Produccin de Aminocidos

INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASMICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

INTRODUCCION

1. Que microorganismos producen aminocidos2. Que sustratos utilizan 3. Recuperacin y la recuperacin de productos.Las etapas de recuperacin y purificacin representan una parte muy importante en el proceso de obtencin del compuesto de inters; se desea recuperar el mximo de producto, en el mnimo tiempo, con el mayor grado de pureza y al mnimo costo. Cliffe (1996) reporta que estas etapas pueden representar el 60% de los costos de materia prima. Si las etapas de recuperacin y purificacin no se manejan en forma adecuada, los costos pueden aumentar hasta ocasionar que el proceso no sea rentable.Al finalizar la fermentacin, el caldo contiene una mezcla de compuestos, tales como: biomasa, restos de sustratos no utilizados por la clula y metabolitos primarios y secundarios. El mtodo empleado para separar y purificar el compuesto deseado se escoge de acuerdo con los siguientes factores: El tipo y la estabilidad del producto La concentracin del producto La presencia y la naturaleza de otras sustancias en el caldo de fermentacin El grado de purificacin mnimo requerido La localizacin del producto con respecto de la clula (extracelular o intracelular) El uso que se le va a dar al producto y su precio de venta.Con base en estos criterios, es ms sencillo definir el camino por seguir para obtener el producto purificado. Algunos de los procedimientos necesarios para recuperar y purificar el producto final son comunes a muchos de los procesos, mientras que otros son especficos.

La separacin lquido-slidoLa separacin lquido-slido es necesaria cuando la fermentacin se lleva a cabo en un medio de cultivo lquido; consiste en separar los slidos (biomasa celular y compuestos insolubles) del caldo de fermentacin. En algunos casos, el compuesto de inters es el slido (la biomasa), mientras que, en otros, este se encuentra en el lquido. Se puede realizar por diferentes mtodos: La filtracin La centrifugacin La floculacin La flotacin.a) La filtracinEs el mtodo de separacin de una mezcla lquido-slido que se emplea con ms regularidad; consiste en hacer pasar la mezcla por filtros con poros que retienen las partculas y dejan pasar el lquido. La eficiencia de la filtracin depende de: El tamao del microorganismo y su morfologa La presencia de capas mucosas en el microorganismo La viscosidad y el pH del caldo de fermentacin.Dos de los tipos de filtros ms utilizados para realizar esta operacin son el filtro prensa y el filtro rotatorio al vaco.El filtro prensa es utilizado en los procesos continuos y semcontinuos. En este tipo de filtro, se ejerce una presin mayor que la atmosfrica al bombear el caldo de fermentacin dentro del filtro, lo cual produce el flujo de! filtrado a travs del sistema. Se alternan placas cubiertas por filtros a ambos lados, con marcos metlicos.El caldo de fermentacin se introduce en un canal, que se forma en las esquinas del sistema, y pasa por los marcos metlicos; los slidos quedan retenidos en el filtro, mientras que el filtrado sale por las placas filtrantes.El filtro rotatorio al vaco se emplea principalmente en procesos discontinuos, tales como la recuperacin de hongos y bacterias del caldo de fermentacin. Est compuesto por un tambor cilndrico sumergido hasta la mitad en el lquido por separar (tambin conocido como papilla de alimentacin). La superficie del tambor tiene varios compartimentos separados por tabiques y est cubierta por un filtro.El tambor gira y, por vaco, empieza el proceso de separacin: la papilla ingresa por succin en cada compartimento, los slidos quedan retenidos en el filtro y el filtrado se va por las tuberas hacia el centro del tambor, donde es recuperado. Despus, los slidos son separados del filtro por inyeccin de aire comprimido en la superficie del mismo y con la ayuda de una cuchilla.b) La centrifugacinLa centrifugacin es una operacin en la que se separan sustancias por medio de la fuerza centrfuga. El mtodo se basa en la diferencia de densidad entre el slido y el lquido; tambin puede utilizarse para separar dos lquidos con densidades muy distintas. Es ms caro que la filtracin y se utiliza cuando esta ltima operacin es muy lenta. El xito de su aplicacin depende de la diferencia de densidad entre los slidos (la biomasa) y el lquido, la viscosidad del lquido y el tamao de las clulas del slido.Hay una gran variedad de centrfugas; la seleccin de una se realiza de acuerdo con el proceso especfico de recuperacin; sin embargo, las que se emplean con mayor frecuencia en los procesos de fermentacin son la centrfuga de discos y la centrfuga de filtro o tamiz.La centrfuga de discos se utiliza para procesos de separacin a gran escala; est compuesta por una serie de conos metlicos conocidos como discos, separados entre s por espacios muy pequeos. Es de mucha utilidad en la separacin de lquidos de diferente densidad.Durante la centrifugacin, los slidos, o el lquido ms denso, quedan retenidos en el borde de los discos y el lquido es eliminado por la parte superior de la centrfuga. En la centrfuga de filtro o tamiz la separacin se produce cuando el caldo de fermentacin es forzado contra un material filtrante y, por la accin de la fuerza centrfuga, el lquido pasa a travs de los filtros y los slidos quedan retenidos en ellos.c) La floculacin y la flotacinLa floculacin y la flotacin son mtodos de separacin de una mezcla lquido-slido empleados con menos frecuencia que los dos anteriores; generalmente, se aplican para aumentar la eficiencia en la filtracin o en la centrifugacin.La floculacin consiste en una separacin de los slidos por agregacin y sedimentacin. El proceso se puede llevar a cabo calentando la suspensin o adicionando sustancias qumicas que actan como agentes floculantes; as, las clulas forman aglomerados que sedimentan. Este mtodo es til cuando las clulas son muy pequeas y no es posible su separacin mediante centrifugacin o filtracin En la flotacin, se introduce un gas en el caldo de fermentacin. Las clulas slidas se adsorben en las burbujas y suben a la superficie como una capa de espuma; ah son recolectadas.La desintegracin celularEsta etapa es imprescindible cuando el microorganismo no excreta el metbolito de inters al caldo de fermentacin. Consiste en romper la pared y la membrana celular del microorganismo. El mtodo por escoger va a depender de cun fuerte es la pared celular; por ejemplo, las bacterias Gram positivas y las levaduras son mucho ms difciles de romper que las bacterias Gram negativas o los hongos filamentosos. La desintegracin celular se puede llevar a cabo por mtodos fsicos, qumicos o biolgicos; sin embargo, los ms utilizados son los fsicos. El dao mecnico a la pared celular de los microorganismos es uno de los mtodos ms comunes y se puede ejecutar con un molino de bolas. El principio de su funcionamiento radica en romper las clulas por efecto de la friccin que sufren al ser sometidas a altas velocidades de mezclado, en presencia de bolas de diferentes materiales (vidrio, cermica u otros). La hontogeneizacin tambin es utilizada v consiste en someter la biomasa a altas presiones, provocando "fuerzas de corte" que rompen las clulas y liberan los compuestos contenidos en ellas.La extraccin lquido-lquidoLa extraccin lquido-lquido es la operacin en la que una sustancia disuelta en una fase lquida (disolvente original) es transferida a otra fase tambin lquida (segundo disolvente). Para que la operacin sea exitosa, los disolventes deben ser insolubles entre s y la sustancia de inters debe ser ms soluble en el segundo disolvente que en el original. Esta operacin se puede aplicar cuando el compuesto de inters se encuentra disuelto en el caldo de fermentacin. Para aplicar el procedimiento, es bsico conocer las propiedades de solubilidad del metbolito. Tambin es factible variar algunas condiciones fisicoqumicas para modificar la solubilidad del compuesto; por ejemplo, si se vara el pH de la disolucin, la solubilidad del compuesto en un solvente orgnico puede variar tambin. La recuperacin del producto se hace revirtiendo las propiedades de solubilidad o evaporando el solvente. Algunos solventes utilizados son: acetona, steres, butanol y reguladores de pH (buffers).La cristalizacinLa cristalizacin, es la formacin de cristales en un lquido. Es muy utilizada para la purificacin de los metabolitos obtenidos en los procesos de fermentacin. La cristalizacin se puede llevar a cabo por enfriamiento, por evaporacin o por adicin de una tercera sustancia (compuesto qumico) que provoca la precipitacin del compuesto de inters, o que disminuye su solubilidad.Este proceso se aplica cuando los productos requieren altos grados de pureza. La cristalizacin se utiliza en la recuperacin del cido ctrico y de algunos aminocidos.La cromatografaLa cromatografa es una tcnica de separacin de sustancias en un soporte (puede ser una columna) que contiene una fase estacionaria. Los componentes de una mezcla se transportan a travs de la fase estacionaria por medio de una fase mvil que fluye. La separacin se basa en las diferencias de velocidad de migracin entre los componentes de la mezcla. Los componentes deben ser solubles en la fase mvil y deben ser capaces de interaccionar con la fase estacionaria, ya sea disolvindose, adsorbindose o reaccionando con ella. La cromatografa es de los procesos ms caros y sirve para purificar compuestos metablicos que se encuentran en una concentracin muy pequea. Se emplea para la separacin de compuestos utilizados en la industria farmacutica y tambin en investigaciones. Las tcnicas cromatografcas se pueden clasificar, segn el mecanismo de separacin, en: cromatografa de adsorcin, de intercambio inico, de filtracin en gel y de afinidad. (Skoog y West, 1987).4. Aplicaciones de los aminocidosLos aminocidosson usados como aditivos de piensos para animales (lisina, metionina, treonina), potenciadores de sabor (glutamato monosdico, serina, cido asprtico) y como nutrientes especficos en el campo de la medicina. En volumen de produccin, el cido glutmico, la lisina y la metionina son los principales aminocidos producidos en el mundo.

De todos los aminocidos, el de mayor inters comercial y del que ms toneladas al ao se producen es el cido glutmico, que se emplea para reforzar el sabor en el sector alimentario. El cido asprtico y la fenilalanina se utilizan en la industria alimentaria, tanto humana como animal, en la alimentacin humana se emplean, por ejemplo, como ingredientes del edulcorante artificial aspartame, un importante constituyente de las bebidas refrescantes dietticas y de otros alimentos que se venden como carentes de azcar. La lisina, es un aminocido esencial para los seres humanos y algunos animales de granja como aditivo alimentario, y la bacteria que la produce comercialmente esBrevibacterium flavum.Existen principalmente tres mtodos para la obtencin de aminocidos: 1) Extraccin de hidrolizados de protenas, que apenas se emplea debido a que, con este mtodo, no se pueden atender las demandas del mercado ni con el mximo rendimiento; 2) La sntesis qumica, que da como resultado mezclas pticamente inactivas que contienen las dos formas posibles de un aminocido (L y D) La forma que interesa producir por su importancia bioqumica es, generalmente, la forma L y, para conseguirla sin que se encuentre en una mezcla con la forma D, es necesaria una fabricacin por el tercer mtodo, 3) Produccin Microbiolgica, este mtodo puede realizarse mediante procesos fermentativos, o bien mediante la sntesis enzimtica. Por qu produccin microbiolgica de aminocidos?

Antes, la extraccin de aminocidos de hidrolizados de protenas, era costosoLa mayora de los aminocidos pueden fabricarse qumicamente, pero la sntesis qumica da mezclas racmica pticamente inactivas D y L.La produccin microbiolgica L-aminocidos estreo especfica, biolgicamente activo puede ser por fermentacin directa o por sntesis enzimtica

4) Bioconversin mediante el uso deenzimasLa seleccin del proceso depende de la tecnologa disponible, coste de las materias primas, tamao y precios de mercado, coste de usar fermentacin respecto reacciones de sntesis, y el impacto ambiental del proceso en s.

La siguiente tabla ilustra los principales procesos utilizados en laproduccin de aminocidos:

Tabla No. 4.1 Procesos utilizados en la produccin de aminocidos

AminocidosProceso de produccin

L-GlutamatoFermentacin

D, L. MetioninaQumico

L-Lisina HClFermentacin

GlicinaQumico

L-FenilalaninaFermentacin

L-Acido asprticoEnzimtico

L-TreoninaFermentacin

L-CistenaExtraccin, Enzimtico

D, L Alanina

Fermentacin

L- Glutamina

L-Arginina

L- Triptfano

L Valina

L LeucinaFermentacin, Extraccin

L AlaninaEnzimtico

L IsoleucinaFermentacin

L Histidina

L Prolina

L Serina

L Tirosina

Purificacin de aminocidos: unidades de adsorcin de carbn activoDurante la produccin de aminocidos, distintas tecnologas de aislamiento, separacin y purificacin son utilizadas. Loscarbones activos en polvoycarbones activos granulares, se usan para eliminar el color y otras impurezas, a fin de: Mejorar el proceso de cristalizacin mediante la eliminacin de impurezas Rendimiento mejorado y, por lo tanto, menos prdida de producto Eliminar el color Productos finales de alta pureza Eliminar compuestos txicos o espumantes antes de la fermentacin Proceso de fermentacin mejorado Mejorar la estabilidad del color Productos finales de alta purezaEl resultado es un aminocido purificado, de alta calidad y libre de contaminantes.Aplicaciones Industriales de los aminocidos.Los aminocidos se utilizan como materias primas en la industria alimentaria, farmacutica, qumica y cosmtica, adems de material de partida para la industria qumica. Tabla 4.2 Mercado de los aminocidos

Volumen mundial (1982, 455 000 toneladas)

66 % en alimentos

33% en alimentacin animal

1% en especialidades qumicas

Volumen de ventas (1982, 1 150 millones de dlares)

52% en alimentos

30% en alimentacin animal

18% en especialidades qumicas

Grafica 4.2 Volumen mundial de toneladas de los aminocidosGrafica 4.1 Volumen de ventas de los aminocidos

Industria de los AlimentosCada aminocido y derivados tiene un sabor caracterstico: dulce, amargo, agrio, salado. El D-glutamato es inspido y los esteres de metil o etil glicina poseen un sabor muy salado. La glicina y L-alanina son dbilmente dulces pero el aspartame (ster de metil L-aspartil-L-fenilalanina) es 200 veces ms dulce que la sacarosa, utilizndose como edulcorante artificial. Recientemente ha aumentado el consumo de L-fenilalanina y cido L-asprtico como materias primas para la sntesis de este ster. Tambin la D-alanina junto con el cido asprtico forma un edulcorante 12 veces ms dulce que el aspartame. Adems, muchos piensos domsticos no contienen los aminocidos esenciales necesarios para el crecimiento equilibrado de los animales, y normalmente, es necesario introducir en la dieta suplementos alimenticios que contengan los aminocidos esenciales, los ms frecuentes son: D L metionina, L-lisina, L-treonina.Tabla No. 4.2 Aminocidos utilizados en la Industria alimentaria

AminocidoProduccin en el mundo (ton)UsosFinalidad

L-glutamato370 000Varios alimentosReforzar el sabor, ablandador de la carne

L-aspartato y alanina5000Jugos de frutasEnriquecer el sabor

Glicina6000Alimentos edulcoradosMejora del sabor, Partida para sntesis orgnicas

L-cistena700Pan y JugosMejora calidad y antioxidante (respectivamente)

L-triptfano+L-histidina400Varios alimentos Leche en polvoAntioxidante, evita enranciado; aditivo nutritivo

Aspartame (L-fenilalania+L-asprtico)7000Bebidas refrescantesEdulcorante bajo en caloras

L-lisina70000Pan (Japn). Aditivo nutritivo

DL-Metionina70000Productos de la soja Aditivo nutritivo

Industria de los cosmticosEn la industria de cosmticos, los aminocidos y sus derivados se utilizan para controlar oneutralizar las variaciones de pH en la piel y los efectos bacterianos. Por ejemplo, la serinase utiliza en cremas o lociones faciales y el glutamato de glucosa se emplea en champs ycremas como compuesto humectante del pelo y de la piel(Kirk, 1992).Por ejemplo.L-ArgininaEs un aminocido con la estructura caracterizada por un grupo guanidino que muestra una muy fuerte basicidad dentro de los aminocidos. Es ampliamente utilizado como ingrediente activo en productos de cuidado de cabello y piel. L-Arginina es uno de los componentes principales de la keratina protena del cabello, L-Arginina muestra excelente seguridad comparado con los agentes comunes alcalinos usados en cosmticos, la L-Arginina es usada como neutralizador en lociones para despus de rasurarse. Adems es altamente biodegradable, soluble en agua y con grandes propiedades de humectacin.Por sus propiedades, L-Arginina, puede ser utilizado en los siguientes productos cosmticos: Cremas, emulsiones y geles hidratantes y nutrientes Shampoos, acondicionadores y estilizantes para cabello En cosmtico color: Maquillajes, rubores, labiales, sombras y bases En productos solares: Tratamientos y protectores para antes y despus del sol Productos hidratantes para bebIndustria qumicaEn la industria qumica los aminocidos se emplean en campos muy diversos. Actualmente en relacin a la proteccin del medioambiente, se presta especial atencin a los poli aminocidos, que son polmeros biodegradables. Entre otras utilidades estos polmeros se utilizan en la produccin del cuero sinttico y los polmeros biodegradables poli-(L-cido asprtico-co-PEG) con aplicacin en el campo de la biomedicina. Algunos derivados de aminocidos se emplean como agentes de limpieza por ejemplo en la eliminacin de aceites de efluentes industriales se est empleando un derivado del cido glutmico.

Los aminocidos estn teniendo una creciente demanda en la industria qumica. A medida que sus precios bajan, su uso es ms diversificado, en la manufactura de polmeros sirven como materias primas, tal es el caso de las fibras de polialanina o bien las resinas de isocianato de lisina; el poli-gama-metilglutamato es usado como una capa superficial de la piel sinttica, la glicina es la materia prima inicial para la produccin del herbicida glifosato y la treonina para el aztreonam (antibitico).

La produccin comercial de aminocidos se resume en la siguiente tabla. Se han desarrollado procesos de fermentacin para todos los aminocidos a excepcin de glicina y L-cistena.Tabla 4.2 Produccin mundial de aminocidos, sus mtodos de produccin y aplicaciones

AminocidoProduccin anual (toneladas mtricas)Mtodos de produccinAplicacin

D, L-alanina130- Uso de enzimas o clulas inmovilizadas- Extraccin de hidrolizados de protenasPotenciador del sabor

L-alanina700- Sntesis qumicaPotenciador del sabor (Produccin de bebidas)

L-arginina1000- Fermentacin directa- Extraccin de hidrolizados de protenasInfusionesTerapia (enfermedades del hgado)Cosmticos

cido L-asprtico4000- Uso de enzimas o clulas inmovilizadas- Extraccin de hidrolizados de protenasTerapiaPotenciador del saborProduccin de aspartame

L-asparagina50- Extraccin de hidrolizados de protenas- Sntesis qumicaTerapia

L-cistena700- Extraccin de hidrolizados de protenasProduccin de panAntioxidanteTerapia (bronquitis)

cido L-glutmico370000- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasPotenciador del sabor

L-glutamina500- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasTerapia (ulcera)

Glicina5000-6000- Sntesis qumicaComponente de los edulcorantes

L-histidina200- Fermentacin directa- Extraccin de hidrolizados de protenasTerapia (ulcera)

L-isoleucina150- Fermentacin directaInfusiones

L-leucina150- Extraccin de hidrolizados de protenas- Fermentacin directaInfusiones

L-lisina70000- Fermentacin directa- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasAditivo de piensosInfusiones

D, L-metionina7000- Sntesis qumicaAditivo de piensos

L-metionina150- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasTerapia

L-ornitina50- Fermentacin directa- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasTerapia del hgado

L-fenilalanina3000- Fermentacin directa- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasInfusionesProduccin de aspartame

L-prolina100- Fermentacin directaInfusiones

L-serina50- Transformacin microbiana de precursores- Fermentacin directaCosmticos

L-treonina160- Fermentacin directaAditivo de piensos

L-triptfano200- Fermentacin directa- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasInfusiones

L-tirosina100- Extraccin de hidrolizados de protenas- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasInfusionesPrecursor de la sntesis de L-DOPA

L-valina150- Fermentacin directa- Uso de enzimas o clulas inmovilizadasInfusiones

Industria farmacuticaLos aminocidos pticamente puros, compuestos que presentan una pureza del cien por cien de una de sus variedades D L, poseen una elevada importancia biomdica debido a sus numerosas posibilidades. Entre sus mbitos de aplicacin destaca la industria farmacutica, ya que estn ligados a la fabricacin de sueros, aditivos alimentarios, antibiticos, antitumorales y reactivos de aplicacin en la sntesis orgnica, entre otros compuestos.En medicina, en pre- y post-operatorios, se estn utilizado transfusiones de aminocidospara mantener el nivel de nitrgeno necesario para el funcionamiento metablico. Adems, se han desarrollado distintas mezclas de aminocidos especiales para el tratamiento de muchas enfermedades(Kirk, 1992).

Tabla No. 4.3 Produccin en cultivos sumergidos de aminocidos de inters farmacutico.

AminocidoInters a nivel farmacutico

L-argininaAlivio de hiperamonemia (aumento agudo o crnico del amonio sanguneo)y trastornos hepticos mediante la estimulacin de la arginasa Estimula secrecin de insulina

L-citrulinaAlivio de hiperamonemia y trastornos hepticos mediante la estimulacin de la arginasa Estimula secrecin de insulina

L-ornitinaAlivio de hiperamonemia y trastornos hepticos mediante la estimulacin de la arginasaEstimula secrecin de insulina

L-histidinaDeficiencia vitamnica B6 en el embarazo

L-homoserinaEnfermedades carenciales

L-glutaminaDeficiencia vitamnica B6 en el embarazoTratamiento de ulceras gstricas

L-isoleucinaEnfermedades carenciales

L-leucinaEnfermedades carenciales

L-fenilalaninaEnfermedades carenciales

L-prolinaEnfermedades carenciales

L-treoninaTratamiento del sobrepeso

L-valinaEnfermedades carenciales

L-cistenaTratamiento de bronquitis e inyeccin intravenosa post-operatoria

Con el objetivo de mejorar la produccin de aminocidos, actualmente se ha adaptado este limitado proceso a la fabricacin de cualquier D-aminocido pticamente puro. El aspecto ms innovador del descubrimiento reside en el desarrollo de un nuevo organismo recombinantecapaz de producir las tres enzimas necesarias en la sntesis de cualquier D-aminocido pticamente puro con una eficacia del 100%. El proceso consiste en introducir en la bacteria Escherichia coli un ADN plasmdico (material gentico extra cromosmico procedente de la bacteria parasitaria de plantas Agrobacterium tumefaciens) con el objetivo de incorporar los genes responsables de producir las enzimas(Martnez, 2009).En el ao 2002, ya se haba logrado producircualquier D-aminocido pticamentepuro con una eficiencia similar a la actual. Pero su elaboracin precisaba de tres organismos, cada uno de ellos responsable de aportar una enzima, y cuatro biorreactores. Tres de ellos eran empleados en la obtencin de las clulas productoras de las enzimas perseguidas; luego, stas eran mezcladas en un cuarto reactor donde se aada el sustrato necesario para la reaccin y se obtenan los compuestos deseados. Gracias al desarrollo de este nuevo mtodo que se ha patentado, se ha conseguido reducir el costo, tanto material como tiempo, de la fabricacin de D-aminocidos pticamente puros al ser necesario un nico organismo y, por tanto, un solo biorreactor.Actualmente este sistema de con expresin enzimtica para la produccin de D-aminocidos se utiliza para la obtencin de D-aminocidos, pero se tiene la intencin de adaptarlo a la fabricacin de otros dos tipos (los L- y pticamente puros).Entre otras aplicaciones, estos ltimos destacan por suya reconocido efecto anti-tumoral.

5. Que parmetros influyen en el procesoa) Temperatura del medio:

Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero de clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la de crecimiento. La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero la Top y la Ea suelen ser distintas. Tambin influye sobre el YX/S porque para T>Top, la energa de mantenimiento es mayor, baja YX/S Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.b) pH del medio:Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puede incrementar el rango adaptando las clulas por incrementos pequeos.

El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la formacin de producto. Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo. El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8. -levaduras: 3 6 -hongos: 3 7 -clulas vegetales: 5 6 -clulas animales: 6,5 7,5 Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de mantenimiento. El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N, aminocidos, CO2).

c) Concentracin de O2 disuelto en (DO)Es un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas. Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de la velocidad de crecimiento. La solubilidad del oxgeno en agua depende de la presin, de la temperatura y de las sales disueltas (a presin atmosfrica es 7ppm). La concentracin crtica de oxgeno disuelto CO2,critica es aquella por debajo de la cual comienza a controlar la velocidad de crecimiento: 510% de la concentracin de saturacin para bacterias y levaduras y 1050% de la concentracin de saturacin para hongos (segn el tamao).

*El O2 se introduce por burbujeo y su concentracin depende de la agitacin.d) Presin parcial de OxigenoSe distinguen dos tipos de microorganismos en funcin de su requerimiento en oxgeno: Los microorganismos aerobios, para los cuales la disponibilidad del oxgeno es indispensable; y los microorganismos anaerobios, para los cuales el oxgeno es txico. Existen, por ltimo, algunos microorganismos capaces de adaptar su metabolismo a las condiciones de oxigenacin imperantes en el medio y que son por lo tanto aerobios facultativos (ste es el caso de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisae, entre otros).La fermentacin aerobia es hasta hoy la ms utilizada ya que el crecimiento es mucho ms rpido en aerobiosis que en anaerobiosis. Sin embargo, los microorganismos anaerobios son capaces de sintetizar una serie de compuestos nicos (metano, etanol, solventes, etc), lo que ha provocado un nuevo inters en su cultivo y estudio, en particular para la industria qumica. Por otra parte es necesario mencionar dos limitantes que presentan las fermentaciones aerobias:a) Muy baja solubilidad del oxgeno en el agua, lo que hace necesario airear y agitar fuertemente el medio de cultivo.b) Produccin elevada de calor que debe ser constantemente removida a fin de mantener estable la temperatura.Las concentraciones de oxgeno y CO2 disueltos en el medio son controladas por sondas de O2 y CO2, respectivamente.e) Potencial redoxAfecta las reacciones de xido-reduccin. Est relacionado con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones de otros iones. Potencial de reduccin del medio:Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de nitrgeno) o por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S, HCl).a) Concentracin de CO2La concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Debido a que puede ser txica para algunas clulas y necesaria para otras. Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.b) Fuerza inica:Esta afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el interior de las clulas. *Depende de la concentracin y de la carga de los iones en el medio.

6. Qu tipo de metabolitos produce7. Conclusiones

Aplicaciones Se obtienen por procesos fermentativos, o bien mediante la sntesis enzimtica. Los microorganismos que producen (Lisina y arginina sonBrevibacteriumflavum, cido L-glutmico y fenilalanina son Corynebacteriumglutamicum, L-triptfano, cido L- asprtico la Escherichiacoli, y a L-Alanina es la Pseudomonasdacunhae); estos son los ms principales El aminocido ms producido es cido L-glutmico a partir de microorganismos8. Bibliografa Fisiologa General. Vas metablicas de sntesis Aminocidos y Nucletidos, Jess Merino Prez y Mara Jos Noriega Borge. Universidad de Cantabria. pg. 2-4 Consultado: 9 de Junio de 2015 Prescott, Harley, Klein (2002) Microbiologa. Ed. McGraw Hill Interamericana. 5 edicin. http://publicaciones.ops.org.ar/publicaciones/publicaciones%20virtuales/haccp_cd/haccp/Fas3.pdf Stainer, Ingraham, Wheelis, Painter (1996) Microbiologa. Ed. Revert, S.A., 2 edicin. Consultados: 6 de Junio de 2015 Miram Cassanello, Conceptos y tcnicas de Biotecnologa (FCEyN UBA), Biotecnologa Industrial Produccin Industrial de Metabolitos, Biorreactores- www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/biotec1/teoricos/CTB...pdf/at.../file Consultado: 6 de Junio de 2015 http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2010/05/05/los-microorganismos-como-factorias-produccion-de-aminoacidos/Consultado: 6 de Junio de 2015 Hernndez Alicia, Alfaro Ileana y Arrieta Ronald, Microbiologa Industrial

BIOSNTESIS DE AMINOCIDOSLa sntesis de aminocidos se desarrolla a un ritmo variable, dependiendo de las necesidades que existan en la clula respecto a cada aminocido particular. Las rutas metablicas son muy variadas; en el caso de los mamferos existen vas anablicas para unos once aminocidos, denominados no esenciales.La mayor parte de los aminocidos no esenciales se sintetizan a travs de vas metablicas muy simples con una secuencia de unas pocas reacciones. Los sustratos iniciales son metabolitos intermediarios del ciclo del cido ctrico, de la gluclisis o de la ruta de las pentosas-fosfato.Estas molculas aportan el esqueleto carbonado e incorporan el nitrgeno orgnico, fundamentalmente, del glutamato o de la glutamina.Existe un grupo de nueve aminocidos, denominados esenciales, que deben ser ingeridos con la dieta, ya que o bien no pueden sintetizarse, o el ritmo de sntesis no cubre las necesidades del organismo en una situacin concreta. En el caso del aminocido arginina, la cantidad necesaria para el adulto se obtiene a travs del ciclo de la urea, pero durante la infancia, cuando se est desarrollando el crecimiento y la sntesis proteica se realiza a mayor escala, la produccin del ciclo de la urea no es suficiente y se ha de incorporar en la dieta. El mismo caso ocurre tambin con otro aminocido como la histidina. Aparte de stos, el resto se puede formar cuando la cantidad de los mismos, bien procedente de la degradacin proteica o bien de la dieta,no es suficiente para permitir el proceso de recambio proteico.

Incorporacin de NH3 (NH4 +) a los aminocidos a travs del glutamato y la glutamina

En la mayora de los aminocidos, el grupo amino procede del glutamato mediante una reaccin de transaminacin, igual a las descritas para el proceso de catabolismo. El glutamato se sintetiza a partir de NH4 + y -cetoglutarato, metabolito del ciclo del cido ctrico, en una reaccin de aminacin directa catalizada por la enzima glutamato deshidrogenasa, la misma enzima que realiza la desaminacin localizada en la matriz mitocondrial, la diferencia estriba en que en la ruta biosinttica la enzima utiliza como coenzima al NADPH y no al NAD+.

NH4 + + -cetoglutarato + NADPH + H+glutamato + NADP+ + H2O

Mediante la glutamina sintetasa se realiza una segunda reaccin de aminacin sobre el glutamato obteniendo la glutamina.Glutamato + NH4 + + ATP glutamina + ADP + Pi + H+

La glutamina es uno de los principales sustratos utilizados por las transaminasas o aminotransferasas, para incorporar los grupos amino sobre los esqueletos carbonados

Rutas anablicas de los aminocidos

Las rutas biosinttica son muy variadas, algunas requieren una nica reaccin y otras son de una gran complejidad. Los aminocidos no esenciales tienen vas biosintticas relativamente simples, mientras que las rutas sintticas de los esenciales son bastante complejas.

Dentro de las ms sencillas estaran las que invirtiendo las reacciones de transaminacion, en las rutas catablicas, permiten obtener, en una nica reaccin, los siguientes aminocidos:Piruvato + glutamato Alanina + -cetoglutaratoOxalacetato + glutamato Aspartato + -cetoglutarato

Si el donador de grupos amino es la glutamina, el proceso es catalizado por una enzima muy ubicua, la asparraginasa y se realiza con coste energtico,

Aspartato + glutamina + ATP Asparragina + glutamato + ADP + Pi

Incluso utilizando un aminocido esencial como la fenilalanina en una nica reaccin puede obtenerse un aminocido no esencial como la tirosina:

Fenilalanina + O2 + NADPH + H+ Tirosina + NADP+ + H2O

Sin embargo, las rutas pueden ser ms complejas, y para clasificarlas se agrupa a los aminocidos por familias, dependiendo del metbolito precursor.

Derivados del -cetoglutaratoYa se ha descrito como el -cetoglutarato, metbolito intermediario del ciclo del cido ctrico, da origen al glutamato y a partir de ste se forman, glutamina, arginina y prolina. La glutamina se sintetiza a travs de la reaccin de aminacin directa, tal como se ha comentado previamente.La arginina se obtiene en el ciclo de la urea, y aunque la mayor parte de ella se rompe,por accin de la arginasa, en ornitina y urea, puede proporcionar la suficiente cantidad de aminocido para el recambio proteico de un individuo adulto, no as en los individuos jvenes que precisan cantidades elevadas para el crecimiento.

Derivados del 3-fosfogliceratoEste metabolito es un intermediario de la gluclisis y a travs de reacciones de transaminacin y reduccin da lugar a serina. A partir de la serina, se obtienen dos aminocidos: la glicina por eliminacin de un tomo de carbono a travs de un transportador, el tetrahidrofolato que mueve unidades activadas de un tomo de carbono. La sntesis de cistena requiere la participacin, adems de serina que proporciona el esqueleto carbonado, de otro aminocido, la metionina, que le suministra el tomo de azufre. En una primera reaccin la metionina se convierte en S-adenosil-metionina, pierde un grupo metilo y reacciona con la serina para dar el aminocido cistena.Regulacin de la sntesis de los aminocidosLa regulacin de las vas biosintticas aminoacdicas se lleva a cabo mediante diversos mecanismos.El eje de la regulacin en la clula parte de la determinacin de las necesidades. Se haDe considerar que una parte de los aminocidos necesarios para la sntesis proteica (alrededor de las 3/4 partes) se recuperan de los formados en la degradacin de protenas, y tan slo el resto deben incorporarse con la dieta o en ltimo extremo, ser sintetizados de nuevo.La retrorregulacin o regulacin feed-back es un sistema comn en las vas biosintticas de los aminocidos, de tal forma que el producto final bloquea la enzima inicial de la ruta, detenindose el proceso cuando la demanda del producto disminuye y su concentracin aumenta. En rutas divergentes, se requiere el aumento de concentracin de todos los productos finales para bloquear la primera enzima, en un tipo de regulacin denominado inhibicin concertada. En rutas compartidas, la regulacin ha de estar muy bien coordinada para evitar la detencin de la sntesis de un aminocido escaso debido a la sobreproduccin de otro. Para evitar estas situaciones, la clula dispone de varias estrategias de inhibicin concertada que aseguran la perfecta coordinacin de las sntesis necesarias.

Productos y servicios que puede ofrecer la microbiologa industrial 1. Produccin de clulas, como por ejemplo levaduras o algas con diferentes finalidades. La levadura ser necesaria para la produccin de pan. Las clulas se usan generalmente para la alimentacin, tanto humana, como en el caso de hongos o algas, como animales, como es el caso de la SCP, para formar parte del pienso, o para ser directamente el pienso. Otras veces se producirn clulas, pero slo se aprovechar una parte, como puede ser el caso de las esporas para los bioinsecticidas. 2. Enzimas y otras protenas de elevado valor aadido. Existen muchos enzimas que pueden entraar inters para su produccin industrial, y con diferentes usos posibles. Incluso otros tipos de protenas pueden ser tiles, como la insulina, el interfern,... 3. Metabolitos primarios y secundarios. Tanto un tipo como el otro pueden tener inters aplicado. Los metabolitos primarios son componentes relacionados con la sntesis de clulas microbianas, con su crecimiento. Aumentan en paralelo al crecimiento celular, o incluso de manera solapada. Son por ejemplo los productos finales de las fermentaciones como el etanol o los cidos orgnicos. Los metabolitos secundarios suelen acumularse en la fase que sigue a la fase de crecimiento activo, la trofofase, que es la que se denomina idiofase. Las sustancias que se producen en la idiofase no tienen relacin directa con la sntesis de materiales celulares, ni con el crecimiento. Son sustancias que no son bsicas para el crecimiento. La trofofase y la idiofase no son fases del crecimiento bacteriano, sino que son solo fases de la produccin de metabolitos, pueden coincidir con las fases de crecimiento, pero no son lo mismo. 4. Otros productos. Los anteriores son los productos de mayor importancia, pero existen otros productos, como: - polisacridos, que tienen muchos usos, como por ejemplo aditivos alimentarios. - Bioplsticos - Ciertas vitaminas - Transformacin de microorganismos. Se obtienen un producto, pero el microorganismo no lo ha sintetizado todo, sino que tan solo ha realizado un par de reacciones sobre l. Es el caso de los esteroides, cidos grasos,... Pueden tener un gran valor aadido. 5. Depuracin de residuos. Los ecosistemas tienen inercia y plasticidad. Cuando sufren alteraciones tienden a recuperarse. La actividad humana altera los ecosistemas, mediante la industria, por ejemplo. La industria que se instala al lado de un ro y usa el agua de este como refrigerante est produciendo en el ro una contaminacin fsica, ya que est alterando un factor bsico, como es la temperatura del ro. El ro continuar fluyendo y pasados unos kilmetros, habr vuelto a la temperatura que tena antes de pasar por la fbrica, ha conseguido restaurar el factor temperatura. Los ecosistemas tienen capacidades de regeneracin y recuperacin, pero la actividad humana actualmente ha superado con creces esta capacidad, por lo que los ecosistemas estarn permanentemente contaminados. Todo esto ha llevado al desarrollo de tecnologas de depuracin, que tratan de reducir el impacto de la actividad humana sobre los ecosistemas. Estas nuevas tcnicas se basan en la mimetizacin de los procesos que tienen lugar en el ro, pero aumentando la concentracin o la intensidad, como en el caso de las plantas de lodos activos. i. Aguas residuales. En los pases desarrollados hay una elevada produccin de aguas residuales, ya sean de origen domstico o industrial. Un elevado porcentaje de esta agua ser tratado biolgicamente. El objetivo de estos procesos es la eliminacin de la materia orgnica del agua, que no eliminarla directamente. Actualmente las aguas residuales se tratan siguiendo una serie de procesos aerbicos clsicos, como son: Lodos activos Lechos bacterianos Lagunas facultativas Reactores de clulas inmovilizadas

ii. Estos procesos hacen que la materia orgnica en suspensin en el agua se elimine por procesos de sedimentacin. Esto genera lodos, lo que implica que las plantas de depuracin de aguas eliminan residuos lquidos, pero los producen slidos, que debern ser tratados como otros residuos slidos. iii. Residuos slidos. Son otro gran problema de los pases desarrollados. Estos residuos pueden ir desde la simple basura del hogar, hasta los lodos resultantes de la depuracin de aguas, pasando por residuos agrcolas e industriales. Los residuos slidos se someten normalmente a procesos de digestin anaerobia. Este tipo de digestin reduce el volumen de los residuos. En condiciones de anaerobiosis, una buena parte del sustrato a partir del cual crecen las bacterias deber ser dedicado a la obtencin de energa, de manera que el crecimiento de bacterias a partir del sustrato es bajo. Los residuos orgnicos pasan a ser casi totalmente CH4 y CO2, lo que se conoce como biogas. El metano producido puede ser un combustible, por lo que puede ser usado como fuente de energa, pero puesto que el principal objetivo es la reduccin del volumen de residuos y su estabilizacin, la produccin de metano no est optimizada, aunque se debe aprovechar el que se produzca.iv. Xenobiticos. Adems de los residuos cotidianos, eventualmente se producen vertidos puntuales de xenobiticos. Se trata de productos producidos qumicamente por el hombre, no producidos por ningn ser vivo, y que no pueden ser degradados por ningn ser vivo. Tambin pueden darse vertidos de sustancias recalcitrantes, que son de difcil y lenta degradacin. Se han descubierto una serie de organismos capaces de degradarlos, que son inoculados cuando se produce un vertido. El problema de los xenobiticos se est haciendo desgraciadamente cada da ms comn. Un problema que se encuentra tambin es que para recalificar el suelo industrial a urbanizable, mucho ms rentable, este debe estar limpio de productos xenobiticos. 6. Aplicaciones analticas. Existe la posibilidad de usar microorganismos como biosensores. Se pueden usar tanto los microorganismos vivos, como sus enzimas u orgnulos unidos a electrodos de manera que las reacciones biolgicas devengan corrientes elctricas. Esto permite medir concentraciones de compuestos especficos en diferentes entornos, detectando contaminantes, aditivos en alimentos.Los biosensores han despertado un gran inters, pero an se estn poniendo a punto. Otro uso analtico de los microorganismos son los bioensayos, que consisten en la determinacin de una sustancia biolgicamente activa, ya sea conocida o no, sobre material vivo. No todos los bioensayos implican el uso de microorganismos. Antes de producir una sustancia a escala industrial, deberemos realizar con ella una serie de bioensayos, que mida una serie de factores de dicha sustancia. i. Biodegradabilidad. Toda sustancia que sea producida a gran escala industrialmente, en cantidades de toneladas, ha de ser biodegradable, porque si no lo fuese se acumulara muy rpidamente en los ecosistemas. Se han de hacer una serie de ensayos en el laboratorio que demuestren dicha biodegradabilidad. En trminos legales, cuando hablamos de biodegradable, en realidad nos referimos a que el 70% del producto es biodegradable, pasando a ser tan solo agua y dixido de carbono. El 30% restante no se degradar y su composicin permanecer desconocida. Esto es lo que estipula la ley.ii. No toxicidad al medio. Las sustancias que van al medio no han de alterar la salud del ecosistema. Existen dos tipos diferentes de ensayos de toxicidad. Agudos: Se expone al ser vivo al producto en cuestin a una concentracin muy elevada, durante un perodo breve de tiempo de su vida, por ejemplo, si calculamos una vida de 40 aos, el perodo breve seran 5 minutos Crnicos: Se expone al individuo a concentraciones bajas del producto durante un largo perodo de su vida, pudiendo incluso llegar a tratar a sus descendientes para ver el efecto en estos. Se han de hacer pruebas para evaluar el efecto de un producto sobre el ecosistema. En teora debera haber una serie de tests que permitiesen evaluar la toxicidad sobre todos los niveles del ecosistema, hasta llegar al hombre. Pero no sale rentable, por lo que se realizan muchos tests sobre bacterias, de manera que si es txico para la bacteria no se comercializar. Pero pese a no ser txico para la bacteria podra ser txico para otros organismos. iii. Mutagenicidad. Es un factor que se ha de tener muy en cuenta. El problema que presenta la mutagenicidad es que los efectos se pueden producir muy adelante, incluso en la descendencia, por lo que los ensayos que comprueban esto son muy largos y complejos. El test ms empleado actualmente es el que se conoce como test de Ames. Ames obtuvo mutantes His- de S. typhimurium. Este mutante tiene una tasa de reversin elevada de aproximadamente 10-4, que Ames tena muy bien medida. Esta bacteria se pona en contacto con la sustancia a comprobar. Si aumentaba la tasa de reversin, se trataba de un producto mutagnico, en caso de no aumentar era no mutagnico. El problema radica en que muchas sustancias son premutgenos, que en su forma inicial no son mutagnicas, pero que al llegar al hgado se activan y pasan a ser mutgenos. Para comprobar que la sustancia no es un premutgeno se le administraba a una rata. Despus se sacrificaba, se extraa el hgado y se someta a ste a una centrifugacin diferencial. Aslas entonces las fraccin microsomal, que contendr premutgenos activados y la compruebas con S. typhimurium. 8. Lixiviacin. Podemos usar los microorganismos para la recuperacin de metales a partir de minerales y restos de minas, con contenidos de metales demasiado bajos para la fundicin, el mtodo tradicional. La biolixiviacin la realiza Thiobacillus ferrooxidans

Produccin microbiana industrial: Fermentacin ( Publicado en "La Revolucin de la Bioingeniera", Fernando Mnckeberg, 1988,Editorial Mediterrneo )Las tcnicas de ingeniera gentica sin duda permitirn avances espectaculares en la eficiencia y rendimiento en la produccin de los ms variados productos microbianos. Sin embargo, es necesario recalcar que estos microorganismos, naturales o manipulados genticamente, deben colocarse en un ambiente favorable tanto para su crecimiento como para la ptima expresin del producto buscado a fin de poder producirlo a nivel industrial. En efecto, el crecimiento microbiano depende tanto del genotipo como del medio ambiente en que ste se desarrolla. Este ambiente controlado y propicio al crecimiento microbiano se logra, ya sea en el laboratorio o en la industria, gracias a un instrumento especial, llamado fermentador (figura 1).En los ltimos aos se han logrado avances significativos en el diseo de los fermentadores as como en el grado de control que se ejerce durante el proceso de fermentacin. El fermentador no es ms que un instrumento que permite al operador controlar el estado del medio de cultivo, el cual determina el crecimiento y produccin de un microorganismo. De ah que este artculo tratar, en primer trmino, sobre algunas caractersticas fisiolgicas generales de los microorganismos que deben ser consideradas durante la fermentacin. Luego nos referiremos a los nutrientes necesarios para sostener el crecimiento y, finalmente, a los medios tecnolgicos para lograr la ptimainteraccin entre nutrientes y microorganismos, con el fin de obtener el metablico deseado con la mxima eficiencia.

Requerimientos fisiolgicos del crecimiento microbiano

Para su crecimiento, los microorganismos utilizados en los procesos tecnolgicos, requieren estrictas condiciones del medio ambiente, tales como:

Medio acuoso.Todas las reacciones biolgicas se realizan en presencia de agua. Esta ltima es por lo general el principal componente del medio de cultivo. Incluso aquellos microorganismos que crecen en un medio slido como granos de cereales, pajas a heno, necesitan que estos sustratos estn humedecidos para poder colonizarlos.

Temperatura de crecimiento. Las temperaturas entre las cuales se puede desarrollar una clula microbiana vara entre 10 y 600C. Segn el rango de temperatura en el cual el crecimiento es posible podemos distinguir microorganismos sicrfilos (4-25 0C), mesfilos (30-40 0C) y termfilos (40-65 0C y ms).

La temperatura del medio de cultivo dentro de un fermentador es medida en forma continua gracias a una termocupla inmersa en l. Esta ltima est conectada a un sistema de calentamiento-enfriamiento del fermentador, el cual permite mantener la temperatura constante durante toda la operacin.

Acidez. El pH de crecimiento de los microorganismos vara entre 3.0 y 8.0. En forma general, las bacterias crecen a pH cercanos a la neutralidad (pH 7.0), con la importante excepcin de las bacterias lcticas que resisten pH cidos. Por el contrario, la mayora de los hongos filamentosos y levaduras prefieren pH cidos, de alrededor de 5.0. Esta cido-tolerancia otorga una ventaja importante a las fermentaciones con hongos, ya que el riesgo de contaminacin bacteriana es bajo.

Durante la fermentacin, hay produccin o consumo de cido en el medio segn el microorganismo, lo cual produce una variacin del pH. Este ltimo es detectado gracias a un electrodo inmerso en el medio. Este electrodo acciona dos bombas (una con cido y otra con lcali) que equilibran constantemente este parmetro.

Presin parcial de oxgeno. Se distinguen dos tipos de microorganismos en funcin de su requerimiento en oxgeno: Los microorganismos aerobios, para los cuales la disponibilidad del oxgeno es indispensable; y los microorganismos anaerobios, para los cuales el oxgeno es txico. Existen, por ltimo, algunos microorganismos capaces de adaptar su metabolismo a las condiciones de oxigenacin imperantes en el medio y que son por lo tanto aerobios facultativos (ste es el caso de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisae, entre otros).

La fermentacin aerobia es hasta hoy la ms utilizada ya que el crecimiento es mucho ms rpido en aerobiosis que en anaerobiosis. Sin embargo, los microorganismos anaerobios son capaces de sintetizar una serie de compuestos nicos (metano, etanol, solventes, etc), lo que ha provocado un nuevo inters en su cultivo y estudio, en particular para la industria qumica. Por otra parte es necesario mencionar dos limitantes que presentan las fermentaciones aerobias:

a) Muy baja solubilidad del oxgeno en el agua, lo que hace necesario airear y agitar fuertemente el medio de cultivo.

b) Produccin elevada de calor que debe ser constantemente removida a fin de mantener estable la temperatura.

Las concentraciones de oxgeno y CO2 disueltos en el medio son controladas por sondas de O2 y CO2, respectivamente.

Nutrientes requeridos para el crecimiento de microorganismos

En primer lugar, el microorganismo requerir de una fuente de carbono de la cual extraer la energa necesaria para su metabolismo. Las fuentes de carbono ms comunes son los hidratos de carbono, tales como almidn y azcares.

Durante los aos sesenta, algunos hidrocarburos derivados del petrleo fueron intensamente estudiados como fuentes de carbono de bajo costo. Esta situacin cambi radicalmente en la dcada del 70, debido al alza del precio del petrleo y hoy en da, por el contrario, se investiga la conversin biolgica de hidratos de carbono en combustibles. En la bsqueda de nuevas fuentes de carbono, se est estudiando, desde hace poco, la utilizacin de recursos lignocelulsicos (pajas de cereales, rboles y sus residuos, etc.), principal fuente de biomasa renovable (captulo 4).

Muchas de estas fuentes de carbono requieren un pretratamiento previo a su utilizacin; es el caso, por ejemplo, del almidn que debe ser cocido e hidrolizado hasta glucosa antes de ser trasformado en etanol por los microorganismos que realizan esta transformacin. Es tambin el caso de la celulosa y de los substratos lignocelulsicos en general, los cuales necesitan drsticos tratamientos fsicos y/o qumicos antes de ser utilizables con este fin.

Otros nutrientes que son necesarios en cantidades importantes para el crecimiento microbiano son el nitrgeno, el fsforo y el azufre. Estos elementos son incorporados en las molculas estructurales y funcionales de la clula. El nitrgeno, en particular, debe ser provisto en proporciones variables bajo la forma de nitrgeno proteico obtenidos a partir de subproductos de la industria del maz, extracto de levadura u otros, y no proteico (sales de amonio, urea, etc.). Los otros dos elementos son entregados como sales de fosfato y sulfato, respectivamente.

Por ltimo, una serie de micronutrientes (vitaminas, hierro, cobalto, cobre, zinc, etc.), deben ser suministrados al medio.

La determinacin de varios de estos nutrientes en forma continua durante la fermentacin permitir en un futuro prximo espectaculares avances en el control de los procesos. Esto ha sido posible gracias al reciente desarrollo de sensores o electrodos biolgicos (enzimticos y microbianos). Esta tecnologa, novedosa y especfica, promete un gran desarrollo en un futuro prximo, ya que tiene grandes ventajas en materia de anlisis, tales como respuesta rpida, aplicacin en muestras coloreadas, uso repetido de los biocatalizadores, etc. El principal problema para su puesta en operacin es la dificultad de esterilizar el biosensor sin inactivarlo.

Tipos de fermentadores

Un fermentador es un recipiente de vidrio o acero inoxidable si el uso es farmacutico, o de material menos noble, como acero al carbono, en el caso de aplicaciones menos exigentes en pureza. Por lo general, el reservorio tiene una altura 2.5 a 4 veces superior a su dimetro, y en funcin de la aplicacin, su volumen vara entre 1000-10 000 lt en el caso de un producto farmacutico, a 1500000 lt, y ms en el caso de la produccin de microorganismos como fuente de protena animal.

El diseo de un fermentador, aparte de asegurar que la operacin s desempee en forma asptica, debe responder a tres requisitos principales: Mezcla adecuada, buena trasferencia del oxgeno del aire al microorganismo y remocin del calor. Este ltimo imperativo explica que, a pesar de las bajas temperaturas a que operan los procesos biolgicos con respecto a la catlisis qumica; sea necesario considerar superficies importantes de intercambio trmico dentro del fermentador para mantener la temperatura de crecimiento. Esto explica tambin en parte el inters que presentan los microorganismos termfilos, capaces de trabajar a temperaturas ms elevadas que otros microorganismos, lo cual reduce por una parte los problemas de remocin de calor durante la fermentacin y, por otra parte, los riesgos de contaminacin por los microorganismos mesfilos.

En forma general existen tres tipos principales de fermentadores para cultivos aerbicos (figuras 1 y 2):

1) Estanques aireados agitados. Estos son los ms tradicionales y tuvieron un gran desarrollo durante los aos 50 y se usan para la produccin de antibiticos como la penicilina a escala industrial. El diseo implementado en aquella poca se ha mantenido hasta hoy, a pesar que se han efectuado varias modificaciones importantes, en particular en el sistema de agitacin.

El fermentador agitado consiste en un cilindro vertical que posee varios deflectores para prevenir la formacin de un torbellino durante la agitacin. El aire estril penetra por la base del reservorio, a travs de un distribuidor circular. El eje vertical lleva una o varias hlices en funcin de la relacin altura/dimetro. En los ltimos veinte aos, varias compaas han modificado los agitadores de sus fermentadores, con el fin de disminuir los gastos en energa de agitacin.

A pesar de que este modelo de fermentador no es el ms econmico de instalar ni de operar, sigue siendo el ms corrientemente utilizado desde los ltimos treinta aos. La razn de su xito reside en su gran versatilidad para ser usado a cualquier escala de produccin y para un gran nmero de procesos sin modificaciones del diseo. Por lo tanto, los costos relativamente elevados de inversin y operacin se encuentran compensados por su flexibilidad.

2) Reactores tubulares (Air-1ift). Se trata de un reactor en forma de torre o columna, en el cual el aire es introducido en la base del tubo, y la ascensin de las burbujas de aire constituye el nico tipo de agitacin existente.

A pesar de que el modelo agitado permite concentraciones superiores de biomasa, el fermentador tubular, por su simplicidad y costos inferiores de energa, mantencin e instalacin, es preferido en algunos procesos al anterior. Estos fermentadores son utilizados en la produccin de cerveza, vinagre y cido ctrico.

3)< Estanques a recirculacin. Todos los fermentadores de este tipo tienen en comn el flujo del medio de cultivo en una direccin definida. Esto se ha logrado gracias a la incorporacin de tubos de aspiracin en el diseo, lo cual permite una recirculacin interna del fluido, o por el uso de un conducto de recirculacin, el que permite una recirculacin externa.

La fuerza motora se desarrolla por el efecto de ascensin de las burbujas de aire (air lift) o por un sistema de flujo hidrodinmico. Existe gran polmica sobre las virtudes de este tipo de sistema, el cual para muchos, es tan eficiente a ms que el tanque agitado con respecto a la trasferencia de masa, y con una economa sustancial de energa.

Este sistema es usado, por ejemplo, por la compaa ICI (Imperial Chemical Industries), de Inglaterra, para producir protena unicelular (ver captulo 4) en un fermentador de 1.500.000 lt. Este tipo de fermentadores ha producido un inters creciente por la reduccin en los costos de produccin. Sin embargo, no se conocen bien an los problemas en la sntesis de un producto que pueden derivar de las fluctuaciones ambientales a las que es sometido un microorganismo en este tipo de fermentadores por la falta de agitacin. Por lo tanto, el desarrollo de la investigacin en este sentido es indispensable.

Etapas para la obtencin de un producto microbiano

La secuencia de etapas envueltas en la obtencin de un producto o de clulas enteras, por fermentacin, son las siguientes:

a) Produccin del biocatalizador (clula o enzima) o starter. EL costo de los catalizadores que hay que agregar puede ser elevado, en particular cuando se trata de enzimas purificadas. En efecto, en este ltimo caso, el costo de muchas de ellas es tal, que el proceso solo es econmico si stas pueden ser utilizadas varias veces. Por lo tanto, durante los ltimos das se han realizado grandes esfuerzos por recuperar la mayor cantidad de catalizador de cada ciclo.

Una forma de realizar este objetivo es reciclar las clulas microbianas a las enzimas. Esto resulta muy difcil de operar con las enzimas y provoca a menudo lesiones en las clulas y contaminacin con organismos forneos del reactor.

Otra manera de reducir las prdidas del catalizador, es mantenindolo dentro del fermentador, inmovilizado. Esto se logra gracias a la transformacin de la enzima soluble o de la clula microbiana, en una nueva forma de catalizador, una forma fija sobre un soporte slido (figura 3).

El primer mtodo de inmovilizacin que fue desarrollado y el ms simple, es la adsorcin: Las enzimas o clulas se adhieren por atraccin fsica a la superficie de un material inerte como celulosa, carbn, arcilla, entre otros. Una unin ms estrecha y estable puede resultar de la formacin de un enlace qumico, covalente, entre el catalizador y el soporte. Este ltimo puede ser de celulosa, perlas de vidrio, plsticos o polmeros sintticos. En estos dos tipos de inmovilizacin, el soporte se encuentra bajo la forma de partculas de pequeo tamao lo que permite una gran superficie de contacto entre el sustrato y el catalizador. Un tercer tipo de inmovilizacin consiste en atrapar el catalizador en una matriz formada por un polmero como almidn, slica u otros. Otro tipo de atrapamiento es la microencapsulacin. Esta consiste en encerrar el biocatalizador en una cpsula de un dimetro muy pequeo, del orden de los 100 micrones. La cpsula funciona como una membrana semi-permeable: deja pasar las pequeas molculas de sustrato y producto libremente, pero retiene las ms grandes (enzimas o clulas).

Estos biocatalizadores inmovilizados, pueden tener varias formas (cilindros, hojas, partculas, etc.) y han sido utilizados en todo tipo de reactores.

Las potencialidades de la inmovilizacin de enzimas y en particular de clulas enteras son considerables, ya que se ha demostrado que no slo se puede reutilizar el biocatalizador, sino que, muchas veces, los rendimientos y la vida media de ste aumentan en forma significativa. Sin embargo, muchos problemas debern ser resueltos, como la eleccin del mejor soporte, asegurar un control adecuada del pH, suplementar adecuadamente con oxgeno en los casos que sea necesario, etc., para asegurar el ptimo funcionamiento de estos biocatalizadores.

b) Preparacin del medio de cultivo (pretratamiento de la materia prima, adicin de nutrientes, ajuste de pH).

c) Esterilizacin del medio de cultivo. Para evitar la contaminacin del medio por microorganismos indeseables, es necesario esterilizarlo y mantener condiciones aspticas durante la fermentacin (aireacin estril, adicin de nutrientes estriles, etc.). Esto se debe a que la mayora de los productas biolgicos obtenidos hasta hoy son producidos en cultivo puro, es decir, por un solo microorganismo. La contaminacin de este cultivo por otros microorganismos puede resultar en la destruccin del catalizador, en su inhibicin o en la destruccin del producto. Por ltimo, pueden introducirse sustancias txicas difciles de separar del producto que nos interesa (como en el caso de un antibitico, por ejemplo).

d) Sntesis del producto. En funcin del producto y del catalizador empleado se determina la modalidad de funcionamiento del fermentador: Continua a discontinua.

En los procesos discontinuos o tipo batch, el aporte de nutrientes es nico, el tiempo de fermentacin es limitado y el producto es recuperado ntegramente al final de la fermentacin por vaciado de la cuba del fermentador. Este mtodo es actualmente el ms utilizado para los productos que necesitan condiciones de esterilidad muy estrictas.

En los procesos continuos, en cambio, el aporte de nutrientes es renovado regularmente y el producto es removido al mismo tiempo. Este tipo de procesos presenta varias ventajas con respecto a los procesos discontinuos. As, por ejemplo, los volmenes de produccin por unidad instalada son muy superiores en un sistema continuo. Por otra parte, el catalizador no es eliminado en este tipo de proceso, lo cual permite economas sustanciales, ya que se considera que el precio del biocatalizador es, por lo menos, igual al de los nutrientes empleados en su crecimiento. Por ltimo y sobre todo, este tipo de cultivo abierto permite una versatilidad inherente de operacin, en el cual todos los parmetros (concentracin microbiana velocidad de crecimiento, concentracin de sustratos y productos) pueden ser controlados indefinidamente.

Existen dos tipos principales de fermentadores continuos: El quemostato, en el cual el crecimiento est controlado por uno o ms sustratos que son limitantes, y el turbidostato, que opera a tasas mximas de crecimiento, gracias al ajuste del flujo de nutrientes a una velocidad tal que el crecimiento no se encuentre en ningn momento limitado por ningn sustrato.

La mxima velocidad de crecimiento de un microorganismo es el resultado de las caractersticas inherentes de ste, ms que la consecuencia de la disponibilidad de nutrientes. En las mejores condiciones, el crecimiento es exponencial. Una disminucin en la velocidad de crecimiento puede operarse limitando la disponibilidad de cualquier nutriente esencial. En esta nueva situacin el crecimiento se encuentra desequilibrado y los nutrientes divergen hacia otras rutas metablicas que no son aparentemente indispensables para el crecimiento. Aquellos metabolitos que son producidos cuando el microorganismo se encuentra en fase exponencial de crecimiento, se llaman primarios (cido ctrico, aminocidos, alcoholes, etc.), por oposicin a los metabolitos secundarios (vitaminas, antibiticos, etc.), los cuales son sintetizados en condiciones de crecimiento sub-ptimas. El tipo de metabolito secundario que ser sintetizado depender del microorganismo involucrado y del nutriente limitante en el medio de cultivo (carbono, nitrgeno, fsforo, azufre, etc.).

Segn el tipo de metabolito requerido, la estrategia de fermentacin a seguir deber en primer lugar tomar en cuenta en qu momento del crecimiento ste se expresa. As, por ejemplo, en el caso de un metabolito secundario, muchas veces convendr utilizar un sistema doble de fermentacin. En el primer recipiente, Se har crecer el microorganismo en condiciones ptimas a fin de obtener el mximo de biomasa microbiana. Luego, esta biomasa se trasladar al segundo recipiente donde la limitacin de un nutriente particular permitir la sntesis del metabolito. Este sistema permite tambin el ptimo aprovechamiento de la materia prima utilizada, la cual sera de otra manera en gran parte desperdiciada.

e) Separacin del medio y del catalizador. El producto puede encontrarse dentro de la clula (producto intracelular), como en el caso de la vitamina B12 o la enzima glucosa isomerasa, por ejemplo; tambin es la situacin de los productos obtenidos por transformacin gentica en Escherichia coli.. O bien puede ser liberado al medio de cultivo (extracelular), como es el caso de la penicilina, amilasa, aminocidos y otros.

f) Purificacin del producto. Si el producto es extracelular, es decir, es excretado al medio por la bacteria, se encontrar relativamente puro, pero diluido en un gran volumen de agua. Si es intracelular (no excretado al medio) estar mezclado con todos los constituyentes celulares y habr que separarlo de ellos.

En el caso de E. coli, por ejemplo, los productos son intracelulares. En primer trmino hay que concentrar las bacterias, lo que se logra por filtracin o centrifugacin.

Para obtener el producto, hay que romper las bacterias, quedando ste mezclado con todos los constituyentes celulares. Para separarlo se utilizan diversos mtodos, tales como precipitacin con sales o alcohol y/o tcnicas cromatogrficas, (que separan las molculas de acuerdo a tamao, carga elctrica o por su afinidad por algn reactivo qumico).

En cada caso, hay que adaptar las diversas alterativas de purificacin y extraccin. Dentro de estos procesos, especialmente para los productos de alto valor comercial, los anticuerpos monoclonales estn comenzando a ser de gran utilidad (ver captulo 12). Ella se debe a su tremenda especificidad y sensibilidad. Sin embargo, paradojalmente, esta ltima propiedad trae problemas en el caso de productos lbiles, ya que la separacin final del complejo antgeno-anticuerpo es difcil de romper y requiere de tratamientos drsticos y muchas veces denaturantes.

Fermentacin con microorganismos recombinantes

Las tcnicas de recombinacin de DNA, estn permitiendo lograr microorganismos que produzcan las sustancias que se desean, de acuerdo a como hayan sido programadas. El cultivar estas bacterias modificadas en reactores industriales agregan problemas que es necesario considerar. El DNA que se les introduce es extrao a ellas. Al crecer y multiplicarse la bacteria, tiende a eliminar el plasmidio, volviendo as a su condicin natural.

Los reactores que deben usarse en estos casos tendrn que tener algunas modificaciones para impedir esta inestabilidad del plasmidio. Cuando se preparan los plasmidios para introducirlos en las bacterias, se agrega un trozo extra de DNA, lo que permitir la expresin del gen deseado slo a altas temperaturas. Esto significa que el reactor tiene que tener dos compartimentos: uno a baja temperatura, en que las bacterias puedan crecer y desarrollarse ptimamente sin expresar el plasmidio. Cuando se logra un nmero suficiente de bacterias, se pasan a un segundo reactor, con mayor temperatura, y all se activa y transcribe el plasmidio.

El trabajar con microorganismos recombinantes, que son ms delicados, requiere tambin de adaptaciones en los reactores. La mayor parte de las industrias de fermentacin tienen, por ejemplo, agitadores convencionales y probablemente sea conveniente modificarlos. De igual forma, el volumen de los fermentadores tendr que ser menor, para permitir una mayor versatilidad.

Sin lugar a dudas, trabajar con microorganismos recombinantes, tiene muchos problemas que an no han sido resueltos y que requieren de mayor investigacin. El proceso de clonacin de un microorganismo, es relativamente sencillo, pero de all a la produccin industrial en fermentadores, hay un largo camino que recorrer. La verdad sea dicha que en esta etapa est uno de los mayores obstculos para el desarrollo de la biotecnologa. Todava falta mucho que conocer acerca de la fisiologa de los microorganismos y su respuesta cuando se introducen genes extraos.

Por ejemplo, la mayora de las protenas humanas son glicosiladas (contienen ligada a la parte proteica, residuos de carbohidratos). No se sabe si esta glicosilacin es importante para la actividad biolgica de la protena. La que s se sabe, es que ni E. coli, ni ninguna otra bacteria puede hacer esta glicosilacin. Por eso ahora se buscan otras alternativas, como levaduras u hongos filamentosos capaces de glicosilar las protenas y que, adems, tienen la ventaja que pueden secretar al medio la protena que producen.

En todo caso, las investigaciones siguen avanzando y se siguen produciendo innovaciones, no todas divulgadas a causa del secreto industrial. Por ejemplo, Gene Link, una compaa australiana, est estudiando el efecto de irradiar microorganismos con pequeas dosis de rayos gama, con el fin de destruir el DNA de las bacterias, dejando indemne el plasmidio. Este producira solamente la protena codificada por l.

En todo caso, los problemas que se han ido presentando, no parecen insalvables, y nuevas investigaciones harn que el proceso productivo sea ms seguro, eficiente y econmico.

Bibliografa

1. Audidiere, P.: Le Choix de un Fermenteur. Biofutur Avril, p 61-63,1984.

2. Bjurstrom, E.: Biotechnology. Chemical Engineering. February 18:126-133,1985.

3. Bull, A., Halt, G. y Lilly, M.D.: Biotechnology, International Trends and Perspectives. OCDE, Paris, 83 pp. 1982.

4. Chibata, I. y Tosa, T.: Transformations of Organic Compounds by Immobilized Microbial Cells. Adv. in Applied Microbiol. 22, 1-27, 1977.

5. Feder, J. y Tolbert, W.: The Large - Scale Cultivation of Mamalian Cells. Sc. Am. 248:24, 1983.

6. Karube, I. y Suzuki, S.: Biosensors for Food Process Control. En: Use of Enzymes in Food Technology (Dupuy, P. Ed.), Tee & Doc. Lavoisier, Paris, p. 3-13, 1982.

7. Kristiansen, B. y Chamberlain, H.E.: Fermenter Design. In The Fihamentous Fungi, vol. 4 (Smith J.E.: Berry, D. y Kristiansen, B. Eds), London, Edward Arnold, p. 1-19, 1983.

8. Gaden Jr., E.L: Production Method in Industrial Microbiology. Sc. Am. 245:180, 1981.

9. Preuss, P.: Industry in Ferment. Science, 6:12, 1985.

10. Yanchinski, S: Boom and Bust in the Bio Business. New Scientist 1544:44, 1987.