aproximaciÓ estructural al cas tgn1412

APROXIMACIÓ APROXIMACIÓ ESTRUCTURAL ESTRUCTURAL

AL CAS TGN1412AL CAS TGN1412

Aparicio E, Esteve A, Fandos N, Gómez V, Lahuerta N, Llopis A, Moros A, Rocasalbas M, Rovira P, Ruiz A, Titos I

Grup F

Ja s’ha vist que el seguiment de protocols per l’estudi era

correcte per la normativa vigent del moment.

No obstant això, no se sap si amb la dosi MABEL es donarien els mateixos

efectes.Podria haver-hi

altres causes dels efectes?Nivell

molecular

?

Índex

CD28 I IMMUNOGLOBULINES PREGUNTES

RELACIONS EVOLUTIVES MODELATGE

1. Obtenció de seqüències:1.1 Seqüències originals 1.2 Seqüències humanitzades

2. Modelatge creació paral·lela d’ Ac2.1 Procediment2.2 Patrons escollits2.3 Avaluació dels models2.4 Dinàmica molecular dels models

INTERACCIONS TGN1412 – CD281. Heavy Chain – Light Chain 2. Fab – CD28

INTERACCIONS Fab – Fc: AGREGATS CD28 i CTLA4

CONCLUSIONS

• Basat en varis patrons

• Basat en 1 patró murí

• Basat en 1 patró humà

CLASSE all beta proteins

PLEGAMENT immunoglobulin-like beta-sandwich

SUPERFAMÍLIA immunoglobulin 4 FAMÍLIES

V set domains (antibody variable domain-like)

C1 set domains (antibody constant domain-like)

C2 set domains

I set domains

Classificació SCOP Ig

Estructura IgG

Dominis Constants Dominis variables

Cadena

pesada

CH1

CH2, CH3 Fc

4 + 3 ß

Greek keys

CH2 conté N-carbohidrats

VH

CDRs

5 + 4 ß

Greek keys

ß-bulge (G): G-X-G-Aromàtic

Cadena

lleugera

CL

4 + 3 ß

Greek keys

VL

CDRs

5 + 4 ß

Greek keys

ß-bulge (G): G-X-G-Aromàtic

CDR2 CDR3

CDR1

CDR1

CDR3 CDR2

VH VL

CH CL

CDR1

CDR2

CDR3

CDR1

CDR2CDR3

Estructura IgG

Estructura CD28

Receptor fisiològic de CD80 i CD86

Homodímer de 44 kDa - domini extracel·lular IgV-like

5 + 4 ß i ß-bulge

- regió transmembrana- domini intracel·lular ric en

motius senyalitzadors

L’estimulació d’aquest receptor provoca: Inducció flux de calci Síntesi interleucines IL2

V set domain

CD80, CD86 i els anticossos

convencionals s’uneixen a

regions distals de la superfície de la membrana i coestimulen la senyalització de

TCR, però no provoquen una

activació òptima

CD80, CD86 i els anticossos

convencionals s’uneixen a

regions distals de la superfície de la membrana i coestimulen la senyalització de

TCR, però no provoquen una

activació òptima

CD28: interaccions

CD28: interaccionsSenyalització intracel·lular depenent del lloc d’interacció:

Els anticossos mitogènics

s’uneixen a la regió C’’D al costat del receptor i

provoquen una activació total de

la cèl·lula T

Els anticossos mitogènics

s’uneixen a la regió C’’D al costat del receptor i

provoquen una activació total de

la cèl·lula T

Qüestions

1. Existeix conservació entre CD28 de diferents

espècies?

2. La humanització de TGN1412 va provocar algun

canvi estructural respecte l’Ac murí?

Qüestions

Qüestions

4. La regió Fab de TGN1412 és capaç

d’interaccionar amb la regió Fc?

Qüestions

Qüestions

RELACIONS RELACIONS EVOLUTIVESEVOLUTIVES

1. Existeix conservació entre CD28 de diferents espècies?

Seqüència

Funció

Estructura

Homòlegs

Ortòlegs

Paràlegs

~

Anàlegs Superfamília

a ortòleg respecte b i c

b, c paràlegs entre sí

1. Relacions evolutives

Alineament CD28 Homo sapiens (NM_006139) – Macaca fascicularis (DQ846738) – Oryctolagus cuniculus (NP_001075676) –

Mus musculus (NP_031668)


CD28Homo_s -MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLCD28Macac -MLRLLLALNLLPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLCD28Conill MILRLLLAFNFFPSIQGTENKILVKQSPMLVVNNNEVNLSCKYTYNLFSKEFRASLYKGACD28Ratoli MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGV **** *.* * *********.** * * ***.*.*** ..****** **

CD28Homo_s DSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPCD28Macac DSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPCD28Conill DSAVEVCVVNGNFSHPHQFHSTTGFNCDGKLGNETVTFYLKNLYVNQTDIYFCKIEVMYPCD28Ratoli NSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYP * ***** **.. * * . ***** **.*** * ** **.********* ***

CD28Homo_s PPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVCD28Macac PPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWALVVVGGVLACYSLLVTVAFCIFWMCD28Conill PPYLDNEKSNGTIIHVKEQHFCPAHPSPKSSTLFWVLVVVGAVLAFYSMLVTVALFSCWMCD28Ratoli PPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSP---KLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT *******.*******.* .* * . * ** **** ** * .***** *

CD28Homo_s RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSCD28Macac RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSCD28Conill KSKKNRLLQSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPARDFAAYRSCD28Ratoli NSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP *.. ***.************ *** ****** *******

Pèptid senyalRegió

extracel·lular Regió citoplasmàtica

Regió transmembranaRegió d’unió del lligand

naturalEpítop del

superanticòs

62,44% d’homolo

gia

SeqA Name Len(aa) SeqB Name Len(aa) Score

=======================================================================

1 CD28Homo 220 2 CD28Maacaca 220 98

=======================================================================

CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment

CD28Homo MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLD 60CD28Macaca MLRLLLALNLLPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLD 60 ********** *************************************************

CD28Homo SAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPP 120CD28Macaca SAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPP 120 ************************************************************

CD28Homo PYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR 180CD28Macaca PYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWALVVVGGVLACYSLLVTVAFCIFWMR 180 ********************************** ******************* ***.*

CD28Homo SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 220CD28Macaca SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 220 ****************************************

Alineament CD28 Homo sapiens (NM_006139) - Macaca fascicularis (DQ846738)

Pèptid senyalRegió

extracel·lular Regió citoplasmàtica

Regió transmembranaRegió d’unió del lligand

naturalEpítop del

superanticòs


Similitud de seqüència similitud d’estructura

Cap canvi a nivell extracel·lular manteniment epítops

Canvis en regió transmembrana transducció de senyals

Existeix conservació en la regió d’interacció de CD28 entre macac i humà


Existeix conservació entre CD28 de diferents espècies?

MODELATGMODELATGEE

2. La humanització de TGN1412 va provocar algun canvi estructural

respecte l’Ac murí?

2.1 Obtenció de seqüències

Seqüències originals Patent TGN1412 Cadena lleugera (LC) Cadena pesada (HC)

Seqüències humanitzades IgG d’Homo sapiens 1HZH CDRs de Mus musculus 1YJD

2.1.1 Seqüències originals

Patent LC HC (Fab + Fc)

Com separar regió Fab de

regió Fc? Obtenció seqüències aminoacídiques

HC TGN1412 (Fc i Fab) HC (Fab) de 1YJD

Alineament de seqüències

2.1.1 Seqüències originals

Alineament HC TGN1412 - HC regió Fab 1YJD1YJD_H|PDB QVQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYHCTGN1412 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY **** *** *. ***.**..** **************.* ********************1YJD_H|PDB NEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGAGTTVTVSSHCTGN1412 NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ******.*** **** ****.***. *.*.******************** ********1YJD_H|PDB AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS-HCTGN1412 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS * * ***.**** * . . * .****** ********.****.*.************ 1YJD_H|PDB DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC-----------------HCTGN1412 GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPFLGGPSVF **.*** ******. . * **** * * *****.. . 1YJD_H|PDB ------------------------------------------------------------HCTGN1412 LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR 1YJD_H|PDB ------------------------------------------------------------HCTGN1412 VVSVLTVLHKDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN 1YJD_H|PDB ------------------------------------------------------------HCTGN1412 QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN 1YJD_H|PDB --------------------------HCTGN1412 VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Seqüències originals Patent TGN1412 Cadena lleugera (LC) Cadena pesada (HC)

Seqüències humanitzades IgG d’Homo sapiens 1HZH CDRs de Mus musculus 1YJD

2.1 Obtenció de seqüències

2.1.2 Seqüències humanitzades

http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid








2.1.2 Seqüències humanitzades LC

IgG Homo sapiens>1HZH:L|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRASGISDRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC

Model Mus musculus>1YJD:L|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNIYVWLNWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN

Alineament LC IgG – LC Mus musculus

1hzhL EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRASGIS

1yjdL DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNIY-VWLNWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVP

.* ..*** .** * *. * .*..*. * . ***.***. *.*.* ** .*.

1hzhL DRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERKRTVAAPSVFIFP

1yjdL SRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFP

********* *****. ..*** * **** . **** ***** **. ***.* ***

1hzhL PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL

1yjdL PSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTL

** *** ** ***** ******.. *.**.*.. . .. * *.*********.****

1hzhL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC

1yjdL TLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN--

**.* .**.* *.** **. **. *****.


HC

IgG Homo sapiens>1HZH:H|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAE

Model Mus musculus>1YJD:H|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

QVQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC



Alineament HC Fab IgG – HC Mus musculus

1yjdH -VQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY

1hzhH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEF

*** ***.*: ***:**::**:**** *:.: ****:* *** :**:* * * * *.::

1yjdH NEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRS-HYGLD------WNFDVWGAG

1hzhH SAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKG

. **:*:.*: .***:*****:* : * *:***:*:* *. * : :**** *

1yjdH TTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTF

1hzhH TTVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF

*** ****.*. ***:****.* : :.. .:******.********:****:*:******

1yjdH PAVLQS-DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIV--------------

1hzhH PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCP

****** .**:*** ******: ::* *** * .*.******

2.2 Modelatge anticòs

MODEL TGN1412 AMB MÚLTIPLES PATRONS

MODEL TGN1412 AMB UN PATRÓ (1YJD) MODEL TGN1412 HUMANIZAT (1HZH +

1YJD)

Divisió del modelatge en tres parts: Cadena lleugera Cadena pesada regió Fab Cadena pesada regió Fc

2.2.1 Procediment

LC HC Fab HC Fc

1. CERCA DE PATRONS PSI-BLAST

Crear matriu de pesos amb Swissprot

Cerca de patrons amb PDB

MODELS AMB

MÚLTIPLES P

ATRONS

2. ALINEAMENT Basat en estructura STAMP,

HMMER

Basat en seqüència CLUSTALW, HMMER

3. CONSTRUCCIÓ DEL MODEL MODELLER

MODELS AMB

UN PATRÓ

2.2.1 Procediment

4. AVALUACIÓ DELS MODELSEnergètica PROSA

Estereoquímica PROCHECK

5. SUPERPOSICIÓ STAMP

6. DINÀMICA MOLECULAR MOLARIS

2.2.1 Procediment

2.2.2 Patrons escollits

Seqüència original amb múltiples patrons:

Seqüència original i humanitzada amb un patró:

Score ESequences producing significant alignments: (bits) Value

pdb|2FGW|2FGW-L Fab fragment of a humanized version of the anti-... 204 2e-53pdb|1VGE|1VGE-L tr1.9 fabfragment: fab fragment of a human igg1 ... 201 1e-52pdb|1FNS|1FNS-L immunoglobulin nmc-4 igg1fragment: fab fragment,... 197 2e-51pdb|6FAB|6FAB-L Antigen-binding fragment of the murine anti-phen... 195 1e-50pdb|1YJD|1YJD-L

pdb|1YJD|1YJD-L

LC



Seqüència original i humanitzada amb un patró:

pdb|1YJD|1YJD-H

Sequences producing significant alignments: (bits) Value

pdb|1FVE|1FVE-B Fab fragment of humanized antibody 4d5, version 7 157 3e-39pdb|1HIL|1HIL-B Igg2a fab fragment (fab 179) 155 1e-38pdb|1KNO|1KNO-B igg2a fab fragment cnj206 152 1e-37pdb|1YJD|1YJD-H

HC Fab



Sequences producing significant alignments: (bits) Value

pdb|1ADQ|1ADQ-A igg4 reafragment: fc; biological_unit: dimer;rf-... 393 e-110 pdb|1E4K|1E4K-A low affinity immunoglobulin gamma fc receptor ii... 391 e-110 pdb|1DN2|1DN2-A immunoglobulin lambda heavy chainfragment: fc fr... 387 e-108 pdb|1FC1|1FC1-A Fc fragment (igg1 class) 379 e-106 pdb|1FRT|1FRT-C Fc receptor (neonatal) complexed with fc (igg) (... 378 e-106

HC Fc

Avaluació energètica LC HC Fab HC Fc

Avaluació estereoquímica LC HC Fab HC Fc

2.2.3 Avaluació models

Model TGN1412 amb múltiples patrons

Model TGN1412 humanitzatModel TGN1412 amb un patró

LC

ESTRUCTURASEQÜÈNCIA

2.2.3 Avaluació energètica

LC

TGN1412 múltiples patrons

TGN1412 un patró

TGN1412 humanitzat

2.2.3 Comparació millors models

Alineament LC 1YJD- LC TGN1412

SeqA Name Len(aa) SeqB Name Len(aa) Score=========================================================1 LCTGN1412 214 2 1YJDL 212 75 =========================================================CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment LCTGN1412 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPS 601YJDL DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNIYVWLNWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPS 60 ****.*********:** :**********************: ***************** LCTGN1412 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP 1201YJDL RFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPP 120 *********.************:********************:****: ***:* **** LCTGN1412 SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT 1801YJDL SSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLT 180 *.***.** *****:******:: :*:**:*.: :... :* *:*********:***** LCTGN1412 LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 2141YJDL LTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN-- 212 *:* :**:*: *:**.**: :**:.*****.

LC 1YJD


E combinada

E parelles

E superfície

Model TGN1412 amb múltiples patrons

Model TGN1412 humanitzatModel TGN1412 amb un patró

HC Fab

SEQÜÈNCIA ESTRUCTURA


HC Fab

TGN1412 múltiples patrons

TGN1412 un patró

TGN1412 humanitzat

2.2.3 Comparació millors models

Alineament HC 1YJD- HC TGN1412

SeqA Name Len(aa) SeqB Name Len(aa) Score=========================================================1 HCTGN1412 223 2 1YJDH 217 75 =========================================================CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment HCTGN1412 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY 601YJDH -VQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY 59 *** ***.*: ***:**::**:**************:* ******************** HCTGN1412 NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 1201YJDH NEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGAGTTVTVSS 119 ******:*** **** .****:***: *:*:******************** ******** HCTGN1412 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS 1801YJDH AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS- 178 *.*. ***:**** * : ::* .:******.********:****:*:************ HCTGN1412 GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG 2231YJDH DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIV---- 217 .**:*** ******: ::* **** * .*.*****::


HC 1YJDE combinada

E parelles

E superfície

HC Fc


Model % core

% allowed

% generou

sly

% disallowe

d

Bad contact

s

cis-peptide

s

Z-Scor

e

mseq_1 93,0 6,4 0,0 0,5 2 3 -8,59

mseq_2 93,0 6,4 0,0 0,5 0 2 -8,39

mseq_ref

_190,9 8,0 0,5 0,5 2 3 8,59

TGN1412

mseq_ ref_2

92,5 7,0 0,0 0,5 1 2 -8,05

múltiples

mest_1 92,5 7,0 0,5 0,0 2 3 -8,39

patrons mest_2 92,5 7,0 0,0 0,5 4 3 -8,58

mest_ref_

1 92,5 7,0 0,5 0,0 2 3 -8,44

mest_ref_

292,5 7,0 0,0 0,5 5 3 -8,65

mseq_1 90,9 7,0 1,1 1,1 1 2 -8,42

TGN1412

mseq_2 92,5 5,9 1,1 0,5 2 2 -8,21

un patró mseq_ref

_192,0 5,9 1,6 0,5 2 2 -8,22

mseq_ref

_292,5 5,9 1,1 0,5 2 2 -8,37

mseq_1 92,0 6,4 1,1 0,5 2 2 -8,36

TGN1412 mseq_2 92,0 6,4 1,1 0,5 3 2 -8,44

humanitzat

mseq_ref_1 91,4 7,0 1,1 0,5 3 2 -8,65

mseq_ref

_2 91,4 7,0 1,1 0,5 4 2 -8,58

LC2.2.3 Avaluació estereoquímica

Model % core

% allowed

% generou

sly

% disallowe

d

Bad contact

s

cis-peptide

s

Z-Scor

e

mseq_1 91,2 7,7 0,5 0,5 5 3 -8.18

mseq_2 91,8 6,7 0,5 1,0 4 2 -7,9

mseq_ref

_190,7 8,2 1,0 0,0 3 2 -8,05

TGN1412

mseq_ ref_2

91,2 7,2 0,5 1,0 4 2 -8,28

múltiples

mest_1 91,8 7,7 0,5 0,0 0 3 -8,2

patrons mest_2 91,2 6,7 1,0 1,0 3 2 -8,11

mest_ref_

1 90,7 7,7 1,5 0,0 3 2 -8,05

mest_ref_

290,7 6,7 1,0 1,5 4 2 -8,28

mseq_1 88,7 10,8 0,5 0,0 4 3 -7,84

TGN1412

mseq_2 90,2 8,2 1,5 0,0 7 3 -7,89

un patró mseq_re

f_188,7 11,3 0,0 0,0 3 3 -

7,81

mseq_ref

_289,7 8,8 8,0 0,5 8 3 -7,72

mseq_1 88,9 11,1 0,0 0,0 3 3 -8,14

TGN1412 mseq_2 91,5 7,9 0,0 0,5 2 2 -8,03

humanitzat

mseq_ref_1 86,2 12,7 0,5 0,5 3 3 -8,04

mseq_re

f_2 90,5 9,0 0,0 0,5 2 2-

8,31

HC Fab

2.2.3 Avaluació estereoquímica

HC Fc

Model%

core

% allowed

% generously allowed

% disallowed

Badconta

cts

cis-pepti

des

z-scores

mseq_1 91,6 7,4 0,5 0,5 2 1 -7,56

mseq_2 90,0 9,5 0,5 0,0 2 1 -7.94

TGN1412

mseq_3 93,7 5,3 1,1 0,0 3 1 -8,01

múltiples

mseq_4 89,5 9,5 0,0 1,1 2 1 -8,26

patrons mest_1 91,6 7,4 0,5 0,5 2 1 -7,56

mest_2 90,0 9,5 0,5 0,0 2 1 -7.56

2.2.3 Avaluació estereoquímica

2.3 Dinàmica molecular

Model obtingut

Dinàmica molecular per

Molaris

Superposar i observar

variacions

1.Minimització

2.Dinàmica molecular a 100K

3.Dinàmica molecular a 300K

4.Optimització

Superposició

RMS = 0.47

1YJD

TGN1412

Cadena lleugera

Cadena pesada

TGN1412

Estructures superposades molt similars

Segons el model obtingut, els canvis estructurals observats no són

suficientment significatius com per causar els efectes adversos

Segons el model obtingut, els canvis estructurals observats no són

suficientment significatius com per causar els efectes adversos

La humanització de TGN1412 va provocar algun canvi estructural

respecte l’Ac murí?

3. Les interaccions entre l’estructura cristal·litzada de l’Ac murí amb CD28

i el model de TGN1412 amb CD28 són iguals?

INTERACCIÓ TGN1412 – INTERACCIÓ TGN1412 – CD28CD28

3.1 Heavy Chain – Light 3.1 Heavy Chain – Light ChainChain

3.1 Interaccions

LCHC

CD28Residus

hidrofòbics

Residus hidrofòbics

HC – LC

3.1 Interaccions

Enllaç hidrofòbic

LEU 188

VAL 135

LCHC

CD28

HC – LC

3.1 Interaccions

Enllaç iònic

GLU 123

LYS 216

LCHC

CD28

3.1 Interaccions

Enllaç phi

TRP 105

TRP 32

LCHC

CD28

HC – LC

3.1 Interaccions

Pont disulfur

LCHC

CD28

HC – LC

CYS 23

CYS 88

3.2 Fab – CD283.2 Fab – CD283.2.1 CD28

3.2.2 Identificació de residus polars

3.2.3 H2O en la zona d’interacció

3.2.4 CDRs

3.2.5 Interaccions

3.2.1 CD28

Epítop

Residus N-glicosilats

Formació homodímers

3.2.1 Epítops CD28

Epítop CD28 per superagonistesEpítop d’unió al lligand fisiològic LC

HCCD2

8

3.2.2 Identificació residus polars

LCHC

CD28Residus

polarsCDRs i epítop

CD28

3.2.3 H2O a la zona d’interacció

LCHC

CD28

Visió des de CD28 Visió des de LC i HC

3.2.3 H2O a la zona d’interacció

LCHC

CD28

3.2.4 CDRS

CDR3 HC

CDR1 HC

CDR2 HC

CDR1 LC

CDR3 LC

CDR2 LC

EPÍTOP DE CD28 PELS

SUPERAGONISTES

LCHC

CD28

3.2.5 Interaccions

Pont d’hidrogen

TYR 61GLY 102

LCHC

CD28

CD28 - Fab

3.2.5 Interaccions

Enllaç iònic

HIS 100

GLU 32

LCHC

CD28

CD28 - Fab

3.2.5 Interaccions

Enllaç phi

TYR 51

HIS 100

LCHC

CD28

CD28 - Fab

La majoria d’interaccions es conserven encara que les distàncies i orientacions poden variar


Residu CD28 Residu HC/LCModel

cristal·litzat (Å)

Model TGN1412

(Å)

Model humanitzat (Å)

PONTS D'HIDROGEN

TYR61:OH GLY102:O (HC) 2,55 2,9 2,37

SER62:O TRP32:NE1 (LC) 3,23 3,29 3,56

LYS63:NZ GLY91:O(LC) 2,52 2,68 2,67

THR64:O TYR30:OH (LC) 3,07 2,77 2,8

GLU32:O SER31:OH (HC) 2,84 3,41 3,51

LYS63:O GLN92:O (LH) 2,857 2,55 3,52

INTERACCIONS IÒNIQUES

LYS63 ASP104:O (HC) 2,73 3,38 3,23

GLU32:O HIS100:NE2 (HC) 3,87 4,22 4,53

INTERACCIONS PHI

TYR61 TRP105 (LC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6

TYR51 HIS100 (HC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6

TYR104:OH TYR101:OH (HC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6

TYR104:CE2 TYR52:CE2 (HC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6

Les interaccions entre l’estructura cristal·litzada de l’Ac murí amb CD28 i el

model de TGN1412 amb CD28 són iguals?

INTERACCIÓ Fab -INTERACCIÓ Fab - FcFc

4. La regió Fab de TGN1412 és capaç d’interaccionar amb la regió

Fc?

Alineament Fc TGN1412 – regió extracel·lular CD28

CLUSTAL W(1.60) multiple sequence alignment

FC PPCPSCPAPFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV1YJDC ------------------------------------------------------------

FC HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHKDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR1YJDC --NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLH-KGLDSAVEVCVVYG-NYSQ * .. .* *. * .*... . *** *..* .. . .

FC EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF1YJDC QLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCK-----IEVMYPPPYLDNEKSN . ***. . . .. *.* ... * . ** ** . *

FC FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK1YJDC GTIIHVK------------------------------------ ..

4. Interacció Fab-Fc

Buscar a Pfam quins dominis té HC de TGN1412

Scores for sequence family classification (score includes all domains):Model Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---ig Immunoglobulin domain 92.0 2.7e-28 4IMPDH_C IMP dehydrogenase / GMP reductase C t -144.6 4.6 1Kunitz_legume Trypsin and protease inhibitors -0.3 5.9 1Ephrin Ephrin -1.1 8.5 1IRK Inward rectifier potassium channel -3.2 9.6 1

Parsed for domains:Model Domain seq-f seq-t hmm-f hmm-t score E-value-------- ------- ----- ----- ----- ----- ----- -------IMPDH_C 1/1 9 196 .. 1 231 [] -144.6 4.6ig 1/4 15 98 .. 1 45 [] 32.1 1e-09Ephrin 1/1 17 26 .. 139 148 .] -1.1 8.5ig 2/4 140 205 .. 1 45 [] 20.0 5.9e-06IRK 1/1 198 208 .. 1 12 [. -3.2 9.6ig 3/4 253 322 .. 1 45 [] 4.8 0.31ig 4/4 359 426 .. 1 45 [] 35.1 1.3e-10Kunitz_legume 1/1 395 401 .. 1 7 [. -0.3 5.9


Buscar a Pfam quins dominis té concretament Fc de TGN1412

Scores for complete sequences (score includes all domains):Sequence Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---FC_TGN1412 39.9 1.4e-15 2

Parsed for domains:Sequence Domain seq-f seq-t hmm-f hmm-t score E-value-------- ------- ----- ----- ----- ----- ----- -------FC_TGN1412 2/2 136 203 .. 1 45 [] 35.1 4.4e-14FC_TGN1412 1/2 30 99 .. 1 45 [] 4.8 0.00011


Buscar a Pfam quins dominis té concretament CD28

Scores for complete sequences (score includes all domains):Sequence Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---1YJDC 4.7 0.00011 1

Parsed for domains:Sequence Domain seq-f seq-t hmm-f hmm-t score E-value-------- ------- ----- ----- ----- ----- ----- -------1YJDC 1/1 15 96 .. 1 45 [] 4.7 0.00011

FC_TGN1412 1/2 30 99 .. 1 45 [] 4.8 0.00011


Superposició Fc - CD28 RMSD = 2.44

FcCD2

8

CH2 +CD2

8

CH3


Epítop

CD28 i Fc dominis Ig similitud estructural Existeix superposició entre CD28 i CH2 Possible reconeixement Fab – CH2 Fc

Poden existir interaccions entre Fab d’un superagonista i CH2 de Fc d’un altre

superagonista

Formació d’agregats

Poden existir interaccions entre Fab d’un superagonista i CH2 de Fc d’un altre

superagonista

Formació d’agregats

La regió Fab de TGN1412 és capaç d’interaccionar amb la regió Fc?

CD28 i CTLA-4 CD28 i CTLA-4

5. Quines diferències hi ha entre CD28 i CTLA-4 pel que fa a la unió al lligand

fisiològic i al superanticòs?

Sequences producing significant alignments:

pdb|1AH1|1AH1 ctla-4fragment: extracellular n-terminal immunoglo... 48 2e-06 pdb|1DQT|1DQT-A cytotoxic t lymphocyte associated antigen 4fragm... 47 3e-06

pdb|1I85|1I85-C t lymphocyte activation antigen cd86fragment: ig... 45 2e-05 pdb|1I8L|1I8L-C t lymphocyte activation antigen cd80fragment: ex... 44 3e-05 pdb|1I85|1I85-D t lymphocyte activation antigen cd86fragment: ig... 40 3e-04

CTLA4

CD80

CD86

5. CD28 i CTLA4

5. CD28 i CTLA-4

Epítop

CD28

CTLA4

Epítop

CD28, CTLA4, CD80 i CD86 comparteixen el domini IgV like

CD28 i CTLA4 uneixen els lligands fisiològics per la regió MYPPPY

CD28 mostra un epítop d’unió al superanticòs que no es troba en CTLA4

Possible desregulació metabòlica

CD28 mostra un epítop d’unió al superanticòs que no es troba en CTLA4

Possible desregulació metabòlica

Quines diferències hi ha entre CD28 i CTLA4 amb el lligand fisiològic i el

superanticòs?

CONCLUSIONS


Segons els models obtinguts, els canvis estructurals observats no són suficientment significatius com per causar els efectes adversos


Poden existir interaccions entre Fab d’un superagonista i CH2 de Fc d’un altre agonista Formació d’agregats

CD28 mostra un epítop d’unió al superanticòs que no es troba en CTLA4 Possible desregulació metabòlica

Preguntes PEM

1. Respecte CD28 i CTLA4, senyala les opcions falses:a) Els dos comparteixies dominis Ig likeb) Poden formar dímers entre ellsc) Els seus lligands fisiològics són CD80 i CD86d) Tenen funcions similars a les vies de senyalització

de les cèl·lules Te) Totes les anteriors són veritat

2. Los anticossos mitogènics de CD28:a) Requereixen senyals coestimulatòries per produir senyalitzaciób) Poden unir-se també als dominis típics d’unió dels anticossos

no-mitogènics (MYPPPY)c) Actua com un superagonistad) Necessiten interaccionar amb la membrana per desencadenar

la seva accióe) Totes les anteriors són falses

Preguntes PEM3. Els CDRs:

a) Són el lloc d’unió dels anticossos al seu antigen

b) Són tres loops de la part variable de la cadena lleugera (VL) i tres més de la part variable de la cadena pesada (VH)

c) Les dues anteriors són correctes

d) Estan formats únicament per aminoàcids hidrofòbics

e) Totes les anteriors són correctes

4. Sobre el dicroisme circular és cert que:

a) Cal tenir un cristall per aplicar aquesta tècnica

b) Serveix per determinar l’estructura terciària de les proteïnes

c) Les dues anteriors són certes

d) La majoria de les biomolècules són capaces de desviar la llum polaritzada

e) Totes les anteriors són certes

Preguntes PEM

5. De les següents afirmacions sobre la cerca d’homòlegs és cert que podem:

1. Realitzar un psiblast de la nostra seqüència contra la base de dades de PDB

2. Realitzar un psiblast de la nostra seqüència contra la base de dades de SCOP

3. Utilitzar el model ocult de Markov corresponent obtingut a Pfam

4. Realitzar un FetchFasta de la nostra proteïna

a) 1 i 3

b) 1, 2 i 3

c) 2 i 4

d) 4

e) 1, 2, 3 i 4

Preguntes PEM

6. Pel que fa a la dinàmica molecular d’un model estructural:a) Únicament es pot utilitzar el programa Molaris b) Si s’utilitza una temperatura baixa, l’algorisme

explorarà més possibilitats d’estructura de la proteïna

c) El millor resultat sempre és l’últim exploratd) La temperatura està directament relacionada amb

l’energia potencial del sistemae) Cap de les anteriors són correctes

7. Respecte als anticossos senyala la opció verdadera: La unió dels dominis CH3 es produeix per N-

glicosilació El beta bulge es troba al domini constant Les dues anteriors Els ponts disulfur serveixen únicament d’unió

intercatenària Cap de les anteriors són correctes

Preguntes PEM8. Sobre l’avaluació dels models creats és cert:

a) El programa Procheck fa una avaluació estereoquímica

b) El programa ProsaII ens mostra els patrons d’energia combinada, de seqüència i per parells


d) El programa ProsaII fa una avaluació estereoquímica

e) Totes les anteriors són falses

9. La relació estructura-seqüència:

a) La seqüència d’una proteïna és, en teoria, suficient per conèixer la seva estructura

b) Sempre que trobem un homòleg a SPROT amb una proteïna problema podrem conèixer l’estructura d’aquesta proteïna problema

c) Els homòlegs paràlegs comparteixen tant seqüència, com estructura i funció

d) La seqüència està molt més conservada que la seqüència al llarg de l’evolució

e) Totes les anteriors són falses

Preguntes PEM

10. Sobre la superposició de proteïnes:

a) Es pot realitzar amb l’opció rough o partint d’un alineament múltiple amb el programa STAMP

b) Un RMS inferior a 2 és un bon resultat


d) El clúster 1 sempre conté totes les proteïnes a superposar

e) Totes les anteriors són certes

aproximaciÓ estructural al cas tgn1412

Documents