análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral ... · pdf file...

Click here to load reader

Post on 15-Aug-2020

6 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

    Co nta cto :Co nta cto : [email protected]

    Tesis de Posgrado

    Análisis del mecanismo deAnálisis del mecanismo de resistencia a la infección viralresistencia a la infección viral mediado por la expresión delmediado por la expresión del

    ORF2b de PLRV en plantasORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanumtransgénicas de Solanum

    tuberosumtuberosum

    Vazquez Rovere, Cecilia

    2000

    Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires

    Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

    This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.

    Cita tipo APA: Vazquez Rovere, Cecilia. (2000). Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3263_VazquezRovere.pdf

    Cita tipo Chicago: Vazquez Rovere, Cecilia. "Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2000. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3263_VazquezRovere.pdf

    http://digital.bl.fcen.uba.ar http://digital.bl.fcen.uba.ar http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3263_VazquezRovere.pdf http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3263_VazquezRovere.pdf mailto:[email protected]

  • TESIS No.3263 Cs.BioLogicas VAZQUEZ ROVERE

    Cecilia

    Biblloteca FCEQNi UBH

  • Nunca pensé que esta sección me íba a costar tanto. Me dijeron que sea concreta, que no haga agradecimientos muy largos pero tengo que agradecer a tanta gente que me resulta difícil no olvidarme de nadie y resumir tantas cosas. Por los posibles olvidos mil disculpas.

    Quisiera agradecer

    A Esteban por confiar en mi, por permitir que crezca dándome la libertad necesaria y guiándome en cada momento, en cada charla de pasillo y al pasar, en acciones que quizá no comprendí y que a Ia larga reconocí. Porque "el jefe" siempre tiene Ia razón.

    A Fernanda y Paula Cr por preocuparse y descubrir que esto era una buena salida.

    Al grupo papa empezando por Fernanda por facilitarme las cosas desde antes de comenzar, por enseñarme y protegerme (aunque a veces demasiado y con una que otra lágrima). A Sebastián por compartir juntos la lucha, porque podemos contar el uno con el otro, por ser mi compañero de mesada, mi compañero de congresos y cursos, mi becario, mi jefe, mi AMIGO. A Tere porque a pesar de preferir a Sebas no hizo diferencias a la hora de trabajar a mi lado. Por cuidar y preocuparte tanto por "tus plantitas". A Andrea no sólo por las mil y una plantas, sino por compartir desde la Facu ideas y pensamientos que en muchas ocasiones no hubo siquiera necesidad de nombrar. Porque a veces con sólo cruzar mirada sabemos de que se trata. A Vero R, la joven uruguaya (que pronto dejará de ser ambas cosas), por insistir y no rendirse, por tirar para adelante y terminar de darle forma al grupo.

    A Mariana por ser mi punto de referencia, por todos sus consejos siempre acertados, porque es espectacular tenerla en el laboratorio (a pesar de Ser "la nionia") y más aún fuera de e'l. Por todo lo que compartimos, desde charlas a Ia hora de la siesta hasta "asaltos y asesinatos" en playas de estacionamiento o "defensa personal con plancha" en la rue Monge. Sabés que la expresión no es mi fuerte... Mil Gracias!

  • A Alex por escucharme, preocuparte y cuidar todos los detalles desde el té de Tilo hasta la microcentrífuga, pasando por la críoconservación. A Analía porque todo es un bien ganancial.

    A Ana Julia, Marianne, Nilda, Marisa LB, Nora, Vale, Marce, Paz

    (aunque reniegue) y Eduardo por compartir el resto de nuestros días en el Lab. Por el ánimo brindado, el buen humor y la buena disposición de todos. (a Nilda por ayudarme con el herbario y otras cosas y a Nora "la pistolera").

    A Dalia, Magda, Marcela, Mercedes, Laura M, Susana, Ale, Diego y Fernando por las charlas de café compartidas y esperemos seguir arreglando el mundo.

    A los vecinos de Marcadores: Norma, Paula, Ruth, María, Vero N, Luis,

    Andrea P, Caro, Flor y Sandra por padecer los tiempos finales de mi tesis. Porque todos compartimos el ser "lechugones" y estar del mismo lado de la fosa.

    A mis grandes amigas: Ceci, Dani, Eleo, Fabi, Laurita y Paula C. Por TODO.

    A Silvíto y Oscar: los grandes baluartes del Instituto.

    A Osvaldo por los viejos tiempos y tantos buenos consejos.

    A Angel: otro Grande, porque "aunque parezco tonta no soy ninguna viva" (Magda y col., 1994).

    A Alicia Ar por su ayuda con los conejos pero sobretodo por sus anécdotas.

    A Gaby C por sus buenos consejos desde que estaba en el INGEBI (y aprovecho para extender míagradecimiento a los plantólogos de allá).

    A mis compañeros de paddle: Osvaldo, Ale, Marisa R, Claudia, Sebas (allá lejos y hace tiempo).

    A Lela, Flavia, Andrea, Daniela, María Elisa, Guido, Silvina, Ariel, Alicia Al, Marisa F, Martin, Karina, Andrea ("Penélope"), Haydée, Lorena,

  • Laura, Isabel, Berta, Susana, Jorge, Fabián, Vilma, Eva, Perla, Any, Marta y a los viejos: Norbius, Sergio, Corina, Paula C, Erica y Dino.

    Porque cada uno de uds de una u otra manera facilitaron esta tarea y permitieron que el trabajo se convierta en una excusa.

    AI INTA que, a través del Dr Eduardo Palma y el Dr Osvaldo Rossetti, me dío el apoyo institucional para desarrollar esta tesis.

    A mis amigos Mariano, Julia y Fernando.

    A Zahira y Alonso que se interesaron en mi carrera y mi trabajo estando siempre dispuestos a colaborar. A Cristián, Diana (y cia), Rocío, Totó, Santiago, Vera, Franco, Bárbara, Sol, Vale, Carlos y Román.

    A mi familia: Tiki, Margot, Alo, Pato, Ferdie, Clau, Yusto, Erica, Luci, Edu, Cocoy, Gonzalo, Santiago, Igna, Agustina, Upí, Ro, Cami, Mili, Vale, Lucía, Augustito y Santi que están siempre conmigo.

    A Tiki y Margot por todo lo que me dieron, me dan y me darán. Porque los hijos somos un camino de ida.

    A Abue que siempre estará conmigo.

    A Gabriel, Mati, Sofi y Marcos por aguantar esta "mala idea" (como dice Marcos) y porque en definitiva todo lo que hago es por y para ellos.

  • INDICE

    I. INTRODUCCION l. EL CULTIVO DE LA PAPA l

    1.1 Importancia del cultivo en la Argentina 3 2. ENFERMEDADES PROVOCADAS POR VIRUS 5 3. VIRUS DEL ENROLLAMIENTO DE LA HOJA DE PAPA ................................... .. 6

    3.1 Características generales de los Luteovirus 6 3.2 Organización genómica del virus del enrollamiento de la hoja de papa (PLRV). 7

    4. ENFERMEDADES PROVOCADAS POR HONGOS 9 5. ENFOQUES CLASICOS PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES ............. .. 10

    5.1 Enfermedades virales lO 5.2 Enfermedades fúngicas ll

    6. ENFOQUES MOLECULARES PARA OBTENER RESISTENCIA ...................... .. ll 6.1 Enfermedades virales 12

    6.2 Resistencia mediada por proteína de cápsidc 12 6.3 Posibles mecanismos de resistencia mediada por cápsíde 14 6.4 Resistencia mediada por replicasa 15 6.5 Posibles mecanismos de resistencia mediada por replicasa 16 6.6 Enfermedades fúngicas 18

    7. SILENCIAMIENTO 19 7.1 Efectos de posición y Silenciamiento de Genes en forma Dependiente de Homología (I-IDGS) 19 7.3 Silenciamiento transcripcional de genes (TGS) 20 7.4 Silenciamiento post-transcripcional de genes (PTGS) ...................................... .. 21 7.5 Silenciamiento sistémico adquirido (SAS) 25 7.6 Mutantes de silP-u ' ' ‘ n 27

    7.7 Efectos de posición y requerimientos para la expresión estable de un transgén _ 29 7.8 Silenciamiento de transgenes y sistemas de defensa del huésped ..................... .. 29 7.9 Aplicaciones del Silenciamiento de genes dependiente de homología .............. .. 30

    II. OBJETIVOS l. SUPUESTOS RELEVANTES 31 2. OBJETIVO GENERAI 32 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 32 4. OBJETIVOS ADICIONALES 33 5. FINALIDADES DE APLICACIÓN Y ETAPAS DE EJECUCIÓN ........................ .. 33 III. MATERIALES Y METODOS l. CEPAS BACTERIANAS Y CONDICIONES DE CULTIVO ................................ .. 35 2. GENOTIPOS VEGETALES EMPLEADOS 36 3. VECTORES DE CLONADO 36 4. OLIGONUCLEÓTIDOS INICIADORFS 37 5. EXTRACCION DE RNA 39 6. CLONADO DEL ORF ZB DE LA REPLICASA DE PLRV ................................... .. 39

    6.1 Sintesis de cDNA viral por transcripción revertida 40 6.2 Amplificación del ORF 2b de PLRV 40

    6.3 Clonado del producto de amplificación en el vector pCR®II ........................... .. 41 7. TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS E.COL] 41

  • 7.1 Preparación de bacterias Ecolí competentes 41 7.2 Transformación de bacterias Ecolz’competentes 42

    8. AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO (MINIPREPARACIÓN) ..................... .. 42 9. TRATAMIENTO CON ENDONUCLEASAS

View more