Producción de pectinasas por Aspergillus niger a partir de cáscaras de naranja y de toronja como fuente de carbono

Aline M. Beltrán V.*, Carmen Larrondo S.*, Mauricio S. Ramírez B.*,

Aseneth Ruiz C.*, Luis M. Salgado R.*

*Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, Calz. Del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Del. Coyoacán, México Distrito Federal.

Resumen: Se realizó un estudio comparativo de la producción de pectinasas por Aspergillus niger a partir de pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja utilizada como fuente de carbono, debido a la importancia que tienen estas enzimas en diversos campos de la industria. Se cuantificó la producción de proteínas por el método de Lowry y se determinaron los azucares reductores por el método de Miller; posteriormente se determinó la actividad enzimática para comparar la producción de pectinasas en las diferentes fuentes de carbono. De acuerdo con los datos obtenidos concluimos que la pectina extraída de la cáscara de naranja induce una mayor producción de pectinasas por Aspergillus niger.

Abstract: We conducted a comparative study for the production of pectinases by Aspergillus niger from pectin extracted from orange peel and grapefruit used as carbon source, because of the importance of this enzymes for many industries. We quantified the production of proteins by the Lowry method and reducing sugars were determined by the method of Miller, later determined to compare the enzymatic activity of pectinases production in different carbon sources. According to the data obtained, we conclude that pectin extracted from orange peel induces higher production of pectinases by Aspergillus niger.

1. Introducción

La palabra pectina viene del nombre griego pectos que significa solidificado o coagulado. En 1790 Vauquelin descubrió la pectina como una sustancia soluble presente en los zumos de fruta, pero no fue hasta 1824 cuando Braconnot, quien continuó el trabajo de Vauquelin, llamó a esta sustancia ácido péctico, ya que tenía propiedades gelificantes cuando se le añadía ácido a la solución.1

Actualmente se sabe que la pectina es una mezcla amplia de

sustancias pécticas de diferente composición que contiene como componente principal ácido pectínico. La pectina en forma natural se localiza en la pared celular y puede estar entrecruzada con otros polisacáridos estructurales y proteínas para formar protopectina insoluble.1

El componente más abundante

de las pectinas es el ácido galacturónico, que forma el esqueleto principal de la molécula consistente en una cadena de residuos de ácido D-galacturónico unidos mediante enlaces

α - (1 – 4). Estos residuos pueden estar parcialmente metilados, esterificados en el C-6 con alcohol metílico, siendo el grado de metilación variable según el origen de la pectina. La pectina también contiene con frecuencia residuos de ramnosa, arabinosa y galactosa. Generalmente la ramnosa forma parte de la cadena principal, mientras que la arabinosa y la galactosa se encuentran en las cadenas laterales unidas a la cadena principal formando ramificaciones.1

Estas pectinas son ingredientes

muy importantes en la industria de los alimentos para hacer gelatinas, helados, salsas, queso. También se emplean en otras industrias, como la farmacéutica, que requieren modificar la viscosidad de sus productos, y en la industria de los plásticos, así como en la fabricación de productos es-pumantes, como agente de clarificación y aglutinante.2

La degradación de este polímero

requiere la intervención de un sistema pectinolítico compuesto por varias enzimas distribuidas en tres grupos principalmente: pectinesterasas las cuales catalizan la desesterificación de los grupos metoxilo, pectina despolimerasas que rompen los enlaces α – (1 – 4) glucosídicos por hidrólisis (polimetilgalacturonasas y poligalactu-ronasas) o transeliminación (pectina y pectato liasas), reacciones que catalizan el rompimiento de la molécula.3

Las pectinasas actúan de

manera sinérgica y secuencial, son secretadas en grandes cantidades por hongos filamentosos, de los que destacan los del género Aspergillus.

Tanto la actividad como los mecanismos que controlan su síntesis y su secreción están bajo la influencia de diversos factores ambientales, tales como el pH del medio, la temperatura de incubación y la naturaleza y cantidad de la fuente de carbono.4

Las pectinasas figuran entre las

enzimas de aplicación industrial más antiguas; pueden clasificarse en dos grandes grupos: ácidas y alcalinas. Las pectinasas ácidas son utilizadas en la industria de zumos de fruta y en la fabricación de vinos. Son mayoritariamente poligalacturonasas de origen fúngico, especialmente de A. niger. Las pectinasas alcalinas se han introducido en diversos procesos industriales, como el textil, principalmente en el enriado de lino y en el procesado de fibras de plantas. Las enzimas que se utilizan en estos sectores proceden mayoritariamente de bacterias, destacando entre ellas las producidas por Bacillus.1

El objetivo de este trabajo es

producir pectinasas por Aspergillus niger a partir de pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja utilizada como fuente de carbono.

2. Material y métodos 2.1 Preparación de la muestra Se pesaron 50 g de albedo de naranja y 50 g de albedo de toronja. Se realizó una extracción ácida de pectina a cada muestra agregando agua destilada en ebullición hasta hidratarla, además de HCl 6N hasta alcanzar un pH de 2 y se hirvió durante 15 min. Se filtró y con el residuo se repitió el proceso 2 veces más y por último se lavó con agua a

ebullición. Finalmente se agregó un volumen de etanol equivalente al volumen total de los filtrados anteriores, dejando reposar 2h para precipitar la pectina. La pectina resultante se filtró y se secó a 40°C.*5 2.2 Cuantificación de esporas en el inóculo 2.2.1 Extracción de las esporas de un medio sólido Se agregó solución salina y perlas de vidrio a la caja de Petri que contenía las esporas y se agitó suavemente hasta suspender las esporas. Se tomó 1 mL de esta suspensión y se llevó a cuenta directa. 2.2.2 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer La muestra se homogenizó por medio de agitación y se colocó con una jeringa estéril entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara y se observó al microscopio con el objetivo de 10x localizando la zona cuadriculada y se contaron las esporas presentes en dicha cuadrícula con ayuda de un cuentacolonias.6 Por último, ya teniendo la concentración de esporas en la solución, se realizó una dilución 2:100 para que el tamaño del inóculo fuera el conveniente (106 esporas/mL). 2.3 Fermentación Se prepararon 100 mL de medio de cultivo basal para cada muestra de pectina (pectina comercial, extracto de albedo de naranja y extracto de albedo de toronja) cuya composición fue la siguiente: 2 g/L de K2HPO4, 2 g/L de

KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 10 g/L de la fuente de carbono correspondiente. Posteriormente se inoculó con 1 mL de la suspensión de esporas cada uno de los matraces y se incubaron a 37°C con agitación de 250 rpm durante 72 h*7, tomando muestras de 6 mL de cada cultivo cada 24 h, las cuales se centrifugaron a 4500 rpm durante 10 min y el sobrenadante se guardó en refrigeración para realizar pruebas posteriores. 2.4 Determinación de azúcares reductores Para determinar azúcares reductores en las muestras del cultivo de fermentación se realizó previamente una curva estándar de azúcares la cual contempló concentraciones de 0 µg hasta 1000 µg de glucosa por mL y se le determinaron azúcares reductores utilizando el método de Miller8; posteriormente se utilizó el mismo método para determinar los azúcares reductores presentes en el sobre-nadante de las muestras problema. 2.5 Determinación de proteínas La cuantificación de proteínas se tomó en cuenta para evaluar la producción de enzimas pectinolíticas. Esto se llevo a cabo utilizando el método de Lowry9, para lo cual fue necesario realizar una curva estándar de albúmina cuyo rango de concentración fue desde 0 µg hasta 100 µg por mL, después se aplicó el método de Lowry para determinar proteínas en el sobrenadante de las muestras problema.

2.6 Determinación de la actividad enzimática Se prepararon dos muestras de: blanco problema (0.5 ml de extracto enzimático, 0.5 ml de buffer de acetatos al 0.1M y 0.5 ml de solución al 0.9% de pectina), blanco enzima (0.5 ml de medio, 0.5 ml de buffer de acetatos al 0.1M y 0.5 ml de solución al 0.9% de pectina), blanco sustrato (0.5 ml de extracto enzimático, 0.5 ml de buffer de acetatos al 0.1M y 0.5 ml de agua); Posteriormente uno de cada uno de los blancos se incubó durante 30 minutos a 45°C y los otros se refrigeraron. Después se determinaron los azucares reductores liberados por el método de DNS. *La actividad exopectinasas se expresa como mg de azúcares reductores liberados/mL de extracto.

3. Resultados y discusión 3.1 Curva estándar de azúcares reductores. Con la curva estándar se obtuvo la ecuación de la recta, con la cual se determinó la concentración de azúcares reductores en cada muestra problema.

3.2 Curva estándar de proteínas

La ecuación obtenida a partir de esta curva estándar se utilizó para calcular la cantidad de proteínas presentes en las muestras problema. 3.3 Pectina En las gráficas se observa que en las primeras 24 horas el microorganismo produjo enzimas suficientes para degradar el sustrato. Después de 48 horas se observa un consumo importante de azúcares reductores, por lo cual el microorganismo produjo proteínas necesarias para seguir degradando la pectina.

3.4 Toronja

Analizando las gráficas, en un principio el microorganismo produjo las enzimas necesarias para empezar a degradar el sustrato, por lo que se observa un aumento en la concentración de azúcares reductores. A las 48 horas consumió gran parte del sustrato, por esto, produjo más enzimas en busca de metabolizar otra fuente de energía, sin embargo entre las 24 y 48 horas es probable que el sustrato se haya terminado, por lo que la producción de proteínas bajó drásticamente.

3.5 Naranja

Como se observa en las gráficas, durante las primeras 24 horas el microorganismo aparentemente utilizó azúcares reductores presentes en el extracto obtenido que fueron más accesibles que la pectina; a partir de las 48 horas esta primera fuente de carbono se agotó y empezó a consumir la pectina extraída de la naranja, es por esto que se observa un incremento en la producción de proteínas y azúcares reductores. 3.6 Actividad enzimática

Al tomar la pectina como nuestra fuente de carbono de referencia, se observa que el extracto de naranja indujo una actividad enzimática semejante a ésta; mientras que en el extracto de toronja es menor.

4. Conclusiones Es posible que Aspergillus niger

produzca pectinasas utilizando

como fuente de carbono pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja.

La pectina extraída de la cáscara de naranja induce una mayor actividad enzimática que la extraída de la cáscara de toronja.

Referencias

1. Soriano M. 2004. Análisis de sistemas pectinolíticos bacterianos. Aislamiento y caracterización de las pectinasas. Pela de Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de Bacillus subtillis. Facultad de Biología. Departamento de Microbiología. Universidad de Barcelona. España. pp. 8-40.

2. Devia J. 2003. Proceso para producir pectinas cítricas. Universidad EAFIT. Medellín, Colombia. pp. 22.

3. Trigui-Lahiani H., Gargouri A. 2006. Cloning, genomic organization and mRNA expression of a pectin lyase gene from a mutant strain of Penicillium occitanis. Gene Section Functional Genomics. pp.: 54.

4. Arreguín-Rangel L., García-Rivero M., Pérez-Vargas J., Martínez-Trujillo M. y Aguilar-Osorio G. 2007. Aprovechamiento de residuos de frutas en la producción de pectinasas y ramnogalacturonasas por dos cepas autóctonas de Aspergillus. Laboratorio de Catálisis Enzimática. Postgrado de Ingeniería Bioquímica. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. México. pp.: 1.

5. Devia J. 2003. Proceso para producir pectinas cítricas. Universidad EAFIT. Medellín, Colombia. pp. 24.

6. Aquiahuatl-Ramos M., Pérez-Chabela M., 2004. Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general. Departamento de biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. México. pp.67

7. Arreguín-Rangel, L., García-Rivero, M., Pérez-Vargas, J., Martínez-Trujillo, M.A. y Aguilar-Osorio, G. 2007. Aprovechamiento de residuos de frutas en la producción de pectinasas y ramnoglacturonasas por 2 cepas autóctonas de Aspergillus. Laboratorio de catálisis enzimática. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. México.

8. Miller, G.L. (1959). Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 31: 426-428.

9. Lowry OH, Rosebrough NL, Farr AL y Randall RJ (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal Biological Chemistry 193: 265-273