antiinflamatorio

ESTUDIO COMPARATIVO DEL EFECTO ANTIINFLAMTORIO DEL Plantago major L“LLANTEN” Y DEL DICLOFENACO EN

RATAS INDUCIDAS POR EDEMA PLANTAR

INDICE1. INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................................4

1.1 GENERALIDADES:...................................................................................................................................5

1.2 DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA DE Plantago major L............................................................................5

1.3UBICACIÓN GEOGRÁFICA...................................................................................................................6

1.4 USOS Y APLICACIONES EN MEDICINA TRADICIONAL.........................................................................6

1.5 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE HOJAS DE Plantago major L.................................................................7

2. MARCO TEORICO.....................................................................................................................................8

2.1 INFLAMACIÓN:...........................................................................................................................8

2.2 CLASIFICACIÓN DE LA INFLAMACIÓN:........................................................................................9

2.3 CARACTERÍSTICAS DE LA INFLAMACIÓN:...................................................................................9

2.4 TIPOS DE INFLAMACIÓN:.........................................................................................................10

2.5 FASES DE LA INFLAMACIÓN:....................................................................................................10

2.6 MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN:........................................................................................10

2.7 FÁRMACOS ANTINFLAMATORIOS (DICLOFENACO).........................................................................13

3. METODOLOGIA.....................................................................................................................................15

3.1 Tipo de Investigación......................................................................................................................15

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA.................................................................................................................15

3.2.1 Población.................................................................................................................................15

3.2.2 Muestra...................................................................................................................................15

3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL..................................................................................................................15

3.3.1 VARIABLES...............................................................................................................................15

3.3.1.1 INDEPENDIENTES:.................................................................................................................15

3.3.1.2 DEPENDIENTES.....................................................................................................................15

3. 4. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICOS.....................................................................................16

3.4.1 PRIMERA FASE:........................................................................................................................16

3.4.2 SEGUNDA FASE........................................................................................................................20

4. RESULTADOS.......................................................................................................................................24

4. 1 RESULTADOS DEL ANÁLISIS MACROMORFOLOGICO......................................................................24

4. 2 RESULTADOS DE LA MARCHA FITOQUÍMICA..................................................................................24

4.3 RESULTADOS DE LA EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA.....................................28

4.4 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS................................................................................................29

4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO....................................................................................................................34

4.5.1 ANALISI DE VARIANZA DE UN SOLO FACTOR...........................................................................34

4.5.2 Prueba de Tukey......................................................................................................................35

5. DISCUSION............................................................................................................................................36

6. CONCLUSIONES.....................................................................................................................................37

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................................................38

1. INTRODUCCIÓNLa inflamación es la respuesta del tejido vivo vascularizado a la lesión; puede ser causada por agentes biológicos, físicos o químicos. Existen liberación de sustancias mediadoras -bradiquinina, prostaglandina, histamina y serotonina-, que inducen permeabilidad vascular. Estas sustancias que se liberan en el proceso inflamatorio, denominadas ‘sopa algogénica’, actúan en las terminaciones nerviosas activando el segundo tipo de nociceptor (tipo C) y generan dolor. La IL-1 permite la inducción de genes que codifican para la ciclooxigenasa tipo 2 (COX2), la fosfolipasa A tipo 2 (PLAT2) y el óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). Otras citoquinas, como IL-2, IL-6 e IL-8, contribuyen a la aparición de manifestaciones de respuesta inflamatoria.Desde tiempos remotos, las plantas medicinales tienen un rol muy importante en la vida del hombre, especialmente para los habitantes del área rural, los cuales conocen su aplicación. Actualmente existe una tendencia mundial cada vez mayor para el uso de los productos naturales, donde el 25 % de las recetas emitidas en países desarrollados, llevan el principio activo de alguna planta medicinal. La aplicación de este tipo de prescripción médica va creciendo cada vez más en los distintos países de Sudamérica, teniendo en cuenta la búsqueda de nuevas fuentes de recursos renovables, para poder reactivar la economía y realizar aportes a las ciencias farmacológicas. Sin embargo a la luz de los modernos avances en botánica, fitoquímica, farmacología, farmacognosia, farmacodinamia y toxicología, el conocimiento tradicional y popular sobre las propiedades medicinales de las plantas deberá ser comprobado y validado para garantizar una terapia adecuada, eficaz y con mínimo riesgo de ocasionar efectos secundarios o tóxicos que puedan resultar peor que la enfermedad.Hoy por hoy proliferan diferentes formas medicamentosas como cápsulas o tabletas preparados a partir de especies vegetales que se utilizan en la medicina tradicional, pero para poder lograr credibilidad en este tipo de medicina es necesario conocer la identidad de la especie vegetal pues la fuerte demanda conlleva a la adulteración de las plantas medicinales, es por esto que se vuelve muy necesario desarrollar procesos de identificación rápidos y seguros que permitan evaluar la cantidad de principios activos presentes enHoy en día, uno de los mayores problemas que afecta a una sociedad como la nuestra es, el abuso indiscriminado de los antiinflamatorios no esteroidales, comúnmente denominados AINES, que se encuentran en el mercado farmacéutico, son los más vendidos a nivel nacional e internacional.Desde el punto de vista epidemiológico los problemas de inflamación y dolor muscular se presentan a toda edad y en los dos géneros, teniendo una mayor incidencia en los adultos mayores, tomando en consideración la epidemiologia de la patología así como las reacciones adversas que presentan los AINES, se crea la necesidad de desarrollar medicamentos antiinflamatorios de origen natural, tomando en consideración que, existe el uso ancestral de las plantas medicinales, así como la ventaja que estos tendrían con respecto a la disminución de efectos secundarios que los medicamentos de síntesis presentan, además estos presentan una mayor aceptación por parte de la población y tienen un menor costo.

OBJETIVO GENERAL Evaluar la actividad antiinflamatoria del extracto hidroalcohólico de las hojas

Plantago major L ”llantén”OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar un tamizaje fitoquímico preliminar del extracto hidroalcohólico de las hojas de Plantago major L “llantén”.

Comparar la actividad antiinflamatoria del extracto hidroalcohólico frente a un fármaco de referencia (Diclofenaco) con la técnica de edema planta a dosis 200 y 300 mg/kg.

Correlacionar la actividad antiinflamatoria del extracto con los metabolitos encontrados en el tamizaje fitoquímico.

HIPÓTESIS

El extracto hidroalcohólico de Plantago major L “llantén” al 30 % presenta propiedades antiinflamatorias semejantes al patrón de Diclofenaco, medido a través de la técnica del edema plantar en ratas

1.1 GENERALIDADES:1.2 DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA DE Plantago major L

Plantago major L es una hierba perenne que desarrolla su ciclo de vida entre seis y siete meses. Posee una altura entre 15 a 30 cm; sin embargo, su longitud puede variar según el distinto hábitat de crecimiento. El tallo de Plantago major L es un rizoma corto de color amarillo. Por otro lado, las raíces son blancas y de tamaño uniforme, surgen del tallo subterráneo.Las hojas son ovaladas, de color verde claro y se unen al tallo por un largo pecíolo; poseen aproximadamente 50 cm de longitud y un ancho de 20 cm en plantas adultas. Nacen a ras de suelo en forma de roseta y se desarrollan verticalmente. Presentan un margen liso o denticulado, además de una nerviación paralela con tres u ocho venas. Los pecíolos son lisos y miden alrededor de 15 cm.La floración ocurre entre mayo y octubre, en zonas templadas. Presenta una inflorescencia tipo espiga, cuya mitad superior se recubre de pequeñas flores, estas poseen una coloración café-verdosa; su corola es amarilla y muy pequeña (unos 3mm de diámetro); por otra parte, las anteras son de color lila, al inicio, y luego se vuelven amarillentas. Los pedúnculos florales nacen del mismo punto de donde arrancan los pecíolos, y son de mayor longitud. El fruto es una pequeña cápsula que, cuando madura, se abre transversalmente dejando caer las semillas que contiene, éstas tienen forma ovalada, tamaño muy reducido y un ligero sabor amargo; se localizan de 8 a 16 semillas por cápsula. Con el clima húmedo, las semillas se vuelven pegajosas, lo que provoca que se adhieran a los animales y de esta manera logran dispersarse

Fig 3: Plantago major “llantén”

TAXONOMÍAReino Plantae

Subreino TracheobiontaDivisión MagnoliophytaClase Magnoliopsida

Subclase AsteridaeOrden LamialesFamilia PlataginaceaeGénero PlantagoEspecie Plantago major L

1.3UBICACIÓN GEOGRÁFICAPlantago major L se encuentra distribuida en casi toda Europa, África Norte, AméricaLatina. Es una planta muy común y fácil de hallar en zonas de pastos, laderas, cerca de cultivos y en los bordes de caminos. Debido a su origen en zonas templadas, crece muy bien en hábitats intervenidos de la región interandina o en las zonas de la serranía peruana

1.4 USOS Y APLICACIONES EN MEDICINA TRADICIONAL

Entre los múltiples usos de esta planta en el campo de la salud humana se encuentran sus propiedades antiinflamatorias:

El baño con la infusión de esta planta, junto con matico (Piper aduncum) y caballo chupa (Equisetum giganteum L) se usa para eliminar la irritación y la inflamación.

El jugo fresco extraído de las hojas se aplica en los ojos para tratar ardor e inflamaciones.

La decocción de las hojas se utiliza para tratar las hinchazones e irritaciones del estómago, intestino, riñones, amígdalas, boca y muelas.

Las hojas tomadas en infusión se usan para tratar inflamaciones de los ovarios y el dolor de la garganta.

Esta planta se utiliza además como: diurético, cicatrizante, antihelmíntico, antiespasmódico, antiulceroso, para tratar espinillas y granos de la cara, es emoliente, depurativo

1.5 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE HOJAS DE Plantago major LDiversos estudios demuestran que Plantago major L se emplea alrededor del mundo para el tratamiento de diversas enfermedades o malestares. La actividad farmacológica de Plantago major L no se amerita a un solo compuesto, sino a la interacción de varios; los efectos son producto de la acción en conjunto de distintas sustancias y de su regulación mutua.Respecto a glúcidos, estudios previos confirman que en extracto acuoso de Plantago major L a 50 oC se pudo extraer los siguientes azúcares: xilosa (39,7 %), arabinosa (13,1 %), galactosa (3 %) y ácido galacturónico (6,7 %), los cuáles son responsables de la actividad antiulcerosa por parte de la plantaEntre los metabolitos derivados del ácido cafeico, los principales metabolitos que posee son plantamajoside y acteósido, diferenciándose en la glicosilación de sus estructuras, estando los primeros glicosilados con una glucosa en su núcleo, y los segundos, con ramnosa; además, plantamajoside tiene una ligera actividad antiinflamatoria, ya que inhibe el metabolismo del ácido araquidónico, las enzimas 5-lipoxigenasa y 1,5-lipoxigenasa. Acteósido inhibe la peroxidación lipídica y tiene efectos antihipertensivos.Uno de los principales metabolitos responsables de las diversas actividades farmacológicas que poseen las hojas de Plantago major L es la presencia de flavonoides. Alguno de estos flavonoides actúan como antioxidantes, siendo este el caso de baicadelina, hispidulina y plantaginina, debido a que so captadores de radicales libres e inhiben la peroxidación lipídica. Tanto baicadelina como hispidulina tienen propiedades antiinflamatorias, la baicadelina inhibe la 12-lipoxigenasa, además de inducir la producción de óxido nítrico en macrófagos. Hispidulina, mientras tanto, es un inhibidor de la 5-lipoxigenasa.

Fig 1: Flavonoides presentes en Plantago major L “llantén”

Las hojas de llantén poseen 6 tipos de iridoides glicosilados, de los cuales la más importante es la aucubina (1,3 %), la cual tiene propiedades antiinflamatorias: cuando es aplicado tópicamente ofrece una actividad inhibitoria de TPA (acetato de 12-O-tetradecanohidroforbol) provocando una disminución de la inflamación del edema de oreja de ratón con una dosis efectiva de 1 mgr/oreja. La aucubina también posee propiedades espasmolíticas y hepatoprotectoras

Fig 2: tipos de iridoides glicosilados presentes en Plantago major L “llantén”

Los triterpenoides ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido 18b-glicirretínico y sitosterol se aislaron de la cera de la hoja de Plantago major L “llantén”. El ácido ursólico inhibe la ciclooxigenasa 2 (IC50: 130 mM) y la ciclooxigenasa-1 (IC50: 295 mM) inhibiendo la biosíntesis de prostaglandinas in vitro mientras que el ácido oleanólico es menos activo. Ácido 18b-Glicirretínico no tiene un efecto inhibidor significativo. Los mecanismos de acción antiinflamatoria también incluyen la inhibición de la liberación de histamina de las células mástil, la inhibición de la elastasa y la inhibición de la actividad de complemento. El ácido ursólico y ácido oleanólico también tiene efecto hepatoprotector y antihiperlipidémico.

2. MARCO TEORICO2.1 INFLAMACIÓN:

Es la reacción de un tejido vivo al daño celular causado por agresiones externas e internas, con objeto de limitar el daño celular, eliminar el agente inicial y

procurar la reparación del tejido dañado. La respuesta inflamatoria se caracteriza en términos mecanicistas por una vasodilatación local transitoria y un incremento de la permeabilidad capilar, infiltración de leucocitos y células fagocíticas, así como degeneración y fibrosis del tejido. No importa cúal sea el estímulo desencadenante, los síntomas inflamatorios característicos son dolor, rubor y tumoración.

2.2 CLASIFICACIÓN DE LA INFLAMACIÓN:La inflamación según su duración se divide en aguda o crónica. La aguda es de duración relativamente corta (minutos, horas o unos pocos días), se inicia muy rápidamente y se caracteriza por el exudado de fluidos plasmáticos y la migración de leucocitos predominante neutrófilos. La inflamación crónica dura semanas, meses o incluso años y se caracteriza histológicamente por el infiltrado de linfocitos y macrófagos con la proliferación de vasos sanguíneos y tejidos conectivo.

Inflamación aguda: Los cambios que se producen tras la lesión tisular se deben a tres procesos: Cambios en el flujo y calibre vascular, que hacen que aumente el

flujo sanguíneo. Cambios estructurales en los vasos sanguíneos que aumentan la

permeabilidad vascular e inducen la formación de exudado inflamatorio.

Paso de los leucocitos del espacio vascular al extravascular alcanzando así el foco de las lesiones.

Inflamación crónica: Si la inflamación dura semanas o meses se considera crónica; y tiene dos características importantes:El infiltrado celular está compuesto sobre todo por macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. La reacción inflamatoria es más productiva que exudativa, es decir, que la formación del tejido fibroso prevalece sobre el exudado de líquidos.La inflamación crónica puede producirse por diversas causas:

Progresión de una inflamación aguda. Episodios recurrentes de inflamación aguda. Inflamación crónica desde el comienzo asociada frecuentemente

a infecciones intracelulares (tuberculosis, lepra).Microscópicamente la inflamación crónica se caracteriza por la presencia de macrófagos y sus derivados (células epitelioides y gigantes), linfocitos, células plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos y fibroblastos.

2.3 CARACTERÍSTICAS DE LA INFLAMACIÓN: La presencia extra de sangre y de líquidos en el área afectada produce una tumefacción o hinchazón perceptible con facilidad, al tiempo que el aumento del volumen sanguíneo provoca el enrojecimiento y la sensación de calor en la zona circundante.El dolor de esta zona ésta causado por la presión sobre las terminaciones nerviosas ejercidas por la tumefacción, así como la intensa estimulación o irritación de las terminaciones sensitivas, provocada por algunos de los componentes del exudado inflamatorio.Otras manifestaciones clínicas de las inflamaciones pueden ser la limitación funcional del órgano involucrado, por acción directa de los factores patógenos, la alteración de la circulación sanguínea en la zona o un cambio en el volumen del órgano afectado.

2.4 TIPOS DE INFLAMACIÓN: Catarral: Abundante producción de moco y acumulación de leucocitos.

Se presenta en las mucosas del intestino y de las vías respiratorias superiores.

Eritematosa: Predomina la hiperemia activa, o aumento de la cantidad de sangre circulante en un área o un órgano. Aparece con frecuencia en la piel o en las membranas mucosas, como resultado de la dilatación y la congestión de los vasos capilares superficiales. Un ejemplo de eritema es la quemadura solar leve.

Exudativa: Exudación de líquidos y otros materiales de las células y de los tejidos. Son los casos de la inflamación de la pleura, o pleuresía, del peritoneo, o peritonitis, y del pericardio, o pericarditis.

Hemorrágica fibrinosa: Debida a la rotura de vasos sanguíneos, esta inflamación se caracteriza por la precipitación de fibrina, proteína que proporciona el carácter semisólido al coágulo sanguíneo. Afecta sobre todo los tejidos muy irrigados, como el pulmonar.

Necrotizante: Predomina el fenómeno de la necrosis a muerte de los tejidos afectados. Un ejemplo grave de este tipo de inflamación es la producida por la gangrena.

Hiperplástica: La hiperplástica es un aumento de número de células. Puede afectar, por ejemplo, las adenoides o vegetaciones, dificultando la respiración nasal. Es típica de las inflamaciones crónicas.

Purulenta: Abundante exudado inflamatorio rico en leucocitos (pus), que si no se elimina de manera natural debe ser extraído.

2.5 FASES DE LA INFLAMACIÓN: Liberación de mediadores: Son moléculas, la mayor parte de ellas, de

estructura elemental que son liberadas o sintetizadas por el mastocito bajo la actuación de determinados estímulos.

Efecto de los mediadores: Una vez liberadas, estas moléculas producen alteraciones vasculares y efectos quimiotácticos que favorecen la llegada de moléculas y células inmunes al foco inflamatorio.

Llegada de moléculas y células inmunes al foco inflamatorio: Proceden en su mayor parte de la sangre, pero también de las zonas circundantes al foco.

Regulación del proceso inflamatorio: Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenómeno inflamatorio también integra una serie de mecanismos inhibidores tendentes a finalizar o equilibrar el proceso.

Reparaciones: Fase constituida por fenómenos que van a determinar la reparación total o parcial de los tejidos dañados por el agente agresor o por la propia respuesta inflamatoria.

2.6 MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN:

Aminas vasoactivas (histamina y serotonina): se almacenan como moléculas preformadas en las células cebadas y se encuentran entre los primeros mediadores que se liberan en las reacciones inflamatorias. La histamina es producida por las células cebadas adyacentes a los vasos, basófilos y plaquetas circulantes, se suele liberar de los gránulos de células cebadas en respuesta a estímulos como lesión física (traumatismo o calor); reacciones inmunitarias que impiden unión de

IgEa células cebadas; las denominadas anafilotoxinas; neuropéptidos y ciertas citocinas(IL-1 y IL-8). La histamina causa dilatación arteriolar y es el principal mediador de la fase inmediata de aumento de la permeabilidad vascular, induciendo una contrcción endotelial venular e hiatos interendoteliales, es inactivado por la enzima histaminasa poco tiempo después de su liberación. La serotonina también es un mediador vasoactivo preformada con actividad similar al de la histamina, se encuentra en los gránulos densos plaquetarios y es liberada durante la agregación plaquetaria.

Metabolismo del ácido araquidónico (prostaglandinas, leucotrienos y lipoxinas): afectan a varios procesos biológicos, incluidos la inflamción y la hemostasia. También llamados eicosanoides, pueden mediar en todas las etapas de la inflamación, su síntesis aumenta en los sitios de rspuesta inflamatoria así como también los agentes que inhiben su síntesis disminuyen la inflamación. Los leucocitos, las células cebadas, las células endoteliales y las plaquetas son las fuentes principales de los metabolitos de AA en la inflamación. El AA es un ácido graso poliinsaturado de 20 átomos de carbono derivado del ácido linoleico de la alimentación y presente en el organiso e su forma estraatificada como componente de los fosfolípidos de la membrana celular. Es liberado de los fosfolípidos por medio de las fosfolipasas celulares que han sido activadas por estímulos mecánicos, químicos o físicos o por mediadores inflamatorios como C5A. El metabolismo del AA sigue una de las 2 vías enzimáticas: la ciclooxigenasa estimula la síntesis de prostaglandinas y tromboxanos, y la lipoxigenasa es responsable de la producción de leucotrienos y lipoxinas.Vía de la ciclooxigenasa: los productos de esta vía incluyen la prostaglandina E2, D2, GFa2, I2 (prostaciclina) y tromboxano A2 (TxA2), cada uno de eelos derivados por la acción de una enzima específica sobre un intermediario de la vía metabólica. Alguna de estas enzimas tiene una distribución tisular restringida. Por ejemplo, las plaquetas contienen la enzima tromboxano sintasa, y por ello TXA2, un potente agregador paquetario y vasocnostrictor, es la principal PG producida en estas células. Por otra parte, las células endoteliales carecen de tromboxano sintasa pero contienen prostaciclina sintasa, que es responasable de la formación de PGI2, vasodilatador y potente inhibidor de la agregación plaquetaria. La PGD2 es el principal metabolito de la vía de la ciclooxigenasa en las células cebadas; junto con la PGE2 y la PGFa2 (que se hallan distribuidas más ampliamente) causa vasodilatación y potencia la formación de edema. Las PG se hallan implicadas también en la patogenia del dolor y la fiebre en la inflamación; la PGE2 aumenta la sensibilidad del dolor a una variedad de otros estímulos e interactúa con las citocinas para causar fiebre.

Vía de la lipoxigenasa: la 5-lipoxigenasa es la enzima metabolizadora del AA predominante en los neutrófilos. El derivado 5-hidroperoxi del AA, 5-HPETE (ácido 5-hidroxiperoxieicosatetraenoico) (que es quimiotáctico para los neutrófilos) o es convertido en una familia de compuestos denominados de modo colectivo leucotrienos. El primer leucotrieno generado a partir del 5-HPETE se denomina leucotrieno A4 (LTA4), que a su vez da lugar a LTB4 o LTBC4. El LTBC4 y sus posteriores metabolitos, LTD4 y LTE4, son producidos principalmente en las células cebadas y cuasan vasoconcstricción, brocoespasmo y aumento de la permeabilidad vascular. Las lipoxinas funcionan principalmente como inhibidores de la inflamación. Una vez que los leucocitos se introducen en los tejidos, cambian gradualmente sus principales productos AA derivados de la lipoxigenasa a lipoxinas, que inhiben la quimiotaxis de neutrófilos y su adhesión al endotelio, sirviendo de este modo como antagonistas endógenos de los leucotrienos. Las plaquetas que se activan y adhieren a los leucocitos son también fuentes importantes de lipoxinas. Las plaquetas solas no pueden sintetizar las lipoxinas A4 y B4 (LXA4 y LXB4), pero pueden formar estos mediadores a partir de un metabolito derivado d elos neutrófilos adyacentes por una vía biosintética transcelular. Por este mecanismo, los productos del AA pueden pasar de una célula a otra.Factor activador de plaquetas: Originalmente denominado así por su capacidad para agregar plaquetas y causar desgranulación, el factor activador de plaquetas es otro mediador derivado de los fosfolípidos con un amplio espectro de efecto inflamatorios. El PAF es aceil-éter-fodforilcolina; se genera a partir de los fosfolípidos de membrana de los neutrófilos, monocitos, basófilos, células endoteliales y plaquetas (y otras células) por la acción de la fosfolipasa A2. Actúa directamente sobre las células diana a través de un receptor específico acoplado a la proteína G. Además de estimular las plaquetas, el PAF causa vasoconstricción y broncoconstricción y es de 100 a 1000 veces más potente que la histamina en la inducción de vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular. El PAF puede desencadenar la mayoría de las reacciones de la inflamación, incluida una mayor adhesión leucocitaria, quimiotaxis, desgranulación leucocitaria y el estallido oxidativo; estimula también la síntesis de otros mediadores, sobre todo eicosanoides.

Fig 4: Generación de metabolitos por la vía del ácido araquidónico

Óxido nítrico: El NO es un gas radical libre soluble y de vida corta producido por muchos tipos celulares y capaz de mediar en varias funciones. En el sistema nervioso central, regula la liberación de neurotransmisores así como el flujo sanguíeno. Los macrófagos lo utilizan como metabolito citotóxico para destruir microbios y células tumorales. Cuando es producido por las células endoteliales (donde fue originalmente denominado factor de reljación derivado del endotelio), causa relajación del músculo liso y vasodilatación. El NO es sintetizado de novo a partir de L-arginina, oxígeno molecular y NADPH por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), hay 3 isoformas de NOS, con diferentes distribuciones tisulares.

2.7 FÁRMACOS ANTINFLAMATORIOS (DICLOFENACO)El diclofenaco, un derivado del ácido fenilacético, es uno de los AINE´s más utilizados. Se comercializa como una sal de potasio para la administración oral, como una formulación de epolamina para la administración transdérmica y como una sal sódica para la aplicación tópica y oral.Mecanismo de acción. El diclofenaco tiene actividades analgesicas, antipireticas y antiinflamatorias. Su potencia es mucho mayor que la de la indometacina, el naproxeno u otros AINE´s tradicionales. La selectividad del diclofenaco para la COX-2 es similar a la del celecoxib. Ademas, el diclofenaco parece reducir las concentraciones intracelulares de AA libre en los leucocitos y modifica tal vez su liberacion o captacion.Absorción, distribución y eliminación. El diclofenaco tiene una absorcion rapida, una considerable union a las proteinas y una semivida de 1 a 2 h. La semivida breve vuelve necesaria la administracion del diclofenaco en dosis bastante mas altas que las que se necesitarian para inhibir por completo la COX-2 en concentraciones plasmaticas maximas para proporcionar una inhibicion durante todo el intervalo de la administracion. Hay un efecto de primer paso considerable, de manera que solo 50% del diclofenaco esta biodisponible. El farmaco se acumula en el liquido sinovial tras la

administracion oral, lo cual explica por que la duracion de su efecto terapeutico es bastante mas prolongada que su semivida plasmatica. El diclofenaco es metabolizado en el higado por un miembro de la subfamilia del CYP2C para formar 4-hidroxidiclofenaco, el principal metabolito, y otras formas hidroxiladas. Despues de la glucuronidacion y la sulfacion, los metabolitos son excretados en la orina (65%) y en la bilis (35%).Aplicaciones terapéuticas. El diclofenaco esta autorizado en Estados Unidos para el tratamiento sintomatico a largo plazo de la artritis reumatoide, la osteoartritis, la espondilitis anquilosante, el dolor, la dismenorrea primaria y la migrana aguda. Se dispone de cuatro formulaciones orales: comprimido de liberacion inmediata y capsulas, comprimidos de liberacion tardia, comprimidos de liberacion prolongada y un polvo para solucion oral. La dosis oral diaria habitual es 100 a 200 mg, administrados en varias dosis fraccionadas. En el caso de la migraña, se administra un saquito de polvo (50 mg) disuelto en 30 a 60 ml de agua. El diclofenaco para uso topico esta disponible en gel y parche transdermico; se considera que las concentraciones sistematicamente activas liberadas por estos preparados contribuyen mas al alivio de los sintomas que el transporte directo a traves de la piel hacia el tejido inflamado.

Fig 5: Diclofenaco

3. METODOLOGIA3.1 Tipo de Investigación La investigación propuesta es de tipo cuasi- experimental, se rige por una estadística no paramétrica; en que la respuesta en los individuos es variable y que la actividad de la planta está demostrada.

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA 3.2.1 Población Ratones blancas de 30 – 50 g de peso, manteniendo en ayuno de sólidos por 12 horas, con dotación de agua, y distribuidas en 5grupos. Grupo 1: Blanco, agua Grupo 2: Control positivo de inflamación. En el cual se administrara únicamente el agente causal de la inflamación (carragenina). Grupo 3: Control referencia al cual se le administrara el fármaco de refencia Diclofenaco (voltaren) y el agente causal de la inflamación ( carragenina). Grupo 4. se administrara el extracto hidroalcohólico de la Plantago major L. a una dosis de 200 mg/kg y el agente causal de la inflamación carragenina. Grupo 5. se administrara el extracto hidroalcohólico de la Plantago major L. a una dosis de 300 mg/kg y el agente causal de la inflamación carragenina. Se utilizarán seis ratonas por cada lote lo que da un total de 30 animales.

3.2.2 Muestra La muestra es el extracto hidroalcoholico de Plantago major L. (Llantén)

3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL La presente investigación constara de tres fases:

Primera etapa: Obtención del extracto hidroalcohólico para pruebas farmacológicas y muestras de prinpio activo seco para la investigación fitoquímica, de Plantago major L.

Segunda etapa: Determinación de la actividad antiinflamatoria en el extracto. Tercera etapa: Análisis Estadísticos.

El tratamiento estadístico que se va aplicar es: Un análisis de varianza con una sola muestra (ANOVA), y posteriormente una prueba de tukey para comparar entre las medias.

3.3.1 VARIABLES

3.3.1.1 INDEPENDIENTES: Medicamento de referencia (Diclofenaco-Voltaren)

Extracto hidroalcohólico (200 mg/kg y 300 mg/kg)

3.3.1.2 DEPENDIENTES. Respuesta de los animales y la actividad antiinflamatoria.

3. 4. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICOS 3.4.1 PRIMERA FASE:

1. RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL a) Procedimiento

se procedió a comprar las hojas de llantén en un mercado localizado en Gamarra. Luego se realizó la selección de la droga (hojas) mediante la separación manual de las partes deterioradas, con signos de insectos, hongos, o que presentaron maltrato, se seleccionó las hojas en buen estado

2. SECADO DEL MATERIAL VEGETAL Materiales

Papel craff Estufaa) Procedimiento

Se extendió los pliegues de papel craff y encima se pusieron las hojas limpias separadas y distribuidas equitatitavamente e posteriormente se llevo a secar en una estuffa a 40o por 2 días.

3. PULVERIZADO DEL MATERIAL VEGETALMateriales

Molino dentado

a) ProcedimientoSe trituro manualmente las hojas seca , luego se procedió a moler y obtener polvo del material vegetal mediante el uso de un molido dentado. Finalmente se almaceno el polvo en un frasco ámbar.

4. OBTENCION DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICOa) Maceración

Materiales o Planta seca y molida o Frasco de vidrio ámbar o Alcohol de 70° GL

Procedimiento Pesar 100g de Plantago major L (Llantén). Seca y molida.

Depositar en el frasco de vidrio y añadir el alcohol de 70° GL hasta cubrir sobre las ¾ partes de la planta.

Dejar en contacto la planta con el alcohol por 1 semana.

Realizar agitación permanente. B) Filtrar

Materiales Gasas Esteriles Papel Filtro Embudo Bageta Beaker Muestra macerada por 1 semana

ProcedimientoSe realizó dos filtraciones seguidas, en el primer filtrado se utilizó las gasas esteriles colocándolo en encima del embudo y se procedió a filtrar el macerado del material vegetal; Luego de haber separado la parte liquida de la parte solida se realizo el segundo filtrado utilizando papel filtro. Después se lleva el filtrado en un plato a secar a la estufa a 40o por 3 días para la obtención de muestra del principio activo seco e luego ser reconstituido en agua.

5. MARCHA FITOQUIMICA

REACCION PROCEDIMIENTO INTERPRETACION

AMINOÁCIDOS - ENSAYO DE NINHIDRINA

Se colocó 1 ml del extracto en un tubo de ensayo limpio, se

añadió 1 ml de ninhidrina al 2% y se calentó en un baño deagua por 5 a 10 minutos

Se considera positiva la prueba si aparece una

coloraciónazul violácea.

COMPUESTOS FENÓLICOS - ENSAYO DE

FeCl3

Se tomó 1 ml de solución en un tubo de ensayo limpio. Se

añadió 1 gota de FeCl3 (MERCK) al 1% en agua y se

mezcló.

La aparición de coloraciones violeta, verde, azul u oscurase considera prueba

positiva.

FLAVONOIDES - ENSAYO DE SHINODA

Se colocó 1ml de solución en un tubo de ensayo limpio. Se

añadió algunas limaduras de Mg (MERCK) y sujetando el

tubo con una pinza se agregó cuidadosamente por la

pared del tubo unas gotas de HCl concentrado.

La aparición de coloraciones naranja a

violeta es pruebapositiva para la presencia

de flavonoides

LEUCOANTOCIANIDINAS - ENSAYO DEROSENHEIM

Se tomó 1 ml de solución en un tubo de ensayo limpio. Se

añadió 0,5 ml de HCl concentrado. Se mezcló, luego se

calentó durante 10 minutos a 100°C en el baño de agua y

se enfrió. Se añadió 0,4 ml de alcohol amílico (MERCK) y

se agitó. Finalmente se dejó separar las fases

La prueba se considera positiva si aparece

coloración en lafase amílica que vaya

desde el carmesí oscuro al rosadodébil.

TANINOS - ENSAYO DE LA GELATINA-SAL

Se colocó 1 ml de solución acuosa neutra en un tubo de

ensayo. Luego se añadió 1 ml de solución de gelatina al

La formación de un precipitado se considera

pruebapositiva.

1% que contenga 10 % de cloruro de sodio (MERCK).

QUINONAS - ENSAYO DE BORNGTRAGER

Se tomó 3 ml de solución clorofórmica y se lo llevó a

sequedad. Se redisolvió en 5 ml de etanol (Lab. promeclin)al 70%:H2O destilada (1:7). Después se añadió 1 ml de

agua oxigenada de 20 volúmenes (Lab. Promeclin), 1 ml de

H2SO4 (MERCK) al 50% y se calentó la mezcla en un baño

de agua hirviendo durante 10 - 15 minutos. Se dejó enfriar

y luego se extrajo en un embudo de separación con 5ml de

benceno (MERCK). Por último se retiró 2 ml de la fase

orgánica y se agitó en otro tubo con 1 ml de solución de

NaOH (MERCK) al 5% en NH4OH (MERCK) al 2%.

La prueba se considera positiva cuando aparecencoloraciones que van del rosado al rojo intenso en

la capaalcalina.

TRITERPENOS Y/O ESTEROIDES -

ENSAYO DE LIEBERMAN-BURCHARD

Se colocó 0,5 ml de muestra clorofórmica anhidra en un

tubo de ensayo limpio y seco. Se añadió 0,5 ml de anhídrido

acético (MERCK) y se agregó cuidadosamente

por la pared del tubo 1 gota de H2SO4 concentrado

(MERCK).

La aparición de coloraciones violeta,

verde, azul seconsidera positiva.

CARDIOTÓNICOS - ENSAYO DE KEDDE

A 1 ml de la fase orgánica se la llevó a sequedad, se

redisolvió en 1 ml de alcohol y se añadió 0,5 ml de reactivode Kedde (MERCK) recién

preparado

Se considera positiva la prueba si aparece una

coloraciónpúrpura o violácea.

ENSAYOS PARA ALCALOIDES

Se colocó 0,5 ml de solución acuosa ácida en 6 tubos de

ensayo limpios. Se añadió una gota de reactivo de

Dragendorff (MERCK), Mayer (MERCK), Marmé (MERCK),

Wagner (MERCK), ácido fosfowolfrámico (MERCK) al 3% yácido fosfomolíbdico (MERCK) al

3%.

Se considera prueba positiva cuando aparecen

precipitadosen por lo menos 3 tubos.

ENSAYOS PARA EL Se evaporó el solvente del Se evaporó el solvente del

RECONOCIMIENTO DEGLÚCIDOS

ENSAYO DE FHELING

extracto en baño de agua y elresiduo se disolvió en 1 ml de

agua. En caliente seañadió un volumen igual de

reactivo de Fheling

extracto en baño de agua y el

residuo se disolvió en 1 ml de agua. En caliente seañadió un volumen igual

de reactivo de Fheling

ENSAYO DE MOLISH

Se agregó 0,25 ml de solución de alfa naftol (MERCK) al

1% a 2 ml de la sustancia problema y en otro tubo con 2ml del problema se añadió 0,25

ml de la solución detimol (MERCK) al 1% Por las

paredes de cada tubo se añadió cuidadosamente 1 ml de H2SO4

concentradohasta que se formaron dos

capas.

La aparición de una coloración violeta en el

caso de alfanaftol y roja con el timol

en la interfase de los líquidos

indica que la prueba es positiva.

ENSAYO DE LAS PENTOSAS

En un tubo se colocaron 2 ml de la solución problema,

se añadió igual volumen de HCl concentrado y varios

cristales de floroglucina (MERCK). Se colocó el tubo en

un baño a ebullición.

La aparición de una coloración roja durante el

calentamiento se considera positiva.

3.4.2 SEGUNDA FASE

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA

EDEMA PLANTAR INDUCIDO POR CARRAGENINA Materiales Jeringas de 1 mL.

Cánulas

Jaula de animales Pletismómetro

Reactivó Agente causal de la inflamación carragenina

Extracto vegetal

Fármaco de referencia

Procedimiento Experimental: Se determina el peso promedio de las ratonas después de un ayuno de doce horas. Una vez separados los distintos lotes de animales de acuerdo al peso se procede a identificarlos: 1. Blanco: Administración de agua

2. Control 1: Carragenina

3. Control 2: Fármaco de referencia y carragenina

4. Problema 1 (200 mg/kg): Extracto hidroalcóholico y carragenina.

5. Problema1 (300 mg/kg): Extracto hidroalcóholico y carragenina.

Se miden los volúmenes basales de la pata derecha posterior de las seis ratonas en un Pletismómetro digital. Los extractos hidroalcóholico a ensayar se administran en dosis de 200 y 300 mg/kg de peso. La administración se hace por vía oral, empleando sondas oro gástricas (cánulas).

El vehículo utilizado es agua. El grupo blanco recibirá solamente el vehículo y otro grupo una dosis del agente antiinflamatorio previamente estandarizado para condición particular (generalmente: 50 mg/kg de fármaco de referencia). Media hora después de la administración del extracto, se inyecta 0.1 ml de una disolución acuosa al 2% de carragenina en la pata trasera izquierda derecha de la rata.

La media del volumen de la pata derecha inflamada se realiza por inmersión en el agua que contiene el pocillo del Pletismómetro hasta el maléolo lateral. Esta medición se realiza 1, 2,3, 5 y 7 horas después del inicio del experimento.

Uso de PlestismometroInstrucciones Generales

El pletismómetro es un instrumento muy delicado y por tanto debe ser tratado con mayor cuidado, evitándose choques, agitación, exceso de calor o humedad.

Use siempre el embalaje original para guardarlo. Jamás suelto en cajones o en la misma mesa de trabajo.

La celda no debe ser presionada porque está ligada a un sistema sensor de presión (transductor) extremadamente sensible para poder percibir variaciones volumétricas muy pequeñas.

Usar siempre agua destilada en la celda, jamás utilice otros líquidos, pues pueden dañar el sensor y también causar error de lectura.

Para su limpieza use siempre agua destilada o de vuelta al equipo, siempre desligado para eliminar el líquido.

Instrucciones de Trabajo Conectar el pletismómetro PLE06D a 110V, de preferencia estabilizada y

protegido del ruido. Llenar la celda uniformemente por completo al límite superior o menos si es de

su conveniencia siempre con Suero fisiológico y gotas de triton Conectar el interruptor a su derecha, se encenderá, “led”, rápidamente arriba

de la llave y aparecerá un numero en el panel digital. Ajustar el potenciómetro central girando en sentido horario anti horario

uniformemente hasta llegar a una lectura de 000,0 que corresponderá a “cero” para su experimento.

Posteriormente calibrar con un pesa standarizada y presionar calibración Luego de haber calibrado se procede a medir los volúmenes experimentales.

Preparación de Reactivos para su administración

EJEMPLO: preparación de solución madre al 30 % (A partir de 3 gramos obtenidos de extracto seco).

3 gr ------------------------- 10ml

1.5 gr --------------------5 ml

En el caso de mi grupo trabajaremos con 2concentraciones distintas: Así que dividimos los 10 ml en 2 fracciones de 5 ml

Por comodidad: decidimos que en la nueva dilucion podamos administrar 1ml a cada rata

25 mgr ------------------ 1ml

1500 gr ----------------- x

X = 60 ml

De los 5 ml de solucion madre lo diluimos hasta obtener 60 ml, asi le daremos 1 ml a cada rata

Por comodidad: decidimos que en la nueva dilucion podamos administrar 1 ml a cada rata

50 mgr -------------------- 1 ml

1500 gr -------------------- x

X = 30 ml

De los 5 ml de solucion madre lo diluimos hasta 30 ml, asi le daremos 1 ml a cada rata

DOSIS (100 mgr/kg)

En caso que la rata pese 250 gr

100 mgr------------------ 1000 gr

x---------------------------- 250 gr

x = 25 mgr

DOSIS (200 mgr/kg)

En caso que la rata pese 250 gr

200 mgr ------------------ 1000 gr

X ----------------------------- 250 gr

X = 50 mgr

OBSERVACIONES : este calculo es hipotetico en caso de que todas tus ratas pesen 250 gr (lo cual es imposible ya que variaran sus pesos), en ese caso deberas sacr el volumen a administrar a cada rata

Ejm: peso real es de 240 gr, como se administra 1ml a una rata de 250 gr

1 ml ---------------------------------- 250 gr

X ------------------------------------- 240 gr

X = 0, 96 ml (recomendación, comprar inyectables o ampollas de 1 ml de capacidad para que sea mas facil

El peso promedio de los ratas:120 g Cantidad máxima que puede ser suministrada: 1 ml a) Agua: Administrar 0,5ml/kg.

0.5 ml ------------- 1000 g X --------------- 120 g

a. Fármaco de referencia: Diclofenaco presentación 50 mg/kg

50 mg ------------- 1000 g X ------------------- 120g

X = 6 mg

I. Tercera FaseAnalisis Estadistico

1. ANOVA2. TUKEY

4. RESULTADOS4. 1 RESULTADOS DEL ANÁLISIS MACROMORFOLOGICOLos resultados del análisis macromorfológico de la droga en estudio se indican en la tabla 3.1.

Tabla 4.1.- Resultado del análisis macromorfológico de la droga

COLOR DE HOJAS En el haz y envés verde claroCONSISTENCIA LisaOLOR CaracterísticoSABOR AmargoTAMAÑO 13,3 cm de largo y 7,9 cm de anchoPRESENCIA DE VELLOSIDADES Carece de vellosidadesFORMA DE LA HOJA OvaladaBORDE DE LA HOJA Ligeramente dentadoBASE FOLIAR RedondeadaDISPOSICION DE LAS HOJAS Basales dispuestas en rosetas

Figura 3.1.- Análisis macromorfológico de droga de PmL

4. 2 RESULTADOS DE LA MARCHA FITOQUÍMICAConvenciones para la interpretación de resultados

TABLA 4.2.- Leyenda de interpretación de los resultados de la marcha fitoquímica

RESULTADO ASIGNACIONNada -

Escaso +/-Moderado +

Abundandte ++

a) Investigación de Alcaloides

Tabla 4.2.1 RESULTADOS DE LA IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES

REACCION RESULTADOS OBSERVACION

Draggendorff

++

Precipitado rojo ladrillo

b) Investigación de Flavonoides

Tabla 4.2.2 RESULTADOS DE LA IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES


Shinoda +/-No se observó espuma pero si una leve coloración roja

Iridoides ++

c) Investigación de Taninos

Tabla 4.2.3 RESULTADOS DE LA IDENTIFICACIÓN DE TANINOS


Cloruro Férrico ++

Coloración verde oscuro

Gelatina salada +

Presencia de precipitado

d) Investigación de Saponinas



Con agua +

Presencia de espuma permanente por un minuto

e) Investigación de carbohidratos



Molish ++

Presencia de una aro morado

f) Investigación de grupos amino y aminoácido libres



Ninhidrina ++

Coloración azul violacea

g) Investigación de Antraquinonas

Tabla 4.2.7 RESULTADOS DE LA IDENTIFICACIÓN DE ANTRAQUINONAS


Bomtrager ++

Color rojo intenso

Al realizar el análisis fitoquímico se determinó la presencia de los siguientes metabolitos: alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas, carbohidratos, aminoácidos y antraquinonas.

4.3 RESULTADOS DE LA EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIAPara la evaluación de la actividad antiinflamatoria se procede a usar el método de Winter modificado et. al 1981.

Se procede a pesar todos los animales de experimentación y se los divide en 5 lotes de 6 ratones cada uno, en los cuales se les procederá a administrar por V.O según el esquema de trabajo.

Tabla 4.3.1 ESQUEMA DE TRABAJO DE LESIONES INFLAMATORIAS

ANIMALESHORA 0 HORA 1

ADMINISTRACION V.S.C (DOSIS) ADMINISTRACION V.O DOSIS

LOTE PESO PROMEDIO CARRAGENINA AGUA EXTRACTO DICLOFENACO

1 122.33 g - 0.56 ml/Kg - -2 115,5 g 0.1ml - - -3 110,67 g 0.1ml - - 50 mg/Kg4 121,5 g 0.1ml - 200mg/Kg -5 112,83 g 0.1ml - 300mg/Kg -

A la hora se empezara el análisis y mediciones de las lesiones y se procede a poner resultados en las tablas.

4.4 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSLOTE BLANCO: Administración de Agua

Tabla 4.4.1 Volumen plantar del lote Blanco

Nº RATON 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS 5 HORAS 7 HORASV0 VT V0 VT V0 VT V0 VT V0 VT

1 0,63 0,63 0,63 0,63 0,63 0,63 0,63 0,63 0,63 0,632 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,563 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,564 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,555 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,576 0,52 0,52 0,52 0,52 0,52 0,52 0,52 0,52 0,52 0,52

LOTE BLANCO POSITIVO: Administración de CARRAGENINA

Tabla 4.4.2 Volumen plantar del lote Blanco

Nº RATON 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS 5 HORAS 7 HORAS

V0 VT V0 VT V0 VT V0 VT V0 VT1 1 1,23 1 1,46 1 1,46 1 1,45 1 1,452 0,9 1,28 0,9 1,33 0,9 1,33 0,9 1,33 0,9 1,333 1,09 1,22 1,09 1,25 1,09 1,25 1,09 1,25 1,09 1,254 0,93 1,23 0,93 1,27 0,93 1,28 0,93 1,28 0,93 1,285 0,98 1,3 0,98 1,35 0,98 1,35 0,98 1,35 0,98 1,356 0,96 1,21 0,96 1,36 0,96 1,35 0,96 1,4 0,96 1,4

LOTE PATRON: Administración de DICLOFENACO + CARRAGENINA

Tabla 4.4.3 Volumen plantar del lote Patrón


1 1 1,21 1 1,43 1 1,42 1 1,42 1 1,422 1,01 1,13 1,01 1,48 1,01 1,38 1,01 1,38 1,01 1,383 1,22 1,41 1,22 1,56 1,22 1,36 1,22 1,36 1,22 1,354 1,01 1,35 1,01 1,45 1,01 1,34 1,01 1,34 1,01 1,345 1 1,32 1 1,2 1 1,2 1 1,2 1 1,26 1,05 1,34 1,05 1,55 1,05 1,35 1,05 1,35 1,05 1,35

LOTE PRUEBA 1: Administración de EXTRACTO 200mg/Kg + CARRAGENINA

Tabla 4.4.4 Volumen plantar del lote Prueba 1


1 1,06 1,42 1,06 1,45 1,06 1,24 1,06 1,24 1,06 1,242 0,98 1,41 0,98 1,51 0,98 1,35 0,98 1,35 0,98 1,353 1,1 1,42 1,1 1,32 1,1 1,32 1,1 1,32 1,1 1,324 1,08 1,4 1,08 1,52 1,08 1,52 1,08 1,52 1,08 1,525 1,15 1,24 1,15 1,17 1,15 1,17 1,15 1,17 1,15 1,176 0,93 1,13 0,93 1,23 0,93 1,23 0,93 1,23 0,93 1,23

LOTE PRUEBA 2: Administración de EXTRACTO DE 300mg/Kg + CARRAGENINA

Tabla 4.4.5 Volumen plantar del lote Prueba 2


1 0,97 1,3 0,97 1,32 0,97 0,98 0,97 0,98 0,97 0,992 1 1,17 1 1,07 1 1,07 1 1,06 1 1,063 0,98 1,17 0,98 1,36 0,98 1,34 0,98 1,34 0,98 1,334 1,15 1,44 1,15 1,48 1,15 1,47 1,15 1,44 1,15 1,445 0,89 1,39 0,89 1,46 0,89 1,45 0,89 1,45 0,89 1,456 1,16 1,27 1,16 1,31 1,16 1,21 1,16 1,21 1,16 1,21

PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DEL LOTE BLANCO POSITIVO

Se calcula el porcentaje de actividad, con la siguiente fórmula:

TABLA 4.4.6 PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DEL LOTE POSITIVO

Nº RATON 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS 5 HORAS 7 HORAS

% ACTIVIDAD % ACTIVIDAD % ACTIVIDAD % ACTIVIDAD % ACTIVIDAD1 23 46,0 46,0 45,0 45,02 42,2 47,8 47,8 47,8 47,83 11,9 14,7 14,7 14,7 14,74 32,3 36,6 37,6 37,6 37,65 32,7 37,8 37,8 37,8 37,86 26,0 41,7 40,6 45,8 45,8

Tabla 4.4.7 PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DEL LOTE DE PATRON

Nº RATON 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS 5 HORAS 7 HORAS% ACTIVIDAD % ACTIVIDAD % ACTIVIDAD % ACTIVIDAD % ACTIVIDAD

1 21,0 43,0 42,0 42,0 42,02 11,9 46,5 36,6 36,6 36,63 15,6 27,9 11,5 11,5 10,74 33,7 43,6 32,7 32,7 32,75 32,0 20,0 20,0 20,0 20,06 27,6 47,6 28,6 28,6 28,6

Tabla 4.4.8 PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DEL LOTE PRUEBA 1


1 34,0 36,8 17,0 17,0 17,02 43,9 54,1 37,8 37,8 37,83 29,1 20,0 20,0 20,0 20,04 29,6 40,7 40,7 40,7 40,75 7,8 1,7 1,7 1,7 1,76 21,5 32,3 32,3 32,3 32,3

Tabla 4.4.9 PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DEL LOTE PRUEBA 2


1 34,0 36,1 1,0 1,0 2,12 17,0 7,0 7,0 6,0 6,03 19,4 38,8 36,7 36,7 35,74 25,2 28,7 27,8 25,2 25,25 56,2 64,0 62,9 62,9 62,96 9,5 12,9 4,3 4,3 4,3

Tabla 4.4.10 PORCENTAJES DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA VS EL TIEMPO

TIEMPO DE ENSAYO BLANCO CARRAGENINA CARRAGENINA+

EXTRACTO 300mgCARRAGENINA+

EXTRACTO 200mgCARRAGENINA+ DICLOFENACO

UNA HORA 0 28,0 26,9 27,6 23,6DOS HORAS 0 37,4 31,3 30,9 38,1TRES HORAS 0 37,4 23,3 24,9 28,6

CINCO HORAS 0 38,1 22,7 24,9 28,6SIETE HORAS 0 38,1 22,7 24,9 28,4

Fig. 3.2. Comparación % de reducción de la inflamación

Los porcentajes de reducción de la inflamación del extracto de 300 mg presenta de manera inmediata y significativa una reducción en el incremento en el volumen plantar del ratón en comparación con el medicamento patrón o estándar y de la misma manera con respecto al extracto de 200 mg.

Tabla 4.4.11 RESULTADOS DEL PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DEL EXTRACTO

El extracto hidroalcohólico de Plantago major L, a la concentración 200 mg, produce una reducción de la inflamación en un porcentaje de 24,9 % y a la concentración de 300 mg es de 22,7 %, considerando que el 100 % es el total de la inflamación se nota que el porcentaje del extracto de 300 mg / kg son menos alto que los porcentajes tanto del fármaco de referencia que es 28,4 % como del extracto de 200 mg/ kg que es 24,9 %.

Las inflamaciones producidas por carragenina se caracterizan por presentar de manera inmediata el incremento en el volumen plantar del ratón y provocar una coloración rojiza en la misma.

PORCENTAJE DE INHIBICIONDICLOFENACO 28,4

EXTRACTO 200mg 24,9EXTRACTO 300mg 22,7

4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico se va a realizar mediante el ANOVA para determinar si los datos presentan o no diferencias significativas, con datos de la concentración de extracto en miligramos con respecto al índice de inflamación.

4.5.1 ANALISI DE VARIANZA DE UN SOLO FACTOR

FORMULACIÓN DE LA HIPÓTESIS

Ho: El efecto farmacológico de las dosis de 200 y 300 mg/kg de peso del extracto Plantago major L es similar al observado con el blanco o No existen diferencias entre los tratamientos.

H1: El efecto farmacológico de las dosis de 200 y 300 mg/kg de peso del extracto Plantago major L es superior al observado con el blanco o Existen diferencias entre los tratamientos.

Tabla 4.4.12 Datos totales del Análisis de la actividad antiinflamatoria

TRATAMIENTO R1 R2 R3 R4 R5 R6BLANCO 0 0 0 0 0 0

CARRAGENINA 45,0 47,8 14,7 37,6 37,8 45,8CARRAGENINA + DICLOFENACO 42,0 36,6 10,7 32,7 20,0 28,6

CARRAGENINA + EXTRACTO 200mg/Kg 17,0 37,8 20,0 40,7 1,7 32,3CARRAGENINA + EXTRACTO 300mg/Kg 2,1 6,0 35,7 25,2 62,9 4,3

Tabla 4.4.13 Análisis de varianza de un solo factor (ANOVA)

Análisis de varianza de un factor

La hipótesis es alternativa porque existe diferencia significativa entre los extractos de la planta con respecto al diclofenaco ya que F calculada es mayor que F tabulada, razón por la cual podemos decir que el medicamento de referencia con los extractos no se comportan de la misma manera.

Esto se debe a que los extractos presentan una actividad antiinflamatoria mayor que el diclofenaco.

PRUEBA DE SIGNIFICANCIA

4.5.2 Prueba de TukeyHSD= 24,45459211

MULTIPLICADOR= 4,1

MSe= 213,4540423n= 6

ANALISIS FUNCIONAL POR TUKEY

TRATAMIENTO MEDIAS

Interpretación:

Al analizar la prueba de significancia es necesario ver la diferencia con respecto al tratamiento 3 que es el medicamento de referencia frente al cual se va a evaluar la actividad del extracto tanto de 200 mg/kg que es el tratamiento 4 así como, 300 mg/kg que es el tratamiento 5, se ve claramente que existe diferencia significativa en los tratamientos 4 con 3 y 5 con 3, aceptando la hipótesis alternativa, el tratamiento 4 y 5 tiene buenas características como antiinflamatoria. Sin embargo, no existe diferencia significativa entre el tratamiento 4 y 5.

5. DISCUSIONLa evaluación de la actividad antiinflamatoria se ha realizado utilizando carragenina. Cabe resaltar que se ha preferido trabajar con carragenina y no con otros agentes irritantes, porque el edema que produce es menos modificado por factores ajenos a los propiamente característicos de la inflamación. Se seleccionó el diclofenaco como control positivo debido a que este medicamento es ampliamente utilizado en el mercado local, ya que este fármaco tiene actividad analgésica, antipirética y antiinflamatoria, siendo más potente que la indometacina.

De acuerdo a los resultados de la marcha fotoquímica se observó la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas, carbohidratos, aminoácidos y antraquinonas; siendo los responsables de la actividad antinflamatoria los “flavonoides e iridoides”, estos resultados son semejantes a la investigación realizada por Davalos J (2008). Según Hussan F. (2015) la actividad antiinflamatoria que poseen los flavonoides se debe a la presencia de Baicadelina y Hispidulina (tipo de flavonoides), donde la Baicadelina inhibe la 12-lipooxigenas además de inducir la producción de óxido nítrico en macrófagos; mientras que la Hispidulina es un inhibidor de la 5-lipooxigenasa. Además, otros estudios mencionan que la acción antiinflamatoria que poseen muchos flavonoides se relaciona con la inhibición de diversas enzimasimplicadas en el metabolismo del ácido araquidónico -como la ciclooxigenasa, lipooxigenasa, fosfato dinucleótido adenina nicotinamida (NADPH) oxidasa y xantina oxidasa-, y de radicales libres, y reducen el estrés oxidativo.

En una investigación realizada por Enciso (2011) indica que a nivel In vitro, los flavonoides polihidroxilados actúan preferentemente por la vía de 5-lipooxigenasa, mientras que los menos hidroxilados inhiben fundamentalmente la vía de ciclooxigenasa, minetras que en In vivo, parecen comportarse como inhibidores duales. Esta diferencia de comportamiento, no exclusiva de flavonoides, se debe a la biotransformación que sufren en el organismo. Otros mecanismos implicados en la acción antiinflamatoria y en los cuales pueden intervenir los flavonoides son: inhibición de la liberación de histamina, inhibición de la migración celular (en el proceso inflamatorio los leucocitos se dirigen por quimiotactismo hacia el foco inflamatorio, donde son activados liberando eicosanoides y otros agentes proinflamatorios), acción antirradicalaria (actuando frente a los radicales libres que se originan en la inflamación), efecto protector vascular (contribuye a disminuir la exudación).

De acuerdo a Hunssan (2015) el llantén poseen 6 tipos de irdoides glicosilados de los cuales el más importante es la aucubina, que presenta propiedades antinflamatorias, donde en estudios anteriores provocó la disminución de la inflamación del edema de oreja de ratón con una dosis efectiva de 1mg por oreja. En nuestra investigación se comprobó mediante el Análisis de varianza de un factor, que los extractos del Plantago major L. de 200 mg/Kg y 300 mg/Kg poseen una mayor actividad antiinflamatoria con respecto al diclofenaco que es el fármaco patrón , y esto se debería principalmente a la acción de los flavonoides e iridoides ya que estos actúan inhibiendo diversas enzimas en el metabolismo del ácido araquidónico -como la ciclooxigenasa, lipooxigenasa. Este resultado se evidencia al observar que el F calculado es mayor que F tabulado, razón por la cual podemos decir que el medicamento de referencia con respecto a los extractos no se comportan de la misma manera.La prueba de Tukey nos va a permitir reconocer si existe diferencias significativas entre grupos de dos, de tal manera podemos identificar que grupo puede presentar mayor actividad con respecto a otra. En nuestro caso se observó que existe una

diferencia significativa en los tratamientos 4 (extracto de 200 mg/Kg) con respecto al 3 (diclofenaco) y 5 (extracto de 300 mg/Kg) con 3, aceptando la hipótesis alternativa, de tal manera a que los extractos del tratamiento 4 y 5 tiene buenas características como antiinflamatoria. Sin embargo, mediante esta prueba se observó que no existe una diferencia significativa entre el tratamiento 4 y 5.

6. CONCLUSIONES Se comprobó la actividad antinflamatoria del extracto hidroalcohólico de las

hojas de Plantago major L “llantén” en comparación con diclofenaco mediante la técnica de edema plantar en ratas.

Se demostró en el tamizaje fitoquímico la presencia de metabolitos activos. Se comprobó que la actividad antiflamatoria se relaciona con la presencia de

iridoides glucosilados y de flavonoides en menor proporción, puesto que se demostró en el tamizaje fitoquímico

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8. ANEXO

antiinflamatorio

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