articulo dengue infectologia

8/6/2019 Articulo Dengue Infectologia

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DIAGNÓSTICO DEL DENGUE, LOS AVANCES Y DESAFÍOS

Departamento de Virología, la OPS / OMS para Enfermedades Virales, 'Pedro Kour''T ropicalInstituto de Medicina, Autopista Novia del Mediod'a, Km. 6, Ciudad Habana, Cuba

Recibido 17 de julio 2002, recibido en forma revisada 10 de marzo 2003; aceptado 12 de marzo2003

Editor correspondiente: Jane Zuckerman, Londres, Reino Unido

Palabras claves:Dengue;Dengue hemorrágicofiebre;Diagnóstico

Resumen

El diagnóstico del dengue fue uno de los temas debatidos en el simposio «ElLa amenaza mundial del dengue - Buscando desesperadamente soluciones ", organizada duranteel 10 Congreso Internacional de Enfermedades Infecciosas, celebrada en Singapur en 2002. Eneste trabajo, se presenta una revisión se centra en los principales avances, problemas y desafíosdel diagnóstico del dengue.

IgM capture ELISA, aislamiento del virus en líneas celulares de mosquitos y los mosquitos viven, eldengue anticuerpos monoclonales específicos y PCR han representado importantes avances en eldengue diagnóstico. Sin embargo, un adecuado método rápido de diagnóstico precoz y accesibleútil tanto para la vigilancia epidemiológica y de diagnóstico clínico sigue siendo necesario. Por otraparte, herramientas que sugieren un pronóstico que permite una mejor gestión también son

necesarias. Por último, infraestructura de laboratorios, conocimientos técnicos y la capacidad deinvestigación debe ser la mejora en los países endémicos con el fin de influir positivamente en lavigilancia del dengue, manejo de casos clínicos y el desarrollo de nuevos enfoques de lucha contrael dengue.

El propio título del simposio "La Global Amenaza de dengue-Buscando desesperadamentesoluciones organizado durante el 10 º Congreso Internacional de Enfermedades Infecciosas enSingapur en 2002, pone de relieve los efectos devastadores de la fiebre del dengue (FD) y denguehemorrágico / síndrome de choque por dengue (DH / SCD), así nuestra actual incapacidad decontrolar y evitar esta enfermedad. Hoy en día, DF y DH / SCD se consideran los másimportantes enfermedades virales transmitidas por artrópodos en términos de la morbilidad y lamortalidad. Más de 2,5 mil millones personas están en riesgo de infección y más de 100 paíseshan transmisión del dengue endémico. DHha sido reportado en 60 de ellas.

La carga de la enfermedad de dengue hemorrágico y el DF no está muy biendocumentado, sin embargo sólo en 1998, más de 1,2millones de casos fueron reportados a la Organización Mundial, con el sudeste de Asia, el oeste dePacifico y, más recientemente, las Américas es el más



regions.2 afectados, La emergencia y re-emergencia de dengue puedeatribuirse a una serie de causas subyacentes.Estos incluyen los cambios demográficos y sociales como el crecimiento demográfico y urbano noplanificado zación, lo que puede dar lugar a grandes, llena humanos poblaciones que viven encentros urbanos con sustancial estándar de vivienda y aguas inadecuadas, aguas residuales ysistemas de gestión de residuos. Cuando estos factores se combinan con un mayor movimiento de

individuos a las de las zonas endémicas, el deterioro de efectividad de medidas el control demosquitos, y la finalidad limitada financiera y los recursos humanos dedicados a la publicidad de lainfraestructura de salud, el dengue puede poner un pieen el población.4-6 infecciones por el virusdel dengue puede ser asintomático, o puede dar lugar a fiebre indiferenciada, DF o DH / DSS.días. Los bebés y niños pequeños generalmente se desarrollan una enfermedad febrilindiferenciada que se puede acompañada de una erupción maculopapular. Mayores chil63niños y adultos pueden desarrollar ya sea un febril leve síndrome de Down o la fiebre del dengueclásico, charac65 racterizado por fiebre, cefalea, mialgias, artralgias y erupción cutánea. Sinembargo, tres o cuatro días después de la inicio de la fiebre y, en general, cuando la fiebre baja,

Algunos pacientes presentan manifestaciones hemorrágicas (en por lo menos una prueba detorniquete positiva), trombocitopenia y hemoconcentración. También puede hepatomegalia se

observa. Los pacientes generalmente se recuperan después de fluidos y la terapia de electrolitos.En los casos graves, shock se observa, que se caracteriza por signos de circulación fallas (débil yrápido el pulso, hipotensión o nar75 de remo de la presión del pulso, piel fría y pegajosa yagitación). El shock es seguido de muerte en 5-10% de los casos si la rehidratación es insuficienteo de78 mpuesto. extravasación de plasma es la principal característica de DHF/DSS.7-10 Ambossíndromes, DF y DH / SCD, causados son por cualquiera de los cuatro serotipos del dengue quebe82tiempo a la familia Flaviviridae.

Los virus del dengueson esféricos, los virus con envoltura de lípidos que contienenuna cadena positiva genoma de ARN de aproximadamente

10 200 nucleótidos que codifican tres estructurales pro86proteínas (cápside, membrana y envoltura) y sieteproteínas no estructurales (NS1, NS2a, NS2b, NS3,NS4a, NS4b, NS5). La proteína de envoltura (E) juegaun papel clave en varios procesos importantes includ90

ción la unión al receptor, la sangre de hemaglutinación de células,inducción de una respuesta inmune protectora, mem92

brana y la fusión de virus assembly.11, 12En la actualidad, la infección secundaria por un dengue diferentes

Serotipo 94 es considerado el más importante individ95factor de riesgo para la UAL DHF/DSS.13-15 La presencia de96 que circulan no neutralizantes, una reacción cruzada anti97

órganos en un individuo previamente inmunológico permitemejora de la infección, favoreciendo el aumento deentrada del virus en la célula diana a través dede la celda Fc receptor.16 Parece que las respuestas de células Ttambién desempeñan un papel importante en la patogénesis de la

la enfermedad grave. Ambos CD4 + y CD8 + T-se han detectado en personas naturalmente inmunizadosy citotóxicos CD4 + específicas del dengue de células T clones



han demostrado tener tanto serotipo específico yespecificidades de reacción cruzada de serotipo. En este modelo,infección previa con el serotipo de dengue una re108

resulta en la presencia en la serie de reactividad cruzadaanticuerpos y células T de memoria. Una vez infectado por unserotipos diferentes, complejos de anticuerpos para el virus de plomo a la activación del

complemento y mejora las infecciones 111-ción de las células monocítica. Los ataques contra el dengue 112monocítica células infectadas por virus por las células T 113 resultadosen la liberación de citoquinas, lisis de las células, y 114la liberación de enzimas intracelulares y activa 115-tores, dando lugar a fugas de plasma y 116 posterioresshock.17, 18 117Recientemente, Mongkolsapaya et al., Han reportado 118la presencia de muchos T específicas de dengue-las células de 119baja afinidad por el virus infectante y de mayor parafina 120-dad para los demás. Ellos sugieren que una profunda 121

la activación de células T y la muerte puede contribuir a los 122trastornos sistémicos observados durante el dengue hemorrágico. Se 123También proponemos que el pecado original antigénico en los 124 Trespuestas de las células puede suprimir o retrasar viral eli-125mination.19 126La patogénesis del DH / SCD no está muy bien de las Naciones Unidas-127derse ni las condiciones de acogida que favorezcan el 128enfermedad grave, sin embargo, los niños, las mujeres, indi-129individuos con enfermedades crónicas como el asma y 130diabetes, y los blancos parecen estar en mayor riesgo. 131Por último, los informes recientes sostienen el riesgo de DH / SCD es de 132mayor si el intervalo es mayor entre la enseñanza primaria y 133

secundario del dengue infection.12-23 134Entre los numerosos temas tratados en el simposio 135fueron los nuevos avances y desafíos en el área 136de diagnóstico de dengue. 137

Aplicaciones e implicaciones de dengue 138diagnóstico

El diagnóstico preciso y eficiente del dengue es im-140portante para el cuidado clínico, apoyar la vigilancia, 141

estudios de la patogénesis y la investigación de vacunas. Diag-142nóstico es también importante para la confirmación de casos (143 DFo DH / SCD), para diferenciar el dengue de otros 144enfermedades como la leptospirosis, la rubéola y otras 145infecciones por flavivirus, y por la clínica el hombre-146gestión y evaluación de los pacientes con graves 147disease.24, 25 148En conjunto con clínicas y epidemiológicas de 149



vigilancia, la detección precoz de dengue circu-150ción o un aumento en la actividad del dengue ofrece a 151las autoridades de salud información útil sobre el tiempo, loca-152ción, el serotipo del virus y la enfermedad severity.7 El uso 153de dengue buenas herramientas de diagnóstico es fundamental para labo-154de confirmación en el laboratorio los DH / SCD, incluido el número-155

mero de muertes caso, determinar qué cepas son 156involucrados, y para derivar estimaciones de la incidencia total de 157siguientes epidemics.7 ,26-31 158Por último, el diagnóstico del dengue es de gran importancia 159para la investigación de acogida, virus y vectores carac-160tics, para determinar las condiciones epidemiológicas 161que influyen en la patogénesis de la enfermedad, y para 162la evaluación de vacunas (fase 1-3 estudios) .

Los protocolos actuales para el diagnóstico deinfecciones por dengue

165 el diagnóstico del dengue se podría realizar a través de166 de aislamiento del virus, genoma y la detección de antígenos y167 pruebas serológicas. La serología es actualmente la más168 aplica extensamente en el diagnóstico de rutina. Por supuesto,169 clínicas, geográficas y datos epidemiológicos170 asociados con el paciente permanezca crítica consid171ciones cuando se evalúa un resultado de laboratorio.

Diagnóstico serológico

173 Dengue infección en un huésped no inmune previamente174 produce una respuesta primaria de anticuerpos char175teriza por un lento y bajo título de anticuerpos re176sponse. IgMantibody es la primera inmunoglobulina177 isotipo a aparecer. IgG anti-dengue aparece en un178 títulos bajos al final de la primera semana de la enfermedad179 inicio, y se incrementa lentamente. Por el contrario, durante un180 infección secundaria (infección del dengue en un previ181ously flavivirus del dengue o inmune del huésped), el anticuerpo182 títulos de lugar con gran rapidez y el anticuerpo reacciona

183 líneas generales, con muchas flaviviruses.36 Los altos niveles de IgG184 son detectables incluso en la fase aguda y185 aumenten drásticamente durante las dos semanas siguientes.186 La cinética de la IgMresponse son más variadas,187 que aparecen tarde durante la fase febril de la enfermedad,188 a menudo precedida por IgG. Algunos anti-dengue IgMfalse189 reacciones negativas se observan en la enseñanza secundaria in190fecciones. Según Panamericana de la Salud Orga191



nización (OPS) directrices, 7 días por cinco de la enfermedad,192 80% de los casos han IgMantibody detectables, y por 193 días seis a diez, 93-99% de los casos han detectable194 IgMthat pueden persistir por más de 90 días.195 IgMdetection de Lucha contra el dengue por medio ligado a enzimas196 inmunoensayo (ELISA) representa uno de los

197 avances más importantes y se ha convertido en un in198herramienta valiosa para el diagnóstico del dengue rutina. Specif199camente, MAC-ELISA (ELISA de captura de anticuerpos IgM) di200nostico se basa en la detección de IgM específica de dengue anticuerpos en el suero problemamediante la captura de ellos nos-201ción IgMantibody anti-humana antes de la envolvente en un 202sólidos phase.37-39 En general, el 10% de falsos negativos y 2031,7% de reacciones positivas falsas se han observado. 204Diferentes formatos, tales como ELISA de captura, la captura de 205ultramicroELISA, dot-ELISA, AuBioDOT IgMcapture 206varilla de medición y se han developed.37 40-43 en suero, 207

sangre en papel filtro, 7,44,45 y más recientemente la saliva 208útiles para IgMdetection si las muestras se toman 209dentro del marco de tiempo apropiado (después de cinco días 210de aparición de la fiebre). Diferentes comerciales kits46-53 211para anti-dengue IgMand detección de IgG están disponibles, 212con cifras variables de sensibilidad y especificidad 213(Ver Tabla 1). 214En un caso sospechoso de dengue, la presencia 215de IgMantibody anti-dengue reciente sugiere-216perfección. IgMdetection no es útil para el dengue 217serotipo debido a la reactividad cruzada determinación 218del anticuerpo mantuvo aún durante la primaria en-219

perfección. En una serie de muestras de suero de dengue 220pacientes en Nicaragua, Panamá y Costa Rica, 221un serotipo específico IgMresponse se observó en 222sólo el 15% y 16% de casos de dengue hemorrágico y el DF, respectivamente, 223y en 17% y el 14% de la primaria y secundaria 224casos (Guzmán MG, datos no publicados). Dengue 225IgMantibodies también una reacción cruzada en cierta medida, con 226otros flavivirus, como la encefalitis japonesa 227y encefalitis de San Luis y amarillo fever.54, 55 228En un intento de cuantificar IgMantibodies a AR-229boviruses de importancia médica a partir de tres virus de la 230

familias (Togaviridae, Flaviviridae y Bunyaviri 231-dae), algunos investigadores han utilizado una norma-232Ized combinado MAC-ELISA usando virus prototipo, 233bien caracterizado sueros de humanos y, en general 234monoclonales conjugados reactiva grupo-anticuerpo. 235Este sistema ha dado lugar a un buen enfoque para 236la detección rápida de muestras de suero humano para diversos 237arboviruses.56 238



Clínicamente, la seroconversión de diagnóstico se define 239como un aumento de cuatro veces (o caída) de los anticuerpos en 240 paressuero por inhibición de la hemaglutinación (HI), comple ción de fijación (CF), la neutralización dereducción de placas242 técnica (PRNT) o ELISA.7, 24,25,57,58 Debido a la243 la presencia de antígenos de reacción cruzada compartida por fla244la mayoría de viviruses, diagnóstico específico no es posible en245 casos. Cuando el diagnóstico serológico específico es re246quired, PRNT se utiliza, ya que este ensayo es el más247 herramienta específica para la determinación serológica de248 de dengue antibodies.59249 Con el fin de determinar la presencia y cantidad250 de dengue-anticuerpos neutralizantes, varios proto251cols han desarrollado; Vero y las líneas de células BHK21252 y carboximetilcelulosa (CMC) y agarosa

253 son de uso frecuente, mientras que algunos investigadores utilizan254 peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) staining.60-64 Cur255rently, algunos laboratorios utilizan PRNT en sus estudios.256 A fin de aplicar PRNT, Shu et al. en257 2002 estandarizados una NS1 indi258 serotipo específicorect ELISA para diferenciar primaria y secundaria259 infecciones por el virus del dengue y obtuvo una buena cor260relación entre IgG anti-NS1 serotipo específico261 (determinado por ELISA) y PRNT results.65, 66 A262 el contrario, Cardoso et al., 2002, demostró que263 la respuesta de IgG contra la proteína premembrane264 era específico de flavivirus. No hay reacción cruzada fue

observó cuando los sueros fueron sometidos a pruebas de 265 personas266 infectados con el virus del dengue o japonés encephali267tis virus. Estos autores recomiendan el uso268 de la proteína de premembrane seroepidemiológica269 studies.67270 HI es la aceptada technique68 serológicas how271nunca, ya que lleva mucho tiempo, se ha convertido en ELISA272 la técnica más utilizada para las pruebas serológicas



273 estudios.274 ELISA para la detección de IgG anti-dengue es actualmente275 utilizado para la clasificación de casos basados en el tipo276 de la infección, primaria o secundaria. Algunos protocolos277 diluciones de suero para uso título de IgG anti-dengue. En oth278res, una proporción de IgM / IgG superior a 1,78 es consid279

rarse un marcador de la infección primaria, y menos se con280considerado un marcador de secundaria infection.38 ,69-72281 relativamente poco tiempo, algunos investigadores han282 demostrado la utilidad de IgA anti-dengue de283protección como un indicador de infección reciente. Talarmin284 et al. determinó la presencia de anticuerpos anti-dengue285 IgMand anticuerpos IgA en 178 sueros de pacientes286 con DF.74 cifras del 100% de sensibilidad y speci287ficity se obtuvieron. anticuerpos IgA se detectaron288 al día seis después de la aparición de la fiebre hasta el día289 25. En promedio, se detectaron en IgMantibodies

290 días 3,8 y 4,6 días y la IgA. Por otra parte,291 Groen et al.75 sugieren también el valor diagnóstico de292 IgA sérica de detección utilizando una inmunofluorescencia293 ensayo (IFA), sin embargo, un mayor porcentaje de IgA294 de detección se observó en las muestras de suero de fase aguda295 de los casos secundarios (62%) en comparación con pri296mary casos (17%). Se obtuvieron resultados similares por Balmaseda et al. cuando se aplica unmétodo de ELISA 297a la detección de IgA anti-dengue en El sera.76 298Por otra parte, Koraka et al. observaron significativamente 299niveles más altos de IgE específica del virus del dengue en el suero 300de DH / SCD, que en los casos DF y no pa 301-dengue

pacientes. La medición de estos anticuerpos es 302propuesto como un pronóstico marker.77 303

Detección de virus 304

viremia del dengue es corto, se observa generalmente de dos a 305tres días antes del inicio de la fiebre y dura cuatro 306a cinco días después. Por lo tanto, las muestras para el virus de iso-307mento deben ser tomadas en los primeros cuatro a cinco días de 308la enfermedad. 309

El suero es la muestra de elección para la rutina de diag-310tico, sin embargo el virus del dengue también puede ser detectado 311en el plasma, los leucocitos y en los tejidos obtenidos en 312la autopsia como el hígado, el bazo, los ganglios linfáticos, pulmón, 313thymus.26 ,78-81 Debido a que el virus del dengue es lábil al calor, 314manejo adecuado de las muestras y del sistema 315la entrega al laboratorio se requiere para el éxito de 316aislamiento del virus. Para el almacenamiento a corto plazo, las muestras de 317



podrán mantenerse a 4 C, sin embargo por más tiempo de almacenamiento de baja 318Se recomiendan temperaturas (-70 C). 319la inoculación de mosquitos es el sistema más sensible 320Para aislar el virus del dengue y de adultos y larvas 321los mosquitos pueden ser utilizados. En general, Toxorhynchites 322los mosquitos son preferibles debido a su gran 323

tamaño y porque no son hematófagos. 324El macho adulto es el Aedes aegypti y Aedes albopictus 325los mosquitos también son útiles para el virus de isolation.82-86 326la inoculación de mosquitos para detectar el dengue es también 327útil en el control de la calidad de las vacunas. Jirakan-328

Al janakit et. inoculados Toxorhynchites splendens 329con la tetravalente vacuna viva atenuada 330 de denguey demostró que no existan interferencias entre los 331serotipos se produjo en 332 infectados mosquitoes.87Debido a la habilidad técnica y amoldadas a 333-entretenimiento necesarios para la inoculación de mosquitos directa, 334

cultivo de células es preferible para el diagnóstico de rutina, de-335Pese a la mayor sensibilidad de los métodos que emplean 336los mosquitos. Estaba claro desde los primeros informes de 337su uso que las culturas de células de mosquitos eran ideales para 338aislamiento del virus del dengue. Diferentes líneas celulares y 339clones se han estudiado, sin embargo, una línea celular cul-340rado de Aedes albopictus (C6/36) se ha convertido en 341la célula huésped de elección para la rutina del virus del dengue isola-342ción, aunque la línea celular de Aedes pseudoscutellaris 343

AP61 también ha tenido éxito used.88-96 344Rodríguez et al.97 utilizó una rápida centrifugación 345técnica para aislar el virus del dengue cultivadas en 346

células C6/36 y obtuvo un 16,6% más de 347 aislamientoscon el método convencional. De aún más im-348tancia, este método fue útil para aislar los 349virus en muestras de tejido procedentes de 350 casos mortales de dengue.79 Estos autorescomunicaron la recov352cubrimiento de 42,8% de los aislamientos virales de estos tejidos353 muestras.354 cultivos celulares de mamíferos, como las células Vero, LL355CMK2 células y otros también han sido empleados con356 efficiency.24 menos, 25,98357 El más antiguo y menos sensible método de iso358

lando el virus es a través de la intracerebral inoc359mento de ratones lactantes, este sólo se utiliza cuando360 no hay otros métodos disponibles. Aunque muchos361 animales presentan síntomas o signos que indican EN362encefalitis, un gran número de animales que no presenten363 señales de illness.99, 100 en términos de aislamiento del virus,364 el uso de líneas celulares de mosquitos representa la más365 importante contribución al dengue diagnóstico.366 de identificación del virus se realiza por regla general us367



usando técnicas de inmunofluorescencia con serotype368anticuerpos monoclonales específicos anti-dengue en369 mosquitos squash cabeza, las células infectadas o en el cerebro tis370demanda de los ratones. Anticuerpos monoclonales específicos371 disponibles en la American Type Culture Collection372 y en la Organización Mundial de la Salud Colaboradores

373 centros han simplificado la identificación de estos374 virus. En general, las muestras se probó por primera vez por IFA375 utilizando un anticuerpo policlonal y los positivos376 se vuelva a probar con los cuatro serotipos específicos377 monoclonal antibodies.101-104 Algunas cepas no son378 identifica fácilmente porque de virus poco concentra379ción, por lo que algunos investigadores han recomendado380 uno o dos pasajes a través de un sistema de cultivo celular 381 con el fin de aumentar el virus concentration.104382 La citometría de flujo ha sido recientemente reportado como383 un método útil para la identificación de dengue 1. Se al384

mínimos que el virus sea identificado diez horas antes de lo385, donde un AMI anti-NS1 anticuerpos monoclonales son386 used.

Detección del antígeno

388 IFA y radioinmunoensayo (RIA) han detectado389 antígenos virales de dengue, sin embargo, la baja sensibilidad390 de estas pruebas no ha permitido su aplicación en391 de diagnóstico habitual purposes.79, 106392 En los últimos años, algunos sistemas han sido sensibles

estandarizadas 393 en un típico formato de ELISA. En 1995, Ma394lergue y Chungue aplicó un estreptavidina-biotina395 amplificada fluorogénicos ELISA para la detección y396 identificación de los antígenos de dengue 3 en el suero. Esta397 ELISA demostró una sensibilidad del 90% y la especificidad de398 98% con respecto al virus de la isolation.107 Más tarde, Kit399tigul et al. demostró que el antígeno del dengue400 se puede detectar con una frecuencia mayor en periph401ral las células mononucleares de sangre (CMSP) en comparación con402 sueros (53,8% frente al 18,9%). Estos investiga403res también hizo uso de un ELISA.108 biotina-estreptavidina404 Más recientemente, la atención se ha centrado en NS1 detección de antígenos. Young y sus

compañeros de trabajo estándar de 405-Ized una captura ELISA NS1 y demostraron los 406presencia de altos niveles de NS1 en la fase aguda 407suero de los pacientes que sufren de infecciones secundarias-408ción. Sugirieron que los de detección de antígeno NS1 409podría ser útil para el diagnóstico precoz y también como 410marcador de viremia.109 Resultados similares se obtuvieron 411por Alcon et al.110 Por último, Libraty et al., demonio-412



trado la eficacia de la detección NS1 como un pre-413Dictor de DH. NS1 los niveles en plasma correlacionan con 414los niveles de viremia, y fue mayor en pacientes de 415 DHen aquellos con DF.111 416Un producto comercial basado en dos pruebas ELISA para anti-417gen de detección (equipo azul) e identificación (equipo rojo) 418

También se ha producido recientemente. De acuerdo con los 419fabricante, la sensibilidad y la especificidad es del 84% 420y 89% para el kit de color azul y el 91% y 93% para el rojo 421Kit (Kit de GLOBIO Azul y Rojo para la detección del antígeno, 422GLOBIO Corp., Beverly, MA, EE.UU.). 423Inmunohistoquímica técnicas (utilizando horsera-424plato peroxidasa o etiquetas de la fosfatasa alcalina) 425han demostrado su utilidad para el dengue anti-426detección de generación en formalina-fijo incluido en parafina 427muestras de tejido, aunque esta tecnología no es 428ampliamente utilizado para el diagnóstico del dengue en zonas endémicas 429

countries.112-114 430

Genoma de detección de 431

En los últimos años, la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) 432se ha convertido en una herramienta importante para el diagnóstico de 433el dengue, para el laboratorio de detección incluyendo entomo-434vigilancia epidemiológica, y para epidemiológica molecular-435lógica studies.115 También ha demostrado su utilidad como una re-436herramienta de búsqueda en la patogénesis, medicamento antiviral, y 437-aspiradora

Los estudios de cine. 438amplificación del ADN es precedida por una marcha atrás 439reacción de transcripción, la producción de la DNA de los 440

ARN diana. El dengue se ha detectado ARN 441por PCR en suero, plasma, las células infectadas, en-442las larvas de mosquitos infectados, criaderos de mosquitos, frescos 443y los tejidos incluidos en parafina y fijados en formalina-444tissue.29 ,30,115-117 445Varios protocolos de PCR se han desarrollado, 446muchos de ellos aplicar una combinación de cuatro serotipo 447pares de oligonucleótidos específicos de imprimación en un solo re-448acción de un tubo o usar un flavivirus del dengue universal o 449

par de primers de oligonucleótidos seguido por un segundo-450amplificación ond con el serotipo específico oligonucleótidos-451tidos. Estos procedimientos también varían en la ge-452ubicación económica de los cebadores (E, NS1, E/NS1, PRM / E, 453NS5, NS5 / 3?) Y, en su especificidad y sensibilidad 454-dad. Algunos protocolos permiten la detección de menos de 45550-100 del virus del dengue pfu.118-135 En las Américas, 456el protocolo desarrollado por Lanciotti et al.112 cuenta con 457



sido ampliamente aplicada. Estos investigadores diseñaron cebadores consenso para C /prMgenes que amplifican un460 511 pares de bases del producto. En una segunda ronda de PCR, utilizando461 cartillas tipo específico, los productos de ADN de diferentes462 tamaños son amplificadas, permitiendo la diferenciación de463 serotipos. Las modificaciones a este protocolo, así como

464 nuevos protocolos también se han used.120, 125130134135465 Cuando se aplica correctamente, la PCR tiene notables ad466ventajas como herramienta para el diagnóstico del dengue. El uso de467 PCR permite la detección del dengue en almacenada sam468pios durante largos periodos. Alvarez et al136 y más tarde Sar469IOL y otros demostraron la AL29 virus dengue 2 en el suero470 y muestras de tejido de autopsia fromDHF / DSS casos que471 había sido almacenado por más de 15 años. Por otra parte,472 fueron capaces de clasificar a los aislamientos de genómica473 secuenciación. Por otra parte, diferentes autores han474 PCR aplicados a la vigilancia entomológica. Comida

475 et al., 1998 y Kow et al. en 2001137.138 identificados476 virus del dengue en Aedes aegypti y Aedes albopic477Tus piscinas mosquito durante una vigilancia de un año478 período en Singapur, lo que permite la aplicación de vec479tor medidas de control. Aedes aegypti infectados fueron480 detectado tan pronto como antes de las seis semanas, el recogni481ción de un brote de dengue en 1995 y 1996. Estos482 autores recomiendan este método como una de las primeras warn483ción del sistema para control de brotes de dengue.484 PCR también permite la detección de concurrentes in485fecciones por serotipos múltiples tanto en el suero sam486pios y en los aislados de cultivo de tejidos o de mosquitos

487-141 inoculation.139 Laille et al., 1991, pudieron488 para la detección de viremia doble por el dengue y el dengue 1 3489 en seis pacientes DF durante el 1989 Nueva Caledonia490 epidemic.139 Del mismo modo, Loroño-Pino et al. fueron capaces de491 para demostrar que el 5,5% de los 292 muestras probaron492 mostraron evidencia de infección por dengue concurrentes493 con dos o más serotypes.141494 Una de las aplicaciones más importantes de la PCR495 es el estudio de la variabilidad de las cepas genéticas con el fin de496 identificar el origen de epidemias y revelar mark497res de virulencia. En relación con el nucleótido la secuenciación o análisis de la enzima de

restricción, PCR 498ha permitido la clasificación de 499 serotipos de dengueen los genotipos (Cuadro 2) 0,142-150 Rico-Hesse y 500compañeros de trabajo han desarrollado un método para comparar 501dengue 2 genomas directamente de plasma del paciente. 502Encontraron algunos aminoácidos y nucleótidos 503cambios en el gen de la proteína E, así como dentro de los 504la región no traducida que pueden representar primaria 505determinantes de la DHF.151, 152 En otros estudios, Kuno 506



et al. estableció la relación genética entre los 507virus del género Flavivirus. Propusieron que los 508dos ramas de la evolución del virus de la puta-509ción ancestro - no-vector y el virus de transmisión vectorial 510agrupaciones - y desde el grupo surgido estos últimos 511transmitida por garrapatas y mosquitos transmitidas viruses.153 recientes 512

informes sugieren que dentro de la recombinación serotipo 513el virus del dengue occurs.154-157 Las consecuencias de la 514estos resultados no están bien definidos. 515Por último, los nuevos protocolos y metodologías PCR 516han aparecido que permiten la detección rápida y 517la cuantificación de ARN. En 1999, Laue et al. 518aplica un sistema totalmente automatizado de amplificación proto-519col (basado en el principio TaqMan) para medir 520

ADN específica del virus de amplificación. Este método 521demuestra una alta especificidad y sensibilidad, sino 522elimina la posibilidad de contaminación cruzada 523

y permite la detección de virus más load.158 524Recientemente, Callahan et al., 2001, aplicó un TaqMan 525RT / PCR para identificar los serotipos de dengue y 526grupos, presentación de informes una sensibilidad del 92,5% y 98,5% 527respectivamente, y una especificidad del 100%, cuando se com-528comparación con el aislamiento del virus en células C6/36. Los resultados fueron 529obtenidos en menos de dos hours.159 Wu et al., 2001, 530aplica una isoterma de ácido nucleico basada en la secuencia 531amplificación (NASBA) para amplificar el ensayo de cuatro 532serotipos del dengue utilizando un conjunto de cebadores universales 533y específicos de serotipo sondas de captura para escribir. 534El ácido nucleico se amplificó sin termociclado 535

y el producto fue detectado por la sonda de hibridación- mediante electroquimioluminiscencia.

mostró una sensibilidad del 98,5% y una especificidad538 de 100% en comparación con el aislamiento viral de539 de la celda C6/36 line.160 Más recientemente, un biosensor 540 ha sido añadido a la técnica NASBA permite541 la detección rápida del virus del dengue sólo en el ARN



542 15 minutes.161 En un enfoque alternativo, un flu543sistema orogénico RT-PCR fue desarrollado para el544 cuantificación e identificación de los virus del dengueconservación y uso de serotipo específico 3? 545 no codificante546 secuencias. Este sistema es capaz de detectar 20 -547 50 ufp / ml de suero y mostró una sensibilidad del

548 92,8% y una especificidad del 92,4% con respecto al virus de la549 en la celda de aislamiento culture.162

casos de laboratorio de clasificación

551 El uso de estas pruebas de diagnóstico para el dengue permite552 a la clasificación de las sospechas de casos clínicos para be553vienen casos probables o confirmados. Una IgM positiva554 serología, o un recíprocos de anticuerpos HI � 1280 o equiv555valente título de IgG por ELISA son los criterios que indican

556 dengue probable. Aislamiento del virus del dengue,557 de dengue demostración de antígenos o PCR positiva, y558 a cuatro o más veces el cambio en la IgG recíproca en559 pares de sueros, se utilizan para confirmar la infección del dengue.560 Los dos probables y casos confirmados son reportables561 para la salud authorities.7

Dengue diagnóstico, donde estamos hoy?Los principales problemas

564 IgMcapture ELISA, aislamiento del virus en mosquitos de la célula565 líneas y los mosquitos en directo, específico del dengue-mono566anticuerpos monoclonales, y la PCR han representedma567

jor los avances en el diagnóstico del dengue. Sin embargo, algunos568 problemas que aún amerita la elaboración oportuna de569 nuevas soluciones:570 � El aislamiento del virus es mucho tiempo.571 � La RCP requiere equipo de laboratorio específico y572 instalaciones, así como una extensa evaluación de la573 protocolos diferentes en condiciones de campo.

574 � detección IgMantibody requiere una sincronización adecuada575 y es confundida por los falsos positivos y576 la gran persistencia de IgMantibodies, commer577kits social aún es necesario una evaluación crítica, y578 de los costes y la disponibilidad de estos equipos y otros579 reactivos deben ser abordados.



¿Qué hace falta para un mejor diagnóstico?

582 El continuo desarrollo de la barata, sensi583tiva pruebas, específico y fácil que permite a principios de diagnóstico del dengue sigue siendonecesario. En concreto, los 584siguientes aspectos requieren la mayor atención: para 585desarrollar: 586(A pruebas) para el diagnóstico clínico temprano de las personas. 587(B) Las pruebas serológicas capaces de diferenciar el dengue 588de otras infecciones por flavivirus y aún más 589específicamente para determinar la infección del dengue 590serotipo. 591(C) protocolos de fácil y barata para genómica 592caracterización y la carga vírica, incluidos los 593

que se pueden aplicar en el campo. 594(D) Modificaciones de los protocolos existentes que simplifican 595manipular las muestras y el transporte. 596(E) antígenos recombinantes como herramientas para la prueba eval-597EVALUACION y producir esos 598 para las pruebas serológicaspruebas. 599(F) Las herramientas que pueden sugerir un pronóstico, lo que permite 600una mejor gestión de seguimiento clínico. 601

Además de estos elementos específicos, también es 602necesarios para implementar mecanismos de mayor 603la disponibilidad de reactivos, para el intercambio de reactivos de referencia 604

(Antígenos, anticuerpos monoclonales, cultivos celulares, 605positivos y negativos los sueros de control), para el nor-606lización de los protocolos en las regiones endémicas, para la im-607demostrando la calidad y cantidad de la competencia de 608prueba, y para aumentar el intercambio de información-609ción y experiencias entre las zonas endémicas en-610incluyendo el desarrollo de la investigación colaborativa 611projects.163 El papel de la Organización Mundial de la Salud-612ción de Centros Colaboradores de todos estos aspectos es de 613crucial. 614Hay algunos otros problemas y necesidades que 615no están relacionados con el desarrollo tecno-616

rrollo. Por ejemplo, el laboratorio infraes-617tura, la experiencia técnica y capacidad de investigación 618es limitada en muchos países donde el dengue es en-619académico. Estos factores influyen negativamente sobre el dengue 620vigilancia, manejo clínico de los casos, y 621el desarrollo de nuevos enfoques para el dengue 622de control. Aunque no se han publicado estimaciones de 623de los créditos otorgados para el campo 624 de dengue



actividades y la investigación, no se discute que los fondos 625son escasos. Es urgente que los fondos se movilizarán 626para aumentar la capacidad básica de salud pública y 627-improbar la infraestructura en los países endémicos. Este 628podría resultar en una disminución de la morbilidad del dengue y 629la mortalidad, mejorar el control, la prevención de enfermedades 630

y un mejor conocimiento del dengue y de DH / DSS. 631El resultado sería un aumento en las investigaciones de 632dirigida hacia el diagnóstico, desarrollo de vacunas 633y la patogenia. Por último, debemos abogar por 634el desarrollo urgente de un caso rápido, 635principios y accesible método de diagnóstico para el dengue 636con el fin de salvar vidas.

articulo dengue infectologia

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