado dentro del ORF del virus. Esta región presenta un patrón de restricción característico para los diferentes genotipos, con lo cual podemos hacer un excente tipaje sin recurrir a técnicas de hibridación post-amplificación con el consiguiente ahorro de tiempo y, como no, de dinero. La realización de PCR para detectar virus del papiloma humano es, hoy día, una técnica que se utiliza de forma rutinaria para el manejo de las mujeres con diagnósticos citológicos de lesiones premalignas y malignas y como instrumento de control de calidad.

La técnica de PCR t(14;18) la utilizamos basicamente para diferenciar procesos benignos en los ganglios linfáticos de linfomas foliculares. En nuestro laboratorio realizamos una amplificación de los dos posibles puntos de traslocación la major breakpoint region y la minor cluster region, además de un fragmento del gen de la beta-actina. La detección del producto amplificado se realiza con la técnica ELISA.

Brevemente utilizamos algunas otras técnicas de biología molecular en nuestro Servicio. Realizamos una pequeña serie de dot blot con sondas biotiniladas complementarias de ADN EBV y tambien realizamos algunos experimentos con el sistema de captación de híbridos.

2.4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. FENOGLIO C, WILLMAN CL. Molecular biology and the pathologist. Arch Pathol Lab Med 111:601-619;1987

2. NUOVO GJ,RICHART RM. A comparison of slot blot, Southern blot and in situ hybridization analyses for HPV DNA in genital tract lesions.Obst Gynecol,74:673-678;1989

3. SCHNEIDER A,GRUBERT T. Diagnosis of HPV infections by recombinant DNA technology.Clin Obst Gynecol,32:127-139;1989

4. SCHOLTE GHA, VAN DOORN LJ, QUINT WGV, LINDEMAN J. Polymerase chain reaction for the detection of Helicobacter pylori in formaldehyde-sublimate fixed, paraffin-embedded gastric biopsies. Diagn Mol Pathol 6:238-243;1997

5. SYRJANEN S.:Basic concepts and practical applications of recombinant DNA techniques in detection of HPV infections.APMIS,98:95-110;1990

6. VELASCO J,PALACIO V,VAZQUEZ S,MOSQUERA C,SAMPEDRO A.:Diagnostic accuracy of the cytologic diagnosis of anal HPV infection compared with DNA hybridization studies.STD;20:1-5;1993

INSTRUMENTOS DE USO HABITUAL Y ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. Dra. Dña. Pilar Arca

Toda la charla girará en torno a qué condiciones debe cumplir un laboratorio de Biología Molecular de tipo clínico. Si bien la Biología Molecular abarca diferentes campos, durante la exposición se hará especial hincapié en aquel relacionado con los ácidos nucleicos: ADN y ARN.

Después de la exhibición de unas diapositivas mostrando la organización espacial del laboratorio de Biología Molecular de Ampligen Diagnósticos se pasará a exponer cuales fueron las razones para dicha distribución, y cuales son los instrumentos totalmente necesarios para que cada una de las áreas funcione de forma autónoma e independiente. Entre dichos instrumentos estarán aquellos dedicados a:

1. la correcta preparación de tampones, sales, soluciones de lisis o soluciones de purificación del ADN /ARN,

2. la obtención y cuantificación del ADN/ARN a partir de distintas muestra biológicas,

3. la amplificación en solución e “in situ” de ADN/ARN,

4. hibridación de ADN/ARN,

5. separación de las moléculas de ADN/ARN en geles de agarosa o de poliacrilamida y,

6. visualización de las moléculas de ADN/ARN una vez separadas en gel.

OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN.

Dra. Dña. Pilar Arca

A un laboratorio de Biología Molecular de tipo clínico llegan distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN. “A priori” se plantean dos situaciones diferentes. Si lo que se pretende es conocer la ubicación física del ADN/ARN de interés en un corte histológico se deberá proceder a estudios “in situ”, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será suficiente con obtener el ADN celular en solución. El ADN en solución es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.

Centrándose en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis: lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan, preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora presentes en la solución de ADN. El ADN una vez limpio de proteínas y/o pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o precipitación con alcohol.

El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. Pueden emplearse

desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida.

Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.

En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:

1. separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exon normal...), o bien,

2. detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

1. Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...).

2. Hibridación. Los fragmentos generados en el PCR se separan en gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...).

3. Secuenciación. Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades...).

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN FASE LÍQUIDA Y CON MEMBRANA. APLICACIÓN A LA ANATOMÍA PATOLÓGICA.

Dr. D. Julio Velasco

1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas de biología molecular que utilizan membranas o las que se utilizan, sondas y ADN diana en medio líquido están poco extendidas en los laboratorios de Anatomía Patológica. La razón fundamental es que, a pesar de sus muchas ventajas, no permiten visualizar la morfología del espécimen.

2. MÉTODOS DE MEMBRANA

Describiremos los más utilizados en Anatomía Patológica.

Hibridación in situ con filtro (HISF). Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN. El método HISF es de muy fácil ejecución, rápido y barato es ,sin embargo, poco específico y, a menudo, resulta difícil separar las señales positivas del fondo (1). Su uso se limita a trabajos con gran cantidad de especímenes.

Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la

purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.

El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espécimen.

El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradigrafía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especímenes mientras que el SB no admite mas de 15. Uno de los problemas mas importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecíficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los híbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecíficas pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa (2).

La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección.La HS es un método con una especificidad estimada en 1-5 X 105 moléculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, además, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (3).

La hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.

En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido

citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.

3. MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA

En la hibridación en fase líquida, la sonda y el HPV diana están en solución. La hibridación en fase líquida ha sido utilizada para estimar la relación genética entre los diferentes HPVs, hoy día es de escaso uso.

El sistema de captación de hibridos también se realiza en medio líquido.Primero se desnaturaliza el especimen, posteriormente se hibrida el HPV ADN con la correspondiente sonda. Los híbridos son capturados por la superficie del recipiente, cubierta con anticuerpos anti-híbridos que reaccionan con fosfatasa alcalina, haciéndose visibles tras la aplicación de un sustrato quimioluminiscente. Los sistemas captación de híbridos están todavía en fase experimental, las pruebas iniciales permiten suponer una elevada sensibilidad y fácil manejo de la técnica.

4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. SCHNEIDER A,GRUBERT T. Diagnosis of HPV infections by recombinant DNA technology.Clin Obst Gynecol 32:127-139;1989

2. VELASCO J, FERNANDEZ C, LOPEZ I, CUETO A, SAMPEDRO A. Disappearence of DNA HPV in sequential specimens of occult cervical infections in a "normal" population. Eur J Gynaec Oncol 23:372-377;1996.

3. PARKKINEN S. Nucleic acid sandwich hybridization in detection of HPV 16 DNA:Technique and its clinical application.J Virol Meth 19:69-77;1988

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR in situ: HIBRIDACIÓN in situ

Y PCR in situ. ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. Dr. D. Julio Velasco

1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas "in situ" tienen la gran ventaja de que son las únicas técnicas de biología molecular que permiten en un solo acto correlacionar positividad o negatividad con la morfología de la lesión. Este hecho es de incalculable valor para una especialidad esencialmente morfológica, como es la Anatomía Patológica.

2. 1. LA HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS). Se utiliza en cortes histológicos y en extendidos citológicos. La sonda se aplica directamente sobre el espécimen (no requiere extracción del ADN), previamente tratado con una proteasa para permitir su acceso al ADN nuclear.La desnaturalización del ADN diana y de sonda marcada se realiza simultaneamente utilizando elevadas temperaturas (alrededor de 100 º). La HIS es una técnica mucho menos sensible que los métodos de membrana,necesitando 100 veces mas copias virales que el dot blot o que el southern blot (1), aunque puede ser tan efectiva como aquellas cuando el tipo infectante es 6/11 o 16 y cuando la lesión muestra los cambios histológicos típicos de lesión HPV (2). Cuando el condiloma se acompaña de displasia, la HIS disminuye la rentabilidad según el grado de la misma, lo cual refleja la disminución del número de copias virales con la progresión de la lesión. Otro problema es que precisa de tejido, puesto que aunque se puede practicar en frotis citológicos sus resultados no son tan buenos como con material procedente de una biopsia. La HIS tiene la gran ventaja de que permite la visualización al microscopio del lugar donde tuvo lugar la hibridación, motivo por el cual es la técnica de hibridación con ácidos nucleícos preferida por los anatomopatólogos.

2. 2. PCR IN SITU. La técnica PCR, como es sabido, utiliza una enzima, la polimerasa, para copiar a una determinada molécula de un ácido nucleico, habitualmente un ADN. La repetición de este proceso origina la producción de un gran número de moléculas hijas puesto que las nuevas moléculas son utilizadas por la polimerasa como moldes. El proceso se inicia con la separación de las dos cadenas que configuran la molécula de ADN o por el calentamiento de solución en la que encuentra el ADN a unos 90º. Tras un descenso térmico de la solución se produce el "anillamiento" o hibridación de dos secuencias diferentes de nucleótidos, denominados "primers" o "cebadores" que delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van añadiendo los nucleótidos presentes en la solución, fase denominada de "extensión" de

los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un número determinado de veces en un aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos térmicos programables. El hecho de que las moleculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos ADNs produce un efecto multiplicador, produciéndose aproximadamente 106 copias de ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reacción de hibridación o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una fuente de luz ultravioleta para su identificación. El avance que hizo posible la técnica de la PCR fué el descubrimiento de polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas. La primera de ellas fué la que que contienen las bacterias denominadas Thermus aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan en manatiales donde las aguas termales están a menudo a temperaturas superiores a 90º. Antes del descubrimiento de esta polimerasa se realizaban técnicas de amplificación de ADN con el fragmento de Klenow como polimerasa ADN,pero esta enzima es inestable a temperaturas superiores a los 37º,con lo que era necesario añadir una dosis de enzima en cada ciclo de amplificación lo cual resultaba extraordinariamente tedioso a la par que se acumulaban grandes cantidades de enzima degradada. El descubrimiento de la Taq polimerasa evitó la necesidad de añadir enzima en cada ciclo de amplificación, facilitando así la automatización del proceso.

La extraordinaria sensibilidad de la técnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un millón de células es un arma de gran valor en la detección de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección oculta. El problema mas importante de las técnicas de amplificación genómica es la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos. La adopción de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separación de especímenes y reactivos o de "primers" anticontaminación permiten la obtención de resultados fiables. Otra desventaja de la reacción de PCR es la no amplificación de genomas cuando no existen "primers" específicos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.

La técnica PCR in situ adapta la tecnología habitual de la PCR a un corte histológico. Se puede utilizar un termociclador convencional con alguno "trucos" (3), o bien recurrir a un termociclador específico para PRC in situ

3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. SMOTKIN D. Virology of Human Papillonavirus. Clin Obstet Gynecol 32:117-126,1989.

2. NUOVO GJ,RICHART RM. A comparison of slot blot, Southern blot and in situ hybridization analyses for HPV DNA in genital tract lesions.Obst Gynecol 74:673-678;1989

3. NUOVO GJ, GALLERY F, MacCONNELL P, BRAUN A. In situ detection of PCR-amplified HIV-1 nucleic acids and tumor necrosis factor RNA in the central nervous system. Am J Pathol 144:1-8;1994

BASES TEÓRICAS DE LA TÉCNICA LCR Dr. D. Juan José Palacios INTRODUCCIÓN

El principio básico de cualquier tecnología diagnóstica molecular es la detección de una secuencia específica de ácidos nucleicos mediante hibridación con una secuencia complementaria, la sonda, seguida de la detección del híbrido. Sin embargo, la sensibilidad de los tests que utilizan sondas de ácidos nucleicos sin recurrir a la amplificación es inferior a la de los tests clásicos. Su aplicación principal es la identificación de microorganismos más que su detección.

La replicación del ADN fue posible en 1958 cuando Kornberg descubrió la ADN polimerasa; durante muchos años la principal aplicación fue la secuenciación de ADN (Sanger et al.). En 1986 Mullis et al. describieron un proceso reiterativo que permitía incrementar exponencialmente el número de ácidos nucleicos (amplificación). Las técnicas de amplificación pueden clasificarse de diferentes formas: conceptualmente, aquellas en las que se amplifica la diana (polymerase chain reaction -PCR-; strand-displacement amplification-SDA-; nucleic acid sequence-based amplification-NASBA-; transcription-mediated amplification-TMA-); las que se amplifica la sonda (Qß replicase amplification-QßRA-); y mixtas (gapped-LCR). Ligasas y mecanismos de ligación

La enzima ADN ligasa es esencial para la replicación del ADN, para la recombinación y para la reparación de material genético in vivo. A partir de virus y de organismos tanto procariotas como eucariotas, se han aislado y caracterizado diferentes ADN ligasas; más recientemente, han sido clonadas y purificadas ADN ligasas a partir de microorganismos termofílicos. Las ligasas caracterizadas hasta la fecha constan de una simple cadena polipeptídica y exhiben diferentes actividades. La actividad de ligación incluye: 1) la unión de ácidos nucleicos de doble cadena con terminales cohesivos, 2) la unión de complejos blunt-end, y 3) la unión de fragmentos de ácidos nucleicos por medio de mecanismo de sellado de brechas (nick-sealing) .

La tecnología diagnóstica de la ligasa explota casi exclusivamente la actividad selladora de brechas. Las ADN ligasas mejor estudiadas son las aisladas de Escherichia coli y las codificadas por el genoma del bacteriofago T4. E. coli ADN ligasa es específica para la unión de segmentos de ADN que estan hibridados a una secuencia de un ADN molde; por contra, T4 ADN ligasa cataliza la unión de segmentos de ARN o ADN con cualquier molde sea ARN o ADN.

El sustrato típico para la actividad de sellado de brechas comprende al menos dos segmentos de ADN que estan hibridados y en posiciones inmediatamente adyacentes en la misma hebra del ácido nucleico molde (Figura-1). La secuencia 5’ debe terminar con un grupo hidroxilo (OH) en 3’; mientras que la secuencia 3’ debe poseer un grupo fosfato (P) en 5’. La unión enzimática de los dos segmentos de ácidos nucleicos se lleva a cabo por medio de una reacción que consta de tres pasos. El complejo ligasa-AMP esta formado por una conexión fosfoamida entre una lisina residual en la molécula de la enzima y el AMP derivado del cofactor apropiado (cualquiera NAD o ATP).

Posteriormente, una conexión fosfodiester se forma entre el AMP del complejo y el fosfato 5’ de la sonda B. El ataque nucleofílico del fosfato 5’ por el grupo hidroxilo 3’ de la sonda A resulta en un sellado de la melladura, con liberación de AMP.

Métodos de detección

La especificidad de las técnicas moleculares es dependiente de la astringencia (“rigidez”) de las condiciones de hibridación, la cual está determinada por una combinación de diferentes factores incluyendo la temperatura y la concentración de sales. La presencia de una secuencia diana dentro de una muestra clínica se demuestra por la formación de un híbrido de ácidos nucleicos entre la diana y la sonda. La sonda puede marcarse directa o indirectamente, con una molécula detectable. El marcaje directo puede realizarse con radioisotopos (ej. P32 o S35) o con moléculas fluorescentes (ej. fluoresceína o rodamina). Las sondas pueden marcarse en posición 5’ o 3’ por medio de reacciones enzimáticas; también es posible el marcaje en posiciones internas mediante la incorporación, vía polimerización, de nucleótidos modificados. El marcaje indirecto depende del uso de una pareja de ligandos por afinidad como son la biotina y la estreptavidina, así, las sondas pueden ser marcadas con biotina en alguna de las diferentes posiciones posibles, y tras la hibridación con la secuencia diana el complejo puede reaccionar con un conjugado estreptavidina-enzima, para, posteriormente, llevar a cabo la detección del complejo resultante mediante la incubación con un sustrato adecuado para la enzima.

Un defecto de estos métodos es la posibilidad de hibridación cruzada de las sondas con secuencias diferentes a la diana elegida. Este problema es especialmente relevante en técnicas de hibridación en solución. Aunque la hibridación en solución ofrece la ventaja de una rápida cinética, se hace necesario separar, antes de la fase de detección, los hibridos sonda-diana de la sonda no unida, lo que dificulta la automatización de estas técnicas. Para reducir este problema se recurre a métodos como el Southern (DNA) y Northern (RNA) blotting, en los que se produce una separación de las moléculas de ácidos nucleicos por electroforesis, para, subsecuentemente, ser transferidas a un soporte sólido. Los ácidos nucleicos inmovilizados se incuban bajo condiciones cuidadosamente controladas en una solución que contiene la sonda para asegurar el más alto nivel de especificidad.

Se han descrito diferentes sistemas de hibridación con dos sondas, el formato más típico es aquel en el que las dos sondas hibridan con secuencias diferentes de la misma diana, una sonda se marca con un grupo de captura y la otra con un grupo detectable. Al reaccionar las dos sondas con la muestra que contiene la secuencia diana se produce la formación de un complejo sonda de captura-diana-sonda de detección; posteriomente,

antes de la fase de detección, este complejo se separa de las sondas no unidas gracias al grupo de captura. La especificidad de este sistema deriva del hecho de que tienen que producirse dos eventos de hibridación diferentes para que se genere el complejo sonda de captura-diana-sonda de detección. Sin embargo, es necesario un cuidadoso control de las condiciones de hibridación para mantener un nivel de especificidad elevado.

A finales de los años 80 se describió un método de ligación de oligonucleótidos para sellar brechas de ADN denominado OLA (oligonucleotide ligation assay), precisa de un mínimo de dos sondas específicas para la misma diana que hibridan en posiciones inmediatamente adyacentes. La sonda A contiene un grupo hidroxilo 3’ libre, la sonda B contiene un grupo 5’ fosfato libre; las sondas hibridadas presentan un sustrato adecuado para que la actividad de la ADN ligasa permita la unión mediante sellado de la brecha. La estabilidad del producto de ligación-diana es mayor que la del producto sonda individual-diana. Las sondas pueden ser modificadas de tal modo que una contenga una mitad con un marcaje de captura y la otra con un marcaje de detección. Con esta configuración únicamente son capturados y detectados los productos ligados. La presencia de errores en la zona de ligación o bien en zonas próximas a ella repercuten negativamente en la actividad de la ligasa; sin embargo, aunque la capacidad de la ligasa para discriminar errores es elevada no es absoluta. La discriminación de errores se ve afectada por la concentración de sales, por la concentración de enzima, y por la temperatura; también por errores específicos de bases. La inclusión de 200 mM NaCl o 2-5 mM espermidina reduce tanto la adenilación como los errores de ligación.

La técnica de ligación de oligonucleótidos es un método particularmente útil para la detección de anormalidades genéticas específicas como son: las mutaciones puntuales, las delecciones y los cambios estructurales. La eficiencia de este sistema ha sido demostrada en diferentes enfermedades (anemia de células falciformes, fibrosis quística). La sensibilidad de la prueba puede ser mejorada asociando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de ácidos nucleicos mediante PCR.

Una variante consiste en la elección de sondas de tal modo que cuando la diana está presente las sondas hibridarán pero en posiciones no inmediatamente adyacentes sino separadas por un hueco o “gap” (Figura-2). El tamaño del hueco puede variar, pero habitualmente afecta a uno o a varios pares de bases. La sonda A se extiende a través de la región del gap por medio de la ADN polimerasa en presencia de los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) para conseguir que las sondas queden adyacentes. A la sonda B se le proporciona un grupo 5’ fosfato. Las sondas, nuevamente adyacentes, son entonces unidas por la ADN ligasa. Las secuencias de las sondas son diseñadas de tal modo que la mutación sea identificada en la secuencia diana siempre que esté situada dentro del gap (entre las sondas hibridadas), o bien en el extremo 3’ de

la sonda A o en el 5’ de la sonda B. Solamente se suministran los dNTPs necesarios para rellenar el gap, ya que la sobreextensión o la infraextensión afectarían la eficacia del paso de ligación. Esta metodología, aunque es extremadamente específica, precisa ir asociada a una PCR para alcanzar un grado de sensibilidad adecuado que permita su aplicación de cara al diagnóstico de las enfermedades infecciosas.

Ligase chain reaction (LCR)

La LCR consta de una serie de ciclos repetidos, de hibridación de oligonucleótidos y de ligación, para generar múltiples copias de la secuencia de ácidos nucleicos elegida como diana. Requiere un mínimo de dos parejas de sondas oligonucleótidas complementarias (sondas A, A’ y sondas B, B’) (figura-3). Dos sondas (A-B y A’-B’) hibridarán en posiciones adyacentes en cada hebra del ADN diana. El complejo diana-sondas será el sustrato para la unión por medio de la ADN ligasa gracias a su actividad selladora de brechas. Una vez producida la ligación, el producto resultante puede ser separado mediante desnaturalización por calor; así, tanto la hebra de ADN monocatenario como el producto ligado servirán de moldes adicionales. En teoría en cada ciclo se duplicará el numero de copias.

Las versiones iniciales de esta reacción empleaban ligasas mesofílicas (E. coli ADN ligasa, T4 ADN ligasa) con lo que era necesario agregar nuevo enzima con cada ciclo debido a la inactivación que experimentaba la misma por efecto del calor en la fase de desnaturalización. La disponibilidad ADN ligasa clonada termoestable (Thermus thermophilus) ha simplificado el procedimiento.

La LCR difiere de los métodos de amplificación basados en la polimerasa (PCR, NASBA, SDA, TMA) en que no se produce síntesis de ADN o ARN “nuevo”. Con los métodos basados en la polimerasa se produce síntesis in vitro de nuevas moléculas que

servirán de moldes para reacciones adicionales; por contra, con la LCR simplemente hay una reorganización de las sondas para generar dianas que soporten el proceso de amplificación. La diana no es duplicada, simplemente sirve de molde para la reorganización de sondas preexistentes; las sondas una vez organizadas y ligadas servirán de sustrato para nuevas reacciones.

La eficiencia de la hibridación y ligación de las sondas en la LCR se consigue con una elevada la concentración de sondas y de ligasa en relación a la concentración de la diana; como resultado, cuando la concentración de la diana es baja la inmensa mayoría de sondas está presente en forma de duplicados de sonda, especialmente en los primeros ciclos. Debido al hecho de que ciertas ligasas son capaces de catalizar una reacción de ligación blunt-end, podría ocurrir que segmentos de ADN de doble cadena se unieran en ausencia de diana, (ligación diana-independiente), y sirvieran de molde para ciclos adicionales generando así un producto indistinguible del generado por una ligación diana-dependiente. Afortunadamente, la eficiencia de este tipo de unión blunt-end es varias veces inferior a de la reacción de sellado de brecha. Para reducir la unión inespecífica blunt-end, se ha recurrido a incluir en la reacción 200 mM de NaCl ó 2-5 mM espermidina; añadir grandes cantidades de ADN no específico; y a evitar la utilización de reactivos como el polietilenglicol o Ficoll que incrementan la eficiencia de la ligación blunt-end. La sensibilidad de la amplificación LCR aunque es adecuada para muchas aplicaciones, particularmente en las enfermedades genéticas en las cuales es crítica la especificidad y no tanto la sensibilidad, resulta insuficiente para su aplicación al campo diagnóstico de las enfermedades infecciosas donde la sensibilidad es esencial. La sensibilidad también puede mejorarse realizando una preamplificación en la cual la secuencia diana es amplificada varios ciclos con dos de las cuatro sondas, para, posteriormente, añadir la segunda pareja de sondas.

La LCR se ha utilizado para la detección de varios agentes infecciosos (papillomavirus, HIV-1, Mycobacterium tuberculosis) y enfermedades genéticas, mantiendo el elevado grado de especificidad comentado anteriormente para otras reacciones mediadas por la ligasa. Sin embargo, todavía existen numerosas aplicaciones que requerirían mejorar la sensibilidad de esta metodología. Variantes de la LCR

Con ellas se trata de evitar la unión inespecífica (blunt-end) de las sondas mediante bloqueo o eliminación de los grupos hidroxilo 3’ o fosfato 5’. Una variante denominada

gapped-LCR está diseñada de tal modo que las sondas hibridan con el ADN diana pero no inmediatamente adyacentes (Figura-4), sino separadas por un hueco o gap; así, las sondas no hidridadas no podrán ser ligadas. Para conseguir que las sondas se vuelvan adyacentes (y con ello que puedan ser ligadas) se emplea una ADN polimerasa y dNTPs apropiados para extender la sonda a través del gap (es crítico evitar la sobre o infraextensión que impedirían la ligación). La extensión de la polimerización se controla con los dNTPs adecuados, la eliminación de uno o más dNTPS asegura que la extensión terminará en el sitio apropiado.

Figura 4. gapped-LCR Conclusión

La especificidad de la unión de segmentos de ADN catalizada por la enzima ADN ligasa puede ser explotada en sistemas diseñados para identificar la presencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos dentro de una muestra biológica. Los métodos de amplificación basados en la ligasa permiten incrementar la sensibilidad sin producir una merma en la especificidad. Se han descrito modificaciones de estas técnicas que permiten reducir la ligación inespecífica. La automatización de los ensayos permitirá en el futuro el uso rutinario de este tipo de tecnología en el laboratorio clínico.

APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICO DE VIRUS ONCOGÉNICOS (I): VIRUS EPSTEIN-BARR. ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.

Dr. D. Julio Velasco

El virus Epstein-Barr (EBV) fué descrito en el año 1964 por Epstein y cultivado en células de un linfoma de un niño de Uganda por Achong y Barr (1). En 1968 Henle et al (2) identificaron al EBV como el agente etiológico de la mononucleosis infecciosa y posteriormente este virus fué detectado constantemente en células neoplásicas de linfoma de Burkitt endémico y de carcinoma indiferenciado nasofaríngeo (3).

El EBV infecta a gran parte de la población mundial de forma asintomática. En muy pocas personas la infección primaria por EBV se manifiesta con el síndrome de la mononucleosis aguda. Durante la primera fase de este síndrome mas del 10% de los linfocitos de sangre periférica están infectados por el virus, al final de enfermedad su número se reduce a unos pocos por millón que persiste indefinidamente. El resultado es una inmunidad a largo plazo.

El EBV es un activador celular B-linfotrófico que transforma in vitro los linfocitos B en lineas celulares linfocitoides que se propagan indefinidamente. El virus penetra en los linfocitos a través del receptor del complemento C3d (también denominado CD2 o CD21).

Durante muchos años las neoplasias malignas relacionadas con el EBV han sido el linfoma de Burkitt y el carcinoma indiferenciado nasofaríngeo, recientemente, y con la utilización de sistemas de detección de elevada sensibilidad se ha comunicado la presencia de ADN viral en procesos linfoproliferativos en inmunodeficiencias de varios tipos, así como en una amplia gama de neoplasias.

Genoma y expresión genética del EBV.

El EBV es un virus herpes de la subfamilia gamma. Es un virus icosaédrico encapsulado que contiene una doble cadena lineal de ADN de 172.000 pares de bases. Una vez infectada la célula, el ADN vírico es transportado al núcleo en donde se dispone fundamentalmente como una molécula circular extracromosómica o episoma. El episoma EBV consta de las secuencias únicas corta y larga (US y UL) separadas por una "large internal repeat sequence" (IR1) y flanqueado por "terminal repeats" (TR) en cada fin del genoma. La secuencia UL se subdivide en elementos repetitivos (IR2, IR3 e IR4).

El genoma EBV contiene mas de 100 ORFs (marcos de lectura abiertos) codificadores potenciales de otros tantos polipéptidos, aunque solo han sido caracterizados una pequeñísima parte de los mismos. Células de lineas linfoblastoides inmortalizadas por EBV expresan seis antígenos nucleares: EBNA-1, 2, 3A, 3B, 3C y LP y tres proteínas de membrana: LMP-1, LMP-2A y LMP-2B.

El antígeno nuclear EBNA-1 es una proteína de unos 76 kDa. Su tamaño varía entre los diferentes EBV aislados y es, por lo tanto, un buen marcador para identificar las diferentes cepas. Muestra una actividad de unión a ADN y se fija con gran afinidad al lugar de replicación viral episomal (OriP). Esta unión conduce a la replicación inicial del genoma EBV y tiene importancia en el mantenimiento del estado episomal.

El antígeno nuclear EBNA-2 es un transactivador específico de genes virales y celulares. En linfoma de Burkitt EBV (-) la transfección con EBNA-2. En células B inmortalizadas EBNA-2 modula la expresión de antígenos celulares de activación (p.e. CD23, CD21) y de antígenos de función linfocitaria (CD11a, CD18, CD58). Basándose basicamente en las diferencias del ORF EBNA-2 se distinguen dos tipos de EBV: EBV-1 (EBNA-2 de 491 aminoácidos) y EBV-2 (EBNA-2 de 443 aminoácidos) que muestran diferentes capacidades transformantes, así el EBV-1 es mas eficaz inmortalizando linfocitos (4).

Las funciones de los ORFs EBNA-3 son poco conocidas, son marcadamente hidrófilos y sus ARNs se transcriben a bajo número de copias. Datos recientes indican que EBNA-3C es esencial para la transformación de linfocitos B. Este ORF es activado por EBNA-2 y modula la transcripción através de la interacción con la proteina J kappa (5).

La única proteina EBV con actividad transformante suficiente probada es la LMP-1. In vitro es esencial para la transformación de linfocitos B en lineas celulares linfocitoides con el concurso de EBV. Induce muchos de los signos de de activación de las células B infectadas como es la expresión de CD23, CD11a, CD18, CD58 y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1). LMP-1 también muestra efectos transformantes en lineas celulares de fibroblastos de mamíferos produciéndo incremento del crecimiento sin sustrato e inhibiendo los efectos del contacto célula-célula. En ratón transgénico la expresión de LMP-1 en piel produce hipertrofia de la epidermis y en células epiteliales humanas incrementa la expresión de receptores de crecimiento epidérmico (6) y que la cola citoplasmática de esta proteina interacciona con el factor asociado a la necrosis tumoral (TRAF-3) comunicando una señal de crecimiento (7). La proteina LMP-1 se localiza en la membrana celular asociada a la vimentina.

La función de LMP-2 es, hasta la fecha, desconocida.

Dos pequeños ARN se detectan en elevado número de copias (mas de 106) en los nucleos de las células con infección latente. Son el EBER1 (165 bases) y el EBER2 (169 bases) (acróstico de: EBV-encoded non-polyadenylated RNAs). Como otros transcriptos de polimerasa III los EBERs no codifican proteinas y son habitualmente encontrados en complejos con la proteina celular La. Se desconoce con exactitud la función de estas moléculas.

Basándose en la expresión variable de los productos génicos latentes se ha propuesto una clasificación de estados de latencia. En latencia I la expresión antigénica está

restringida a EBNA-1. En esta situación los promotores Wp, Cp y LMP están silentes. En latencia II la expresión antigénica ocurre en EBNA-1 y EBNA-2 y está dirigida, al igual que en latencia I, desde un promotor en el fragmento BamHI-F del genoma, si

bien en este estado tambien se detecta transcripción desde los promotores LMP. En latencia III se expresan todos los EBNA y LMPs. Los transcriptos se dirigen desde el promotor Cp, si bien en una fase muy temprana de la infección o cuando existe delección o mutación de Cp el promotor Wp se puede activar.

La entrada del EBV en estado lítico con producción de viriones infecciosos se asocia a la expresión de una gran cantidad de proteinas víricas que incluyen enzimas involucradas en el metabolismo de ácidos nucleicos y en la formación de proteinas de la cápside. La proteina llave, la primera que se expresa, es ZEBRA, es el producto del fragmento BamHI-Z leftward reading frame (BZLF)1. ZEBRA es una proteina unida al ADN que transactiva otros genes líticos. Su ausencia se puede considerar como evidencia de infección latente, aunque su presencia no implica necesariamente la existencia de infección lítica. Otras proteinas líticas dignas de mención son la BCFR1, practicamente idéntica a la interleuquina 10 y la BHFR1 similar a bcl-2, un inhibidor de la apoptosis. Se postula si esta proteina puede tener una acción similar en células infectadas por EBV en fase lítica.

Detección de EBV en tejidos.

Southern blot (SB). Las sondas habitualmente utilizadas son las homólogas a IR1, ya que esta secuencia se repite 10 veces, lo que se traduce en el aumento de la sensibilidad de la detección. SB ofrece algunas ventajas en la detección tisular de EBV:

· Es el único sistema que permite certificar la monoclonalidad de una infección EBV. La presencia de una única banda terminal fusionada sugiere que la las células infectadas representan una expansión clonal de una única célula con infección viral latente. En contraste con la presencia de múltiples bandas que reflejan de episomos con números variables de TRs, característico de la existencia de infecciones múltiples y, por tanto, de infecciones poli u oligoclonales (8).

· El análisis con SB de los IRs permite reconocer la infección lítica. La digestión de ADN EBV linear con BamHI libera un fragmento terminal (derecho) de 4 kb fusionado con un número variable de IRs y fragmento terminal (izdo) de 3,5 kb fusionado con un número variable de IRs (9).

· En algunos casos se puede determinar con SB si el ADN EBV está o no en el genoma celular.

Hibridación in situ (HIS). Se utiliza con sondas homólogas IR1 en tejidos congelados, fijados, en lineas celulares y en extensiones de cromosomas en metafase (10). La mayor

desventaja de HIS con sondas ADN es su baja sensibilidad y, por tanto, su incapacidad para detectar infecciones latentes. La situación es muy distinta cuando se emplean sondas ARN complementarios de EBER1 y de EBER2, los cuales están presentes en elevadísimo número de copias en la infección latente. Las sondas PNA mejoran la sensibilidad (11).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Su gran sensibilidad ha ocasionado un cambio profundo en la detección de ADN EBV.

Técnicas inmunohistoquímicas. Con anticuerpos frente a: LMP-1, EBNA-2 y ZEBRA.

EBV en linfomas. EBV se detecta en un elevado porcentaje de linfomas de Burkitt endémicos y entre el 15% y el 30% de los no endémicos (12), por tanto su presencia no es constante, no así la presencia de translocaciones cromosómicas que afectan al oncogen c-myc.

Los linfomas Burkitt EBV (+), endémicos o no, muestran un patrón de latencia I, con expresión restringida a EBER1 y EBER2, aunque de forma esporádica se ha documentado expresión de LMP-1 (13).

En 1987 Weiss et al (10) identificaron ADN EBV en cuatro linfomas de Hodgkin con SB, uno de los genomas estaba presente en forma episomal monoclonal y en los otros tres casos el ADN era policlonal. En las series publicadas con posterioridad la frecuencia de ADN EBV oscila entre, aproximadamente, un 40% con técnicas de membrana, a cerca de un 80% cuando se utiliza PCR (14). En un estudio reciente de 102 casos con hibridación EBER (15) se observó señal fundamentalmente en células de Hodgkin o de Reed-Sternberg en el 45% de los casos, en linfocitos acompañantes en el 22% y ausencia de señal en el 33% de casos. Con técnicas inmunohistoquímicas se detectó expresión de LMP-1 en células de Hodgkin o de Reed-Sternberg EBER (+) y negatividad en linfocitos EBER positivos. La positividad para EBER sugiere que en la infección es un evento precoz en la génesis tumoral y los resultados inmunohistoquímicos son los de una fase de latencia II.

De los estudios realizados hasta la fecha se puede extraer que los casos de Hodgkin de niños y de edades avanzadas son neoplasias asociadas a EBV, a diferencia de los linfomas de Hodgkin de adultos jóvenes (15).

En Europa aproximadamente el 40% de linfomas no Hodgkin T son EBER (+), siendo el linfoma T periférico linfoadenopatía anginmunoblástica-like el tipo en el que mas frecuencia se detecta esta positividad (cerca del 50%). La asociación de los procesos linfoproliferativos en postransplantados con EBV es inéquivoca y está bien demostrada serologicamente y con técnicas de hibridación molecular. Los procesos linfoproliferativos de los postransplantados es un grupo heterogéneo que abarca el espectro de hiperplasia B polimorfa a neoplasia B polimorfa, aunque también se

observan linfomas monomorfos, de morfología convencional, todos ellos están relacionados con EBV.

EBV en linfoepiteliomas-like.

El carcinoma indiferenciado nasofaríngeo (linfoepitelioma-like) fué, junto con el linfoma de Burkitt, la primera neoplasia que se asoció al EBV. El carcinoma indiferenciado nasofaríngeo se asocia a anticuerpos IgA anti-antígenos muy variados de EBV, que en ocasiones preceden al establecimiento del tumor y que sirven para su monitorización. Practicamente todos los carcinomas indiferenciados nasofaríngeos son EBER (+) y solo unos pocos expresan LMP-1, ninguno EBNA-2. La infección lítica se limita a esporádicos casos ZEBRA (+), es decir, la mayor parte de estas neoplasias exhiben un patrón típico de latencia II con expresión de EBER, LMP-1 y EBNA-1. Los datos obtenidos hasta la fecha permiten considerar a la infección por EBV como el paso definitivo hacia la carcinogénesis en la mucosa nasofaríngea (16).

Otros carcinomas tipo linfoepiteliomas, extra nasofaríngeos, contienen EBV. En linfoepiteliomas-like gástricos se detecta habitualmente el virus y, en los casos que se realizó SB, se objetivó que el ADN vírico es una expansión clonal de una única célula infectada. En muy pocos casos se realizó detección de proteinas codificadas, no existiendo expresión de LMP-1 o EBNA-2, (17) lo cual sugiere un patrón de latencia I.

Casi la totalidad de los linfoepiteliomas-like de glándula salival de pacientes chinos o esquimales contienen ADN vírico, sin que hasta la fecha se haya analizado la clonalidad.

Aproximadamente la mitad de los linfoepiteliomas-like de pulmón y de timo contienen EBV, en los casos estudiados, se objetivó ADN EBV episomal y clonal.

En un caso de linfoepitelioma-like de esófago se demostró la presencia de ADN EBV (18).

En la revisión efectuada hasta la fecha no se ha demostrado ADN EBV en los linfoepiteliomas-like de: cérvix uterino, piel, mama (carcinoma medular) y cavidad oral.

EBV en adenocarcinomas gástricos.

En 1992 se comunica por primera vez la presencia de ADN EBV en el 16% de adenocarcinomas gástricos sin llamativo componente linfoide (19). En las series publicadas con posterioridad se obtiene una frecuencia de tumores asociados a EBV comprendida entre el 2% y el 32,8% (Tabla 1).

Ref. Método Prev.LL. Prev.AC. Prev.total País/Etnia ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 20 HIS 18/20 (90%) 104/1.828

(5,7%) 122/1.848 (6,6%) Japón

21 HIS 17/19 (89,5%) 112/1.806 (6,2%) 129/1.825 (7%) Japón

22 HIS+PCR 14/18 (77,8%) 1/10 (10%) 15/28 (53,6%) Japón

23 HIS+PCR 8/9 (88,9%) 62/991 (6,2%) 70/1.000 (7%) Japón

24 HIS+PCR 6/6(100%) 2/66(3%) 8/72(11%) Japón

25 HIS 5/7(71,4%) 2/67(3%) 7/74 (9,5%) China (H-Kong)

26 HIS 1/1(100%) 3/41(7,3%) 4/42 (9,5%) China (H-Kong)

27 HIS+PCR 1/1(100%) 5/54(9,2%)

6/55(11%) Taiwan

28 HIS 10/10 (100%) 2/79(2,5%) 12/89 (13,5%) Corea

29 HIS 1/1(100%) 0/18(0%) 1/19 (5,2%) GB

30 HIS 4/4(100%) 3/35(9%) 7/39(18%) Alemania

31 HIS+PCR 4/65 (6,1%)(*) Italia

32 HIS 4/6(66,6%) 1/53(1,8%) 7/39(18%) Francia

33 PCR 3/3(100%) USA

19 PCR 22/138 (16%)

USA

(*): Con estroma linfoide prominente

Predominan los pacientes varones con tumores localizados en cardias o cuerpo, poco o moderadamente diferenciados y con un importante estroma linfoide asociado. En los casos en que se realizó SB se demostró infección monoclonal, también se apreció que la infección afectaba a la totalidad de las células tumorales. Ambos hechos sugieren que la infección viral ocurrió antes de transformación neoplásica (25, 34).

En los casos en los que se detectaron proteinas codificadas se demostró expresión de LMP-1 en pacientes inmunodeprimidos (34, 35) y en un pequeño porcentaje de pacientes sin alteraciones en la inmunidad en Taiwan (27). BIBLIOGRAFIA

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APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICO DE VIRUS ONCOGÉNICOS (II): VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.

Dr. D. Julio Velasco

Los virus del papiloma humano (HPVs) son virus epidermotrópicos, cuyo genoma es una doble cadena superenrrollada de ADN de unas 8 kilobases de longitud Y de 5 x 106 daltons de peso. El ADN está recubierto por histonas celulares a modo del virus SV 40 y por una cápside icosaédrica de 72 capsómeros. Parte del ADN vírico constituye la "unidad reguladora no codificadora" u URR con funciones en la replicación y la transcripción viral. El resto del genoma se agrupa en "zonas de lectura abierta" u ORFs, que se subdividen en ORFs L o "late" y en ORFs E o "early". Los L codifican las proteinas necesarias para construir la cápside. Algunos ORFs E codifican proteinas reguladoras, otros proteinas de función desconocida mientras que algunas de estas secuencias tienen una actividad potencialmente transformadora de la célula, especialmente los denominados E6 y E7 de algunos de los HPVs. La clasificación de los HPVs se basa en las diferencias de homología que existen en la secuencia de ácidos nucleicos. Aquellos HPVs que tengan menos del 50% de homología en la secuencia de ácidos nucleicos con los tipos nuevos caracterizados son considerados como tipos nuevos. Hoy en día están bien caracterizados mas de 70 genotipos, con diferente genoma, los cuales ocasionan varias enfermedades cutáneas y ano-genitales, la mayoría de comportamiento benigno, si bien varios genotipos están asociados con la transformación neoplásica.

Los HPVs infectan las células escamosas o sus progenitoras (células de reserva). El intervalo entre la exposición al virus y el desarrollo de la lesión oscila entre unas semanas y varios meses, y quizás más. Se calcula una media de 6-24 meses entre el contacto con el HPV y la detección de ADN HPV. Las células basales actuan como reservorio de ADN vírico. La iniciación de la replicación viral ocurre en las células descendientes de las basales infectadas. En los estratos superiores el virus se replica y se encapsula. Una parte de los queratinocitos exhiben halos perinucleares y nucleos grandes e hipercromáticos, algunos con morfología típica de coilocitos, en estas células se concentran todos los viriones maduros. La maduración viral está unida a la maduración celular y, a la postre, a la producción de queratinas y de involucrina. Las

células con estos cambios morfológicos son positivas para PCNA, Ki-67/Mb-1 y otros índices de cinética celular (1), lo cual implica que, de alguna manera, la replicación viral influye en el crecimiento celular. El mecanismo de oncogénesis mas aceptado es la unión del ORF 7 con el producto del gen del retinoblastoma y del ORF 6 con el producto del gen P53, con la consiguiente inhabilitación funcional de ambos genes reguladores (2a,2b).

2. METODOS DE DETECCIÓN Y TIPAJE DE HPV

En la actualidad existe un arsenal de métodos para detectar HPVs, unos mas extendidos, otros con mayor sensibilidad... Destacan los basados en las técnicas de biología molecular, ya que son los únicos que permiten establecer el genotipo infectante, cuestión clave en este tipo de infección en la que solamente algunos tipos son realmente transformantes.

2.1. METODOS MORFOLOGICOS UTILIZADOS EN EL DIAGNOSTICO DE INFECCION HPV

La citología.La primera aproximación al diagnóstico de infección HPV fué realizada por Ayre (3) en frotis citológicos cérvico-vaginales, quien describe brevemente, en año 1949, los ya bien conocidos coilocitos, como uno de los cambios citológicos asociados a lesiónes precancerosas. Siete años después Koss y Durfee (4) acuñan el término de "atipia coilocítica" que designa unas células muy características con un espacio claro perinuclear aunque no lo relacionaron con la infección viral. Fué el propio Ayre (5), quien en 1959 sugirió la hipótesis de que dichos cambios podrían estar producidos por un un agente viral. Otro tipo de célula asociada a infección HPV visible en el frotis citológico es disqueratocito, menos específico que el coilocito, ya que se pueden detectar en lesiones no relacionadas con HPV.

El frotis citológico sigue siendo en la actualidad el método por medio del cual se realizan la gran mayoría de diagnósticos de infección HPV ano-genital, fundamentalmente con el frotis cérvico-vaginal, técnica que es acreedora de una gran especificidad, próxima al 100%, y cuya sensibilidad está comprendida entre un 15% y un 58% para lesiones condilomatosas. Un porcentaje variable de estas lesiones son clasificadas como lesión escamosa intraepitelial de bajo grado, que engloba al condiloma plano y a la displasia leve asociada a condiloma. El resto de frotis con cambios HPV corresponden a una lesión escamosa intraepitelial de alto grado, término con el que la reciente Clasificación de Bethesda (6) agrupa a la displasia moderada, displasia grave y carcinoma in situ. El frotis citológico del canal anal se está empleando con éxito en grupos de riesgo y su seguridad diagnóstica es similar al frotis cérvico-vaginal (7). También se emplean, con peores resultados, la citología uretral y vulvar para detectar infecciones HPV. Los falsos negativos de la citología son consecuencia de una toma mal realizada o de un error de interpretación del frotis. Una causa habitual de falso positivo es la utilización de criterios citológicos muy amplios, poco específicos.

La biopsia. La muestra tisular es otro método para el diagnóstico de esta infección profusamente utilizado. Existen, al igual que con la citología problemas de interpretación y grandes diferencias interobservador y la posibilidad de un falso negativo tras una toma-biopsia realizada a ciegas o por un colposcopista poco experimentado. Con la biopsia se obtiene un diagnóstico refinado y de gran precisión,

así sabremos con exactitud si existe displasia asociada al condiloma y como es esta asociación, si vertical u horizontal.

La microscopía electrónica. La ultraestructura se utiliza raramente para diagnosticar infecciones HPV, su escasa sensibilidad, inferior al 50%, la necesidad de un costoso aparataje y la lentitud del proceso relegaron este sistema en la detección de HPVs.

2.2. METODOS INMUMOLOGICOS PARA DETECTAR HPVs

Anticuerpos anti-cápside. La detección inmunohistoquímica del antígenos de la cápside vírica comunes a todos los papilomavirus, con anticuerpos producidos en conejos. El porcentaje de lesiones positivas con esta técnica está en relación inversa a la severidad de la lesión, de manera que su detección en displasias graves y carcinomas in situ no supera el 10%.

Anticuerpos anti-proteinas codificadas por secuencias del genoma viral. Los métodos descritos hasta ahora permiten con mayor o menor sensibilidad establecer el diagnóstico de infección por HPV, pero ninguno de ellos es capaz de determinar el o los genotipos implicados, hecho fundamental en una infección vírica en la cual solo algunos genotipos son verdaderamente transformantes. La posibilidad de producir anticuerpos anti-proteinas específicas de un determinado genotipo tiene la importante limitación de la inexistencia de métodos de propagación vírica in vitro, ya que no existen medios de cultivo eficaces para estos virus. Algunos investigadores abordaron este escollo con el desarrollo de métodos de obtención de anticuerpos de fusión, clonando secuencias de ADN de HPVs, induciendo de forma artificial, en cultivos bacterianos, la proteina codificada por la secuencia genómica clonada. Los anticuerpos elaborados contra estas proteinas se están comenzando a utilizar, aún a nivel experimental, en el diagnóstico de infecciones para determinados genotipos de HPV en sangre periférica o tejidos.

2.3. LAS TECNICAS DE HIBRIDACION MOLECULAR

La aplicación de técnicas de biología molecular están especialmente indicadas en el diagnóstico de las infecciones producidas por HPVs ya que permiten conocer el/los genotipos causantes de la infección y permite separar las infecciones de "alto riesgo" (las producidas fundamentalmente por los genotipos 16, 18, 45, 56), de "riesgo intermedio" (31, 33, 35, 39, 51, 52, 53, 55, 58, 59, 63, 66, 68) de transformación neoplásica de las de "bajo riesgo"(los HPVs 6, 11, 42, 44) son genotipos mas prevalentes en lesiones benignas) (8a).

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) es el mejor proceder disponible actualmente para el diagnóstico de infección HPV (8b). Existen varias técnicas de hibridación molecular, cada una con sus ventajas y sus desventajas, todas se basan en la complementariedad de las bases nitrogenadas-la molécula de ADN es una doble cadena de polinucleótidos,ambas unidas por puentes de hidrógeno a nivel de las bases nitrogenadas que sean complementarias-y en el fénomeno de la desnaturalización y renaturalización del ADN-los puentes de hidrógeno entre cada par de bases se rompen por la acción del calor o de un álcali, separándose ambas cadenas (desnaturalización), el enfriamiento o la acidificación de la reacción provocan en ensamblaje de ambas cadenas de nucleótidos (renaturalización). Todas las técnicas de hibridación detectan un ácido

nucleico presente en las células del material a analizar por medio de otro, complementario del anterior y marcado con un isótopo radioactivo (sondas calientes) o con sustancias no isotópicas (sondas frías), fundamentalmente la biotina,aunque también se utiliza la fotobiotina, la digoxigenina, el mercurio/trinitrofenol, la fluoresceina y la rodamina entre otros. Tradicionalmente se ha considerado que las sondas calientes eran mas sensibles, difíciles de manejar y peligrosas que las frías. En la actualidad con la aplicación de nuevos sistemas de detección enzimáticos se consiguen niveles de sensibilidad similares para ambas, con la ventaja de que las sondas no isotópicas tienen un margen muy superior de caducidad y no existe exposición de radioactividad para el personal manipulador.

Las reacciones de hibridación molecular utilizadas en el diagnóstico y tificación de HPVs son las siguientes:

Hibridación in situ con filtro (HISF). Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN. El método HISF es de muy fácil ejecución, rápido y barato es ,sin embargo, poco específico y, a menudo, resulta difícil separar las señales positivas del fondo (9). Su uso se limita a trabajos con gran cantidad de especímenes.

Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.

El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espécimen.

El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradigrafía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especímenes mientras que el SB no admite mas de 15. Uno de los problemas mas importantes del DB es el "fondo" provocado por las

hibridaciones inespecíficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los híbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecíficas pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa (10).

La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección.La HS es un método con una especificidad estimada en 1-5 X 105 moléculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, además, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (11).

La Hibridación in situ (HIS). Se utiliza en cortes histológicos y en extendidos citológicos. La sonda se aplica directamente sobre el espécimen (no requiere extracción del ADN), previamente tratado con una proteasa para permitir su acceso al ADN nuclear.La desnaturalización del ADN diana y de sonda marcada se realiza simultaneamente utilizando elevadas temperaturas (alrededor de 100 º). La HIS es una técnica mucho menos sensible que los métodos de membrana,necesitando 100 veces mas copias virales que el DB o el SB (12), aunque puede ser tan efectiva como aquellas cuando el tipo infectante es 6/11 o 16 y cuando la lesión muestra los cambios histológicos típicos de lesión HPV (13). Cuando el condiloma se acompaña de displasia, la HIS disminuye la rentabilidad según el grado de la misma, lo cual refleja la disminución del número de copias virales con la progresión de la lesión. Otro problema es que precisa de tejido, puesto que aunque se puede practicar en frotis citológicos sus resultados no son tan buenos como con material procedente de una biopsia. La HIS tiene la gran ventaja de que permite la visualización al microscopio del lugar donde tuvo lugar la hibridación, motivo por el cual es la técnica de hibridación con ácidos nucleícos preferida por los anatomopatólogos.

La hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.

En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.

En la hibridación en fase líquida, la sonda y el HPV diana están en solución. La hibridación en fase líquida ha sido utilizada para estimar la relación genética entre los diferentes HPVs, hoy día es de escaso uso.

El sistema de captación de hibridos también se realiza en medio líquido.Primero se desnaturaliza el especimen, posteriormente se hibrida el HPV ADN con la correspondiente sonda. Los híbridos son capturados por la superficie del recipiente , cubierta con anticuerpos anti-híbridos que reaccionan con fosfatasa alcalina, haciéndose visibles tras la aplicación de un sustrato quimioluminiscente. Los sistemas captación de

híbridos están todavía en fase experimental, las pruebas iniciales permiten suponer una elevada sensibilidad y fácil manejo de la técnica.

2.4. METODOS DE AMPLIFICACION GENOMICA.

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza una enzima, la polimerasa, para copiar a una determinada molécula de un ácido nucleico, habitualmente un ADN. La repetición de este proceso origina la producción de un gran número de moléculas hijas puesto que las nuevas moléculas son utilizadas por la polimerasa como moldes. El proceso se inicia con la separación de las dos cadenas que configuran la molécula de ADN o por el calentamiento de solución en la que encuentra el ADN a unos 90º. Tras un descenso térmico de la solución se produce el "anillamiento" o hibridación de dos secuencias diferentes de nucleótidos, denominados "primers" o "cebadores" que delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van añadiendo los nucleótidos presentes en la solución, fase denominada de "extensión" de los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un número determinado de veces en un aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos térmicos programables. El hecho de que las moleculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos ADNs produce un efecto multiplicador, produciéndose aproximadamente 106 copias de ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reacción de hibridación o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una fuente de luz ultravioleta para su identificación. El avance que hizo posible la técnica de la PCR fué el descubrimiento de polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas. La primera de ellas fué la que que contienen las bacterias denominadas Thermus aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan en manatiales donde las aguas termales están a menudo a temperaturas superiores a 90º. Antes del descubrimiento de esta polimerasa se realizaban técnicas de amplificación de ADN con el fragmento de Klenow como polimerasa ADN,pero esta enzima es inestable a temperaturas superiores a los 37º,con lo que era necesario añadir una dosis de enzima en cada ciclo de amplificación lo cual resultaba extraordinariamente tedioso a la par que se acumulaban grandes cantidades de enzima degradada. El descubrimiento de la Taq polimerasa evitó la necesidad de añadir enzima en cada ciclo de amplificación, facilitando así la automatización del proceso.

La extraordinaria sensibilidad de la técnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un millón de células es un arma de gran valor en la detección de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección oculta. El problema mas importante de las técnicas de amplificación genómica es la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos. La adopción de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separación de especímenes y reactivos o de "primers" anticontaminación permiten la obtención de resultados fiables. Otra desventaja de la reacción de PCR es la no amplificación de genomas cuando no existen "primers" específicos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.

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