Producción de sueros policlonales para

investigación y diagnóstico

Q.F. Susana Cáceres Polo Tecnológico de la Facultad de Química

Pando - Canelones

Un poco de historia…

• La producción de sueros de origen animal se inició a nivel mundial por 1920.

• Inicialmente estaban dirigidos contra toxinas de

origen microbiano (T. diftérica y tetánica) y posteriormente se aplicaron a la producción de sueros contra venenos de serpientes y alacranes (inmunización pasiva).

• Hoy su aplicación se ha extendido a otras áreas

como la investigación y el diagnóstico.

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Son sustancias de naturaleza glucoproteica producidas por el sistema inmune de un animal como respuesta ante el ingreso al organismo de una sustancia extraña llamada “antígeno”.

Los componentes del suero responsables de esos efectos son los anticuerpos (Ac), también

llamados inmunoglobulinas

La idea de la producción de antisueros es manipular el sistema inmune del animal de modo de obtener

anticuerpos específicos contra un blanco de interés.

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Existen diferentes clases de inmunoglobulinas

Humano

• En la mayoría de los mamíferos están presentes la IgM, IgG, IgA e IgE.

• En la gallina en lugar de IgG hay IgY (yema de huevo)

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- Los anticuerpos están constituidos por la asociación de cuatro cadenas polipeptídicas unidas entre sí mediante puentes disulfuro. - Dos cadenas se denominan pesadas y las otras dos ligeras. - La región variable es la zona de reconocimiento del Ag, cuya secuencia de aminoácidos es peculiar de cada anticuerpo. - La región constante, tiene la misma secuencia en todos los anticuerpos de la misma clase.

Estructura de los anticuerpos

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¿Qué es un antígeno?

• Se denomina antígeno a cualquier molécula que puede ser reconocida por el sistema inmune de un organismo.

• Inmunógeno: es el antígeno que por sí sólo es capaz de inducir una respuesta inmune específica.

Los haptenos son moléculas pequeñas capaces de reaccionar con los anticuerpos pero no de generarlos por

si mismas.

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Antígenos

Pueden ser: • Nativos: m.o. o proteína purificada a partir de un

preparado mas complejo. • Recombinantes • Péptidos sintéticos

Estructuras químicas muy diferentes: proteínas, lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, etc.

¿A que se debe que ciertas moléculas al ser introducidas en el organismo induzcan respuesta inmune

y otras no?

Depende del tamaño molecular (superior a 10 kDa), de los grupos químicos activos y de la estructura espacial

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Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune, en el suero del animal aumenta notablemente la cantidad de Ac específicos que reconocen el antígeno empleado.

Anticuerpos policlonales

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Como en su síntesis están involucrados numerosos clones de linfocitos B se lo denomina policlonal.

Los Ac son producidos por linfocitos B (plasmocitos). Cada plasmocito producirá moléculas de Ac con una especificidad característica en el suero de un animal inmunizado, se acumulan un número elevado de diferentes moléculas de Ac específicas en mayor o menor medida para el antígeno

Anticuerpos policlonales

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Teoría de la

selección clonal

REPERTORIO

CELULAS B

Anticuerpos

específicos

PLASMOCITOS CELULAS B MEMORIA

Diferenciación

Proliferación

ANTIGENO

SELECCION

Plasmocitos Células B de memoria

tiempo

Primera inoculación

Segunda inoculación

Respuesta primaria y secundaria

En este proceso se dan dos eventos fundamentales: cambio de clase (IgM a IgG por ejemplo) e hipermutaciones que conducen al aumento

de la avidez

Obtención de anticuerpos policlonales

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Obtención de anticuerpos policlonales

Se obtienen administrando el antígeno en animales

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Selección del animal:

Depende de:

- Cantidad de antígeno disponible.

- Cantidad de anticuerpo o antisuero que se necesita preparar vs instalaciones necesarias para alojarlo.

- Relación filogenética entre las especies de origen del antígeno y la especie usada para obtener el antisuero.

- Uso que se le dará a los anticuerpos (ELISA, Ac 2º)

Algunas consideraciones previas…

• Información sobre la toxicidad y/o patogenicidad del inmunógeno, composición del buffer, pH etc.

• Preparación del antígeno (esterilidad, formolado). • Evaluar la necesidad del uso de adyuvante y cual. • Definir vía de inoculación y cronograma de

inmunizaciones (protocolo)

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Vías de inoculación

- Intradérmica (nº sitios y volumen. Sedación) - Subcutánea - Intramuscular - Intraperitoneal (ratón) - Intravenosa – reservado para inmunógenos particulados

pequeños, bacterias formoladas, en solución salina.

Adyuvantes

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- Se emplean para mejorar la respuesta inmune. - Forman depósitos en los sitios de inyección liberando lentamente el antígeno en forma sostenida. - Activan macrófagos y linfocitos T colaboradores.

Ejemplos: ACF (Adyuvante completo de Freund) AIF Fosfato o hidróxido de aluminio Preparados comerciales Se trata de evitar el uso de ACF pues genera una respuesta inflamatoria crónica, de no haber otra opción se inyecta en varios puntos en muy pequeños volúmenes. Su uso se limita a la primera inmunización.

Sangrías

• Antes de comenzar el protocolo de inmunización se realiza una sangría (pre-inmune) para determinar el estatus de los animales con respecto al inmunógeno.

• En conejos se sangra por punción de la vena central de la

oreja. • El volumen de sangre que se extrae nunca es > al 15% de

la volemia (1% del peso corporal) (1 sangría al mes).

• En caso de sangrías a blanco estas se realizan bajo anestesia

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Caso especial, la gallina, donde se recogen los huevos y de la yema se purifican las Igs

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Separar el suero

Purificación de Ac por

cromatografía de afinidad

Según la aplicación se puede requerir pasos posteriores de purificación

Ac específicos

20 20

Radioisótopos

Marcado

Fluoróforo

Partículas de colorante

Marcado Enzimas

Coloides metálicos

Látex

Hematíes

Complejos de Ru

Para poder utilizar la reacción Ag-Ac en un inmunoensayo, a veces debe buscarse una forma de hacer evidente esa reacción.

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Control de calidad del suero policlonal

Diferentes técnicas según el antígeno y la aplicación posterior.

• ELISA

• Western blot

• Aglutinación directa

• Inmunodifusión

ELiSA

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Ac en suero

E

E

Sustrato Señal

Ag

Conj. Anti IgG conejo

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Inmunoblot

Las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfieren mediante una corriente eléctrica a una membrana de

nitrocelulosa.

Sobre ella se aplican los mismos pasos de un ELISA (incubación con el suero policlonal, incubación con el conjugado y revelado con un sustrato que precipite)

Aglutinación directa

La interacción entre un antígeno particulado y anticuerpos presentes en el suero inmune (antisuero) provoca la formación de un complejo macroscópico en forma de red visible a simple vista.

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Aplicaciones: Antisueros contra Ag de superficie celular (bacterias, hematies, etc)

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Inmunodifusión: Método de Ouchterlony

• Resultado: bandas de identidad, no identidad o identidad parcial.

• La posición de la banda puede variar de acuerdo a las [ ] de ambos reactantes.

Agar gelificado con orificios equidistantes donde se siembran soluciones de Ag o Ac, se dejan difundir y si el Ac reconoce el Ag se forman bandas de precipitación de inmunocomplejos.

Aplicaciones

Los anticuerpos sirven como reactivos biológicos que se usan de rutina en muchas ensayos que se aplican tanto en el laboratorio clínico como en control de calidad, seguimiento de procesos e investigación

Gran especificidad extraordinaria capacidad

para discriminar estructuras

antigénicamente similares

Aplicaciones

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Detección de moléculas mediante un inmunoensayo cuali o cuantitativo

• Enzimoinmunoensayo (ELISA) • Western blot • Aglutinación • Inmunofluorescencia • Inmunohistoquímica • Inmunocromatografía

Inmunoensayo: técnica analítica que usa la reacción antígeno-anticuerpo como medio para generar un resultado perceptible.

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ELISA

El conjugado es un Ac producido en otra especie distinta a la de la

muestra

Permite determinar la concentración de un Ag o Ac mediante el uso de uno de ellos en fase sólida detectándose la formación del complejo Ag-Ac mediante un trazador enzimático (conjugado).

El Ac de captura y el conjugado pueden ser el mismo Ac uno unido

a enzima y el otro no

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Aglutinación de partículas de látex Partículas

sensibilizadas con el Ac

Ag en muestra

Reacción de aglutinación

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Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

Conjugado anti- IgG humana a fluoresceína Diagnóstico de Lupus

cutáneo

Tinción inmuno-histoquímica con anticuerpo anti- Treponema pallidum

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Inmunocromatografía

• Técnica rápida y sencilla que no requiere reactivos ni instrumentación adicional

• Ej. Test de embarazo, determinación cualitativa de Aflatoxinas (límite de detección de 4 ppb).