6CFE01-245

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Evidencias de selección local en genes candidatos y caracteres relacionados con la

resistencia a la sequía a lo largo del rango de distribución del pino canario

LÓPEZ, R1., LÓPEZ DE HEREDIA, U.

1, COLLADA, C.

1, CANO, F.J.

1, EMERSON, B.C.

2,

COCHARD, H.3 y GIL, L.

1

1 Grupo de Investigación de Genética y Fisiología Forestal. ETSI Montes. UPM. 2 Grupo de Ecología y Evolución en Islas. IPNA-CSIC. 3 Physique et Physiologie Intégratives de l’Arbre Fruitier et Forestier. INRA.

Resumen

Los actuales escenarios de calentamiento global indican que las masas forestales de climas

mediterráneos se enfrentan a una creciente presión selectiva para adaptarse a condiciones más

xéricas. En este contexto, la variación genética se presenta como un importante sustrato para

que los procesos selectivos actúen y generen genotipos adaptados a nuevos ambientes. La

adaptación de poblaciones o individuos al ambiente donde habitan puede estimarse a partir de

la asociación entre la variación de parámetros ambientales y los caracteres fenotípicos

obtenidos en ensayos de procedencia, tales como crecimiento o supervivencia, o bien con los

SNPs (mutaciones puntuales) presentes en regiones codificantes o reguladoras de genes cuya

función está potencialmente involucrada en la variación observada para un determinado

carácter. El estudio del análisis de asociación entre SNPs y fenotipos de interés permite

además la identificación de variantes alélicas (Quantitative Trait Nucleotides, QTNs), con la

que se puede establecer una estrategia de selección asistida basada en genes candidatos. Esta

metodología facilita la selección de genotipos de interés en base a su secuencia de ADN

reduciendo el coste de pruebas fenotípicas y posibilitando la selección para caracteres

complejos con alta interacción ambiental.

En este trabajo analizamos los patrones de variación de genes candidatos de poblaciones a lo

largo de todo el rango de distribución de Pinus canariensis. También en parámetros

fisiológicos del xilema implicados en la conducción de agua hasta las hojas y la resistencia a

la cavitación, relacionados los primeros con el crecimiento y los segundos con la

supervivencia. Esta especie habita en un archipiélago donde la migración es limitada y donde

se han sucedido procesos complejos de extinción y recolonización. El análisis de asociación

mostró gradientes clinales ambientales pronunciados para algunos genes candidatos. En

particular, la aridez parece ser el factor ambiental que ha ejercido mayor presión selectiva en

la especie. Estos resultados se vieron reforzados por las diferencias entre poblaciones en lo

referente a la resistencia a la cavitación del xilema y su alta correlación con la supervivencia

en las regiones más áridas.

Palabras clave Diferenciación genética, variación clinal, test de neutralidad, Fst, Qst, resistencia a la

cavitación, conductividad hidráulica.

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1. Introducción

Aunque la disponibilidad de agua ha sido considerada como uno de los motores de la

distribución de las especies (RAMÍREZ-VALIENTE ET AL., 2009), el aumento actual de las

temperaturas y de los periodos de sequía en un escenario de cambio climático global puede

superar el potencial de las especies longevas para hacer frente a las nuevas condiciones

ambientales (IPCC, 2007). La facilidad de adaptación de estas especies a los cambios en el

entorno es función a corto plazo de la capacidad de cada individuo para alterar su estructura y

función (plasticidad fenotípica), mientras que a medio y largo plazo las migraciones y la

variabilidad genética son más importantes, ya que permiten que los mecanismos de selección

actúen y originen cambios en la estructura poblacional (NICOTRA ET AL., 2010). En este

contexto, la identificación de los mecanismos de resistencia a la sequía y de los genes

implicados permitiría comprender los procesos evolutivos que intervienen en la adaptación de

las plantas al estrés hídrico y seleccionar aquellos genotipos potencialmente adaptados, así

como asegurar la sostenibilidad de los bosques.

Un objetivo importante de la genética de poblaciones es identificar la base genética de

la diferenciación fenotípica adaptativa y la acción de los procesos selectivos en la misma

(GONZÁLEZ-MARTÍNEZ ET AL., 2007). Dos categorías de procesos evolutivos

determinan la diferenciación entre poblaciones. La primera incluye los procesos evolutivos

neutrales (por ejemplo migración o deriva genética). La segunda está relacionada con la

selección natural bajo distintas condiciones ambientales (STILL ET AL., 2005). Un

procedimiento habitual para discernir entre la influencia de ambas categorías en la

diferenciación poblacional consiste en la comparación entre el grado de diferenciación

genética obtenida mediante marcadores neutrales (Fst; Wright, 1951) y la divergencia de

caracteres cuantitativos fenotípicos (Qst; SPITZE, 1993). Cuando la diferencia de caracteres

fenotípicos es mayor que la observada en caracteres moleculares neutrales (Qst > Fst) se

considera como una evidencia de selección natural divergente, es decir que diferentes

genotipos están favorecidos bajo condiciones ambientales diferentes (MERILÄ &

CRNOKRAK, 2001). Los recientes progresos en genómica permiten mejorar los estudios de

adaptación de las especies a diferentes entornos y proporcionan herramientas útiles para

predecir su respuesta ante futuros escenarios ambientales (COCHARD ET AL., 2009;

GRIVET ET AL., 2009). En particular, se pueden comprobar desviaciones de la neutralidad a

través de tests desarrollados recientemente que son independientes de la demografía (LI ET

AL., 2012) y, posteriormente, incorporados en comparaciones de Fst / Qst.

Otra forma de poner de manifiesto la acción de la selección natural es detectar variación

genética clinal a lo largo de gradientes ambientales (GRIVET ET AL., 2011). Para ello se

intentan identificar correlaciones entre los patrones de frecuencias alélicas o regiones

codificantes no neutrales de genes candidatos y las variables ambientales, que pueden actuar

como agentes selectivos que promueven la selección natural (HANCOCK ET AL., 2011). De

manera más intuitiva, podemos encontrar indicios sólidos de adaptación local a partir de la

asociación de las variables ambientales con caracteres fenotípicos obtenidos a partir de

ensayos de procedencia. La evidencia de selección cobra mucha más fuerza si se puede

mostrar también una correlación entre el fenotipo / genotipo de interés (por ejemplo, el

momento de brotación) y una medida de fitness (por ejemplo, el número de supervivientes de

la progenie) (HANCOCK & DIRIENZO, 2008).

4/17

Las Islas Canarias constituyen un archipiélago sometido a vulcanismo activo desde hace

más de 20,6 millones de años (CARRACEDO ET AL., 1998). La intensidad y recurrencia de

los eventos volcánicos varían ampliamente dentro y entre islas (JUAN ET AL., 2000) y, junto

con la heterogeneidad del hábitat y la actividad humana, se cree que son los principales

determinantes de la diversidad genética y la ecología de la biota canaria (EMERSON, 2002;

DE NASCIMENTO ET AL., 2009; LÓPEZ DE HEREDIA ET AL., 2010). Las condiciones

climáticas de las islas son diversas debido a su fisiografía y localización geográfica. Los

vientos Alisios húmedos de dirección noreste y los vientos saharianos secos del este provocan

grandes clinas ambientales que varían conjuntamente con la xericidad y la edad de aparición

de las islas: las islas occidentales (La Palma, El Hierro, Tenerife, La Gomera) son más

húmedas, modernas y geológicamente menos estables que las islas orientales (Fuerteventura,

Lanzarote, Gran Canaria).

El pino canario es el único pino endémico del Archipiélago Canario. La expansión y

diferenciación de sus poblaciones parecen ser resultado de una dinámica de extinciones

locales y recolonización en las que el vulcanismo ha jugado un papel decisivo. En la

actualidad abarca condiciones ambientales muy variadas. Crece espontáneamente desde casi

el nivel del mar hasta cerca de 2.400m y existen masas naturales desde en ambientes

subdesérticos con menos de 300 mm de precipitación anual hasta en bosques mixtos de pinos

y frondosas con más de 1.500 mm.

2. Objetivos

En este trabajo intentamos discernir entre efectos demográficos y procesos selectivos en

la diferenciación genética de las poblaciones de pino canario mediante el análisis de genes

candidatos y de la variación ambiental y fenotípica de caracteres cuantitativos obtenidos en

ensayos de procedencias. Por un lado compararemos la estructura genética espacial del pino

canario obtenida con a partir de los genes estudiados con la diferenciación fenotípica entre

poblaciones obtenida en ensayos de procedencias para detectar procesos selectivos. Por otro,

intentaremos identificar regiones génicas que se desvíen de la neutralidad para estudiar

posteriormente si existe alguna correlación con las condiciones ambientales actuales de las

poblaciones. Por último comprobaremos si existe alguna relación entre los caracteres

fenotípicos y la diversidad genética molecular para identificar posibles genes candidatos, es

decir genes implicados en alguno de los caracteres cuantitativos medidos en campo tales

como la supervivencia, el crecimiento, la eficiencia hidráulica y la vulnerabilidad a la

cavitación.

3. Metodología

3.1. Análisis de genes candidatos

Hemos seleccionado 24 poblaciones naturales de P. canariensis para la secuenciación

de genes candidatos (Figura 1). De cada población recogimos acículas de 24-26 árboles,

excepto de las poblaciones marginales en las que el tamaño muestral se redujo a 3-10 árboles.

Como grupo externo (outgroup) utilizamos 7 muestras de P. pinea, debido a su proximidad

filogenética con P. canariensis (ECKERT y HALL, 2006). Para la extracción de DNA

utilizamos el kit Invitek (Invisorb® Spin Plant Mini Kit). Se secuenciaron amplicones de 8

genes nucleares (Tabla 1) usando cebadores transferidos de P. pinaster (GRIVET ET AL.,

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2011), P. sylvestris (PALMÉ ET AL., 2008), P. taeda (BROWN ET AL., 2004) y varias

especies del subgénero Strobus (TSUTSUI ET AL. 2009).

Tabla 1. Genes nucleares secuenciados, función en la que están potencialmente implicados y tamaño de la secuencia

analizada (en pares de bases).

ID gen Categoría funcional Total (bp)

Región

codificante

(bp)

Región no

codificante

(bp)

cad Biosíntesis de la lignina (fin de la ruta de

biosíntesis del monolignol) 412 301 111

lp3-3 Estrés hídricos (pertenece a la familia de

genes ASR) 404 237 167

CCoAOMT Biosíntesis de la lignina (reforzamiento de la

pared celular) 511 264 247

gapCp

Ciclo de Calvin en la fotosíntesis y glicólisis

citosólica. Tiene un papel en el desarrollo de

la raíz

566 197 369

eph Respuesta frente a ataques de patógenos 642 332 310

phy Proteínas azules de cobre involucradas en el

transporte de electrones 484 223 261

pal Biosíntesis de compuestos fenilpropanos en

el desarrollo de la lignina 408 283 125

rps10 Síntesis de proteínas 392 298 94

La alineación de las secuencias la realizamos con CLUSTALW en el software

BIOEDIT (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/page2.html). Para estimar dos haplotipos por

individuo en cada locus utilizamos el programa PHASE (STEPHENS ET AL., 2001). En total

obtuvimos entre 6 y 52 secuencias de haplotipos por población. A partir de las mismas

calculamos varios estadísticos de diversidad molecular con el programa DnaSAM 5.1

(ECKERT ET AL., 2009). La diversidad de nucleótidos la estimamos con los parámetros θπ

(Nei, 1987) y θW (WATTERSON, 1975), y para la diversidad haplotípica utilizamos el

estadístico Hd de Nei (1987). Para construir las redes de haplotipos para cada gen seguimos el

método Median Joining Network implementado en el programa SplitsTree 4 (HUSON &

BRYANT, 2006). La distribución de la variabilidad genética individual, poblacional y entre

islas la calculamos a través de un AMOVA para cada locus con el programa Arlequin 3.11

(EXCOFFIER ET AL., 2005). Obtuvimos las matrices de valores Fst considerando el modelo

de sustitución para cada locus obtenido con jModeltest 0.1.1 (POSADA, 2008).

Para detectar desviaciones de la neutralidad de cada gen candidato utilizamos distintos

tests de selección obteniendo que para el pino canario estos genes pueden considerarse

neutrales, es decir, en principio no sometidos a procesos selectivos.

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Figura 1. Izquierda: Median Joining Network de los 22 haplotipos encontrados para P. canariensis y P. pinea. Los

colores representan la frecuencia de cada haplotipo en cada isla (TF=Tenerife; GC=Gran Canaria; LP=La Palma; EH= El

Hierro; LG=La Gomera; PP=Pinus pinea. Derecha: Localización de las poblaciones naturales muestreadas para el análisis

molecular con la distribución de haplotipos del gen GapCP.

3.2. Supervivencia, crecimiento y parámetros hidráulicos de las poblaciones en un

ensayo de procedencias multilocalidad

De las 24 poblaciones utilizadas para el análisis genético, 19 están representadas en un

ensayo de procedencias multilocalidad de pino canario. Para el propósito de este trabajo

utilizamos tres de las parcelas de ensayo: Los Realejos, en el norte de Tenerife, como

representativa de ambiente húmedo influenciado por el mar de nubes, su precipitación media

anual varía entre 700-800 mm más la precipitación horizontal; Fasnia que se encuentra en una

de las zonas más secas de Tenerife, con una valor medio de 460 mm de precipitación anual y

orientación sudeste y Tirajana, en el sur de Gran Canaria, situada en un ambiente casi

desértico con apenas 300 mm de precipitación anual y suelos con muy poca retención de agua

(para una descripción más detallada del los ensayos ver LÓPEZ ET AL., 2007).

Durante los seis primeros años tras el establecimiento de las plantaciones, en 1999,

medimos la supervivencia, altura y diámetro de todos los árboles. En 2010 realizamos las

curvas de vulnerabilidad a la cavitación en ramas de 8 procedencias utilizando la técnica del

Cavitron (COCHARD ET AL., 2005). Utilizamos ramas de 16-28 individuos por procedencia

de los dos sitios de ensayo más extremos, Los Realejos y Tirajana. A partir de las curvas de

vulnerabilidad se estimaron los parámetros P12, P50 y P88 (potencial hídrico al que se produce

el 12%. 50% y 88% de pérdida de conductividad hidráulica, respectivamente). En las mismas

ramas evaluamos la eficiencia hidráulica a través de la conductividad específica, Ks y la

conductividad específica foliar, Kl (más detalles acerca del cálculo de los parámetros

hidráulicos en LÓPEZ ET AL., 2013).

7/17

La proporción de la variación total entre poblaciones de los caracteres fenotípicos se

calculó con el estadístico Qst, dividiendo la varianza genética aditiva total en dos

componentes: interpoblacional (σB) e intrapoblacional (σw):

Qst = =

donde h2 es la heredabilidad en sentido estricto, y n el número de sitios de ensayo.

Asumimos un valor de h2 = 0.2 basándonos en valores en la bibliografía para otros pinos ya

que no existen datos publicados de pino canario. Estimamos los componentes de la varianza:

varianza de la población (Vα), varianza de la interacción población x sitio de ensayo (Vαβ) y

varianza residual (Vε), utilizado la opción REML del procedimiento VARCOMP en SAS a

partir del modelo:

Yij = µ + αi + βj + αβij + ε

donde Yij es el valor fenotípico de la procedencia i-ésima en el sitio j; µ es la media

poblacional, αi es el efecto de la i-ésima procedencia, βj es el efecto del j-ésimo sitio, αβij es la

interacción entre la i-ésima procedencia en el sitio j, y ε es el error experimental.

La distribución e intervalos de confianza de los Qst los calculamos mediante

bootstrapping. Para detectar diferencias entre los valores medios de los Fst y Qst, se

generaron 1000 bootstrap para ambos estadísticos (WHITLOCK, 2008). Posteriormente

comparamos los intervalos de confianza al 95% de las distribuciones de ambos estadísticos.

3.3. Caracterización ambiental de las poblaciones

Medimos las coordenadas geográficas (X_UTM, Y_UTM y altitud) de cada población

con un GPS. Las variables climáticas las obtuvimos a partir de las bases de datos del

GRAFCAN (http://www.grafcan.es/) y de la AEMET

(http://www.aemet.es/es/serviciosclimaticos/datosclimatologicos). Para la caracterización de

las poblaciones seleccionamos: precipitación media anual, precipitación media estacional,

precipitación máxima en 24 horas, temperatura media anual, temperatura mínima anual,

temperatura máxima anual, temperatura media máxima, temperatura media mínima, rango

anual de temperaturas, evapotranspiración potencial total y estacional, radiación solar,

frecuencia de heladas, erosión potencial del suelo y duración del periodo de sequía. Como

muchas de las variables están correlacionadas entre sí, aplicamos un Análisis de Componentes

Principales (PCA) para reducir el número de variables en los análisis de correlaciones con los

parámetros genéticos y variables fenotípicas.

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Estimamos la edad de las poblaciones de pino canario a partir de la edad de las coladas

volcánicas sobre las que se asientan basándonos en la literatura publicada (Tabla 2).

Tabla 2. Localización, características climáticas y edad de las poblaciones de pino canario incluidas en los análisis

moleculares. Se han señalado con un asterisco aquellas poblaciones representadas en los ensayos de procedencias.

Isla Población X Y Altitud Ta (ºC) Pa (mm) Sq (meses) Edad (Ma)

TE

NE

RIF

E

Anaga 373332 3159843 245 19,4 363 6,5 5,4

Arafo (*) 359227 3137506 940 15,4 658 4,0 1,2

La Esperanza (*) 364449 3144184 1060 13,2 785 13,2 0,69-0

La Guancha (*) 338033 3136348 1060 13,1 573 13,1 0,69-0

Vilaflor Alto (*) 336661 3119757 2145 11,5 372 4,5 0,69-0

Vilaflor Bajo 339148 3116789 1435 15,4 371 4,5 0,69-0

Chío (*) 326893 3130161 1450 13,3 443 3,0 0,69-0

Arico (*) 347929 3123062 1830 13,5 372 4,0 0,69-0

Ifonche 334324 3113839 1040 17,9 364 5,0 1,2

LA

PA

LM

A

Tagoja (*) 225438 3181505 1650 11,7 528 4,0 0,5

Garafía (*) 219189 3189233 1040 14,7 953 3,5 1,65

El Fayal (*) 210305 3186846 782 16,5 573 4,0 0,531

Taburiente (*) 218606 3180918 845 15,4 705 3,5 0,5

El Paso (*) 222932 3174530 1085 14,20 811 3,5 0,659

Fuencaliente (*) 220535 3163050 1180 13,40 831 3,0 < 0,0001

HIERRO El Julán (*) 203934 3068731 935 16,4 450 4,5 0.0002

Hoyo Morcillo (*) 199963 3069239 965 16,4 417 4,5 0.0002

GOMERA Imada 278913 3108478 1080 16,1 484 4,5 8,6-7,8

GR

AN

CA

NA

RIA

Tamadaba (*) 431978 3103714 1.190 15,3 575 4,0 3,5

Gáldar 439376 3099201 1700 13,4 826 2,8 0,0029

Mogán (*) 430833 3087207 525 18,3 282 7,0 3,5

Inagua (*) 433324 3089930 995 17,0 382 4,5 3,5

Barranco de Soria (*) 434530 3088373 820 17,9 332 6,0 3,89

Tirajana (*) 441718 3089646 1150 18., 482 4,0 3,69

Arguineguín 434941 3077536 250 20,7 183 9,5 11,77

3.4. Variación de la diversidad genética según gradientes geográficos y ambientales

Para identificar indicios de adaptación a ambientes locales, realizamos un análisis de

correlación entre los parámetros de diversidad poblacional (Hd y θπ), las frecuencias

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haplotípicas, las coordenadas geográficas y las tres primeras componentes principales de los

datos climáticos. Se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.

Implementamos test de Mantel en el software PASSaGE2 para examinar si la distancia

geográfica entre las poblaciones estaba asociada con la diversidad poblacional o con las

distancias entre caracteres fenotípicos cuantitativos, así como entre distancias genéticas

moleculares y cuantitativas (significación del test obtenida con 1000 permutaciones). Es decir

si las poblaciones más próximas son más parecidas genética y fenotípicamente entre sí que las

que se encuentran más alejadas geográficamente.

4. Resultados y Discusión

4.1. Diferenciación neutral frente a variación adaptativa

Las poblaciones se comportaron como una metapoblación más o menos panmíctica,

superando los efectos de la deriva genética y con muy poca diferenciación local. Para los diez

genes seleccionados se repitió un patrón con uno o dos haplotipos mayoritarios y un número

variable de haplotipos raros, lo que se tradujo en valores de Fst bajos para todos los genes

secuenciados, con un valor promedio de 0,065 (0,02; p<0,01). Los valores de Qst variaron

entre 0,044 para la altura (0,09; p<0,001) y 0,452 (0,08; p<0001) para el P88 (Tabla 3). Los

valores de Qst de la altura, diámetro y la eficiencia hidráulica no difirieron significativamente

de los valores de Fst. Es decir, las pequeñas diferencias encontradas entre poblaciones en

caracteres cuantitativos podrían ser resultado de la deriva genética u otros procesos de

diferenciación genética neutrales. Sin embargo, en las variables relacionadas con la

resistencia a la cavitación los valores de Qst fueron mayores que el de Fst (Tabla 3) indicando

selección espacial divergente. De hecho el pino canario ha sido la primera conífera en la que

se ha encontrado por una parte que existen diferencias entre poblaciones para los parámetros

de resistencia a la cavitación pero que además, estas diferencias, mucho más acusadas cuando

las plantas crecen en ambientes con un prolongado periodo de sequía, como sucede en el

ensayo de Tirajana, están ligadas al clima de las masas de origen. Es decir las poblaciones de

ambientes más secos son más resistentes a la cavitación que las de ambientes más húmedos

(LÓPEZ ET AL., 2013). La construcción de un xilema más resistente a la cavitación en

ambientes secos se ha visto de manera generalizada cuando se han realizado comparaciones

entre especies (POCKMAN & SPERRY, 2000), por lo que se ha confirmado que es un

carácter estrechamente ligado con la resistencia a la sequía y al crecimiento en lugares con

baja disponibilidad hídrica.

A pesar del elevado flujo genético entre islas (NAVASCUÉS ET AL., 2006) y entre

poblaciones situadas a distintas altitudes en la mismas ladera (NAVASCUÉS ET AL., 2008),

el amplio rango de condiciones ambientales y las frecuentes perturbaciones a las que están

sometidas las masas de pino canario pueden haber ejercido presiones selectivas muy fuertes

en el pasado, favoreciendo por un lado genotipos en general muy plásticos, es decir con gran

capacidad de cambios en el fenotipo según el ambiente en el que crezcan, como ya se ha visto

con anterioridad en otros caracteres como el reparto de biomasa, la capacidad de ajuste

osmótico y la morfología foliar (LÓPEZ ET AL., 2009; 2010) pero que además están

adaptados a las condiciones locales.

10/17

Tabla 3. Porcentaje de la varianza explicada y valores de significación (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001) de los

factores procedencia, sitio (localidad de ensayo) y su interacción para los valores de eficiencia hidráulica, resistencia a la

cavitación y crecimiento obtenidos del modelo lineal general y valor de la diferenciación genética poblacional para cada

variable cuantitativa (Qst ± desviación estándar).

Ks: conductividad hidráulica específica; Kl: conductividad hidráulica foliar; P12, P50, P88: potencial hídrico que

causa el 12%, 50% y 88% de pérdida de conductividad hidráulica respectivamente; H: altura a los 6 años del

establecimiento del ensayo; Db: diámetro basal a los 6 años.

Variable Sitio Procedencia Sitio x Proc Qst

Eficiencia hidráulica

Ks 15,33 *** 1,45 - 0,076 (0,10)

Kl 10,53 *** 3,58 1,28 0,089 (0,11)

Resistencia a la cavitación

P12 34,35 *** 0 4,96 0,093 (0,08)

P50 53,11 *** 5,48 *** 5,50 * 0,365 (0,09)

P88 42,75 *** 9,00 *** 8,39 ** 0,452 (0,08)

Crecimiento

H 94,12 *** 0,11 0 0,044 (0,09)

Db 59.96 *** 2.35 0 0,135 (0,09)

4.2. Relación entre las variables ambientales, la diversidad genética y la diferenciación

fenotípica

La estructura genética de las poblaciones no siguió un patrón de aislamiento por

distancia según los resultados del test de Mantel (p > 0,3). Es decir, las poblaciones más

próximas geográficamente no fueron las más cercanas genéticamente. La mayor parte de las

clinas detectadas en la diversidad genética de 4 de los 8 genes analizados, tanto a nivel de

SNPs como de haplotipos, fueron longitudinales. Las diversidades haplotípica (Hd) y

nucleotídica (θπ) de los genes phy y cad aumentaron hacia el este mientras que la diversidad

de los genes gapCp y eph siguió un patrón opuesto, siendo mucho menor en las poblaciones

de Gran Canaria.

Las tres primeras componentes principales de los datos climáticos (autovalor > 1,0)

explicaron juntas el 84,9% de la varianza total de los datos. La primera componente principal

(PC1; 55,1%) puede asimilarse a un índice de aridez: los climas más húmedos y templados se

sitúan en un extremo (valores negativos), mientras que los más secos y cálidos en el otro

(valores positivos). Este gradiente de aridez está además muy correlacionado con la longitud.

La PC2 (20%) mostró correlaciones positivas con la altitud, temperaturas y precipitaciones

estivales, el rango de temperaturas, las temperaturas máximas y la evotranspiración potencial

en verano y negativamente con la precipitación, las temperaturas mínimas y la

evotranspiración potencial en invierno. Por último la PC3 (12%) estuvo relacionada con la

radiación solar, temperatura media estival y temperaturas máximas anuales.

Las diversidades haplotípicas de tres de los genes candidatos (gapCp, CCoAOMT y pal)

mostraron una fuerte correlación negativa con la PC1 (r = -0,55; -0,51; -0,53; p ≤ 0.02,

respectivamente), sugiriendo la posibilidad de que la selección pueda haber actuado sobre la

diversidad de estos genes (Figura 2). No obstante, ninguno de estos genes mostró evidencias

11/17

de selección para ninguno de los tests realizados. Es decir que, a pesar de que parece que

estos genes presentan una clara variación clinal no podemos descartar que las diferencias

entre las distintas poblaciones se deban a efectos demográficos.

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

Hd C

CoA

OM

T

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

El Hierro

Gran Canaria

La Palma

Tenerife

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

Hd g

apC

p

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

Hd p

al

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Figura 2. Correlaciones entre el índice de aridez obtenido mediante el análisis de componentes principales de 21

variables climáticas (ver material y métodos) y las diversidad de los genes CCoAOMT (a), gapCp (b) y pal (c).

Cuando las correlaciones se efectuaron entre las variables climáticas y las frecuencias

haplotípicas encontramos que seis de los genes sufrieron cambios direccionales en las

mismas: la frecuencia de los haplotipos rps10_2 y pal_1 disminuyó con el aumento de la

aridez, mientras que la frecuencia de rps10_1 y gapCp_2 se incrementó (p ≤ 0.01; Figura 3).

De hecho, para el gen gapCp el segundo haplotipo está casi fijado en las poblaciones más

xéricas (Figura 1). El haplotipo pal_1 se caracteriza por un SNP en la región codificante que

se traduce en el cambio de un aminoácido entre las poblaciones más xéricas y las más

húmedas. En el caso de los haplotipos gapCp_2, rps10_1 y rps10_2 no se encontraron SNPs

en la región codificante que expliquen las correlaciones con la variación ambiental, por lo que

estas correlaciones podrían estar sesgadas por la historia demográfica de las poblaciones. Sin

embargo, no puede descartarse que los SNPs identificados en la región no codificante de estos

genes estén ligados a otras regiones codificantes que sí estén sometidas a selección.

a b

c

12/17

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

rps10_1

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

rps10_2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

pal_

1

0.0

0.2

0.4

0.6

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

GapC

p_2

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Figura 3. Correlaciones entre el índice de aridez obtenido mediante el análisis de componentes principales de 21

variables climáticas (ver material y métodos) y las frecuencias haplotípicas de 2 haplotipos del gen rps10 (a y b) de un

haplotipo del gen pal (c) y de un haplotipo del gen GapCP (d). Los símbolos representan las distintas islas (ver Figura 2).

La sequía parece haber sido un agente selectivo importante para el pino canario. Si bien,

el gradiente de aridez actual de las islas se superpone con la edad de emergencia de las

mismas y su posterior colonización por el pino canario: las islas orientales son las más

antiguas y también las más áridas. De hecho hay evidencias de la presencia de pino canario en

Fuerteventura y Lanzarote en épocas pasadas (CLIMENT ET AL., 1996). La superposición

de clima y antigüedad de las poblaciones podría ocasionar que parte de las correlaciones

encontradas entre clima y diversidad genética estuvieran sobrestimadas debido a procesos de

diferenciación neutral. Aunque tenemos que tener en cuenta estas posibles correlaciones

espurias, se ha demostrado que los métodos basados en las relaciones entre datos genéticos y

ambientales son prometedores ya que permiten el estudio de las adaptaciones y procesos

específicos de una determinada especie al ambiente en el que habita utilizando las frecuencias

alélicas o la estructura genética de sus poblaciones (JOOST ET AL., 2008). Estos métodos de

correlación son además mucho más atractivos que los métodos basados en la detección de

outliers (como en EVENO ET AL., 2008) ya que evidencian factores de selección

particulares y permiten trabajar con hipótesis más concretas basándose en variables

ambientales determinadas.

a b

c d

13/17

El análisis de correlación entre la localización y las variables ambientales con los

valores fenotípicos medidos en los ensayos de procedencias reveló una fuerte correlación

entre el gradiente de aridez y la supervivencia en los dos ensayos más secos, Fasnia (r= 0.75)

y Tirajana (r = 0.57), así como con la altura y la resistencia a la cavitación en esta última

parcela (r = 0.65) (Figura 4). Las poblaciones que se asientan en terrenos más secos presentan

evidencias de adaptación local y sobreviven y crecen más en estos ambientes que las que

habitan en las laderas de exposición norte de las islas, con condiciones mucho más húmedas y

suelos más desarrollados. Parte de esta adaptación local podría deberse a una mayor

resistencia a la cavitación. Las poblaciones más xéricas soportarían diferencias de potencial

hídrico entre suelo y copa mucho mayores que las húmedas sin perder conductividad

hidráulica, y por tanto podrían seguir realizando fotosíntesis aún en condiciones de cierto

déficit hídrico.

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6

Su

pe

rviv

en

cia

Tira

jana

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6

Su

pe

rviv

en

cia

Fa

sn

ia

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Factor 1 (Aridez)

-6 -4 -2 0 2 4 6

Altu

ra T

ira

jana

40

50

60

70

80

CCoAOMT_2

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Su

pe

rviv

en

cia

Tira

jana

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Figura 4. Correlaciones entre el índice de aridez obtenido mediante el análisis de componentes principales de 21

variables climáticas (ver material y métodos), la supervivencia en los dos ensayos de procedencias más secos, Tirajana (a) y

Fasnia (b) y la altura en Tirajana (c). Correlación entre las frecuencias haplotípicas del gen CCoAOMT_2 y la

supervivencia en Tirajana. Los símbolos representan las distintas islas (ver Figura 2).

a b

c d

14/17

4.3. Genes candidatos asociados a la eficiencia hidráulica y la resistencia a la cavitación

Los resultados de los test de Mantel para los genes CCoAOMT y cad revelaron que el

primero está correlacionado con los valores de P50 (r = 0,587; p<0,05) y diámetro basal (r =

0,509; p<0,05), mientras que el segundo se relaciona con la conductividad específica foliar, Kl

(0,433; p<0,05). Estudios anteriores con los genes CCoAOMT y lp3-3 han indicado que

podrían estar implicados en la resistencia a la sequía en P. pinaster (EVENO ET AL., 2008) y

P. halepensis (GRIVET ET AL., 2011). Nuestros resultados apuntan a la implicación del

primero, descrito en procesos de formación de la pared secundaria celular, en la resistencia a

la cavitación del sistema hidráulico de la planta y en el crecimiento diametral. El gen cad, que

se expresa en tejidos que están llevando a cabo de forma activa procesos de lignificación

(GRIMA-PETTENATI ET AL., 1993) y podría ser un gen candidato relacionado con la

conducción de agua a través de la planta. Tenemos que señalar que los test de neutralidad

realizados, tanto con el CCoAOMT como con el cad, no evidenciaron ninguna desviación de

la misma a pesar de las correlaciones encontradas con procesos fisiológicos. Esto podría

indicar que no son los genes bajo selección pero podrían estar ligados a genes que sí han

sufrido procesos selectivos. El siguiente paso para confirmar el papel de estos genes

candidatos en la resistencia a la sequía, sería el estudio de la expresión de los mismos en

plantas sometidas a déficit hídrico.

5. Conclusiones

Las dos aproximaciones utilizadas en este trabajo para distinguir procesos selectivos

asociados a variables climáticas indican que la sequía parece haber sido un fuerte agente de

selección natural en el pino canario. A pesar del elevado flujo genético entre sus poblaciones,

hemos detectado selección divergente sobre caracteres relacionados con la resistencia a la

cavitación. Se han detectado clinas ambientales en la diversidad de tres genes candidatos y

además dos de ellos CCoAOMT y cad han sido identificados como potenciales genes

candidatos en la resistencia a la cavitación y la eficiencia hidráulica de la planta.

6. Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Gobierno de las Islas Canarias, a los Cabildos de Gran

Canaria y Tenerife y al Parque Nacional de Taburiente por su apoyo y colaboración durante

tantos años de estudio del pino canario. Gracias también a toda la gente involucrada en el

establecimiento, cuidado y mediciones de los ensayos de procedencias, así como a Christian

Bodet y Pierre Conchon por su ayuda con el Cavitron. Este estudio ha sido financiado por el

Ministerio de Ciencia e Innovación a través del proyecto VULCAN (AGL2009-10606).

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