HISTOQUÍMICA DE PIGMENTOS. Los pigmentos son sustancias coloreadas de orígen muy diverso que suelen hallarse en células y tejidos. Estas sustancias pueden plantear interrogantes de relevancia para el diagnóstico, sobretodo por la similitud de color ( pardo) que muchos de ellos comparten. Es frente a esta situación donde cobra gran valor la diferenciación Histoquímica.

Los pigmentos , en general los podemos clasificar como:

I) Pigmentos derivados del metabolismos de la Tirosina y del Triptofano: MELANINA Y CROMAFINES.

II) Pigmentos derivados del grupo pirrólico: PORFIRINAS; HEMOGLOBINA; HEMOSIDERINA; BILIRRUBINA; HEMATOIDINA; PIGMENTO MALÁRICO; PIGMENTO FORMOLADO.

III) Pigmentos lipídicos: LIPOFUCSINA ; CEROIDE. IV) Carotenoides.

Otra clasificación dice relación con pigmentos EXÖGENOS y ENDÖGENOS. Dentro de los pigmentos EXÖGENOS podemos considerar a aquellos considerados como “artefactos de técnica”: a base de depósitos de cristales demercurio (fijadores sublimados); pigmento formolado (formalina ácida); Antracosis (carbón); tinturas de tatuaje; Pigmento malárico. Como pigmentos ENDOGENOS entenderemos a todas aquellas sustancias coloreadas presentes en los tejidos y elaboradas por el propio organismo a aprtir de materiales provenientes del catabolismo, degradación o síntesis de diferentes elementos. Estos pueden subdividirse en 2 grandes grupos: los llamados PIGMENTOS HEMOGLOBINÉMICOS Y LOS NO HEMOGLOBINÉMICOS. En cuanto a su localización, los podemos clasificar como: INTRACELULARES y EXTRACELULARES.

I.-Pigmentos derivados del metabolismos de la Tirosina y del Triptofano MELANINA: -Son resistentes a todo tipo de solventes orgánicos (incluso piridina caliente). -No es modificada por la acción de ácidos. -Si se modifica por la acción de álcalis (1 N): disuelve la matríz de los gránulos. -Es el único pigmento que se decolora con sustancias oxidantes (pierde el color pero se mantienen los gránulos). - Reducen la Plata amoniacal a pH = 4 (también la lipofucsina y el pigmento de Dubin-Johnson). - Dan Test de SCHMORL positivo: Reducen el ferricianuro de potasio en presencia de cloruro férrico a Ferrocianuro Férrico (Azul de Prusia). Lo mismo sucede con la lipofucsina, pero es sensible para la melanina). -Forma complejos con el ión Ferroso: Azul de Turnbull. -Se tiñe con colorantes básicos (Azul de Toluidina). -Es PAS negativo. -No se colorea con lisocromos. Para el estudio histoquímico de la melanina tenemos 4 métodos: 1.- MÉTODOS DE REDUCCIÓN: Schmorl Y Fontana-Masson. Recordemos que la melanina presenta capacidad reductora “per se”, según su estructura. 2.-MASSON-FONTANA (1914): La Melanina es ARGENTAFÍN . Los cortes de tejido se incuban en una solución de plata amoniacal a temperatura ambiente durante toda la noche en oscuridad. Luego se elimina la plata no reducida con Tiosulfato. 3.- REACCIÓN DE SCHMORL: La melanina es capaz de reducir el:

Ferricianuro Férrico Ferrocianuro Férrico. La melanina también, es capaz de formar QUELATOS con los iones Ferroso (Fe +2). 4.- REACCIÓN DE CAPTURA DEL IÓN FERROSO (Lillie, 1957). Uno de los métodos más sensibles para melanina. Las melaninas forman quelatos con el ión ferroso presente

en el Sulfato Ferroso. Los Fe+2 quedan quelados en el pigmento = melanina ferrosa. Posteriormente se incuban los cortes con Ferricianuro de potasio , formándose el Ferricianuro Ferroso (+2), semejante al Azul de Turnbull. Como anexo, diremos que también resulta útil la caracterización de células névicas por medio de la reacción de la DOPA oxidasa Cortes por congelación y sin fijar, se incuban a 37ºC por 45 min a 2 hrs con DOPA (dihidroxifenilalanina) en buffer fosfato a pH 7,4. Las áreas de actuividad enzimáticas se observan de color pardo oscuro. Una célula melánica por mucho que no presentara pigmentación visible, presentaba la maquinaria enzimática para generar melanina. DECOLORACIÓN DE LA MELANINA: Al oxidarse este pigmento pierde su coloración característica (por ruptura del anillo fenólico con dobles enlaces). Agentes oxidantes utilizados : Peróxido de Hidrógeno. Los cortes se tratan por varias horas. También se utiliza el ácido ascórbico, son de los más específicos. Con el Permanganato de Potasio se utilizan cortes parafinados (los anteriores también) a 60ºC ó bién con energía de microondas. El inconveniente: también decolora otros pigmentos (no sirve para hacer diagnóstico de melanina por decoloración). Sin embargo consideremos la utilidad desde el punto de vista que la decoloración nos permitiría visualizar lo que oculta la melanina, la célula, por ejemplo (melanomas melánicos y enmascaramiento de cromógenos como el DAB utilizado en IHQ de melanomas). Otros potenciales agentes oxidantes son, elFeCl3 y el HCl

Acúmulos de histiocitos cargados de pigmento melánico (melanófagos) en dermis de piel canina (Imágen A). Del mismo modo, queratinocitos con pigmento melánico localizados en el perímetro de la epidermis basal de la piel pigmentada en el perro (imagen B). En ambas muestras se aplicó el método de Fontana-Masson. En el recuadro (imagen C, puede verse la melanina en elestrato basal de la epidermis del perro con su color natural (marrón).

A B

C Figura N

° 1

PIGMENTO CROMAFÍN (Reacción cromafín). La adrenalina, la noradrenalina y la serotonina son hormonas que se caracterizan por tener ciertos redicales químicos similares,siendo la estructura básica de las dos primeras un difenol que recibe la denominación de pirocatequina y la tercera,un indol oxidado en posición 5. La adrenalina y noradrenalina se producen en la médulasuprarrenal e intervienen en la regulación de la circulación sanguínea y en los mecanismos de stress. La Serotonina (5-hidroxitriptamina) esun importante mediador químico relacionado con mecanismos alérgicos, vasodilatación,exudación y activación de la reacción inflamatoria. Estas tres hormonas pueden detectarse histoquímicamente a través de una reacción, la reacción cromafín. La adrenalina y la noradrenalina son sustancias reductoras que en contacto con un agente oxidante como el Dicromato de Potasio se oxidan, originando como producto de reacción óxido de Cromo e Hidróxido Potásico. El óxido de Crmo es un pigmento pardo, insoluble en agua, que precipita sobre el tejido. Debido a esto último, lo s tejidos que presentan estas hormonas reducen directamente el dicromato de potasio presente en fijadores como el Zenker y el Helly (fijación y coloración de manera simultánea). Esta reacción se manifiestaaún con posterioridad si eltejido ha sido previamente fijado con formalina (El Feocromocitoma por ejemplo se caracteriza macroscópicamente por presentar una coloración marrón-rojiza característica cuando se pone en contacto consoluciones fijadoras que contienen Dicromato de potasio.

Serotonina

PIGMENTOS HEMOGLOBINÉMICOS: II.- Pigmentos derivados del grupo pirrólico. HEMOGLOBINA: -Los estudios histoquímicas, pasan por la acción Seudoperoxidásica de esta y tinción con colorantes ácidos. - Es conveniente no fijar. De ser necesario conservar la morfología, hacerlo con Formol-Acetato de Plomo o bién con Formol Ferricianuro. La técnica más habitual es la de las peroxidasas (Bencidina). Las seudoperoxidasas son resistentes a la temperatura de proceso. IDENTIFICACIÓN DE FIERRO (ver hemosiderina). Por oxidación (con Permanganato ó peróxido de H) del ión ferroso (Fe +2) presente en la hemoglobina y posterior reconocimiento con ferrocianuro de potasio que pasa a ferrocianuro Férrico (azul de Prusia).

DERIVADOS DE LA HEMOGLOBINA (HEMOGLOBINÉMICOS).

1.- BILIRRUBINA:

- Insoluble en agua. - Soluble en cloroformo; tetracloruro de carbono; álcalis. - No reacciona con Fierro. - No es decolorado por agentes oxidantes. - Da reacción argentafin. - No se colorea con lisocromos. Histoquímica del pigmento biliar (bilirrubina): - REACCIONES DE OXIDACIÓN: La bilirrubina se presente de color pardo-

amarillento. Al oxidarla se logra su conversión a biliverdina (verdosa)

Reacción de KUTLIK (1957): Utiliza Cloruro Férrico que en presencia de ácido acético ó Alumbre Férrico en agua. La bilis es oxidada a biliverdina (verde) y colecianina (azul verdoso).

Reacción de STEIN (1935): Se utiliza una solución de Yodo. La bilirrubina se oxida a biliverdina. La reacción de FOUCHET (1917): Utiliza Cloruro Férrico en solución con ATC. La reacción de Glenner (1957):Utiliza Bicromato de potasio en cortes por congelación. Importante en chequeo previo de la coloración característica de la bilirrubina. Reacción de GMELIN (1826): Aquí la bilirrubina presente es tratada con ácido Nítrico ó Sulfúrico concentrados. Aquí se constata una serie de espectros cromáticos sufridos por la bilirrubina y sus derivados (amarillo; verde; rojo; azul; púrpura). No siempre da los resultados esperados. No es permanente; Suele presentarse muy rápidamente. Culmina habitualmente con la destrucción del tejido. - REACCIONES CON SALES DE DIAZONIO (tejidos cortados por congelación y

sin fijar). Según RAIA (1965): se utilza el Di-cloro 2,4 Anilina diazotada + bilirrubina conjugada---------- azul. DEAMENT (1968): Utilizó el etil antramilato + bili conjugada ----rojo. Es más sensible y el tejido puede fijarse.

2.- HEMATOIDINA. Pigmento de color café en hemorragia e infartos antiguos. Tendría una estructura similar a la bilirrubina. Al oxidarse se colorea.

Presencia de pigmento de color pardo oscuro atribuíble a pigmento biliar con la H/E (imagenA) en muestra de hígado con colestasia intrahepática. La imagen B,muestra el pigmento biliar caracterizado con el método de Kutlik.

A B Figura N

° 2

3.- PIGMENTO FORMOLADO: Pigmento de localización extracelular.

Se debe a la acción de la formalina acidificada (pH 3-4) por tiempo prolongado en tejidos ricos en glóbulos rojos. -Se elimina con el tratamiento de soluciones alcohólicas de ácido pícrico ó soluciones alcalinas (amoníaco). .No presenta ión ferroso ni férrico. -No da autofluorescencia. -No presenta lípidos. - Es molecularmente similar al pigmento producido por el hematozoario de la Malaria.

4.- PIGMENTO MALÁRICO: Pigmento café de localización intracelular.

- Intracelular. - No presenta reacciones de Fierro (no presenta fierro). - Argentafin negativo. - No es fluorescente. - Insoluble en agua. - Insoluble en solventes orgánicos y ácidos diluídos. - No se tiñe con lisocromos.

5.- HEMOSIDERINA. Pigmento café de localización intracelular. Complejo de ión Férrico unido a proteína. -Micelas de Hidróxido de fierro; Ferritina y derivados de la ferritina (Fierro = 57 % del peso seco; proteínas el 17% y monosacáridos y lípidos). Localización : extra ó intracelular (macrófagos).

- No utilizar fijadores ácidos (ácidos diluídos la disuelven). - Insoluble en agua y álcalis. - Soluble en ácidos diluídos. - No presenta reacción argentafin. - No se colorean con lisocromos.

- Es PAS negativo. - No se decoloran frente a agentes oxidantes

En la reacción de PERLS no se identifica la Hemosiderina como tal, sino los iones Férricos. La hemosiderina y la ferritina, liberan iones férrico (Fe +3) en presencia de un ácido mineral diluído. El Fe +3, el cual, en presencia de ión Ferrocianuro, forma un precipitado de color azul, el Azul de Prusia (Ferrocianuro Férrico). La ecuación que representa la reacción es la siguiente:

3K4[Fe+2(CN)6]+ 4Fe+3 Cl3 Fe4+3 [Fe+2(CN)6]3 + 12 KCl Ferrocianuro de Potasio + ión Férrico Ferrocianuro Férrico ( Azul de Prusia)

Formación del Azul de Turnbull para la identificación de Fe +2: Esta reacción utiliza el Ferricianuro de potasio. Hay reducción del Fierro +3 a Fierro +2 que luego se identifica con ferricianuro de Potasio, con lo que genera el Ferricianuro ferroso (+2), de color azul , similar al de Prusia, llamado azul de Turnbull. La reducción del Fierro +3 se logra con el tratamiento del tejido con Sulfuro de Amonio, formándose el Sulfuro de Ferroso que es soluble y que se disocia en iones Ferroso y Sulfuro (gas). El Sulfuro Ferroso reacciona con el Ferricianuro de K formándose el Ferricianuro Ferroso que es una molécula compleja, insoluble.

2K3[Fe+3(CN)6] + 3Fe+2 Cl2 Fe+2[Fe+3(CN)6]2 + 6KCl Ferricianuro de Potasio + ión Férroso Feericianuro Ferroso (Azul de Turnbull)

La reacción más específica y sensible es la de Perls (Azul de Prusia): Ferrocianuro de potasio en medio ácido y ión Férrico (presente en la hemosiderina) ferrocianuro férrico (azul de prusia). El tratamiento de la médula ósea con descalcificadotes ácidos (especialmente el ácido Nítrico), elimina el Fierro por solubilización .

HCl

HCl

PIGMENTOS NO HEMOGLOBINÉMICOS. PIGMENTOS LIPÍDICOS (LIPOPIGMENTOS)

Localización: Intracelular. 1.- PIGMENTO CEROIDE. Gránulos de color café, intracelulares. Se logra hallar a partir de cirrosis dietética en ratas; Anemia experimental en perros; Fístula biliar crónica; desnutrición severa en el hombre; macrófagos del ovario; musculatura digestiva en síndromes de mala absorción (sprue); Pancreatitis crónica; Nódulos regenerativos en cirrosis. Al parecer, el pigmento se formaría por polimerización de ácidos grasos insaturados y se trataría de una lipofucsina en fase inicial de formación, aunque con características propias.

-Son altamente estables a los solventes orgánicos (alcohol; acetona; éter; cloroformo). -No es solubilizado por álcalis ni ácidos diluídos. -Presentan autofluorescencia amarillo-verde. -Se colorea con lisocromos. -No reducen al Ferricianuro (Schmorl negativo). -Reacción cromafin negativa. -Muy ácido-resistente (teñidos con colorantes básicos tipo fucsina, resisten

Tejido hepático presentando hemosiderosis (Imagen A) . La hemosiderina presente en los hepátocitos es puesta de manifiesto con el método de Perls, en el cual el ión Férrico el Ferrocianuro Férrico (Azul de Prusia) el cual se aprecia como un depósito granular difuso de color azulado (imagen B).

A

B

Figura N° 3

decoloración con mezcla de alcohol-ácido). -Reacción Fierro negativa.

2.-LIPOFUCSINA. El término de lipofucsina proviene de hecho de que en el miocardio de ancianos se aprecia pardo y fláccido= atrofia “fusca” (café). Su coloración es pardo-amarillenta. Se trata de una sustancia relacionada al ceroide, pero mucho más polimerizada que éste, mayoritariamente lipídica y no degradable (mezcla compleja de lípidos y proteínas) generada a partir de lisosomas alterados (Cuerpos residuales ,siempre rodeados por una membrana).

- Resistente a solventes orgánicos. - Presenta resistencia al tratamiento con álcalis concentrados. - Presenta fluorescencia café-rojiza. - Reacciones Fierro negativas. - Test de Schmorl positiva (reducen al Ferricianuro). - Se tiñen con lisocromos ( Negro Sudán y Azul de Nilo). - Acido resistencia variable. - PAS positiva en fases intermedias de oxidación (restos de hidratos de carbono).

Tanto el pigmento ceroide como de lipofucsina se les denominan “pigmentos de desgaste”, generándose a todas las edades y donde se acumula a lo largo del tiempo. Se pueden encontrar en hepatocitos; miocardio; neuronas; zona reticular de corteza suprarrenal; células intersticiales del testículo; etc.

ACTIVIDADES DIRIGIDA A LOS ALUMNOS: 1.- Investigue y obtenga imágenes que caractericen en el contexto de la histología normal ó histopatología cada uno de los pigmentos mencionados. 2.- Revise las ecuaciones que caracterizan a la reacción del Azul de Prusia y la del Azul de Turnbull. Caracterice lo expuesto por medio de imágenes, siguiendo el protocolo histoquímico y fundamente . 3.- En relación a la melanina: exponga la bioquímica de la síntesis de melanina y caracterice cada uno de los pasos a nivel ultraestructural. Apoye su investigación por medio de imágenes. 4.- Realice un listado de lesiones melánicas y caracterícelas conceptual y gráficamente. ¿Por qué ya no se utiliza la reacción de la DOPA oxidasa en el diagnóstico de melanomas amelánicos?. 5.- Haga resumen del metabolismo de la hemoglobina con énfasis en la síntesis. Oriénte su exposición hacia los principales grupos químicos. 6.- Caracterice los principales eventos asociados al catabolismo de la hemoglobina, reconociendo aquellos

A.- Miocardio normal teñido con H/E . B.- Método de Scmorl que pone de manifiesto los gránulos de lipofucsina con tonalidades oscuras ( ). C.- Pigmento de lipofucsina visualizado en miocardio con el método del Sulfato Azul de Nilo (imagen C).

A B

C

Figura N° 4

sitios de degradación y caracterizando aquellos derivados de interés histoquímico. 7.- Establezca una defensa con respecto a la utilidad de caracterizar pigmento biliar en el contexto de la Histopatología. 8.- Repase lo relacionado con el concepto de sustancia cromafín y argentafin respectivamente. Realice un listado de sustancias cromafines y argentafines. 9.- Investigue en relación al pigmento que se presenta en la Ocronosis y en el síndrome de Dubin-Johnson.

ANEXO 1. PIGMENTOS

PIGMENTO COLOR Y FORMA LOCALIZACIÓN CAUSA EXTRACCIÓN

FORMOLADO

Café oscuro

Extracelular

Formol ácido + hematíes Bouin; Soluc. Ac.

Pícrico-OH

MALÁRICO

Pardo

Intracelular (macrófagos)

Plasmodium malariae.

Alcohol-ácido (por

hrs.)

HEMOSIDERINA

Pardo

Intracelular (macrófagos)

Hemorragia

MELANINA

Café (claro-oscuro)

Intracelular(melanocitos;

célula epitelial, melanóforos)

Pigmentación normal.

Agentes oxidantes (permanganato; Peróxido; etc)

LIPOFUCSINA

Pardo amarillo

Intracelular

Oxidación de lípidos y

lipoproteínas

BILIAR

Amarillento con H/E

Extracelular (canalículos biliares)

Lisis de hematíes y degradación de la

hemoglobina. Patologías que afectan drenaje normal de la bilis.

CARACTERÍSTICAS HISTOQUÍMICAS DE LOS PRINCIPALES PIGMENTOS

14

ANEXO 2. MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA PIGMENTOS

Método Lipofucsina Ceroide Pig. Biliar

Dubin-Johnson

Hemosiderina Hemoglobina

Ocronosis Cromafin Melanina Formalina

Malárico

Color

Café – amarillento

Café .amarillento

Café-amarilento

Café oscuro

Café amarillento Café amarillento

Amarillo oscuro

Café Amarillo oscuro- café

Café oscuro

Café oscuro

Sudan /Oil Red

+ + - - - - - - - - -

Reacción de Perls

- - - - + - - - - - -

Reducción de ferrocianuro

+ a + - a + - - - - - + + - -

Argentafin

Variable

- - - - - - + + - -

Acido-resistencia

- + - - - - - - - - -

PAS + + - + - - - -

Ocasional

+ - -

Oxidante (peróxido) - - - + - - - -

Ocasional

+ + +

Stein

- - + - - - - - - - -

Gmelin

- - + - - - - - - - -

Fluorescencia

+ + - + - - + - - - -

15

HISTOQUÍMICA DE SUSTANCIAS INORGÁNICAS. Las sustancias inorgánicas en los tejidos las podemos hallar como:

- Sustancias propias de la célula y tejidos. - Sustancias propias de algunas patologías. - Depósitos por tratamiento o medicación.

Un requisito que deben cumplir las sustancias inorgánicas para ser evidenciables es el de ser capaz de encontrarse en un estado ionizado: Ca +2; Fe +2; Fe +3; etc. Para esto último deben hallarse solubles. Si no son ionizables , la única manera de ser identificables es a través de la microincineración. En este apartado consideraremos tres tipos de iones relevantes, estos son: el ión Calcio (Ca+2) ; El Fierro (Fe+2 y Fe+3) y el Cobre (Cu+2). A.-CALCIO = Depósitos calcificados. Se puede presentar como: Sales solubles (plasma sanguíneo) ; Sales ligeramente solubles e Insolubles (tejidos osificados y tejido óseo). La calcificación distrófica se caracteriza por una acumulación patológica de sales de Calcio en tejidos necrosados ó degenerados. También podemos encontrar depósitos localizados de sales de calcio en lesiones beniganas como es el caso de los Carcinomas papilares que presentan “cuerpos de psamoma” ; las microcalcificaciones mamarias ; lesiones inflamatorias de la vesícula biliar y calcificación de la media de algunas arterias (de Monckeberg). Debemos recordar que existen tumores malignos productoras de osteoide, susceptible de presentar calcificaciones (osteosarcoma). Desde el punto de vista de la Histoquímica del Calcio tenemos las siguientes reacciones:

1.- Aquellas en que hay formación de una laca: Rojo de Alizarina S ; hematoxilina; Azul de Galamina. De estas las más conocida es la del Rojo de Alizarina S, en donde el color de la laca varía de acuerdo al pH de la reacción y van del Anaranjado al Rojizo .

16

-ROJO DE ALIZARINA :La Alizarina es un colorante del tipo antraquinona sintética. Los quelatos de Calcio se constituyen a partir de 2 moléculas de Alizarina Roja S. El mecanismo de quelación no está completamente claro. Con la alizarina (colorante aniónico) podemos tener fondo. Para que el Calcio reaccione con la Alizarina debemos , primero que nada, solubilizarlo, es decir liberarlo de los depósitos insolubles por medio de un ácido. Un inconveniente inherente a la solubilización por medio de soluciones ácidas es que puede haber difusión del ión y pérdida del mismo. La idea es que exista la menor difusión posible y esto lo logramos manejando el pH: pH muy bajo = más calcio liberado del depósito = reacción más intensa = > sensibilidad, el riesgo es también > difusión del ión. A pH mas alto = < sensibilidad ; < color y por ende < difusión. El rango más adecuado es de pH 4 – 8. Con respecto a la fijación del tejido, algo que seguramente ya se inmaginan: no utilizar fijadores ácidos. Si bién la formalina neutra se utiliza con mayor frecuencia, no es la que mejor conserva al ión. Sacrificando la morfología, sería recomendable el uso del etanol al 80% como un buen fijador. El criterio mediría que: Si la cantidad de calcio es escasa, el fijador es crítico y ahí me inclino, en desmedro de la morfología por el etanol.

Con respecto a la Hemateína (formada por la oxidación de la hematoxilina), diremos que es capaz de formar lacas intensamente coloreadas con muchos metales (Al; Be; Bi; Cr; Cu; Fe; Mo; etc).

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2.- Reacciones de Quelación: Hay atrapamiento del Calcio a través de una sustancia (colorante* o no) que actúa como quelante. * Aún, comprendiendo que en la génesis de una laca existe quelación del metal por parte de la molécula colorante, consideraremos al Glioxal como el principal “agente quelante” dentro de losmétodos de quelación, reservándonos la oprtunidad de referirnos más profundamente al rol de la Alizarina S en la caracterización de depósitos de de Calcio como laca por aspectos netamente formativos.

-Uso del Glioxal (GBHA) : es uno de los método más sensibles. Recomendable para la identificación de pequeñas cantidades de depósitos de Calcio. No se trata de un colorante. Forma quelatos con diversos metales aparte del calcio (Estroncio; Bario; Níquel; Cadmio). El quelato obtenido a partir del Glioxal con el Calcio es de color rojo-anaranjado (semejante al de la Alizarina). Técnica sensible pero compleja. Se debe trabajar con soluciones que no presentes trazas de calcio. El tratamiento de la muestra es, ya sea por: Congelación–sustitución (con alcoholes) ó Congelación-desecación inclusión en parafina; cortes de 7 micras y montaje sin adhesivo. Secado a 40ºC. La reacción con GBHA puede darse en depósitos compactos y otras en donde el calcio se hallaba soluble. Las soluciones se depositan sobre el tejido parafinado y se dejan ahí hasta la desecación, luego se desparafinan los cortes y se puede contrastar el fondo. Los resultados son magníficos. Para grandes cantidades me inclinaría por métodos como Von Kossa o Rojo de Alizarina.

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3.- Reacciones de Sustitución: Se utilizan sales de plata (Nitrato de Plata) , en donde la plata sustituye al ión calcio (o cualquier ión metálico) en las sales y posteriormente se reduce a plata metálica (Ag o) en presencia de luz solar.

El método aplicado es el de Von Kossa (VK). Es una reacción Argirófila basada en la reducción de sales de plata, formándose un Carbonato de plata. El método de VK lo que está demostrando en sí, son los fosfatos y carbonatos no el Ca+2. Es una técnica sencilla.

Con Carbonatos: Ca CO3 + 2Ag+ Ag2 CO3 + Ca +2

Con Fosfatos: Ca (PO4)2 + 6 Ag 2 Ag3 PO4 + 3 Ca+2

B.- COBRE. Este ión es escaso en nuestro organismo, pero es posible hallarlo como depósito tóxico en el hígado y Sistema Nervioso (por acumulación) en personas que sufren la enfermedad

Nucleos de calcificación tisular vistos con el método de Von Kossa (imagen A) y con el de la Alizarina Roja (Imagen B).

A B

Fig

ura

N° 5

19

de Wilson. Es una enfermedad poco frecuente. En arácnidos y moluscos existen moléculas transportadoras de oxígeno que presentan cobre. La cantidad de cobre que requerimos es escasa y el cobre es transportado por la ceruloplasmina, molécula sérica encargada de su transporte (el 95% de éste) Los pacientes portadores del mal de Wilson presentan un defecto en el gen codificante de la ceruloplasmina, en el brazo largo del cromosoma 13 (autonómica recesiva). En estos pacientes se manifiesta una hepatitis crónica con fibrosis y destrucción del parénquima (necrosis). Un método utilizado es el del Acido Rubeánico (Ditiooxamina), cuya especificidad es relativa ( sensibilidad < 15%). En esta reacción existe quelación del Cobre por medio del ácido Rubeánico formándose un polímero que adquiere un color típicamente verdoso. El tratamiento de la enfermedad en estos pacientes es sólo paliativo , con la administración de agentes quelantes como el Zinc que atrapa cobre.

Hígado con depósitos patológicos de Cobre en paciente con enfermedad de Wilson,

puestos de manifiesto con el método de la Rodanina. La coloración se manifiestas como pequeñas granulaciones pardo-anaranjadas en

el citoplasma de los hepatocitos.

Figura N° 6

5-(4-dimetilaminobecilideno)- Rodanina

20

El cobre en la enfermedad de Wilson se acumula en el hígado en forma difusa a nivel del citosol, formando complejos lisosómicos insolubles unidos a una proteína específica, la metalotioneína. La sensibilidad y selectividad de las pruebas histoquímicas es variable. El cobre lisosómico puede detectarse por medio del método de la Orceína de Shikata que colorea la proteína en exceso , que se encuentra asociada al metal y generalmente es positiva en lesiones de larga data. El método de la Rodanina suele ser reconocido como el método que presenta lamayor sensibilidad. Se considera que la Ronanina colorea directamente el cobre que se encuentra unido a la Tioneína en estados tempranos de la enfermedad. ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO. 1.- Realice un listado de lesiones (tanto benignas como malignas) que con mayor frecuencia presentan fenómenos de calcificación. 2.- Revise el concepto de “osteoide” y averigue que lesiones pueden formarlo. 3.- Caracterice por medio de imágenes microscópicas los fenómenos anteriormente mencionados. Agregue imágenes de los principales métodos mencionados. 4.- Realice un cuadro con los signos característicos de la Enfermedad de Wilson y respalde lo anterior con 2 signos clásicos de la enfermedad (imágenes).

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REQUISITO FUNDAMENTAL: IÓNES SOLUBLES.

-Propias de células y tejidos. -propias de algunas patologías. -Depósitos por tratamiento o medicación.

Formación de LACAS : Rojo de Alizarina S; Hematoxilinas.

IÓN CALCIO (Ca +2:) Reacciones de QUELACIÖN: Con atrapamiento de Ca +2 por una sustancia, ya Sea este, un Colorante u otra sustancia. Uso del GLIOXAL (GBHA) , quelato de color rojo-anaranjado

Reacción de SUSTITUCIÓN (Argirófila) utilizando Sales de Plata, en donde la plata sustituye al Ca +2 en sales insolubles (carbonatos; fosfatos) y posterior reducción a Plata metálica (Ag0) en presencia de luz solar. Método de Von Kossa.

IÓN Férrico (Fe+3); IÓN Ferroso (Fe+2) : Azul de Prusia ; Azul de Turnbull.

IÓN Cobre (Cu+2): Método de Quelación con Ditiooxamina (Acido Rubeánico). Baja sensibilidad (15 %) con la formación de un polímero

de color verdoso.Otro método es el de la Rodanina (dimetilaminobencilideno) y el de la Orceína de Shikata.

MÉTODOS DE ESTUDIO IN SITU

(FERROCIANURO FÉRRICO) ; (FERRICIANURO FERROSO)

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Reacciones de Oxidación: -Kutlik : FeCl3 + Ac. Acético biliverdina. -Stein: Yodo biliverdina.

- BILIRRUBINA(Pigmento biliar): -Gmelin : HNO3/H2SO4 Arcoiris no permanente.

Reacciones con Sales de Diazonio: Por congelación y sin fijar.

(Derivados de la Hb) - HEMATOIDINA: Con estructura similar a la bilirrubina. Al oxidarla es posible colorearla. Presente en hemorragias e infartos.

---- PIGMENTO FORMOLADO: Extracción con una solución OH de Ac. Pícrico.

---- PIGMENTO MALÁRICO: No presenta Fierro en su molécula.Negativo para todo.

---- HEMOGLOBINA: -Oxidación del Fierro con KMnO4 ó H2O2 a Fe+3. -Reacción seudoperoxidásica y colorantes ácidos.

---- HEMOSIDERINA: a) Perls (Azul de Prusia), ácido mineral diluído + FerroCN (Fe+3 + Proteína) = Ferroc. FÉRRICO (Azul de Prusia). b) Azul de Turnbull: Fe+2 + FerriCNFERROSO (Fe+3 Se reduce con Sulfuro de Amonio).

Es decir, derivados del metabolismo de la hemoglobina (Pirrol y Porfirínicos).

MÉTODOS DE ESTUDIO IN SITU

HEMOGLOBINÉMICOS:

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----CEROIDE: Lisocromo(+); Fluorescencia(+):amarillo-verde.

LIPÍDICOS: (lipopigmentos)

----LIPOFUCSINA: Lisocromo(+);Schmorl(+) Fluorescencia(+): café-rojiza. PAS (+).

PIGMENTOS CAROTENOIDES: Derivados de la vitamina A. NO HEMOGLOBINÉMICOS

Métodos de REDUCCIÓN : -Schmorl (FerriCN FerroCN)

---- Fontana-Masson (Argentfin)

Formación de QUELATOS: -Quelatos con Fe+2 a partir de Sulfato Ferroso, luego:

MELANINA: FERRICN de K FERRICN Fe+2 .

---- Reacción de la DOPA oxidasa (Congelación; 37ºC; pH 7,4)

---- DECOLORACIÓN:con H2O2; KMnO4; Ac. Ascórbico. Utilidad en ICQ.

Pigmento derivado del metabolismo de la Tirosina y el triptofano

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HISTOQUÍMICA DE ENZIMAS. Las enzimas podemos considerarlas como biocatalizadores orgánicos. ¿ Que las diferencia de aquellos inorgánicos?. El que són eficientes y específicos. Eficientes en el sentido, de que las cantidades que actúan son del orden de los micromoles y dentro de la especificidad, existe una relativa y otra absoluta (una enzima, un sustrato). Además, las enzimas presentan capacidad de regulación, todo dependerá de la vía metabólica donde ésta se encuentre. Las enzimas presentan una subunidad catalítica y otra regulatoria. En histoquímica nos interesamos en, ya sea, su localización o bién, actividad. Otras veces, los dos aspectos a la vez. La inmunohistoquímica nos aporta bastante información en cuanto a la enzima como proteína antigénica. (generamos anticuerpos anti- enzima). A partir de esta información , no podemos obtener información de su actividad, sólo su localización. En la histoquímica de enzimas, nosotros detectamos la actividad de la enzima, agregándole su sustrato y ese sustrato por acción enzimática puede sufrir hidrólisis; reducción; oxidación y se obtiene un producto. Las reacciones enzimáticas pueden representarse a traves de las siguientes euaciones tipo:

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Es de gran importancia que el producto final coloreado se forme rapidamente, sin difusión del mismo, ya que representa fielmente actividad y localización. Para que esto ocurra, la concentración del agente capturante en la mezcla de incubación debe ser la suficiente y correcta para esa reacción enzimática (si es mucha, el agente capturante puede inhibir a la enzima y unirse inespecíficamente a grupos aniónicos del tejido; si no es la suficiente: parte del producto de reacción primario (PPR) sin reaccionar, puede unirse a otras estructuras del tejido y dar reacción inespecífica). La reacción A es la más eficiente: El producto final de la reacción (PFR) es insoluble y colororeado. Debe ser altamente insoluble (la mayoría de las veces en agua, pero soluble en solventes orgánicos). En la reacción B, la localización suele ser deficiente por difusión de los productos, es más larga. La reacción C es la de mayor especificidad, ya que presenta menor número de pasos, pero no siempre es factible de realizar. En microscopía electrónica se suele aplicar este tipo de reacción, ya que es la más fidedigna de localización.Este tipo de reacciones es característica de óxido reductasas. En ella el sustrato es soluble e incoloro cuando se halla oxidado e insoluble y coloreado en estado reducido. Se trata de una reacción sencilla que da buena localización.

PREPARACIÓN DEL TEJIDO PARA HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA. Antes de realizar la reacción enzimática en células y/o tejidos debemos preparar el material de estudio.La intención siempre va dirigida a:

- Mantener la localización de la enzima. - Conservar la actividad de la enzima.

Con la intención de conseguir la localización, podemos sacrificar la actividad de la enzima. La fijación química representa una oportunidad para desnaturalizar la enzima que queremos chequear. La temperatura; el pH y el tipo de fijador, son variables que debemos considerar estrictamente en histoquímica de enzimas. Muchas de las enzimas que deseamos estudiar son solubles, por lo que la fijación contribuye directamente a la insolubilización de las mismas. También nos interesa contar con una buena morfología. Es decir, sacrificamos actividad por localización.

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¡ EN HISTOQUÍMICA SE DETECTA LA ACTIVIDAD ENZIMATICA!

Importante: PRESERVAR LA ENZIMA; INMOVILIZARLA E INMOVILIZAR EL PRODUCTO OBTENIDO POR LA ENZIMA. FIJACIÓN. No todas las enzimas resisten la fijación química de los tejidos (la desnaturalización , junto con alterar la estructura III y IV, modificaría estructuralmente el sitio activo de la enzima). Para estudios de enzimas oxidativas, por ejemplo, utilizar tiempos cortos de fijación y trabajar a baja temperatura es prioritario. Hay enzimas que si resisten la fijación bastante bién (tiempos más prolongados y en frío). Todas las fijaciones que se hagan con enzimas, ya sea por tiempos largos o cortos se realizan en frío. Podemos resumir, con respecto a los objetivos de la fijación en Histoquímica enzimática, que son la de:

- Conservar morfología. - Insolubilizar a la enzima. - Aumentar la permeabilidad de la célula.

La fijación permite hacer permeable la célula a los productos presentes en la mezcla de incubación (sobretodo en células enteras). MÉTODOS PARA LA CONSERVACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: 1.- Congelación-Desecación. 2.- Tejido sin fijar; corte por congelación; fijación post-corte y post-reacción. 3.-Breve fijación previo al corte por congelación. 4.- Enzimas que resisten fijación y congelación. Se deben elegir bien los fijadores a utilizar y cuidar los procedimientos posteriores. El Formaldehído neutralizado; Alcohol ó Acetona. Las fijaciones siempre a baja temperatura (4º C).

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En el caso de enzimas que resisten la inclusión, utilizar parafinas con pto. de fusión entre 50-52ºC, por tiempo breve, cuidando la temperatura. El Glutaraldehído se utiliza SÓLO en algunos casos. Algunos de los protocolos consideran: -Fijar el tejido a 4ºC por tiempos que van de las 2 a 6 horas. -Cortar el tejido en fresco y después postfijar 10 min en acetona fría (la más utilizada) ó Formaldehído neutro por 15 min.

TIPOS DE ALTERACIONES PRESENTES EN TEJIDOS SIN FIJAR IINNJJUURRIIAA CCAAUUSSAA EEFFEECCTTOO SSOOLLUUCCIIÓÓNN

ANOXIA

Privación del aporte sanguíneo

(Oxígeno)

Daño mitocondrial

Extracción y congelación

inmediata del tejido.

TÉRMICA

-Congelación y Deshielo.

-Almacenamiento a Tº ambiente.

-Sobrecalentamiento de cortes

durante el secado.

-Pérdida de factores solubles (cofactores)

-Reducción de la actividad enzimática.

-Pérdida de la actividad

enzimática

-Conservar idealmente a-70ºC; -20ºC.

-Conservar cortes de crióstato a

-20ºC-

-Guardar cortes, mientras se secan a 4ºC (húmedo).

OSMÓTICA

Tumefacción mitocondrial: Aumento de la permeabilidad.

-Pérdida de enzimas solubles y cofactores

-Protección con soluciones hiperosmóticas.

SIEMPRE QUE SE FIJA UN TEJIDO PARA ESTUDIO ENZIMÁTICO, UNO DEBE CONSIDERAR LA PÉRDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, LO QUE ES MÁS O MENOS CONSIDERABLE SEGÚN LA ENZIMA A ESTUDIAR.

CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS .Según la reacción química que realizan. A.- OXIDO-REDUCTASAS: Catalizan reacciones en donde existe transferencia de electrones (óxido-reducción).Ejps: Dehidrogenasas ; Peroxidasas. B.- TRANFERASAS: Catalizan reacciones en las que hay transferencia de grupos químicos (radicales completos). Estos pueden ser grupos metilos ; monosacáridos; Fosfatos.

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C.- HIDROLASAS: Rompen uniones agregando una molécula de agua (hidrolizan uniones). Se pueden romper enlaces C-O ; C-C; C-N; C-O-PO3; C-S. Enlaces éster; glicosídicos; Peptídicos. D.- LIASAS: Rompen los mismos tipos de enlaces anteriores pero por un mecanismo diferente (adicionando grupos a dobles enlaces). Ejp. Piruvato descarboxilasa. E.- ISOMERASAS: Rompen un enlace pero a su vez, generan otro (transfieren grupos químicos dentro de una misma molécula). Participan en fenómenos de epimerización e isomería geométrica (cis; trans). F.- LIGASAS: Se forman enlaces dependientes de la presencia de ATP. Formación de enlaces C-N; C-O; C-S; C-C en reacciones de condensación asociadas a la degradación de ATP. Ejp. Tirosil ARNt sintetasa. En relación a los COFACTORES, Estos pueden ser ORGÁNICOS (coenzimas) o bién , INORGÁNICOS (activadores). Las coenzimas en general son derivados de Vitaminas (NAD; FAD; NADP). Los activadores son metales bivalentes como el Mg+2; K+; Fe+2; F+3; Na+, etc. La proteína sola es llamada APOENZIMA, con su co-factor, es decir la proteína catalítica: HOLOENZIMA. Existen enzimas que siempre se encuentran asociadas a su cofactor (Ez-FAD).La manera en que ejercen su acción los cofactores es:

- Formando un complejo que le otorga a la enzima una conformación ópticamente activa.

- En el caso de los cofactores inorgánicos, se establece un puente de coordinación entre el sustrato y la enzima.

- Sirven como aceptores de electrones ó algún grupo químico proveniente del sustrato y de este modo transferirlo a otros grupos que serán el producto final.

En relación al SITIO ACTIVO DE LA ENZIMA, diremos: Que está constituído por aminoácidos y éstos pueden ser: -Esenciales: Al extraerse no producen alteración en la actividad de la enzima.

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-Estructurales: Otorgan un microambientepara que se lleve a cabo la reacción. -Residuos catalíticos: Atacan al grupo específico

I.- HIDROLASAS.

Fosfatasas: Hidrolizan enlaces Fosfo-monoésteres; Fosfo-diésteres; Piro-fosfatos o bién, Fosfamida. Fosfatasas específicas: De acuerdo al producto que forman se identifican. Fosfatasas inespecíficas (relativas): Se diferencian por el pH al cual actúan. Fosfatasas alcalinas: 8,3 – 9,4 Fosfatasas ácidas : 4,5 – 5,5 Las específicas pueden ser alcalinas como: 5´nucleotidasa ; ATP asa a pH 7,2 y sus sustrato específico es ATP ; Tiaminopirofosfatasa ; Glucosa 6 Fosfatasa; Ribonucleasa ó bién , ácidas inespecíficas que catalizan uniones ésteres entre ácidos carboxílicos y una variedad de alcoholes y fenoles (familia de las esterasas, colinesterasas, lipasas, etc).

Las Fosfatasas catalizan la hidrólisis de ésteres y amidas de ácido Fosfórico. I.-FOSFATASA ALCALINA pH óptimo : 8,8 – 9,4 Activadores: Mg+2; Mn+2; Zn+2 Inhibidores: EDTA; L-Cisteína; Levamisol (más utilizado); Tetramisol. No se inhiben todas, pero sí, la mayoría. Localización (controles +) : TCP del riñón; endotelio de arterias; Chapa estríada intestinal; etc. Pretratamiento del tejido: -Fijación en OH absoluto a 4ºC por 18 hrs e inclusión en parafina (1 hora) -Fijación en Formol neutro 2 – 4 hrs / 4ºC (cortes por congelación) -Formol-Calcio de Baker (Formol neutro + Cloruro de Calcio al 1%) 2 – 4 hrs. A 4ºC.

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Tejido sin fijar se corta en crióstato. Tejido sin fijar se monta en portaobjeto y se deja secar por 15 min, luego se fija con acetona fría por 10 min. También se puede utilizar Formalina al 10% por 15 min. La actividad más efectiva se logra cuando aplicamos “congelación-desecación” ó “congelación-sustitución” (difícil).

MÉTODOS DE CAPTURA O COPULACIÓN SIMULTÁNEA. I.- MÉTODOS QUE UTILIZAN SALES METÁLICAS Muy utilizado y barato, no siendo el mejor. Método de Gomori (Modificado en 1952). Substrato : B-Glicerofosfato; fenilfosfato ó Naftilfosfato de Sodio Aceptor (Capturador): Ca+2 Producto de la reacción: SCo (Sulfuro de cobalto) El tejido (Riñón en este caso) puede ser fijado en alcohol absoluto por 18 horas a 4ºC ó bién en Formol Calcio de Baker por 2 horas.

Se puede utilizar ión Magnesio (Mg+2) ó Manganeso (Mn+2) al 5x10 elevado a la -3 como cofactor. De igual manera Acido Ascórbico al 0,01 M y sales biliares. El pH, sobre 9,2 tiene un mejor rendimiento del pp del Fosfato de Calcio. A pH 8 – 8,5 se disuelve el Fosfato de Calcio. Bajo pH 9 se obtiene un producto más soluble (el producto de la enzima con el agente capturante).

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La reacción puede ser inhibida por Cisteína (Cis); Fenilalanina )Fenil-Ala; Adrenalina. Especificidad: La hemosiderina, también da la reacción y también reaccionan los grupos Fosfatos del ADN pero, es posible diferenciarlos (Hemosiderina con Pearls y la reacción de los Fosfatos del ADN se solubilizan con Tampón Citrato 0,1 M a pH 5. También podría agregarse más Glicerofosfato). DIFICULTADES DEL MÉTODO:

- Hay difusión de la actividad de la enzima (cuidar el tiempo. Tiempos largos facilitan la difusión)

- Difusión del Fosfato por lenta unión al Calcio (cuidar la concentración del Calcio: unión debe ser rápida, sin difusión y que el Calcio no inhiba a la enzima). Si hay poco Calcio, habrá difusión del Fosfato, unión lenta al calcio y unión del Fosfato a grupos con carga positiva (+), obteniéndose inespecificidad.

- Disolución del Fosfato de Ca a pH < 8,5 . Es una técnica que la mayoría de las veces anda bién, siempre y cuando se controlen las variables (37ºC). II.- Técnica de Burnstone (1958). MÉTODOS QUE UTILIZAN SALES DE DIAZONIO CON LA FORMACIÓN DE UN COLORANTE AZOICO. La ventaja de ésta técnica es que se realiza en un solo paso; es sensible y bastante específica. Eso sí, es cara. Antes de Burnstone se utilizaba Alfa-Naftil Fosfato de la manera siguiente:

Enzima

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Se da en tiempos muy cortos (es una reacción simultánea), no se necesitan controles ya que los Naftoles no existen en la célula animal. El colorante azoico formado, es bastante más insoluble que los Fosfatos de Calcio y son también mejor medidos por citofotometría. Con la azo-copulación, se puede trabajar a pHs no tan alcalinos (pH 8 – 8,5 y no se destruye tanto el tejido) . El método de la Alfa Naftil Fosfato en presencia de Fosfatasa alcalina a pH 8 es más adecuado para que se produzca la copulación del Naftol y la Sal de Diazonio . Tiempo de copulación: Muy rápido y poco controlable. Burnstone, utiliza Naftoles Sustituídos (buén método).

I) NAFTOL AS-MX ( Un Beta Naftol que tiene sustituída una amida con metilos).

II) NAFTOL AS-TR

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La copulación es del orden de segundos (más controlada); presentando los Naftoles una vida media mayor que los Alfa ó Beta Naftil. La copulación se halla favorecida por el pH alcalino. Existe otro método en el que se utilizan Sales de Tetrazolium, y no es muy utilizado en Histoquímica de Fosfatasas Alcalinas . Se utilizan más en IHQ e HIS. El hallazgo de que a partir del uso de Naftoles Fosfato substituídos del tipo AS permitiían la obtención de productos fluorescentes, permitió una aproximación distinta y más efectiva a la visualización y localización de la histoquímica enzimática por fluorescencia,lo cual permitía la detección , aún cuando los niveles de actividad fueran muy bajos. Esto último presentaba un solo inconveniente, la difusión del producto. Esto se solucionó parcialmente a partir del uso de los Naftoles Fosfato AS-BI o AS-MX y el Fast Red, los cuales hacían posible obtener un producto final fluorescente de color rojo relativamente bién localizado. Los problemas con la difusión de los productos de reacción enzimática se mantuvieron debido a que la mayoría de los substratos enzimáticos y los productos incoloros de hidrólisis que debían copular con una Sal u otro medio de captura para generar un producto fluorescente eran solubles. En síntesis, la resolución se veía comprometida por la difusión de los productos de reacción lejos del sitio de la actividad enzimática antes de precipitar como una sustancia coloreada e insoluble. La técnica histoquímica basada en compuestos fluorescentes, idealmente debían proporcionar especificidad, buena localización y fotoestabilidad. Esto se resolvió utilizando substratos fluorogénicos, uno de estos fué el 2-(5´-cloro-2-fosforiloxifenil)-6-cloro4(3H)—quinazolinona ,conocido como ELF-97 fosfato , el que al liberarse del substrato forma un precipitado fluorescente verde –amarillento brillante en el sitio de laactividad enzimática, el cual es visible a la microscopía de florescencia (ver Figura N°7).

I) NAFTOL AS-BI

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II.-FOSFATASAS ÁCIDAS: El pH al cual trabajan se sitúa entre 5 a 5,5. Fijar el riñón con Alcohol Absoluto a 4ºC x 18 hrs. Fijar Intestino Delgado en Acetona anhidra a 4º C por 18 hrs. y luego inclusión en parafina. Técnica de Gomori por Captura de Metal. Es el más utilizado ya que el pH no facilita la copulación con sales de Diazonio. La reacción se puede resumir del la siguiente manera:

La reacción se da en menos etapas y la localización de la enzima suele ser más exacta.

A*: Sublínea de células HeLa en las que se caracterizó a nivel de la ME la ctividad de Fosfatasa Alcalina. Se utilizó Beta-Glicerofosfato al 1,5 % en Buffer TRIS 0,2 M a pH 9 como substrato + Nitrato de Pb. Como inhibidor específico se utilizó Fenilalanina o Homoarginina.Los cortes ,posteriormente fueron incluídos en Epon y cortados en ultramicrótomo. La actividad enzimática se verificó principalmente a nivel de la membrana plasmática y lisosomas. B** : Localización de actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina endógena en cortes de crióstato obtenidos a partir de Intestino de pez cebra por medio de : ELF-97 (E) ; Fast Blue (C); Fast Red (F); BCI/NBT (D). Los controles negativos se obtuvieron por inhibición con L-Fenilalanina . Para la obtención de colorantes azoicos como producto final de la reacción, se utilizó el Naftol Fosfato AS-MX como substrato . * Chi Wei,L et Al. Plasma membrane localization of Alkaline Phosphatase in HeLa cells. J.Histochem & Cytochem. October ,1975 ** Cox,W& Singer,V. A High resolution , fluorescence-based method for localization of endogenous Alkaline Phosphatase activity. . J.Histochem & Cytochem. Vol 47 (11):1443-1455, 1999.

A

Figura N° 7

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Con éste método, al igual que con las alcalinas, utilizaremos siempre el anión Fosfato, la diferencia es que no lo uniremos al Calcio (el Fosfato de Ca es soluble a este pH), utilizaremos una Sal de plomo (varias pueden ser): El anión Fosfato + sal de Plomo = Fosfato ácido de plomo, insoluble e incoloro. Fosfato de Pb + Sulfuro de Amonio = Sulfuro de Pb (negro e insoluble en agua y además en solventes orgánicos). OJO: Las células del Sistema Nervioso presentan metalofilia (Falsos positivos). Si bién el rendimiento de las Sales de Diazonio es inferior con respecto a las Alcalinas, en algo se soluciona este problema utilizando Naftoles Sustituídos (con grupos metilos), lo que los hace más insolubles que el Alfa- Naftol y más reactivos también. Hay distintos Naftoles sustituídos, los más conocidos y aplicados son el Naftol AS-MX y el Naftol AS-TR. Al ser más insolubles, debemos solubilizarlos con Dimetilformamida (DMF). La copulación será más lenta, por lo tanto el tiempo de incubación será más largo (con respecto al Alfa Naftol, en las Fosfatasas Alcalinas) ,sin observarse desplazamientos. Debido a los sustituyentes que presenta, existe mayor afinidad con las proteínas y se desplazará menos.

A.- Actividad de Fosfatasa ácida en mucosa intestinal de rata, visualizada en muestras fijadas en Glutaraldehído y cortadas en crióstato por medio de Beta-Glicerofosfato de Sodio a pH 5,0, utilizando captura por metal. Vease en A, que la actividad enzimática (negro) se halla localizada principalmente a nivel la membrana apical del epitelio. B.- Cortes congelados de glándula prostática humana. Que pónen de manifiesto laactividad de la Fosfatasa ácida La máxima intensidad de la reacción se localiza principalmente a nivel de la membrana apical de las glándulas (Método del DiCloro-Alfa-Naftol + DiazoBlue B = Azocopulación)**. * Serrano,J. The cytochemical demostration of prostatic acid phosphatase using a new substrate, phosphorylcholine. J.Histochem & Cytochem. May, 1976 ** Gomori,G. Histochemical Methods for Acid Phosphatase.

A B Figura N

° 8

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Los Naftoles sustituídos son más estables a pH ácidos, debido a que presentan grupos sustituyentes y toleran incubaciones más prolongadas debido a su escasa solubilidad. Gomori sugiere aumentar la concentración del Glicerofosfato de 0,005 M a 0,14 M y el Nitrato de Pb de 0,037 M a 0,08 M. Mejores resultados se dan, cuando el sustrato está en relación 6:1. El producto final será insoluble; visible y cuantificable.

Respecto a las MEZCLAS INCUBADORAS. El Sustrato debe hallarse en condiciones de saturación con el fin de mantener la velocidad máxima de la enzima. Debe utilizarse el Tampón adecuado , ajustando el pH óptimo a la cual la enzima trabaja (los pH van desde ácidos como el de las Fosf. Acidas = 5; neutros como el de las oxidasas = 7,2 ó bien alcalinos como el la Fosf. Alcalina = 8,5 – 9 ). El tipo de tampón va a depender del pH utilizado, con las Fosfatasas no es conveniente utilizar Buffer Fosfato; utilizamos Acetato ó Bórax.. Con enzimas oxidativas, las coenzimas presentes en el tejido son escasas. Las reacciones de la Deshidrogenasa quitan hidrógenos al sustrato , los que son capturados por la coenzima y de ahí al aceptor artificial de nuestra elección . También necesitamos agregar activadores como Mg+2 ó Mn+2, los más utilizados: ésto dependerá de la enzima. La mezcla debe considerar un agente capturador ó capturante, pudiendo ser este un metal ó un compuestos reducibles como lo son las sales de Tetrazolium u oxidable como la DAB. La concentración es crítica, no debe inhibir a la enzima.

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Respecto a los CONTROLES: Controles negativos se pueden realizar:

- Por supresión del sustrato en la mezcla incubadora. Si no hay sustrato, la enzima no se manifestará y lo que podemos observar como reacción, no será proveniente específicamente de la actividad de la enzima que estamos estudiando.

- Utilizando inhibidores específicos. Una misma familia de enzimas suele inhibirse con el mismo inhibidor (Fosfatasas alcalinas con Levamisol; otras con cisteína, etc).

- Desnaturalización por calor. Si calentamos por 10 min en agua hirviendo el corte ó trozo delgado de tejido fresco, inhibiremos todas las enzimas.

En el caso de las enzimas oxidativas, estas no se trabajan en cortes por congelación, ya que el CO2 las inhibe (cuando se utilizaba micrótomo de congelación), es recomendable trabajar en cortes obtenidos a partir de crióstato.

II.- OXIDO REDUCTASAS.

SH2 + A S + AH2 El substrato reducido es oxidado por la enzima, reduciendo al aceptor.

Con respecto a las enzimas oxidativas, diremos que para su estudio es crítico el tiempo que el tejido permanece en hipoxia. La fijación inactiva a la enzima (cuidado con el desplazamiento) ; la morfología también será deficiente. Una vez obtenida la muestra, esta debe ser congelada rápidamente. Los cortes también deben ser mantenidos en frío. Si congelamos, debemos asegurarnos de que no haya descongelación (se pierden cofactores solubles). Entonces congelamos, guardamos a -20ºC (hasta 7 días), ideal a -80ºC con Isopentano (hasta 1 mes). Por factores osmóticos, puede existir aumento de la permeabilidad mitocondrial, con fuga de cofactores ó coenzimas (NAD; NADP; FAD), para evitar esto último se agregan agentes protectores como la PVP (polivinilpirrolidona) o la Sucrosa (Sacarosa) al 0,88 M, medios considerados como hiperosmóticos.

Enzima

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DE ACUERDO AL ACEPTOR, LAS ENZIMAS LAS PODEMOS DIVIDIR EN 3 GRUPOS:

a) OXIDASAS: Las hallamos en gral. en la cadena respiratoria (mitocondria). EL ACEPTOR ES ESPECÍFICO, EL OXÍGENO.

SH2 + O2 S + H2 O

Estos complejos enzimáticos se encuentran en el espesor de la membrana mitocondrial. Estan ordenados de acuerdo a su potencial de acción. En la catálisis participa oxígeno. Aquellos con potencial más negativo se hallarán al comienzo de la cadena (-0,320 volt) La citocromo oxidasa se compone de 2 grupos Heme y 2 atomos de Cobre (Cu). LAS SALES DE TETRAZOLIUM utilizadas como aceptores artificiales (para identificar cada complejo) se seleccionan de acuerdo a las diferencias de potencial adecuados, que le otorgan especificidad.

b) PEROXIDASAS:. -Citocromo C peroxidasas: (oxidan al citocromo C en presencia de peróxido de Hidrógeno). -Catalasas: transforman el peróxido de Hidrógeno en agua + oxígeno. -Peroxidasas: diversas que corresponden a las verdo-peroxidasas.

SH2 + H2O2 S + 2H2 O Seudoperoxidasas: la hemoglobina da la reacción (descompone el peróxido de hidrógeno a Agua + oxígeno). La reacción más antigua conocida es la de ADLER (1904). Trabajó con Benzidina en presencia de peróxido de hidrógeno.

Oxidasa

Deshidrogenasa

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El incoveniente: Soluble en alcohol; Benzol; Tolueno , virando de azul a café pardo (poco visible). Se utiliza Nitroprusiato de Sodio como un estabilizante. La citoquímica de las peroxidasas son utilizadas como marcadors para diferenciar ciertas entidades patológicas. La línea blanca presenta gran cantidad de peroxisomas. Ejp: Diferenciar leucemias Mieloblásticas de Linfoblásticas:

Neutrófilos (+); Eosinófilos (+); Mieelocitos (+); Lnfocitos (-).

c) DESHIDROGENASAS ANAERÓBICAS. Existe una gran familia de Deshidrogenasas que participan en el Ciclo de Krebs.

EL ACEPTOR NUNCA ES OXÍGENO, sino NAD; NADP; FAD (Coenzimas).

SH2 + A A H2 + S El sustrato es específico (Deh. Láctica/Ac. Láctico; Deh. Succínica/ Succinato ó Ac Succínico; etc)

EL SUSTRATO SE OXIDA, LA COENZIMA SE REDUCE

Deshidrogenasa

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Recordemos que el FAD se halla unido covalentemente a la enzima (grupo prostético), por lo que no requiere que la agreguemos a la solución de incubación. Distinto es el caso de NAD y NADP, el que puede difundir y bajar su concentración en la célula. Succino Dehidrogenasa: Normalmente la acción de esta enzima se acompaña de la reducción de su coenzima (FAD) y posteriormente el FAD céde su protón a la cadena respiratoria.

Receptores o aceptores artificiales de protones (sustancias con potenciales de reducción similares a la del FAD: Azul de Metileno ; Sales de Tetrazolium).

El potencial redox debe ser el adecuado para que, la substancia que funciona como aceptor artificial, pueda aceptar protones con facilidad. El aceptor (SAL DE T.). debe funcionar como un marcador, o sea al reducirse se conviertan en un producto insoluble y coloreado (FORMAZANES). Una vez reducidas, deben ser estables a la reoxidación (especialmente durante el montaje de las preparaciones).

Compuesto soluble y débilemnte coloreado Compuesto insoluble , fuertemnte coloreado e insoluble en lípidos

SAL DE TETRAZOLIUM FORMAZAN

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Los FORMAZANES presentan algún frado de liposolubilidad, por tanto, la idea es que el Formazan sea lo más insoluble posible en lípidos. Para el análisis de la raección, es importante el tamaño de las partículas de Formazan (en gral. tienden a dar precipitados groseros). Mientras mása fino sea el formazan, mayor resolución presentará la señal. La idea general al utilizar Sales de Tetrazolium en la caracterización de oxidasas es, reemplazar el aceptor biológico por un aceptor artificial (Sal de Tetrazolium), la que en estado oxidado no presentan color y es soluble , una vez reducidas, son coloreadas e insolubles (Formazanes). Las Sales de T. recibirán los H+ del FAD (deben presentar un potencial de óxido-reducción mayor que el que presenta el FAD, de modo que el FAD ceda los protones al aceptor artificial.

A: Sales de Tetrazolium .Actividad de la Succino deshidrogenasa en cortes de crióstato , enzima mitocondrial que caracteriza a las fibras musculares aeróbicas. Las fibras anaeróbicas no presentan depósito de formazan. La marcación se concentra en la periferia de cada una una de las fibras aeróbicas, en relación al sarcolema por reducción del NBT. Músculo esquelético de cerdo. B: Sales Metálicas.La actividad ATPásica es característica de fibras aeróbicas y anaeróbicas, con una mayor o menor densidad en la fibra muscular. El fosfato clivado del ATP por la enzima, es capturado por una Sal de Cobalto, la cual es posteriormente ennegrecida por la formación del Sulfuro de cobalto. Las fibras musculares que no presentan marcación dicen relación con fibras de contracción lenta ( cuyas Isoenzimas presentes,tanto en fibras lentas como rápidas fueron inactivadas por el tratamiento previo de los cortes de crióstato del tejido con Formaldehído).

A B

Figura N

° 9

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CARACTERÍSTICAS DE ALGUNAS SALES DE TETRAZOLIUM

CARACTERÍSTICAS QUE DEBERÍA PRESENTAR UNA BUENA SAL DE TETRAZOLIUM:

+ 1.- Que sean reductores eficientes (con un potencial redox alto, más que el aceptor biológico) 2.- Que las partículas de Formazán sean insolubles en lípidos (inespecificidad). 3.- Que las partículas sean pequeñas, para tener una buena localización de la actividad enzimática . 4.- Que sean estables y no alteradas por la luz. La sales con un grupo Tetrazolium dan un color rojo; las que presentan dos grupos son de color azul. Las Sales utilizadas habitualmente son del tipo di- tetrazolium. En relación a la mezcla incubadora utilizada:

- Se trabaja a pH= 7 – 7,2 , para todas las deshidrogenasas se utiliza el mismo pH, de ser más alcalino habría reacción inespecífica del NAD ó NADP. Muchos grupos SH presentes en el músculo, actúan como reductores a pH alcalino (> 8,5) lo que ocasionará la reducción de la Sal de T. de manera inespecífica. A pH = 7, los grupos SH no presentan poder reductor.

Sal de

Tetrazolium

Sensibilidad

Color

Estabilidad frente a la

reoxidadción

Soluble en

lípidos

Precipitado

TTC 1 Rojo Inestable Insoluble Muy grueso INT 3 Púrpura Inestable Insoluble Grueso NT 3 Púrpura Estable Soluble Variable BT 2 Rojo-Azul Estable Soluble Variable

NNT 4 Púrpura Inestable Insoluble Fino NBT 4 Azul Inestable Insoluble Fino NTT 4 Negro Inestable Insoluble Fino

TNBT 4 Azul Inestable Insoluble Fino

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-El Buffer utilizado es TRIS. -El substrato es generalmente el anión inorgánico como sal sódica (Succinato de Sodio). - La Coenzima es NAD ó NADP (debe agregársele, ya que escasea). Con respecto al FAD, no es necesario ( es un grupo prostético). -Cofactores: generalmente ión Mg. - Se le agrega Sucrosa o PVP que contribuyen a la hiperosmolaridad (así no difunden las enzimas). En resumen: para la determinación de Deshidrogenasas, reemplazamos el aceptor biológico por un aceptor artificial , que en estado oxidado es incoloro y soluble y en estado reducido, es insoluble y coloreado.

CITOQUÍMICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A LA ULTRAESTRUCTURA (MET).

EN MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA LOS ESTUDIOS ENZIMÁTICOS SE UTILIZAN PARA PRECISAR LOCALIZACIÓN. SI QUEREMOS MEDIR ACTIVIDAD, DEBEMOS UTILIZAR MÉTODOS A NIVEL DE LA MICROSCOPÍA ÓPTICA. Para ello encontramos 2 modalidades: 1.- Demostrar la actividad (histoquímica enzimática) 2.- Demostración de la proteína (inmunocitoquímica). FIJADORES EN CITOQUÍMICA ENZIMÁTICA: -Formaldehído (a partir de p-Formaldehído ya que el metanol inactiva algunas enzimas): 4ºC al 4% y el tiempo sería variable (según la enzima). -Glutaraldehído: 0,2 -0,5 % a 4ºC. -Mezclas de ambos. - Solvente utilizado en la mezcla incubadora: Buffer cacodilato a pH de 7,2 ; 0,1 M. Se trabaja con pequeños trozos de tejido de 20 a 250 micrones de espesor.

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Los cuales se congelan en Isopentano sumergido en N líquido (almacenaje en Isopentano); Cortes en Crióstato a -10 a -20ºC. Los objetivos de la Histoquímica enzimática a nivel de la MET, serían muy similares a la microscopía óptica.

- Preservar actividad. - Consevar localización.

La ecuación general para ME, dice relación con: SSUUBBSSTTRRAATTOO ++ EENNZZIIMMAA PPRROODDUUCCTTOO DDEE RREEAACCCCIIÓÓNN PPRRIIMMAARRIIOO ((PPRRPP)) ++ AAGGEENNTTEE CCAAPPTTUURRAANNTTEE PPRROODDUUCCTTOO FFIINNAALL DDEE LLAA RREEAACCCCIIÓÓNN ((PPFFRR)) == EELLEECCTTRRÓÓNN DDEENNSSOO

Mezcla incubadora: Sustrato: A concentración saturante. Agente capturante: Sales metálicas (Plomo: Aluminio; Cerio) ; Sales de Diazonio; Sales de Tetrazolium. Debe hallarse en concentración adecuada. Cercano al sitio de reacción de la enzima. Factores que influyen en lo anterior: espesor del tejido; grado de compactación del mismo; Fijación. Temperatura: Más baja que la óptima fisiológica, si la enzima es abundante. pH: El apropiado para la enzima. Osmolaridad: Fisiológica.

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Tratamientos posteriores a la incubación: -Si tejido no ha sido fijado, fijarlo con glutaraldehído. -Si el PFR no presenta el contraste adecuado, intentar aumentarlo (generalmente se utiliza post-fijación en Osmio) Con respecto a las características del producto final, podemos decir: -Debe formarse inmediatamente y este debe ser muy insoluble y electrón denso. Podemos tener dos tipos de producto final de reacción (PFR): -Un pp estable que no presenta un contraste adecuado por lo que debemos tratarlo con Osmio. Ejps: Sales de Diazonio; Sales de T. y DAB. -Un pp estable, no reactivo, con alto contraste electrónico y resistente a tratamientos posteriores ( uso de Sales de Plomo; Aluminio; Cerio; Ferrocianuro Cúprico, etc). Efectos de la fijación en histoquímica enzimática para ME. -Disminuye ó inhibe la actividad enzimática por desnaturalización de la proteína. -facilita penetración de reactivos.

ESTUDIO DE FOSFATASAS A LA ME. Fijación: Glutaraldehído al 2% + Sucrosa (2 horas a 4ºC, si se trata de trozos pequeños) Sustratos: Beta- Glicerofosfato ; Citidín-5-Monofosfato. Agentes capturantes: Pb; Al; Ce. Sales de Plomo (Pb): -Pueden dar reacciones inespecíficas por afinidad con estructuras ululares. -Inhibe a las Fosfatasas. -Se obtienen pp groseros (mala localización). -Penetran lentamente. -Técnica de Gomori (1952). Sales de Aluminio (Al): -Más específico. -pp finos que no enmascaran estructuras de lisosomas.

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Cerio (Ce): -Buen capturante de Fosfato. -Reacciones más uniformes y reproducibles. -Más específico. -pp finos. -Poco penetrante (usar cortes delgados de 4 – 7 micras. -Células de cultivo deben permeabilizarse con detergentes. A.- Demostración de Fosfatasas ácidas con sales metálicas a ME:

B.- Demostración de fosfatasas alcalinas con Sales de Diazonio:

C.- Demostración de deshirogenasas con Sales de Tetrazolium:

Sustrato + Sales de Tetrazolium(*) Formazán + Substrato oxidado

SE SUBSTITUYE EL ACEPTOR BIOLÓGICO (TISULAR) POR UNO ARTIFICIAL (*)

Enzima

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D.- Demostración de deshidrogenasas con sales metálicas:

SUBSTRATO + FERRICIANURO DE K

FERROCIANURO CÚPRICO + SUBSTRATO OXIDADO (Electrón denso) Actividades a desarrollar por el alumno. 1.- Para cada una de las enzimas estudiadas , realice un cuadro de análisis,en el que se ponga de manifiesto los componentes de la solución substrato, consignado de manera clara la siguiente información: - Enzima. - Modalidad del método ( Captura por metal; Copulación simultánea; reducción de sales de T. ). - Substrato. - Agente capturante(cuando corresponda). - Agente copulador (cuando corresponda). - Producto primario de la reacción (cuando corresponda). - Aceptor artificial (cuando corresponda). - Tampón , pH y T°. - Coenzima o aceptor biológico(cuando corresponda). - Cofactores. - Inhibidores generales o específicos. - Producto final de la reacción (PFR). - Control (+). - Control (-).

Enzima

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HISTOENZIMOLOGÍA O HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA: El objetivo es la demostración de la actividad enzimática presente en los tejidos. Para ello se emplean diversas sustancias (cromógenos o sales metálicas) que, bajo la acción de la enzima, adquieren una coloración determinada o precipitan un producto insoluble poseedor de color, indicativo de la presencia de dicha enzima. TIPO DE REACCIÓN que catalizan: HIDROLASAS; OXIDOREDUCTASAS; TRANSFERASAS; LIASAS; LIGASAS; ISOMERASAS.

I) CLASIFICACIÓN EL SUSTRATO cuya descomposición catalizan : FOSTASA ALCALINA : 5´NUCLEOTIDASA.

II) FUNDAMENTO GENERAL DE LAS TÉCNICAS HISTOENZIMOLÓGICAS: DEMOSTRACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN UN TEJIDO: CONSERNAR LOCALIZACIÓN Y ACTIVIDAD DE LA ENZIMA EN EL TEJIDO. Solubilidad de la enzima LOCALIZAR CORRECTAMENTE EL PRODUCTO DE LA ACTIVIDAD. COLOREADO (Producto Final Coloreado = PFC) Enzima + Sustrato Producto Primario de la Reacción (PPR) INSOLUBLE Y REDUCIDO . Ejp. Oxido reductasas (soluble no coloreado) OXIDADO PPR NO OPACO O COLOREADO + AGENTE CAPTURANTE Producto Final Coloreado (PFC). Sal metálica o colorante azoico E INSOLUBLE.

III) NIVELES DE OBSERVACIÓN: 1.- MICROSCOPÍA ÓPTICA : Sales metálicas ; Sales de Diazonio (Colorantes Azoicos); Sales de Tetrazolium (Formazanes). 2.- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA: -Demostración de actividad enzimática (citoquímica) ó demostración de la proteína (ICQ).

- Agentes capturantes: Sales de Pb; Al; Ce; Sales de Diazonio; Sales de tetrazolium. OBJETIVO DE LA FIJACIÓN EN HISTOENZIMOLOGÍA: CONSERVAR MORFOLOGÍA; INSOLUBILIZAR A LA ENZIMA Y AUMENTAR LA PERMEABILIDAD DE LA CÉLULA.

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IV) PROBLEMÁTICAS ASOCIADAS A LA TÉCNICA: A.- ESTRICTEZ DE LAS VARIABLES : Temperatura; pH; Substratos; Cofactores; inactivadotes; etc. B.- FALSOS (-) : NO SE OBSERVA REACTIVIDAD Y DEBERÍA VERSE. -Por difusión de la enzima.

C.- FALSOS POSITIVOS: -Contaminación (bacteriana = enzimas homónimas). -Absorción inespecíficas. V ) APLICACIONES: La Histoenzimología ( ) v/s la IHQ.

- Resulta más sencillo certificar la presencia de la enzima, atendiendo a su estructura antigénica que a su actividad biológica. - Vigencia de la Histoenzimología en :

CONTROLES GRALES:

Eliminación de actividad enzimática por calor (60 – 90ºC). FALSOS POSITIVOS Ausencia de Sustrato en la mezcla incubadora. FALSOS NEGATIVOS: Incubando simultáneamente tanto la muestra problema, en la que se pretende determinar la actividad y el tejido control (testigo), cuya presencia y actividad es certificada. La muestra control nos debiera confirmar la correcta manipulación técnica y confirmar la validez del método.

a.- Biopsia de músculo esquelético. b.- Detección de ganglios y tejido nervioso en Hirschprung. c.- Defectos enzimáticos en biopsia yeyunal. d.- Identificación de células del Sistema hematopoyético. e.- Demostración de mastocitos. f.- Identificación de actividad osteoblástica.

EXISTE REACTIVIDAD NO DEBIENDO HABERLA; DEBIENDO OBSERVARSE, ESTA NO PRESENTA LA LOCALIZACIÓN ADECUADA.

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VI) FIJACIÓN, INCLUSIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: - La actividad enzimática sólo la encontramos presente en células y tejidos vivos. MÉTODO IDEAL: CRIODESECACIÓN (Freeze-Drying) y CRIOSUSTITUCIÓN (Freeze-Substitution), la actividad enzimática no se altera y el tejido queda incluído y listo para ser cortado por congelación. EN EL CASO DE FIJACIÓN PRE-REACCIÓN : -Es posible utilizar FORMALINA TAMPONADA al 10 % / 4º C ; FORMOL CÁLCICO . -El tejido fresco y congelado en N líquido ó Isopentano a -50º C. Luego se corta en criostato (- 20º C) y se fija en acetona fría. (favorece la deshidratación y post coloración de contraste, sin modificar la actividad de la enzima. CON RESPECTO A LA INCLUSIÓN , PREVIA OBTENCIÓN DE CORTES AL MICRÓTOMO:

- Imbibición en medio hidrosoluble (OCT =” Optimal Cutting Temperatura) antes de congelar. - Inclusión en gelatina o PEG, sin extracción del agua tisular. - Inclusión en parafina de bajo punto de fusión (40 º C) y conservación relativa de la actividad enzimática. Utilizando como agente deshidratante: Acetona.

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MODALIDADES DE CAPTURA; COPULACIÓN Y ACEPTORES ARTIFICIALES EN HISTOENZIMOLOGÍA

I.- MÉTODO PARA FOSFATASAS ALCALINAS (Gomori modificado): SALES METÁLICAS.

CH3-OH I II OH pH :8,9 – 9,4

CH2-O---P=O _ ENZIMA___ Ca3(PO4)2 + Co(NO3)2 Co3 (PO4)2 + Ca(NO3)2 OH Ca Cl2 insoluble e incoloro CH3-OH (soluble) a pH <8,5) III IV

+ S(NH4)2 Co S Negro,insoluble

Lo más indicado para Fosfatasas ácidas

II.- MÉTODO PARA FOSFATASAS ALCALINAS (Burnstone, 1958): MÉTODO POR COPULACIÓN SIMULTÁNEA (AZOCOPULACIÓN).

ONa aN-P=O OH OH

Fsfatasa Alk. + _N=N_ Na2 HPO4 + + -N≡N- + H2O Naftol Fosfato de Na (Sustituídos) Naftol Sal de Diazonio Colorante Azoico (osmiófilo)

No adecuado para Fosfatasas ácidas

III.- MÉTODO QUE UTILIZAN SALES DE TETRAZOLIUM: IDENTIFICACIÓN DE ÓXIDO-REDUCTASAS. COOH COOH

CH2 Succino-deshidrogenasa –FAD CH + H+

+ SAL DE TETRAZOLIUM (N=N +, CÍCLICA) FORMAZAN

CH2 CH (OXIDADA , INCOLORA Y SOLUBLE) Aceptor reducido, coloreado e insoluble. COOH COOH Aceptor artificial (débilmente osmiófilo) Ac. Succínico Ac. Fumárico

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MÉTODOS PARA FOSFATASAS ÁCIDAS: pH : 5 -5,5 Mala Copulación MÉTODOS PARA FOSFATASAS ALCALINAS: pH : 8,8 – 9,4 OXIDASAS: SH2 + O2 S + H2O Sustrato inespecífico ; Aceptor oxígeno (Citocromooxidasa) MÉTODOS PARA ENZIMAS OXIDATIVAS : DESHIDROGENASAS: H2 + A AH2 + S (ÓXIDORREDUCTASAS) Aceptor nunca es oxígeno (NAD; FAD; NADP); Sustrato específico. Mitocondrias Requieren oxígeno; Lábiles a la Anoxia; resisten mal la fijación PEROXIDASAS: SH2 + H2O2 S + 2 H2O Peróxido como oxidante (ACEPTOR) y el agua como aceptor. Inespecíficas para El sustrato que es el DADOR (CROMOGENO SE OXIDA)

SALES METÁLICAS(Gomori, 1950): Tampón acetato 0,1M pH 5 + Nitrato de Pb + Β-Glicerofosfato de Na. =Sulfuro de plomo(n) SALES DE DIAZONIO(Burnstone, 1962): Naftol Fosfato AS-MX ; N,N-DMF + Tampón acetato 0,1 M, pH 5,2; Fast Blue B.

SALES METÁLICAS (Gomori, 1952): β-Glicerofosfato +Cloruro de Calcio+ Sulfato de Magnesio+ barbital sódico. SALES DIAZONIO (Gomori, 1951): Naftol Fosfato AS-MX + N,N- DMF + Tampón TRIS- Maleato 0,05 M, pH 8,7 + Fast Red TR. VENTAJA: UN SOLO PASO; SENSIBLE Y ESPECÍFICA.

PROBLEMAS DEL MÉTODO (sales Metálicas): 1.- Difusión de la actividad de la enzima (no tiempos largos). 2.- Difusión del Fosfato por lenta unión al Calcio (poco calcio, difusión del Fosfato y unión a grupos (+) del tejido. 3.- Disolución del Fosfato al usar pH < 8,5 (solubilización).

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BIBLIOGRAFÍA.

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