UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA

ANLISIS QUMICO DE ANTOCIANINAS EN FRUTOS SILVESTRES COLOMBIANOS

LILIANA ANDREA SANTACRUZ CIFUENTES Cdigo 197518 Tesis de Maestra en Ciencias Qumica

Directora: Prof. Dra. Coralia Osorio Roa

Bogot D.C., Mayo 20 de 2011

LISTA DE ABREVIATURAS

ABTS APCI CC CCC CCD CP DPPH EM EPR ESI HPLC HPLC-DAD

cido 2,2-azino-bis-(3-etilenbenzotiazolina-6-cido sulfnico) Ionizacin qumica a presin atmosfrica Cromatografa en columna Cromatografa en contra corriente Cromatografa en capa delgada Cromatografa en papel 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo Espectro de masas Resonancia electrnica paramagntica Ionizacin Electrospray Cromatografa lquida de alta eficiencia Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a un detector de arreglo de diodos

HPLC-EM

Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a espectrometra de masas

RMN TOF

Resonancia magntica nuclear Tiempo de vuelo

CONTENIDO PginaRESUMEN INTRODUCCIN 1 1.1 1.2 ESTADO ACTUAL DEL TEMA DESCRIPCIN DE LAS FRUTAS ESTUDIADAS ANTOCIANINAS 6 6 9 9 11 16 19 21 23

1.2.1 Generalidades. 1.2.2 Biosntesis de las antocianinas. 1.2.3 Antocianinas en frutas. 1.2.5 Extraccin y purificacin de antocianinas. 1.2.6 Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis. 1.2.7 Anlisis por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC/MS) 1.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE MEDIANTE EL USO DE ESPECTROFOTOMETRA UV-Vis 1.4 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR RESONANCIA ELECTRNICA PARAMAGNTICA (EPR) 1.5 APLICACIN DE COLORIMETRA TRIESTMULO EN LOS EXTRACTOS DE ANTOCIANINAS 2 METODOLOGA

30

35

36 41 41 41

2.1 MATERIAL VEGETAL 2.2 OBTENCIN DEL EXTRACTO ENRIQUECIDO EN ANTOCIANINAS (ERA)

2.3 ANLISIS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC-DAD) 2.4 ANLISIS POR HPLC- MS-IT-TOF 2.5 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 2.5.1 Obtencin de los extractos para actividad antioxidante. 2.5.2 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo TEAC-espectroscopa UV-Vis. 2.5.3 Determinacin de la actividad Antioxidante frente al radical DPPH por espectroscopa UV-Vis. 2.6 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA PARAMAGNTICA (EPR). 2.7 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DEL COLOR DE LOS ERA 2.8 ANLISIS ESTADSTICO 3 RESULTADOS Y DISCUSIN 46 47 48 49 49 59 59 61 45 42 43 44 44 45

3.1 DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN ANTOCINICA DE LOS ERA 3.2 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ERA 3.2.1 Espectroscopia UV-Vis. 3.2.2 Espectroscopia EPR. 3.3 EFECTO DEL PH Y TIEMPO DE ALMACENAMIENTO SOBRE EL COLOR DE LOS ERAS 4 CONCLUSIONES

65 78 84

BIBLIOGRAFIA

LISTA DE TABLAS PaginaTabla 1. Composicin antocinica de algunas frutas tropicales Tabla 2. Contenido de antocianinas totales en algunas frutas Tabla 3. Identificacin y cuantificacin de las antocianinas presentes Tabla 4. Identificacin y cuantificacin de antocianinas en Mora (Rubus megalococcus Focke) Tabla 5. Identificacin y cuantificacin de antocianinas en Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)) 57 55 14 15 51

Tabla 6. Actividad antioxidante de los ERAS de las cuatro frutas frente a los radicales ABTS y DPPH Tabla 7. Constantes (K) de velocidad de atrapamiento de los radicales libres de los ARE de las cuatro frutas (expresadas en unidades arbitrarias (a.u)) por los mtodos ABTS y DPPH Tabla 8. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de motiln Tabla 9. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de Coral Tabla 10. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de mora Tabla 11. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de uva de rbol 72 71 70 69 65 60

LISTA DE FIGURAS PaginaFigura 1. Mora (Rubus megalococcus Focke) Figura 2. La Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery) Figura 3. Motiln y Coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg) Figura 4. (a). Estructura bsica de las antocianidinas (b). Estructura de los monosacridos ms comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas Figura 5. Cambios en la estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH21 Figura 6. Ruta general de la biosntesis de antocianinas. Figura 7. Interacciones de coopigmentacin de las antocianinas49 10 11 12 17 7 8 9

Figura 8. Espectro de absorcin de cianidina-3-ramnoglucsido a distintos valores de pH 18 Figura 9. Estructuras de las resinas de (a) Toyopearl (b) Sephadex LH-2061 21

Figura 10. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (lnea continua); no aciladas y 3-glucosiladas (lnea discontinua) Figura 11. Interfase Electrospray (ESI) Figura 12. Esquema de los modos de adquisicin permitidos en un instrumento QqQ Figura 13. Esquema del equipo LC-MS-IT-TOF 22 24 27 28

Figura 14. (a) Reaccin del DPPH con el mtodo del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (b) Esquema de reaccin entre 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y Trolox. Figura 15. (a) Formacin del radical ABTS (b) reaccin del catin radical ABTS+ con compuestos fenlicos. Figura 16. Modelo de color CIELAB 34 38 33

Figura 17. Anlisis por HPLC de los ERA de a) Coral, b) Motiln. La identificacin de cada pico corresponde con la tabla Figura 18. Espectro de ESIMS (compuesto 2) de delfinidina-3-rutinsido presente en el extracto ARE de las frutas coral y motiln Figura 19. Espectro de masas del flavonol presente en la fruta motiln ( tR 23min) Figura 20. Anlisis por HPLC del ERA de mora pequea. La identificacin de cada pico corresponde con la tabla 4. 55 53 53 50

Figura 21.Anlisis por HPLC del ERA de Uva de rbol. La identificacin de cada pico corresponde con la tabla 5 Figura 22. Estructuras qumicas de los compuestos encontrados en las cuatro frutas. (1) Delfinidina-3-O-glucopiranosa. (2) Delfinidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil-glucopiransido). (3) Cianidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido. (4) Petunidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido(5) Cianidina 3-O-glucopiranosido Figura 23. Set de espectros EPR individuales del ARE de Motiln registrados a diferentes tiempos de reaccin en presencia de los radicales libres (a) ABTS y (b) DPPH. 62 Figura 24. Concentracin relativa de a) ABTS y b) DPPH en presencia de los extractos de las cuatro frutas. Referencia * = solucin de radical libre sin antioxidante Figura 25. Espectros UV-Vis de los ERA (1mg/10mL) de las cuatro frutas estudiadas a pH 1.5 Figura 26. (a)Variacin del color en los ERAS de las frutas a diferentes valores de pH en tiempo=0. (a) Motiln (b) Coral. (c). Uva. (d). Mora Figura 27. Evaluacin del color durante el almacenamiento de los extractos ARE a pH 1.5. (a).Motiln, (b). Coral, (c), Uva (d) Mora 73 67 66 64 59 57

Figura 28. Cambios en a: claridad (L*); b: el croma (C*ab) y c: el tono (hab) de los extractos crudos con respecto al pH. 76

A Dios por estar siempre presente en mi vida A mi esposo por su inmenso apoyo A mi hijo por su paciencia

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de Colombia y al Posgrado en Qumica por permitirme alcanzar este importante logro en mi carrera profesional.

A la profesora Dra. Coralia Osorio Roa por su apoyo, comprensin y orientacin, durante la realizacin del presente trabajo.

A la profesora Alicia Lucia Morales por la colaboracin en el suministro de la fruta mora pequea.

Al IFS (International Fundation of Science (Proyecto E/4826-1)) por la financiacin de este trabajo.

Al Profesor Dr. Francisco Heredia y a la Profesora Dra. Lourdes Gonzlez Miret del grupo Color y Calidad de Alimentos, del Departamento de Farmacia de la Universidad de Sevilla (Espaa) por la valiosa colaboracin y asesora en las medidas objetivas de color.

Al profesor Dr. Jos Gregorio Carriazo del departamento de qumica y al profesor Dr. Ovidio Almanza del departamento de fsica, por la colaboracin en las medidas de actividad antioxidante por EPR.

A mis compaeros del grupo de investigacin Grupo de Aditivos Naturales de Aroma y Color (GANAC) por su apoyo, colaboracin y amistad.

A mi familia por su apoyo incondicional, y por acompaarme en esta etapa de mi vida.

RESUMEN

Colombia produce una amplia gama de frutas tropicales, de las cuales existen muy pocos estudios qumicos. La investigacin en el campo de los pigmentos naturales provenientes de frutas, permite establecer el potencial de ellas como alimento con propiedades biofuncionales y el desarrollo de productos con valor agregado que puedan ser usados como colorantes naturales. En este trabajo se realiz el anlisis cualitativo y cuantitativo de los pigmentos antocianicos en cuatro frutas tropicales colombianas: uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima macrocarpa Mull. Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln (Hyeronima macrocarpa Mull. Arg). Se obtuvieron los extractos enriquecidos en antocianinas (AREs) por adsorcin selectiva sobre Amberlita XAD-7 del extracto metanlico de las frutas. Estos extractos se analizaron por cromatografa lquida acoplada a un detector de arreglo de diodos (LC-DAD) y cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas con interfase electrospray (LC/MS-ESI). Estos anlisis junto con la coinyeccin con patrones permitieron elucidar la estructura de la mayora de los compuestos. La cuantificacin se realiz mediante el mtodo de estndar externo.

Los anlisis realizados en el coral y el motiln, confirmaron la presencia de la antocianina delfinidina-3-rutinsido como compuesto mayoritario, seguido por delfinidina-3-glucsido, cianidina-3-rutinsido y petunidina-3-rutinsido. En estas dos frutas se identificaron las mismas antocianinas, siendo mucho mayor la concentracin en el motiln que en el coral. En la mora pequea se confirm la presencia de cianidina-3-glucsido como compuesto mayoritario junto con cianidina3-rutinsido; y en la uva de rbol se identific la antocianina cianidina-3-glucsido como compuesto mayoritario junto con la antocianina delfinidina-3-glucsido.

1

Posteriormente se evalu la actividad antioxidante de los extractos de las cuatro frutas frente a los radicales libres ABTS y DPPH mediante espectroscopa UV-Vis y EPR (Resonancia electrnica paramagntica). Con los resultados de espectroscopa UVVis se determin que el extracto ms activo fue el de motiln, seguido por el de uva, coral y mora. El uso de la tcnica de EPR permiti seguir el curso de la reaccin de atrapamiento de los dos radicales libres por las sustancias antioxidantes presentes en los AREs, observando una disminucin en la concentracin de radicales libres con el tiempo y una cintica de segundo orden. Al aplicar dicho modelo cintico, se confirm que el extracto ms activo frente a los dos radicales libres era el de motiln, y que frente al ABTS se encontraban diferencias de actividad ms significativas que con el DPPH. La tcnica de EPR es ms exacta porque permite la evaluacin directa de la cantidad de radicales libres en solucin.

Finalmente, se evalu la estabilidad de los diferentes extractos frente a variaciones de pH y durante un periodo de almacenamiento de un mes. Se confirm que el pH es un factor que afecta significativamente el color de los AREs y con base en las medidas de colorimetra triestimulo a diferentes pHs (1.5, 3.5, 5.5 y 7.5) se concluy que el extracto ms estable era el de uva de rbol porque se encontraron menores variaciones en el croma con respecto a las otras frutas.

Con estos resultados se comprob que las frutas estudiadas son una fuente promisoria de pigmentos naturales, siendo ms interesantes el motiln y la uva de rbol debido a su contenido de antocianinas, actividad antioxidante y estabilidad del color de los extractos.

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INTRODUCCION

El consumo de frutas y verduras ha demostrado su efectividad en la prevencin de algunas enfermedades en los seres humanos y en los animales. Las hortalizas, frutas y sus semillas son ricas en vitaminas como C y E, -caroteno y polifenoles como proantocianidinas y antocianinas. Estos compuestos podran proteger a los organismos contra lesiones causadas por radicales libres1.

Entre estos compuestos, las antocianinas son pigmentos naturales que se clasifican dentro del grupo de los flavonoides. Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y son responsables de los colores rojo, violeta y azul de frutas, bayas y flores. En las plantas la principal funcin que cumplen es la de atraer seres vivos (principalmente insectos y pjaros) para propsitos de polinizacin y dispersin de semillas2. Estos compuestos polifenlicos son solubles en agua, lo cual facilita su incorporacin en una gran variedad de sistemas alimenticios acuosos.

Recientemente su estudio ha tomado importancia no solo debido a su actividad antioxidante sino tambin a sus posibles beneficios para la salud humana ya que se ha relacionado su consumo con la reduccin de la incidencia de enfermedades como el cncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologas 3 . Por ejemplo algunos artculos sugieren que las estructuras qumicas de las antocianinas tienen un impacto significativo en su actividad biolgica, y los datos sugieren que las antocianinas monoglicosiladas y no aciladas son los ms potentes inhibidores de la proliferacin y crecimiento de las clulas de cncer de colon4. Estudios actuales sobre la actividad biolgica de las antocianinas muestran que estas podran sustituir algunos frmacos usados en el tratamiento de diferentes enfermedades. Es as como el extracto crudo de antocianinas de Vaccinium myrtillus fu administrado por va oral e intravenosa para reducir la fragilidad y la permeabilidad capilar de los vasos sanguneos 5 . Se ha demostrado tambin que fracciones de antocianinas provenientes del vino son3

efectivas para atrapar especies reactivas del oxgeno (ROS), adems de inhibir la oxidacin de lipoprotenas y la agregacin de plaquetas.

A pesar de los beneficios antes mencionados, un tema controversial es la biodisponibilidad de las antocianinas en el ser humano, ya que metablicamente las antocianinas parecen ser muy diferentes de otros flavonoides con cantidades de excrecin mucho mayores en la orina en relacin con la cantidad consumida 6 . Mientras que la ciencia est empezando a sealar el gran potencial y los beneficios de los polifenoles, investigadores de la Universidad de Houston encabezados por el Dr. Ming Hu, han expresado que se deben realizar investigaciones sobre la biodisponibilidad y utilizacin de los antioxidantes, especialmente polifenoles, con el fin de ayudar al xito en la implementacin de los mismos como agentes quimioprotectores en el futuro7. De acuerdo con los datos presentados por la OMS/FAO en el informe sobre la salud en el mundo del 2003, la ingesta insuficiente de frutas y verduras es uno de los 10 factores de riesgo principales que contribuyen a la mortalidad atribuible. Adicionalmente el informe plantea que la integracin de las frutas y verduras en la dieta diaria podra ayudar a prevenir importantes enfermedades no transmisibles, como las enfermedades cardiovasculares y algunos cnceres. El consumo de frutas y verduras variadas es beneficioso porque garantiza un consumo suficiente de la mayora de los micronutrientes, de fibra dietaria y de una serie de sustancias no nutrientes esenciales; adems, el aumento del consumo de frutas y verduras puede ayudar a desplazar los alimentos ricos en grasas saturadas, azcares o sal. Actualmente el consumo estimado de frutas y verduras es muy variable en todo el mundo, oscilando entre 100 g/da en los pases menos desarrollados y aproximadamente 450 g/da en Europa Occidental8.

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En Colombia la gran biodiversidad de bayas, frutos, flores y plantas est determinada por la gran variedad de los pisos trmicos que ofrece la geografa Colombiana. Esta ventaja competitiva que nos ofrece nuestra riqueza natural nos permite plantear el presente trabajo con el objeto de evaluar y cuantificar la composicin antocinica de especies silvestres colombianas promisorias para el desarrollo de productos benficos para la salud humana como los colorantes naturales . Los frutos seleccionados fueron: La uva de rbol (Myrciaria cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln (Hyeronima

macrocarpa Mll.Arg). Adicionalmente se evalu la actividad antioxidante in vitro de los extractos de estas frutas mediante espectroscopa UV-Vis y EPR.

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1 1.1

ESTADO ACTUAL DEL TEMA DESCRIPCIN DE LAS FRUTAS ESTUDIADAS

La fruta Mora pequea (Rubus megalococcus Focke) (Rosaceae) (Figura 1) es una planta de vegetacin perenne, de porte arbustivo semierecto, conformada por varios tallos espinosos que pueden crecer hasta tres metros. Las hojas tienen tres foliolos, ovoides de 4 a 5 centmetros de largo con espinas ganchudas, las inflorescencias se presentan en racimos terminales aunque en ocasiones se ubican en las axilas de las hojas. La fruta es esfrica o elipsoidal de tamao variable, 1.5 a 2.5 cm, en su dimetro ms ancho, de color verde cuando se estn formando, pasando por un color rojo hasta morado oscuro cuando se maduran. Es originaria de las zonas altas tropicales de Amrica principalmente en Colombia, Ecuador, Panam, Guatemala, Honduras, Mxico y Salvador9. Hasta el momento no existen estudios qumicos de esta especie.

Esta especie pertenece al gnero Rubus, el cual comprende unas 250 especies que se distribuyen en todo el mundo. Las frutas de esta especie son conocidas por ser ricas en vitaminas A, B y C, y se afirma que las races y las hojas tienen propiedades medicinales10. Recientes investigaciones han reportado la presencia de antocianinas en la fresa y en la mora en proporciones de 6 mg/kg y 508 mg/kg de cianidina-3glucsido, respectivamente max=506 nm,11 , 12

y de acuerdo a las investigaciones dichas

antocianinas son responsables del color rojo de dichas frutas en un espectro visible

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Figura 1. Mora (Rubus megalococcus Focke) La uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora. (Mart.)D.Bery) (Myrtaceae) (Figura 2), tambin conocida como guapur o jaboticaba, pertenece a la familia Myrtaceae al igual que otras ms conocidas como la guayaba, la feijoa y el camu-camu. Es un pequeo rbol de aproximadamente 2 metros de alto, ramificado, de corteza lisa que se desprende fcilmente y que crece generalmente bajo la sombra de rboles ms grandes. Sus frutos producen la impresin de estar pegados al tallo de 3-4 cm de dimetro, se concentran en el tronco principal y las ramas gruesas. Son morados al principio y negros al madurar. Se consume directamente como fruta fresca, pero tambin se usa para preparar refrescos, mermeladas, licores y vinagres caseros, entre otros productos. Adems, la cscara del tallo y del fruto es una eficaz medicina para la diarrea. 13 En esta especie se ha encontrado la presencia de taninos y de las antocianinas, cianidina-3-glucsido y delfinidina-3-glucsido.14,15 Esta fruta tambin ha mostrado actividad antioxidante ( IC50 = 35 g/mL de extracto) 16,17 En Colombia la industria de los colorantes naturales representa una oportunidad para el mercado, dada las actuales tendencias de usar compontes naturales para el consumo humano enmarcado en el importante papel que estos juegan en la salud humana.

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Figura 2. La Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery) 18 Las frutas coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg, Euphorbiaceae) y motiln (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg, Euphorbiaceae) (Figura 3) pertenecen al mismo gnero Hyeronima el cual consta de 15 especies distribuidas en Amrica tropical. Hyeronima macrocarpa es un rbol de corteza agrietada y griscea, de hojas elpticas, densamente lepidotadas de 4-9 cm de longitud y 2.5 4 cm de ancho, pecolos entre 2-2.5 cm de longitud, inflorescencias axilares y subterminales, flores verde amarillentas, fruto elipsoide casi esfrico, rojo a morado al madurar, de hasta 1 cm de longitud en el coral y 2 cm en el motiln. Estas especies son promisorias para uso alimenticio y como fuente de pigmentos y hasta el momento no hay estudios qumicos publicados a excepcin de un trabajo realizado en motiln de Nario donde se evalu la actividad antioxidante y la eficiencia antiradical de extracto de la pulpa de esta fruta.19 A pesar de haber sido identificadas como pertenecientes a la misma especie, estas frutas presentan caractersticas diferentes que ameritan un estudio botnico profundo para definir su variedad.

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Figura 3. Motiln y Coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg) 1.2 ANTOCIANINAS

1.2.1 Generalidades. Las antocianidinas (agliconas) son la estructura bsica de las antocianinas (Figura 4a). Constan de un anillo aromtico (A) unido a un anillo heterocclico (C) que contiene oxgeno, el cual est unido por un enlace carbonocarbono a un tercer anillo aromtico (B). El esqueleto bsico de las antocianinas es el 2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio con diferentes sustituciones 20. Cuando las antocianidinas estn en su forma glicosidada se conocen como antocianinas. Los monosacridos comnmente encontrados son D-glucosa, L-ramnosa, D-arabinosa y D-xilosa (Figura 4b) aunque tambin pueden contener oligosacridos como gentobiosa, rutinosa y soforosa. Normalmente los monosacridos se unen con los grupos hidroxilo de la posicin 3 de la antocianidina, mientras que los disacridos sustituyen los hidroxilos 3 y 5 o los de la posicin 3 y 721.

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Figura 4 (a). Estructura bsica de las antocianidinas 22(b). Estructura de los monosacridos ms comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas23

Se ha demostrado que las antocianinas relativamente simples son ms estables en un medio cido que en un medio neutro o alcalino. En medio cido la forma predominante es la del in flavilio, el cual da el color rojo; a medida que el pH se eleva, las antocianinas se transforman en una base quinnica de color azulado (Figura 5). El color de estas molculas fue explicado por primera vez en 1939 por Pauling, quien propuso que la estructura resonante del in flavilium era el responsable de la intensidad de su color.

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Figura 5. Cambios en la estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH21 1.2.2 Biosntesis de las antocianinas. Los compuestos fenlicos son biosintetizados por varias rutas, entre las cuales sobresalen la del cido shikmico y la del cido malnico. En la ruta del cido shikmico, los carbohidratos simples derivados de la gliclisis, de la ruta de las pentosas fosfato y del ciclo de Calvin se convierten en diversos cidos orgnicos como el cinmico, p-coumrico, cafeico, ferlico, clorognico y fenilalanina. En el paso principal de la biosntesis de flavonoides, ordinariamente el p-coumaril-CoA, derivado de la L-fenilalanina en el metabolismo general del fenilpropanoide entra en una reaccin de condensacin con tres molculas de malonil-CoA para formar un intermediario chalcona (C ). El C es15 15

formado para dar el precursor de la antocianina, por ej. El flavan-3,4-diol, que es transformado al catin flavilio antocianidina por una hidroxilacin en el C-2 seguida por dos deshidrataciones 24 (Figura 6). Finalmente, la molcula se estabiliza por glicosilacin del O-heterociclo, luego suceden las posteriores modificaciones de la

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antocianina que incluyen una hidroxilacin adicional, metilacin de los grupos hidroxilos, posterior acilacin y glicosilacin25.

Figura 6. Ruta general de la biosntesis de antocianinas.26

La fenilalanina amonio liasa (PAL), primera enzima en la ruta, juega un papel central en dirigir la sntesis hacia metabolitos secundarios y por ello ha sido extensamente estudiada. Un estudio realizado por Aoki et al27., Demostr que la actividad PAL en frutos de fresa maduros es mucho mayor que en frutos verdes. As, se encontr una correlacin muy estrecha entre la actividad de PAL y la concentracin de antocianinas, que se incrementa durante la maduracin28.

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1.2.3 Antocianinas en frutas. El estudio de las antocianinas en frutas tropicales, ha tomado fuerza la ltima dcada no solo por la capacidad colorante29, sino tambin por su capacidad antioxidante30. Es as como los extractos de distintas frutas como mora, frambuesa y diferentes cultivos de grosella han demostrado actuar de manera eficaz como inhibidores de radicales libres31.

Muchas frutas son ricas en antocianinas y en la mayora de los estudios publicados se ha realizado la identificacin y cuantificacin de estos pigmentos por HPLC-EM y HPLC-DAD. Mazza y Miniati han publicado una extensa revisin sobre antocianinas en frutas tropicales hasta el ao 1987 encontrando cerca de 20 compuestos responsables del color rojo en frutas32. Durante los ltimos aos se ha publicado la composicin de los pigmentos de una gran variedad de plantas de diferente origen geogrfico, de diferentes familias y con diferentes mtodos de extraccin.33,34 En un estudio realizado por De Brito et al 35, se realiz la identificacin y cuantificacin de antocianinas en algunas frutas tropicales: acerola (Malphigia emarginata), jussara (Euterpe edulis), jambolo (Cumini syzygium) y Guajiru (Chrysobalanus icaco), por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas, con el fin de demostrar la presencia de antocianinas en frutas tropicales. Se encontraron las antocianinas: cianidina, delfinidina, pelargonidina, petunidina y malvidina en cantidades

apreciables (75mg/100g y 275mg/100g peso seco). Vasco et al.Error! Bookmark not defined., Realizaron una investigacin en algunos frutos ecuatorianos para

identificar y cuantificar los compuestos fenlicos responsables de la actividad antioxidante en estos frutos, se estudiaron tres pertenecientes a la familia de las Rosaceas (mora andina, fresa y ciruela capuli), otra especie de la familia Ericaceae (mortio) y tres frutas de la familia Passifloraceae. Entre los compuestos fenlicos encontrados, la antocianina cianidina estuvo presente en todos los frutos, la delfinidina solo se encontr en el mortio y la pelargonidina en la fresa.

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Recientemente se han publicado varios estudios dedicados a la bsqueda de nuevas fuentes vegetales ricas en antocianinas (Tabla 1), entre las cuales se encuentran uvas, repollo morado, aceitunas, grosellas, manzanas, fresas, ciruelas y cerezas, entre otras. Tabla 1. Composicin antocinica de algunas frutas tropicalesNombre comn Uva Caimarona Acerola Jambolao Nombre Cientfico Antocianina Dp-3-O--glucopiransido Cy-3-O--glucopiransido Cy3-O--(malonil) glucopiransido36 Cy-3-ramnsido, Pn-3-ramnsido Dp-3-galactpiranosido,Pt-3-galactopiransido Dp-3-(6-acetil) galactopiransido. Pt-3-(6-acetil) galactopiransido, Dp-3-(6acetil) glucsido, Pt-3-(6 succinil) ramnsido, Pn-3-(6succinil) ramnsido Dp-3-5, diglucsido, Cy-diglucsido, Ptdiglucsido, Pn-diglucsido, Mv-diglucsido-3sambubisido, Cy-3-glucsido, Cy-3-rutinsido, Pg-3-glucsido, Pg-3-rutinsido, Cy 3ramnsido. Dp-3-O--glucopiransido, Cy-3-O-glucopiransido, Pt-3-O--glucopiransido Pg-3-O--glucopiransido, Pn-3-O-glucopiransido, Mv-3-O--glucopiransido37 Cy-3-O--glucopiransido Cy-O--glucopiransido Cy-3-O--glucopiransido Dp-3-O--glucopiransido38 Cy-diglucsido, Pt.diglucsido, Pn-diglucsido Cy-3-O--glucopiransido Pg-3-glucsido, Pg-3-rutinsido, ramnsido.Error! Bookmark Cy-3-

Pourouma cecropiifolia Malphigia emarginata Syzygium cumini

Jussara

Euterpe edulis

Guajiru

Chrysobalanus icaco

Bacuau

Eugenia umbelliflora

Manzana estrella Surinam cherry Jaboticaba Mango Chirimoya zapote

Chrysophyllum Cainito Eugenia uniflora Myrciaria Cauliflora Mangifera indica Annona cherimolia Mill. Calocarpum zapota

not

defined.corozo Bactris guineensis Cy-3-sambubisido, cy-3-glucsido, cy-3rutinsido, Pn-3-glucsido, Pn-3-rutinsido, Cy3-(6-O-malonil) glucsido.39

Mv: Malvidina, Pn: Peonidina, Cy: cianidina, Pg: pelargonidina, Dp:delfinidina

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En general el contenido total de antocianinas en frutas puede estar entre 20 y 1000 mg /100g de fruta fresca (Tabla 2). En algunos estudios la cuantificacin se realiz por HPLC usando el mtodo de estndar externo con base en la respuesta de compuestos patrn; pero tambin se ha utilizado el mtodo de pH diferencial,40 para la obtencin de la concentracin de las antocianinas. Este mtodo se basa en las transformaciones reversibles que sufren las antocianinas con los cambios de pH, manifestado por un cambio en la absorbancia. La forma oxonium predomina a pH 1 y el hemiacetal a pH 4.5 (Figura 5). El pH diferencial es un mtodo basado en esta reaccin, y permite una rpida y exacta medida de las antocianinas totales, incluso en la presencia de pigmentos degradados polimerizados y de otros compuestos interferentes. Este mtodo fue utilizado primero por Fuleki y Francis (1968),41 para medir el contenido de antocianina en arndano.

Tabla 2. Contenido de antocianinas totales en algunas frutasTaxonomia Vaccinium uliginosum L. Rubus occidental L. V. parvifolium R. nigrum cv Sambucus nigra V. vinifera Citrus sinensis Nombre comn Arndano alpino Concentracin (mg/ 100g fruta ) 256 627 34 411 200-1000 30-750 200 Estndar Mv-3-glu Cy-3-glu Cy-3-gl Cy-3-glu Cy-3-glu Cy-3-glu Cy-3-glu Referencia Andersen (1987)42 Moyer et al. (2002)43 " Bridle et al.(1997)44 " "

Frambuesa negra Arandano rojo Grosella negra Cauco negro Uva de vid Naranjo dulce Mv: malvidina, Cy: Cianidina, glu: Glucosa

La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas: uva de rbol (), coral (Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), fue Para la obtencin de la concentracin de antocianinas (Tabla 2), se utiliza la frmula de pH diferencial:

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A= (A vis-max A 700)

pH1

(A

vis-max

A 700)

pH 4.5

En donde A

vis-max

es la lectura del pico ms alto a pH 1 y pH 4.5, y A 700 , es la

lectura a 700 nm, tanto para pH 1 como pH 4.5. As por ejemplo, Khknen et al45., determinaron cuantitativamente los compuestos fenlicos por HPLC, presentes en algunas especies de arndano (Vaccinium myrtillus), arndano rojo (Vaccinium vitis-idaea) y grosellero negro (Ribes nigrum), encontrando que el mayor contenido de antocianinas de las bayas que se consumen en Finlandia se encuentra en los arndanos (300-600 mg/100g de peso fresco) y en el grosellero negro (80 a 810 mg/100 g). Otras bayas oscuras, tales como crowberries (Empetrum nigrum L.) tienen un contenido de antocianinas en el rango de 300-560 mg/100g.46 1.2.4 Antocianinas como colorantes alimenticios. Las antocianinas se han convertido en una opcin interesante para la industria alimenticia como posibles sustitutos de los colorantes sintticos. Adicionalmente estas sustancias poseen un valor agregado por su capacidad antioxidante y citotxica47.

De acuerdo con su estructura, el color de las antocianinas vara segn los grupos que se encuentren unidos a ella como hidroxilo, metoxilo, azcares azucares acilados. As por ejemplo el aumento nmero de hidroxilos en el anillo B de la antocianidina causa un desplazamiento batocrmico en la longitud de onda de mxima absorcin de las antocianinas, en el caso de la pelargonidina se observa un cambio de color desde el naranja ( mx. 520 nm) hasta la delfinidina azul-violeta ( mx. 545 nm).48 Por otro lado, la glicosilacin y la acilacin de los azcares tambin aumentan la estabilidad.49

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Otros factores como la concentracin, el pH, la temperatura, el oxgeno, las enzimas, la existencia de reacciones de condensacin, la formacin de complejos con metales o interaccin con otros componentes de los alimentos tambin afectan la estabilidad del color.32 La copigmentacin es un fenmeno que se da por la interaccin hidrfoba entre los ncleos aromticos de las antocianinas agrupadas (Figura 7), en donde una de las consecuencias de este estado es la intensificacin del color, lo que mejora las perspectivas de la utilizacin de antocianinas como colorantes naturales en alimentos.50

Figura 7. Interacciones de coopigmentacin de las antocianinas49 Como se mencion anteriormente las antocianinas son sensibles a los cambios de pH, el cual tiene un efecto en la estructura y la estabilidad de estas. En soluciones acuosas a valores de pH inferiores a 2, bsicamente 100% del pigmento se encuentra en su forma ms estable o de in oxonio o catin flavilio de color rojo intenso, a valores de pH ms altos ocurre una prdida el protn y adicin de agua en la posicin 2, dando lugar a un equilibrio entre la pseudobase carbinol o hemicetal y la forma chalcona, o de cadena abierta. Tanto el hemicetal como la chalcona, son formas incoloras y bastante inestables. A valores de pH superiores a siete se presentan las formas quinoidales, de color prpura que se degradan rpidamente por oxidacin con el aire (Figura 5), por lo cual, el uso prctico de estos pigmentos como colorantes naturales

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se limita a alimentos cidos con pH inferior a 3.5 51, 52. La prdida de color a medida que el pH aumenta, puede ser evaluada registrando el espectro de absorcin del pigmento con un espectrofotmetro. En la figura 8, en el espectro de absorcin decianidina-3-ramnoglucsido se observa una disminucin en el espectro a 510 nm a

medida que el pH aumenta, lo que indica que hay una prdida del color rojo, existiendo un equilibrio entre las dos formas de la antocianina (catin flavilio y base carbinol)53.

Figura 8. Espectro de absorcin de cianidina-3-ramnoglucsido a distintos valores de pH54 En relacin a la extraccin de estos pigmentos, Rodrguez y Wolstrad40, sealan que el carcter polar de la molcula de antocianina permite su solubilidad en variados solventes, tales como alcoholes, acetona y agua. La eleccin del mtodo de extraccin debe maximizar la recuperacin de pigmentos con una mnima cantidad de solventes y una degradacin o alteracin mnima del estado natural. Dentro de los mtodos ms utilizados estn la extraccin con metanol y la extraccin con acetona y cloroformo.

Entre las posibles fuentes de antocianinas para su utilizacin como colorantes, se encuentran las uvas, los arndanos, el repollo morado y la zanahoria negra. Las

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principales antocianinas presentes en los arndanos son los glucsidos de cianidina y peonidina51. Algunos investigadores han estudiado la toxicidad de las antocianinas y compuestos relacionados concluyendo que estos compuestos son inocuos para la salud. 55 Estos compuestos, se encuentran dentro de la clasificacin de colorantes naturales aceptados sin restricciones sanitarias para su uso en la industria alimenticia.56 1.2.5 Extraccin y purificacin de antocianinas. La extraccin de pigmentos naturales, debe llevarse a cabo teniendo en cuenta los factores que pueden afectar la integridad de los mismos; por lo cual este es un paso muy importante debido a que los resultados obtenidos dependen en gran parte del proceso de extraccin realizado.

Las antocianinas son compuestos solubles en solventes polares y comnmente se extraen de sus fuentes naturales usando metanol o etanol con pocas cantidades de algunos cidos como cido clorhdrico, actico y frmico, ya que el cido mantiene el pH cido lo que previene el desplazamiento de los equilibrios qumicos de hidratacin y formacin de chalconas. Adicionalmente el uso de cidos dbiles previene la degradacin de las antocianinas no aciladas las cuales presentan mayor labilidad. Sin embargo, durante el proceso de evaporacin del solvente acidificado puede ocurrir degradacin de las antocianinas aciladas, por la hidrlisis parcial o total de los cidos enlazados a los azcares, especialmente en antocianinas aciladas con cidos dicarboxilicos como el cido malnico. Por lo anterior se recomienda para la extraccin de estos pigmentos el uso de cidos dbiles como el trifluoroactico, tartrico o ctrico.5758

Degenhardt et al

., encontraron que la mezcla bifsica terbutil-metil-ter/n-

butanol/acetonitrilo/agua (acidificada al 1% con cido trifluoroactico) (2:2:1:5) es un buen sistema de solventes en el proceso de extraccin de antocianinas de repollo rojo (B. Oleracea L) y grosella negra (Ribes nigrum L).

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Woo et al59., estudiaron la extraccin de antocianinas a partir de los desechos del proceso de elaboracin de jugo de arndanos, realizando una extraccin con alcohol y cido, una purificacin parcial por medio de ultrafiltracin, y una concentracin posterior con aplicacin de smosis inversa, concluyendo que es posible la obtencin de un colorante a partir de los desechos de la industria de jugos de arndanos.

En la mayora de los casos, para la extraccin de las antocianinas se aprovecha la afinidad que tiene este tipo de compuestos por materiales adsorbentes como la Amberlita XAD-7. A diferencia de las resinas XAD-2 y XAD-4 formadas bajo una matriz de estireno y divinilbenceno con diferente grado de entrecruzamiento, la Amberlita XAD-7 tiene una estructura tipo acrilato (rea superficial 450 m2/g, radio de poro 45 , porosidad 1.14 ml/g, tamao de partcula 0.25-0.84 mm, densidad 1.24 g/ml). Este tipo de resina posee el cdigo de regulacin del consejo de Europa, sobre resinas de intercambio inico y adsorbentes usados en el procesamiento de alimentos, adoptado por el Comit de Ministros el 30 de septiembre de 1997, polivinilpirrolidona (PVP), octadecilsilano, Sephadex G-25, Sephadex LH-20, poliamidas, resinas de intercambio inico, almina cida, entre otras.60 Luego que los pigmentos son retenidos es necesario eliminar otros componentes que no son de inters como azcares, cidos orgnicos, protenas y sales. La complejidad de los extractos naturales enriquecidos en antocianinas hace necesario realizar su fraccionamiento mediante el uso de tcnicas cromatogrficas que permitan la obtencin de fracciones ms simples sin degradacin del material. Para esto se han usado mltiples tcnicas como la cromatografa en papel (CP), la cromatografa en capa delgada (CCD) en almina, la cromatografa en columna (CC) y la cromatografa en contracorriente (CCC). El fraccionamiento de este tipo de compuestos por CC, se puede realizar mediante el uso de resinas de exclusin por tamao como lo demuestra un estudio realizado por Frytlog et al 61 , donde se compar el uso de las resinas Toyopearl HW-40F con Sephadex LH-20, para el

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anlisis de antocianinas. As, se determin que el fraccionamiento obtenido con la resina Toyopearl presentaba una mejor resolucin de los picos de algunas antocianinas presentes en la muestra a evaluar. Las estructuras de las resinas Toyopearl y Sephadex se muestran en la (Figura 9).

Figura 9. Estructuras de las resinas de (a) Toyopearl (b) Sephadex LH-2061 1.2.6 Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis. Debido a su

estructura, las antocianinas presentan mximos de absorcin tanto en la regin visible como en la ultravioleta lo que resulta muy importante para la caracterizacin estructural de dichos compuestos. Sus espectros de absorcin se caracterizan por tener dos bandas separadas una en la regin visible entre 465 y 550 nm y otra ms

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pequea en el UV alrededor de 275nm62 (Figura 4). Es as como se pueden identificar las antocianinas por su absorcin en la regin visible.63.

La glicosidacin conlleva a un desplazamiento hipsocrmico de los mximos de absorcin en el visible. As por ejemplo, entre (max 520nm) de la pelargonidina y de la pelargonidina-3-glucsido (505nm) , ocurre un desplazamiento de de 15/nm ; entre cianidina (max 535nm ) y cianidina-3-glucsido (max 523nm) un de 12/nm, entre delfinidina (max 544) y delfinidina-3-glucsido (max. 534nm) un de 10/nm62.

Los derivados acilados no muestran diferencia con respecto a los correspondientes no acilados en la zona del visible, sin embargo, en la regin del ultravioleta suelen presentar un mximo adicional en el intervalo de 310-335 nm, correspondiente a la absorcin del grupo acilo (Figura 10); la esterificacin con cido p-cumrico aumenta la absorcin en torno a 308-313 nm y con cido cafico en 326-329 nm. Este hombro no se presenta cuando el cido sustituyente es el cido actico64 .

Figura 10. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (lnea continua); no aciladas y 3-glucosiladas (lnea discontinua) 65

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1.2.7 Anlisis por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC/MS). La cromatografa lquida en fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. Debido a que las antocianinas son compuestos polares, este tipo de columnas se usa para el anlisis cualitativo y cuantitativo de mezclas de estos pigmentos63.

El orden de elucin de las antocianinas en columnas de fase reversa depende del patrn de hidroxilacin y metoxilacin de la aglicona, del grado de glicosilacin y acil sustitucin, as como tambin de la composicin de la fase mvil. Usualmente, el tiempo de retencin de las agliconas se da en el siguiente orden: delfinidina< cianidina