225

Apéndice

REGLAS BASICAS DE BIOSEGURIDAD Se beben tomar las siguientes precauciones cuando de hacen las pruebas de sus-ceptibilidad:

1. Siga las prácticas de Bio-Seguridad Nivel 2 (BSL2).* No se requiere usar guantes y mascarilla cuando se trabaja con bacterias BSL2 en cultivo puro.

2. Use una bata de laboratorio abotonada. 3. Desinfecte el área de trabajo antes de trabajar, si se derrama algún material, y

al fi nal de la jornada de trabajo. 4. Evite crear aerosoles. Para la prueba de difusión por discos, remueve el exceso

de inoculo del hisopo antes de inocular el agar. Si se requiere usar el vortex, use tubos con tapas de rosca y sello.

5. Use el envase para agudos cuando disponga de pipetas, lupas para inocular, hisopos, palitos de madera, hisopos o cualquier material agudo.

6. Todo material contaminado debe ser descartado en envases para material bio-lógico peligroso.

*A ningún costo, podrá encontrar en la “Web,” en español y en ingles, un manual con información esencial sobre las prácticas de bioseguidad BSL-2.

“Bioseguridad en Laboratorios Biomédicos y de Microbiología (BMBL):, 4 a edición.” http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty.htm

El manual se puede comprar enviando su pedido a la siguiente dirección: US Government Printing Offi ce Washington, DC 20202 Stock #: 017-040-00547-4

226 Apéndice

MÉTODO DE PREPARACIÓN DEL 0,5 STANDARD DE MCFARLAND Reactivos

1% Cloruro de Bario (BaCl 2 ) anhídrido 1% Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) puro y frío

Método de Preparación

1. Añadir 0,5 mL de 1% BaCl 2 a 99,5 mL de 1% de H 2 SO 4 . 2. Revuelva para mantener en suspensión. 3. Mezclar completamente ante de proceder al siguiente paso. 4. Distribuya 5 mL de la solución de McFarland en tubos de diámetros similares.

Se sugiere usar los mismos tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de las suspensiones antes de la inoculación.

5. Cuando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale a un cultivo que contiene 1,5 x 10 8 células.

6. Los tubos que contienen la solución de 0.5 McFarland se deben guardar en un lugar oscuro, a temperatura ambiente.

7. Consulte el documento M2 de la NCCLS para mas detalles y también para el procedimiento para el control de calidad.

Apéndice 227

...De NCCLS M100-S14 (M7)La siguiente tabla refl eja los medicamentos listados para ser probados contra los organismos respectivos en las Tablas 2A-2J en M100 y da algunos ejemplos a considerar para protocolos de verifi cación en dada institución. La lista incluye Fenotipos que 1) nunca han sido documentados, 2) no son comunes, y/o 3) representan resultado que fácilmente pueden ocurrir de errores técnicos y que pueden tener consecuencias clínicas signifi cativas.

Tabla 8. Sugerencias para Verifi cación de Resultados de Prueba de Susceptibilidad Antimicrobial y Confi rmación de Identifi cación de Organismos

Organismo o Grupo

Categoría Ia

Fenotipos que no han sido reportados, no son comunes

y/o resultan de errores técnicos

Categoría IIb

Fenotipos que pueden ser poco comunes en dada institución y/o

resultan de errores técnicos

Organismos gram-negativos

Enterobacteriaceae (cualquiera) carbapeneme-I o R amikacina-Rfl ouroquinolona-R

Citrobacter freudiiEnterobacter spp.Serratia marcescens

ampicilina, cefazolina o cefatolina-S

Escherichia coli BLEE confi rmado positivo

Klebsiella spp. ampicilina-S BLEE confi rmado positivo

Proteus vulgarisProvidencia spp.

ampicilina-S

Pseudomonas aeruginosa gentamicina concurrente y tobramicina y amikacina-R

Stenotrophomonas maltophilia carbapeneme-S trimetrhoprim-sulfamethoxazole-R

Haemophilus infl uenzae aztreonam-NScarbapeneme-Scefalosporina 3era generación-NSc

fl uoroquinolona-NS

ampicilina-R y beta-lactamasa negativa amoxicila-ácido clavulánico-R

Neisseria gonorrhoeae cefalosporina 3era generación-R fl uoroquinolona-R

Cualquier organismo Resistente a todos los agentes probados rutinariamente.

Organismos gram-positivos

Enterococcus spp vancomicina-R

Enterococcus faecalis ampicilina o penicilina-Rquinupristina-dalfopristina-Slinezolida-R

aminoglucósido-R de alto-nivel (particularmente si aislado de área de cuerpo estéril)

228 Apéndice

Organismos gram-positivos

Enterococcus faecium linezolida-R aminoglucósido-R de alto-nivel (particularmente si aislado de área de cuerpo estéril)

Staphylococcus aureus linezolida-NSquinupristina-dalfopristina-I o Rvancomicina-I o R

oxacilina-R

Staphylococcus, coagulosa-negativa linezolida-NSvancomicina-I o R

penicilina-Rcefalosporina-R 3era- generación

Streptococcus pneumoniae fl uoroquinolona-Rlinezolidac -NSvancomicinac -NS

Streptococcus grupo beta ampicilina o penicilinac -NScefalosporina 3era-generación-NSlinezolida-NSvancomicinac-NS

Streptococcus grupo viridian linezolida-NSvancomicina-NS

penicilina-I o -R

Cualquier organismo Resistente a todos los agentes probados rutinariamente.

aCategoría I

Cuando los resultados listados en esta categoría son observados en aislamientos individuales de pacientes, deben ser verifi cados por uno o más de los

siguientes:

1. Asegurando que los resultados inusuales no son debido a errores de trascripción, contaminación o uso de un panel, cultivo o medio defectuoso.

2. Checando reportes anteriores del paciente para determinar si el aislamiento fue encontrado y verifi cado anteriormente.

3. Confi rmando la identifi cación de aislamientos.

4. Repitiendo la prueba de susceptibilidad para confi rmar los resultados. Algunas veces ayuda el usar métodos de prueba alternativos para la prueba a

repetir.

5. Para aislamientos que muestran resultados otros que susceptibilidad para esos agentes antimicrobianos para los que solo son proveídos criterios

interpretativos de susceptibilidad en las Tablas 2A-2J (listados con “NS” arriba) y para estafi lococos con vancomicina intermedia o resultados

resistentes; 1) confi rmar la identifi cación del organismo; 2) confi rmar el resultado de la prueba de susceptibilidad antimicrobial; 3) guardar el

aislamiento; y 4) mandar el aislamiento a un laboratorio de referencia que lo probará por medio de un método de dilución de referencia NCCLS.bCategoría II

Cuando los resultados listados en esta categoría son observados en aislamientos individuales de pacientes, los pasos de verifi cación como se resalta en la

Categoría I, deben ser considerados si la resistencia es poco común en dada institución. cPara estas combinaciones de agentes/organismos antimicrobiales la resistencia no ha sido documentada a la fecha.

Apéndice 229

Prueba de Susceptibilidad por Difusión por discos Guía para la Resolución de Problemas

RESULTADOS ABERRANTES CAUSAS PROBABLES ACCION CORRECTIVA(documentar todos los errores)

EFECTO EN LOS REPORTESDIARIOS

El halo (zona) de tetraciclina esmuy grande y el de clindami-cina muy pequeno en las ce-pas control de Escherichiacoli y Staphylococcus aureus

El halo de tetraciclina es muypequeno y el de clindamicinamuy grande en las cepas con-trol de Escherichia coli yStaphylococcus aureus

pH del medio demasiado bajo

pH del medio demasiado alto

Ajustar el pH del medio a 7,2–7,4 antes de verter el medio

Use un lote nuevoLos medios comerciales no de-

ben tener problemas de pH

NO REPORTAR los resultadoshasta que se haya corregido elproblema y que un lote nuevodel medio produzca resultadossatisfactorios con las cepascontrol

El halo de los aminglycosidos esmuy pequeno con la cepacontrol de Pseudomonas ae-ruginosa

Los halos en los aminoglycosi-dos con la cepa control dePseudomonas aeruginosa esmuy grande

La concentracion en Ca�� y/oMg�� es muy alta en el me-dio

La concentracion en Ca�� y/oMg�� es muy baja en el me-dio

(La incubacion en CO2 puede al-terar el pH de la superficie delagar)

Adquirir un nuevo lote de agarque cumpla con los requisitosdel control de calidad

NO REPORTAR los resultadosde aminoglycosidos en P. ae-ruginosa y Acinetobacterhasta que los halos correspon-dan a los estandares del con-trol de calidad

Los halos son universalmentemuy grandes en las placas(platos) control

Bajo inoculo Ajustar el inoculo a la turbidezde 0,5 McFarland

No reportar hasta que el controlde calidad este dentro de losrangos (limites) aceptables

El nivel nutritivo del medio esmuy bajo

Usar solamente el agar Mueller-Hinton

NO REPORTAR hasta que seuse agar Mueller-Hinton

Organismos de crecimientolento (no se evidencia en loscontroles)

Usar el procedimiento de la con-centracion mınima inhibitoria(CIM) solamente

NO REPORTAR los resultadospor difusion en discos conningun organismo de creci-miento lento

Medio de profundidad inadecu-ada (muy delgado)

Usar un medio con profundidadde 4 mm

NO UTILIZAR este lote paralas pruebas

Los halos son universalmentemuy pequenos en las placas

Inoculo demasiado concentrado Ajustar el inoculo a la turbidezde 0,5 McFarland

NO REPORTAR hasta que seuse agar Mueller-Hinton

control Medio de profundidad inade-cuada (muy grueso)

Usar un medio con profundidadde 4 mm

NO UTILIZAR este lote del me-dio para las pruebas

Los resultados para un solodisco son mas altos o mas ba-jos que el nivel especificadopara las cepas control

Error en la lectura de la zonaborrosa.

Errores de trascripcion.Disco malo. (los discos malos

tienen tendencia a deteriorarsegradualmente)

El disco no se adhirio´ firmementea la superficie del agar.

Note el error. Repita la lectura ypida una segunda opinion.

Estadısticamente, se puede es-perar ocasionalmente algunresultado fuera de los rangos.

Los valores suelen caer dentrode los rangos al repetir laprueba.

Reportar los resultados con losotros discos siguiendo el pro-tocolo establecido.

Repetir la prueba con el antibió-tico fuera de rango con lacepa control y las cepas delos pacientes antes de reportarlas pruebas actuales.

RESULTADOS ABERRANTES CAUSAS PROBABLES ACCION CORRECTIVA(documentar todos los errores)

EFECTO EN LOS REPORTESDIARIOS

Colonias dentro de la zona deinhibicion

Cultivo mixto o contaminado Aislar, identificar y repetir laprueba con un cultivo purosolamente

NO REPORTAR los resultadosde esta placa

Mutantes resistentes dentro de lazona de inhibicion

Hacer una tincion de Gram o al-guna otra prueba para recono-cer el contaminante. Repetirla prueba

Medir las zonas libres de colon-ias e interpretar

Halos muy grandes con los ana-erobios

NO USAR el procedimiento dedifusion por discos para pro-bar anaerobios

La cepa de S. aureus de un pa-ciente es resistente a oxacilinaun dıa y sensible el otro dıa

Pueden ser dos organismos di-ferentes

El cambio de temperatura de37�C a 35�C puede alterar eltamano del halo en este caso.

Controlar la temperatura de laprueba. La prueba se debehacer a 35�C y la placa debeser incubada por 24 horas.

Hacer la prueba de disco con ce-foxitina, si no fue hecha antes(referencia al documentoNCCLS).

Reportar los resultados obteni-dos despues de 24 horas com-pletas de incubacion a tem-peratura de 35�C

Zonas de inhibicion solapadas Discos colocados muy cerca unode cada uno

No utilizar mas de 12 discos enlas placas 150 mm y 4 o 5discos en placas de 100 mm.Colocar los discos no mas de15 mm del borde de la placa.

Repetir la prueba

Halos indistintos con coloniasindividuales evidentes en laplaca de agar

Inoculacion inapropiada, Inoculoinadecuado.

Usar el inoculo apropiadamenteajustado y repetir la prueba

Repetir la prueba antes de repor-tar

Fenomeno de “Zona” Velo de crecimiento “swarming”de Proteus

Leer la zona ancha y clara. Pa-sar en alto el “swarming”dentro de la zona

Reportar los resultados del halobien definido.

Ignore el “swarming”Un borde borroso de las zonas

alrededor de los discos depenicilina o ampicilina usual-mente ocurre con cepas de S.aureus que son beta-lacta-masa negativa.

Medir el punto donde se nota lademarcacion obvia entre elcrecimiento y la falta de cre-cimiento. Procure no hacer es-fuerzo para ver las coloniasmas pequenas.

Reportar los halos como se in-dico anteriormente.

Sulfonamides Ignore el crecimiento escaso enla zona de inhibicion. Medirel halo donde haya 80% dereduccion en el crecimiento.

Reportar los halos como se in-dico anteriormente.

Beta-lactamase positiva Haemo-philus influenzae beta-lacta-masa positiva con penicilina oampicilina

Use el halo interior Notificar al medico si el diag-nostico es meningitidis.

Halos indistintos con sulfa-methozazone con o sin tri-methoprim o con trimetoprimsolamente

El exceso de tiamina o timidinaen el medio permite que cier-tos organismos adopten vıasmetabolicas alternas a losblancos metabolicos usualesde estos antibioticos

Use placas comerciales libres detimidina. Medir el halo dondehaya 80% de reduccion en elcrecimiento.

Reportar como de costumbre siconfıa que los resultados sonbuenos

NOTA: Para mas informacion, refierase a el Apendice de este Manual: la Tabla 8 “Sugerencias para la Verificacion de los Resultados de la Prueba deSusceptibilidad Antimicrobiana y Confirmacion de la Identificacion de los Organismos”: del documento M100 de la NCCLS.

230 Appéndice