BIOLOGIA CELULAR

5.- TECNICAS DE ESTUDIO DE LA CELULA

5.1. Microscopía.

5.1.1 Electrónica y óptica La mayoría de los microscopios utilizan luz visible

como fuente de iluminación y se denominan microscopios ópticos. Los

microscopios ópticos con una sola lente, como el de Leeuwenhoek, actúan

como una lupa simple. Se denominan microscopios simples. El uso de un

microscopio simple requiere cierta habilidad, porque el espécimen ha de

mantenerse muy cerca del ojo del observador. (Se ha dicho que el éxito de

Leeuwenhoek fue debido en parte a que era corto de vista.) Los microscopios

simples no producen buenas imágenes debido a los fenómenos de aberración

(defecto) de las lentes.

Los microscopios ópticos de nuestros días son descendientes del microscopio

compuesto, que ya se había inventado, aunque no perfeccionado, en la época

de Leeuwenhoek. Un microscopio compuesto tiene dos lentes, lo cual permite

un mayor aumento; pero todas las lentes simples ya sean una, en un

microscopio simple o dos, en uno compuesto- presentan aberraciones. La

imagen aparece, a menudo, rodeada de anillos coloreados, y no todas las

partes del campo de observación se encuentran enfocadas. El problema se

solventa usando lentes correctoras, de manera que todas juntas constituyen

un sistema de lentes. Por tanto, un microscopio moderno tiene realmente dos

sistemas de lentes objetivo y ocular.

5.1.2 Contraste de fase Microscopio de contraste de fase – Permite

observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células

vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción

en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una

muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de

refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con

respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra.

Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie

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de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de

la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil

sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las

porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen

corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos

microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y

cortes semifinos no coloreados.

5.1.3 Luz ultravioleta Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el

microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por

las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una

longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una

resolución de 0,1 um. La microscopia ultravioleta no es muy diferente

del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son

registrados en fotografías. La muestra no se puede observar

directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar

la retina.

El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que

contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas

específicas para la iluminación se puede obtener mediciones

espectrofotométricas para cuntificar el DNA y el RNA de cada célula.

Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple

modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante

llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un

segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el

observador.

Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus

ángulos de rotación se usa para determinar el grado en que una

estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un

cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se

denomina birrefringencia.

Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las

inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares

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.5.1.4 Polarización

¿Qué pasa cuando una fuente ordinaria de luz pasa a través de ciertos

cristales? Los átomos en un cristal estan acomodados en una gran número de

canales paralelos. La luz pasa a través de ambos cristales cuando sus canales

son paralelos, pero se cortará completamente si los canales están cruzados.

Un solo cristal entonces mantendrán

atrás todas las vibraciones excepta una

que está alineada con su propia fibra.

Una fuente de luz cuyas vibraciones

son de este modo confinadas en una

dirección se dice que es un polaridazor

plano. Esta experiencia también nos muestra que las ondas de la luz son

traversas. La onda longitudinal no pueden ser polarizadas.

Una invención de Nicol puede ser usada para producir y detectar la luz

polarizada. Este es conocido como el prisma Nicol. El prima se coloca en el

frente de la fuente de luz y es rotado. Si la fuente de luz es plana polarizada la

luz que se ve a través del prisma Nicol varía en intensidad y nada pasa a través

del prisma en cierta posición y el brillo del camino.

La luz polarizada puede ser usada para encontrar simplemente como la fuerza

de la luz se distribuye en las partes de una maquinaria. Un modelo de una

parte está hecha de plástico y sujetada al tipo de fuerza. Cuando se ve por la

luz polarizada, aparecen bandas de colores que muestran exactamente donde

se ejerce la fuerza en la pieza.

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Fig 108Credits: Freeman

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5.1.5 Fluorescencia Microscopio de fluorescencia – Una molécula que

fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del

espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta.

Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la

vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas

autofluorecentes su aplicación más difundida es para revelar una

fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o

anticuerpos en procedimientos de coloración inmunocitoquímica.

También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un

animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos

métodos sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de

las fibras nerviosas en neurobiología y en detección de marcadores del

crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados.

5.2 Métodos citoquímicos. Las técnicas histoquímicas son un conjunto de

técnicas usadas para la localización de moléculas, dependiendo del nivel

donde estemos trabajando se llamarán histo-químicas (tejidos) o citoquímicas

(célula) aunque ambos términos se usan como sinónimos.

5.2.1 Tinción Existen técnicas de tinción específicas que ponen de

manifiesto distintos componentes celulares:

*Técnica del PAS ( ácido peryódico de Schiff) se utiliza para teñir carbohidratos

y revela la existencia del glicocáliz que aparece de color morado.

*La tinción de Feulgen es específica para el ADN y tiñe el núcleo de color

morado.

*Los lípidos se pueden detectar con tetróxido de osmio (color negro) o con rojo

de Sudán (rojo).

*El almidón se detecta con la solución de Lugol y aparecerá de color violeta.

*El colorante llamado verde brillante tiñe la lignina.

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Otro tipo son las técnicas de tinción diferenciales que utilizan al

menos dos colorantes distintos; es el caso de la llamada tinción de gram que

permite diferenciar bacterias gram + (color azul) de bacterias gram – (color

rojo).

nvestigación de tejidos muertos y preservados.

En general los métodos histológicos se clasifican en dos grupos:

Los que se basan en la observación directa de células y tejidos vivos

Los que analizan material muerto o inanimado.

5.2.5.3.1 Fijación Métodos histológicos. Existe un conjunto de procedimientos

implicados en la descripción y comprensión de la estructura de las

células y de los tejidos vivos, que por motivos técnicos, muchas veces

se debe serguir el camino de la

5.3.2 Inclusión

5.3.3 Corte

5.3.4 Montaje

5.3.5 Tinción5.3. Fraccionamiento del contenido celular.

El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y

fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El

objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y

mitocondria del tejido de plantas por el método de fraccionamiento celular. Los

otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y estimar el

coeficiente de sedimentación de los cloroplastos.

5.5 Marcaje de moléculas celulares con isótopos RADIOACTIVOS

Se utilizan en la centellografía, utilizando la emisión de radiación gamma de

algunas sustancias radiactivas. Se introducen en el organismo y con un

detector apropiado se ubican los sectores donde se acumula en mayor medida.

Su resolución es muy baja.      Como los isótopos radiactivos se usan para

determinar el tiempo que hace que se solidificaron las rocas (edad de las

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rocas) se les conoce como “los relojes naturales”. Por ejemplo, si una roca

contenía uranio-238 al solidificarse los productos de la desintegración

radiactiva del uranio no pueden escapar por difusión, por lo que quedan

retenidos en la roca, y se transforman en plomo-206. Para conocer la vida

media (t1/2) de la roca se necesita conocer la reacción química global del

proceso y la relación actual entre el plomo-206 y el uranio-238 en la roca, y es:

La resonancia magnética nuclear (RMN o NMR de sus siglas en inglés) es un

fenómeno físico basado en las propiedades magnéticas que poseen los

núcleos atómicos. La RMN permite alinear los campos magnéticos de

diferentes átomos en la dirección de un campo magnético externo. La

respuesta a este campo externo depende del tipo de núcleos atómicos por lo

que esta técnica puede utilizarse para obtener información sobre una muestra.

La resonancia magnética nuclear hace uso de las propiedades de resonancia

aplicando radiofrecuencias a los átomos o dipolos entre los campos alineados

de la muestra y permite estudiar la información estructural o química de una

muestra. La RMN se utiliza también en el campo de la investigación de

ordenadores cuánticos. Sus aplicaciones más frecuentes se encuentran ligadas

al campo de la medicina.

Aplicaciones médicas

En medicina, la Resonancia Magnética es una técnica de obtención de

imágenes del organismo basada en el fenómeno físico de la resonancia. Estas

imágenes se utilizan como fuente de información en numerosos diagnósticos.

RM funcional

La RM utiliza fuertes campos magnéticos que actúan sobres los átomos que

componen diferentes sustancias en el cuerpo como el hidrógeno. Los

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diferentes tejidos emiten diferentes ondas en función de su densidad y de su

contenido en agua. Una computadora traduce los patrones de estas ondas en

imágenes muy detalladas de las partes del cuerpo en las cuales se pueden

identificar anomalías que pueden ser utilizadas para un diagnóstico médico. La

RM produce cortes axiales (trasversales) del cuerpo parecidos a los de la

tomografía axial computarizada, pero también puede presentar proyecciones

en diferentes planos: coronales y sagitales. Como en la TAC, se puede usar

contraste intravenoso (gadolinio).

Es una de las técnicas más novedosas de la Radiología. La técnica usa

equipos con potentes campos magnéticos que oscilan desde 0,2 hasta 2 ó más

Teslas (1 Tesla = 10.000 Gauss). Los campos así generados son capaces de

alinear ordenamente el momento magnético de los átomos con un número

impar de nucleones del organismo que se estudia. Que se somete a señales de

radio frecuencia, que le otrogan energía a los diferentes átomos, cuando la

señal cesa, los átomos se realinean con el campo magnético, esto produce

liberación de energía en forma de señales electromagnéticas que son

recogidas por bobinas (antenas)y procesadas por ordenador, que se emplean

para formar imágenes del cuerpo. El átomo más abundante y utilizado

usualmente en este estudio es el de Hidrógeno.

Esta prueba de imagen se realiza en el servicio de Imagen, a pesar de que no

es una exploración radiológica en la que se empleen rayos X, ni se esté

expuesto a radiaciones ionizantes. El inconveniente de esta prueba es el

tiempo que se emplea en su realización, el ruido molesto que produce y que no

se debe realizar en las personas que porten cualquier dispositivo metálico

como prótesis, marcapasos, etc. Además, el paciente debe colocarse en el

interior de un tubo que impide el movimiento durante un periodo prolongado de

tiempo, a veces hasta una hora, lo que puede molestar a las personas que

padecen de claustrofobia.

Una modalidad de resonancia magnética es la resonancia magnética

endorrectal, que se utiliza sobre todo para el estadiaje del cáncer de próstata.

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%C3%A9tica_nuclear"

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