análisis antibióticos uhplc hrmseurolab.org.es/newsletter/junio2014/10.z.05.pdf · 2014. 6....

LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA

ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS

EN TEJIDO ANIMAL

POR LC‐HRMS

Carmen Igualada Cañas

Unidad de Residuos de Medicamentos Veterinarios

Laboratorio Salud Pública Valencia

Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio



• Conceptos básicos

• Estrategias trabajo Alta Resolución de masas

• Elaboración Base de Datos

• Método para análisis de antibióticos en tejido LC-HRMS

• Validación. Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: (20/1/2010)

• Resultados

• Aplicación en muestras

• “Post-Targeted” análisis

• Fragmentación

• Conclusiones



CONCEPTOS BÁSICOS

Resolución de masa: (Resolving power):

Capacidad de un espectrómetro de masas de distinguir 2 iones con m/z similares.

‐ Procedimiento de medida

Peak width en unidades de masa

2 puntos pico: 5% altura pico (10% valley definition) o

50% altura pico (Full Width at Half Maximun: FWHM)

mmR∆

=m/z centroid del ión

peak width

en unidades de masa

Procedimiento de medida

Valor m/z de la medida



MEDIDAS DE RESOLUCIÓN EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS

R FWHM 2 x R 10%Valley Definition



RESOLVING POWER EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS

DECISIÓN 2002/657/CE

High resolution

R≥10000 en 10% Valle RFWHM ≥ 20000

En todo el rango de masas



VARIACIÓN RESOLUCIÓN - m/z

zm

αR 1



CONCEPTOS BÁSICOS

•Masa Nominal

Masa de un ión calculada usando la masa entera del isótopo más abundante de cada elemento. (H=1, C=12,O=16….)

•Masa Monoisotópica

Masa de un ión calculada usando la masa exacta del isótopo más abundante de cada elemento. (1H=1.0078, 12C=12.0000, 16 O=15.9949

•Abundancia Isotópica

Distribución natural de un mismo elemento con diferentes masas atómicas (12C=12.0000=98.9 % y 13C=13.0034= 1.1 %)



Masas exactas y abundancias relativas ISOTOPOS

CONCEPTOS BÁSICOS

INTERPRETACIÓN

PATRÓN ISOTÓPICO



CONCEPTOS BÁSICOS

•Exactitud de masa:

Diferencia (error) entre la masa medida o experimental y la masa calculada o teórica.

miliDaltons (1mDa= 0.001 uma)

ppm=(Dm/m)x 106

Cálculo error Da

Cálculo error mDa

Cálculo error ppm 610xm

mm

true

truemeas −=∆

310xmmm truemeas )( −=∆

)( truemeas mmm −=∆



ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS EN TEJIDO ANIMAL POR UHPLC‐HRMS

OBJETIVO

Cubrir las carencias del Método de inhibición del crecimiento bacteriano en placas:

•Falta de especificidad

•Falta de sensibilidad para algunos grupos y compuestos

DESARROLLAR MÉTODO SCREENING CUALITATIVO

MULTI-ANALITO MULTI-FAMILIA MULTI-MATRIZ




Esquema del equipo Exactive-Orbitrap TM

fragmentacion

SOURCE

PSEUDO MS/MS



Características Equipo Exactive-Orbitrap TM

•Full-Scan: 50-4000 m/z

•Resolución : max.100000 FWHM

•Masa Exacta:



ESTRATEGIAS

“TARGETED” ANÁLISIS. SCREENING DE COMPUESTOS CONOCIDOS•Tenemos standards.•Se obtienen XIC de ión específico: ión molecular, isótopos, fragmentos.•RT o RRT•A menor ventana de extracción de masa, menos compuestos isobáricos interferentes

“POST-TARGETED” ANÁLISIS. SCREENING DE COMPUESTOS CONOCIDOS•No tenemos standards.•Se obtienen XIC de ión específico: ión molecular, isótopos, fragmentos.•Información BASE DE DATOS•RT o RRT ??•A menor ventana de extracción de masa, menos compuestos isobáricos interferentes•Tras la identificación se requiere obtener standards para completar estudio.

“NON-TARGETED” ANÁLISIS. SCREENING DE COMPUESTOS DESCONOCIDOS•Se obtienen XIC de iones inespecíficos. •Se estudian señales discriminatorias: Grupo control, grupo “incurred”•Elucidación estructural, Metabolómica, Biomarcadores.•Ultra high Resolution y



Elaboración BASE DE DATOS

•Base de datos para “Targeted” Análisis

- Establecer condiciones Cromatografia Liquida (LC/ UHPLC)

- Establecer condiciones Espectrometría Masas: General.

- Adquisición MS : Polaridad: + y –

- Conocer Fórmula molecular de los compuestos

•Añadir “Non-Targeted” compuestos:

- Conocer Fórmula molecular de los compuestos

•Completar toda la información posible: -Aductos

- Fragmentos

- Conocer Fórmula molecular de los fragmentos

RT

Ión molecular oIón diagnostico

Patrón Isotópico

Fragmentos

Iones adicionales

!!complejo¡¡



Elaboración BASE DE DATOS

Isótopos, aductos, fragmentos…

Fórmula empírica neutra



BASE DE DATOS



Lista de Targeted Compuestos y Familias

TETRACICLINAS: Epi-tetraciclina, Tetraciclina, Epi-oxitetraciclina, Oxitetraciclina, Epi-clortetraciclina, Clortetraciclina, Doxiciclina.PENICILINAS: Amoxicilina, Ampicilina, Penicilina G, Penicilina V, Oxacilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Nafcilina.CEFALOSPORINAS: Cefalexina, Ceftiofur, Desfuroylceftiofur, Cefoperazona.QUINOLONAS: Ac. Oxolínico, Flumequina, Danofloxacina, Ciprofloxacina, Enrofloxacina, Difloxacina.SULFONAMIDAS: Sulfatiazol, Sulfapiridina, Sulfametoxipiridazina, Sulfametazina, Sulfaquinoxalina, Sulfadimetoxina, Sulfadiazina, Sulfamerazina, Sulfacetamida.MACRÓLIDOS: Tilosina, Eritromicina, Tilmicosina, Espiramicina, Neospiramicina, LINCOSAMIDAS: Lincomicina

PATRONES INTERNOS: Demeclociclina, Penicilina G-D7, Amoxicilina-D4, Norfloxacina-D5, Roxitromicina, Sulfadimetoxina-D6



1g muestra homogeneizada en tubos de 50

mL

UHPLC-HRMS. Orbitrap ExactiveTM

Filtrar por 0.2 µm PTFE

100 µL ISTDs+ 2 mL H2O ultrapura

+ 8 mL ACN

Agitar 10 min

centrifugar 5000 rpm, 5 minPasar el extractoa tubo

con 0.5 g de C18 y agitar 5 min.

Pasar el extractoa tubo de 15 ml y evaporar a sequedad 45ºC con N2

centrifugar 5000 rpm, 5 min

1000 µL 0.1% HCOOH:MeOH

(90:10)

ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS EN TEJIDO ANIMAL POR UHPLC‐

HRMS



Sistema LC:Autosampler: Accela Open ASUHPLC: Accela 1250 pump

Condiciones LC

Composición fase móvil: Fase móvil A: HCOOH 0.1%

Fase móvil B: Metanol (0.1% HCOOH)

Columna: Kinetex C18 XB (100 x 3.00 mm, 2.6 µ)

Modo Elución: Gradiente

Flujo: 400 µL/min

Volumen inyeccion: 10 µL

Condiciones HRMS

Sistema HRMS:Interfase: HESI IIAnalyzer: Orbitrap ExactiveTM

Automatic gain control : 106(Balanced) AGC

Resolving power (FWHM): 50.000 (High)

Switching polarity, mass range (m/z):

positive mode: 80-1200

negative mode: 80-1200

Spray voltage: 3.0 kV(+); 2.5kV(-)

Sheath gas flow rate: 45

Auxiliary gas flow rate: 10

Skimmer voltage: 20 V

Heater temperature: 225 ºC

Capillary temperature: 260 ºC

Capillary Voltage: 40V

Tube lens voltage: 110V

686M_LQ2 #87 RT: 1.00 AV: 1 NL: 4.19E6T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

268.13986

349.05368

229.15434

248.14877213.12303150.05807

175.00140 259.09335241.12912

288.16614159.02751204.12271

273.08392219.13354

308.09061187.10741162.11221 336.22757193.00163 318.16562

CONDICIONES LC-HRMS. Orbitrap ExactiveTM




VALIDACIÓN

• Decisión 2002/657/CE:

•Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: •Especificidad/Selectividad

•CCβ

•Cut-Off level

•Cut-off factor Fm

•Threshold value T



Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: (20/1/2010)(compuestos con MRL)

•Habla de Validación Abreviada por Laboratorio Receptor. Indica Requisitos para el Laboratorio Receptor.•Screening Target Concentration (SCT): Concentración a partir de la cual el resultado del screening es “Positivo”. Debería ser ½ MRL.

•CCβ o Detection Capability: Contenido mínimo de un analito que podría ser detectado, identificado y/o cuantificado con una probabilidad de error de β. (βerror: probabilidad de falso negativo. Debe ser < 5 %). CCβ ≤ MRL

•Cut-Off level: Respuesta que indica que un analito está presente a la Screening Target Concentration o por encima de ésta.

•20 muestras blanco+ 20 muestras adicionadas a STC: si STC ≤ ½ LMR

•Cut-Off Level: Respuesta más baja de las muestras adicionadas a STC.

•Cálculo Threshold value T y Cut-off factor Fm

•SCT=CCβ si falsos negativos ≤ 5 %



Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: (20/1/2010)(compuestos con MRL)

• Threshold value: T

donde, B = respuesta rel. media en los blancos

SDb= desviación Standard de esas respuestas

• Cut-Off factor: Fm

Según Decisión 202/657/CE CCβ está validado si:Fm > B

Además, si Fm > T, nº falsos positivos < 5%

T=B+(1.64 x SDb) Fm=M-(1.64 x SD)

Cálculo T y Fm

donde, M = respuesta rel. media en las muestras adicionadas a STC

SD= desviación Standard de esas respuestas



Validación Antibióticos Músculo y Riñón

Músculo

Riñón

Selección de Blancos: Procedentes de muestras “negativas” al Test de las 5 placas. Positivas a: Tetras, QNs, Penic, Sulf, Macr

Estudios previos: Se estimó experimentalmente Screening Level Concentration : 20 µg/Kg (Excepto: 13 µg/Kg PenG, AMX, AMP, TILM, y 6 µg/Kg PenV)En todos los casos: ≤ ¼ LMR

20 muestras Blanco (3 bovino, 3 ovino, 4 ave, 4 conej, 1 equi, 1 porcino)

20 muestras adicionadas a SLC

20 muestras Blanco (4 bovino, 9 ovino, 7 porcino)

20 muestras adicionadas a SLC



Ejemplo Validación Enrofloxacina Músculo

T=B+(1.64 x SDb)

T=0,005+(1.64 x0,016)=0,031

Fm=M-(1.64 x SD)

Fm=1,664+(1.64 x0,416)=0,982

Fm>B

Fm>T

VALIDADO

SCREENING TARGET CONCENTRATION 20 µg/Kg

Cut-Off level

CCβ= 20 µg/Kg



Ejemplo Validación Enrofloxacina Riñón

SCREENING TARGET CONCENTRATION 20 µg/Kg

T=B+(1.64 x SDb)

T=0,000+(1.64 x0,000)=0

Fm=M-(1.64 x SD)

Fm=2.255+(1.64 x0,471)=1.483

Fm>B

Fm>T

VALIDADO

CCβ= 20 µg/Kg

Cut-Off level



Validación. Blanco Músculo Ave y adición al CCβ.

BlancoRT: 2.00 - 9.00

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)

0

50

1000

50

1000

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance 0

50

1000

50

100 RT: 3.27

RT: 2.13

RT: 5.46

RT: 5.65

RT: 6.77

RT: 3.02 RT: 3.32

RT: 3.32

RT: 3.13

RT: 5.23

RT: 4.33

RT: 8.03RT: 6.60RT: 2.15 RT: 2.61

NL: 2.91E4m/z= 215.03773-215.05923 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221





NL: 1.47E4m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221

RT: 2.00 - 9.00

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)

0

50

1000

50

1000

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance 0

50

1000

50

100RT: 2.98

RT: 3.28

RT: 3.12

RT: 5.37RT: 5.65

RT: 4.19

RT: 3.34RT: 2.93 RT: 7.77

RT: 3.32

RT: 5.00RT: 4.77RT: 3.62

RT: 3.94

RT: 5.19RT: 4.24 RT: 7.74 RT: 7.93RT: 7.36

RT: 2.65

NL: 6.40E4m/z= 215.03773-215.05923 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221





NL: 9.78E4m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221

Adición CCβ

Sulfacetamida

Amoxicilina

Ampicilina

Espiramicina

Ciprofloxacina

Penicilina V



Validación. Blanco Riñón Bovino y adición al CCβ.

Blanco Adición CCβ

Sulfacetamida

Amoxicilina

Ampicilina

Espiramicina

Ciprofloxacina

Penicilina V

RT: 2.00 - 9.00

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)

0

50

1000

50

1000

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance 0

50

1000

50

100RT: 4.75

RT: 2.67RT: 3.57

RT: 3.93RT: 2.09 RT: 5.26RT: 2.83

RT: 3.13 RT: 5.69RT: 4.77

RT: 4.46

RT: 3.11

RT: 5.97

RT: 5.17

RT: 4.35

RT: 5.36RT: 3.34

RT: 5.92

RT: 5.91

RT: 7.58

RT: 3.78RT: 3.61 RT: 4.45RT: 2.96






NL: 1.84E5m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_2884

RT: 2.00 - 9.00

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)

0

50

1000

50

1000

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance 0

50

1000

50

100RT: 4.74

RT: 3.56 RT: 3.92RT: 2.67

RT: 5.67

RT: 4.71

RT: 3.10

RT: 5.42

RT: 5.96

RT: 5.74

RT: 3.33RT: 5.36

RT: 5.88RT: 4.74

RT: 5.90

RT: 4.39RT: 3.76RT: 2.97






NL: 1.63E5m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2884



Interpretación resultados

IDENTIFICACION(Validación)

CONFIRMACIÓN

•RT o RRT

•Masa exacta [M+H]+ o [M-H]-

(mass window 5 ppm)

•RT o RRT

•Masa exacta [M+H]+ o [M-H]-

•Patrón Isotópico

•Aductos

•Fragmentos (HCD)

(mass window 5 ppm)

•RIA (Relative Isotopic Abundance)



RT: 2.51 - 6.01 SM: 7G

2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

ENROFLOXACIN

RT: 4.33AA: 531429

NL: 1.05E5m/z= 360.16999-360.17359 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 621M

355 360 365 370 375 380 385m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

360.17114C 19 H23 O3 N3 F

-1.81500 ppm

378.16541361.17456 385.24396357.21405 364.18552 389.18121382.15298

359.22827

366.10559 379.16885352.63034 376.19733370.05508 387.21664

360.17180C 19 H23 O3 N3 F

0.00000 ppm

361.17515

362.17851 365.18611

NL:1.73E5621M#383 RT: 4.33 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]

NL:7.98E5C 19 H22 FN3 O3 +H: C 19 H23 F 1 N3 O3pa Chrg 1

Muestra Músculo ave

350 355 360 365 370 375 380 385 390m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

360.17102C 19 H23 O3 N3 F

-2.15393 ppm

361.17453382.15259362.20633 378.16489 385.24384 389.18030369.11145357.21356 377.22806353.67056 380.61691373.24225

360.17180C 19 H23 O3 N3 F

0.00000 ppm

361.17515

362.17851 366.18946

NL:1.54E5E20_M1#383 RT: 4.33 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]

NL:7.98E5C 19 H22 FN3 O3 +H: C 19 H23 F 1 N3 O3pa Chrg 1

RT: 2.50 - 6.00 SM: 7G

2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 4.33AA: 539456

NL: 9.88E4m/z= 360.16999-360.17359 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E20_M1

Músculo ave adicionado20 ppb

APLICABILIDAD. Ej. ENROFLOXACINA

Patrón Isotópico Teórico

Patrón Isotópico Experimental

Area Ratio 0.618

Area Ratio 0.725

Screening positiva

C19H22FN3O3



460 462 464 466 468 470 472 474 476 478m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

461.15454C 22 H25 O9 N2-1.98574 ppm

462.15814

467.17593464.22525 474.29178460.73221

461.15546

462.15881

463.16217 465.16641 467.17066 469.17490

NL:9.76E4937R#363 RT: 4.13 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]

NL:7.64E5C 22 H24 N2 O9 +H: C 22 H25 N2 O9pa Chrg 1

APLICABILIDAD. Ej. OXITETRACICLINART: 3.00 - 5.04 SM: 7G

3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 4.13AA: 448422

RT: 3.88AA: 20383

NL: 7.57E4m/z= 461.15315-461.15777 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 937R

RIÑÓN OVINO Screening positivoOTC

460 462 464 466 468 470 472 474 476m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

461.15527C 22 H25 O9 N2-0.39751 ppm

462.15814

467.17828470.27286468.18134

461.15546

462.15881C 21 13C H25 O9 N2

0.00000 ppm

463.16217 465.16641 467.17066 469.17490

NL:8.78E4E40_R1#365 RT: 4.14 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]

NL:7.64E5C 22 H24 N2 O9 +H: C 22 H25 N2 O9pa Chrg 1

RT: 3.00 - 5.04 SM: 7G

3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 4.14AA: 281656

RT: 3.89AA: 93937

NL: 5.08E4m/z= 461.15315-461.15777 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E40_R1

RIÑÓN PORCINOadicionado20 ppb

Area Ratio 5.699 OTC

Area Ratio 1.926 Epi-OTC

Area Ratio 6.690 OTC

Area Ratio 0.303 Epi-OTC

Confirmación OTC

C22H24N2O9

Patrón Isotópico Experimental

Patrón Isotópico Teórico



Criterios Confirmación Decisión 2002/657/CE

•Define alta resolución en masas: > 20000 FWHM

•Full Scan : Iones diagnóstico: ión molecular, iones aductos, iones fragmentos e iones isótopos con Intensidad Relativa > 10%.

•Criterios Tolerancias Intensidades Relativas: Tabla 4 Decisión

•Full Scan: Mínimo de 4 iones diagnóstico (>10%). ¿También en HRMS?

•HRMS: 2 IPs / ión

•Tabla 6: HRMS: nº de iones : N ; nº de IPs: 2N

•4 IPs grupo A y 3 IPs grupo B

Faltaría revisar y/o incluir :

-Criterio RRT para UHPLC - Full Scan: nº iones diagnóstico HRMS

-Criterio Masa exacta (¿5 ppm?) - Criterio para Pseudo-fragmentación

-Criterio para Patrón Isotópico



RT: 5.00 - 8.00 SM: 7G

5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0Time (min)

0

50

100

0

50

100

0

50

100

0

50

100

RT: 6.22AA: 34820

RT: 6.22AA: 246418

RT: 7.33AA: 18782

RT: 6.82AA: 6420

RT: 6.22AA: 38182

RT: 6.22MA: 5887

NL: 4.69E3m/z= 524.03366-524.03890 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS LQ_2001



NL: 7.62E2m/z= 396.04111-396.04507 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS LQ_2001

RT: 5.00 - 8.00 SM: 7G

5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0Time (min)

0

50

100

0

50

100

0

50

100

0

50

100

5.30

7.407.53

7.947.216.22 6.986.796.385.87 6.03

5.21 5.575.15 5.40

6.826.41 6.985.90 7.21 7.626.09 7.46 7.816.63

NL: 0m/z= 524.03366-524.03890 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2186

NL: 2.66E3m/z= 241.03778-241.04020 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS BM_2186

NL: 1.68E3m/z= 285.00963-285.01249 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2186

NL: 0m/z= 396.04111-396.04507 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS BM_2186

CEFTIOFUR

C9 H

9 N4 O

3 S2 +

285.01106

396.04309

C14H14N5O5S2+

C8H9N4O3S+

241.03898

C19H18N5O7S3+

CEFTIOFUR

524.03628

Fragmentación: sin selección Ión Precursor

Riñon porcino Blanco

Riñon porcino adicionado 20 ppb



“Post-targeted” analisis. Pirlimycin

Grupo Lincosamidas

C17H31ClN2O5S Masa Exacta: 410,16367

[M+H]+ Masa Exacta: 411,17149



411.0 411.5 412.0 412.5 413.0 413.5 414.0 414.5m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Relative Abu

ndan

ce

411.16962C 17 H32 O5 N2 Cl S

-4.57296 ppm

413.16653C 17 H32 O5 N2 37Cl S

-4.87076 ppm412.17313C 16 13C H32 O5 N2 Cl S

-4.18644 ppm 414.17035C 16 13C H32 O5 N2 37Cl S

-3.74855 ppm413.26453 413.69876411.17150

C 17 H32 O5 N2 Cl S0.00000 ppm

413.16855C 17 H32 O5 N2 37Cl S

0.00000 ppm412.17485C 16 13C H32 O5 N2 Cl S

0.00000 ppm 414.17190C 16 13C H32 O5 N2 37Cl S

0.00000 ppm

NL:1.26E64865A#507 RT: 5.80 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]

NL:5.85E5C 17 H31 ClN2 O5 S +H: C 17 H32 Cl1 N2 O5 S 1pa Chrg 1

RT: 5.50 - 8.00

5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0Time (min)

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Relative Abu

ndan

ce

0

20

40

60

80

100RT: 5.80

RT: 7.80RT: 7.41RT: 5.80

RT: 6.36RT: 5.80

RT: 7.64RT: 7.45RT: 6.47RT: 6.03 RT: 6.24RT: 5.55RT: 5.80

RT: 6.50RT: 6.17 RT: 7.77RT: 6.64 RT: 7.38RT: 6.94RT: 5.62 RT: 7.06

NL: 1.26E6m/z= 410.67-411.67 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 4865A




“Post-targeted” analisis. Pirlimycin. Músculo Bovino.

[M+H]+

[M+1]+

[M+2]+

[M+3]+



Conclusiones

•El método propuesto es adecuado como método de screening cualitativo para el control de antibióticos en tejido animal.

•Se ha validado con criterios de identificación: RRT y Exactitud masa < 5 ppm

•Para todos los analitos y ambas matrices se cumple Fm>B y Fm>T

•El uso de Alta Resolución en masas y masa exacta confiere una alta selectividad.

•CCβ obtenido es 20 µg/Kg para todos los analitos excepto AMX, AMP, PENG, TILM (13 µg/Kg) y PEN V (6 µg/Kg)

•Información Patrón Isotópico, RIA, aductos y fragmentos le confieren caracteristicas de método de confirmación. Necesaria Revisión Decision 2002/ 657/CE

• Posibilidad de análisis retrospectivo: “Post-Targeted”

• Posibilidad de elucidación estructural y estudio biomarcadores: “Non-Targeted”

• Si picos cromatográficos muy estrechos (UHPLC): pocos scans/pico



Perspectivas

• Mucho trabajo por hacer. Esta tecnología tiene un gran potencial en la identificación y confirmación de moléculas.

• Estudiar inclusión aminoglucósidos.

• Desarrollar mismo método para MS/MS (Triple Cuadrupolo) Hasta Actualización Decisión 657. Estudio Estrategia confirmación.

• Completar la Base de datos a todos los Antibióticos de interés incluyendo Fragmentos. Estrategia “Post-Targeted” Análisis.

• Estudiar comportamiento de Patrón Isotópico en distintas matrices.

• Actualmente se ha finalizado la validación de un método de Screening cuantitativo para análisis de 86 compuestos en piensos: β-agonistas, hormonas, corticosteroides, tranquilizantes, nitroimidazoles, anfenicoles, micotoxinas, toxinas de plantas, alcaloides del ergot, carbadox, olaquindox, virginiamicina y otros.



Publicaciones HRMS Res. Medicamentos Veterinarios

•Residuos en piensos: En fase de elaboración.

> 100 compuestos



GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN

e-mail: [email protected]

análisis antibióticos uhplc hrmseurolab.org.es/newsletter/junio2014/10.z.05.pdf · 2014. 6....

Documents