ANEXO IV

JACUMAR JUNTA NACIONAL ASESORA DE CULTIVOS MARINOS

PLANES NACIONALES DE CULTIVOS MARINOS

INFORME FINAL Anexo Informes CCAA

CANTABRIA

Título: OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO Y MANEJO DEL ERIZO DE MAR

PLAN NACIONAL DE CULTIVOS MARINOS

CERIMAR 2010-2013

Título: Optimización del Cultivo y el Manejo del Erizo de mar

COMUNIDAD AUTÓNOMA DE CANTABRIA

Informe final 2013

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Financiado por:

Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos (JACUMAR). Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente

Servicio de Pesca. Consejería de Ganadería, Pesca y Desarrollo Rural. Gobierno de Cantabria

También ha colaborado en la financiación The Association of European Marine Biological Laboratories (ASSEMBLE)

Equipo de trabajo:

Grupo de Ecología. Dpto. de Ciencias y Técnicas del Agua y del Medio Ambiente de la Universidad de Cantabria Investigador responsable Dr. Juan Carlos Jordana Canteras

Investigadores colaboradores:

Lcda. María Segovia Viadero Dpto. de Ciencias del Mar y Biología Aplicada de la Universidad de Alicante Dra. Mercedes González- Wangüemet Centro de Ciencias del Mar (CCMAR). Dpto. de Ecología Marina y Evolución de la Universidade do Algarve, Faro, Portugal

ANTECEDENTES

Debido a la sobrepesca, los stocks de erizos y mas concretamente del erizo común Paracentrotus lividus, han mermado en Europa hasta su práctica desaparición en algunas pesquerías. Tradicionalmente se han tomado medidas para frenar la sobrepesca, como es la aplicación de tallas mínimas, épocas de veda o planes de explotación que regulan la extracción en determinadas zonas. En la actualidad, las nuevas tecnologías desarrolladas en acuicultura han hecho posible la implementación de medidas complementarias que potencian la recuperación de los stock afectados, como son los planes de mejora de stocks y/o repoblación.

OBJETIVOS

Nuestros objetivos generales, en la CA de Cantabria, son el diseño de sistemas de marcaje y métodos de control para las repoblaciones y su posterior utilización para valorar la incidencia de las repoblaciones con juveniles de erizo procedente de criadero en las poblaciones naturales.

Para cumplir con esos objetivos hemos llevado a cabo durante los años 2010, 2011 y 2012 distintas experiencias de marcado y recaptura de juveniles criados en cautividad del erizo de mar P. lividus primero para testar los distintos marcadores y posteriormente para evaluar el éxito de las repoblaciones aplicando aquellos marcadores que consideramos como válidos. En el año 2012 se incorporaron también en el proyecto aspectos genéticos.

Debido a la finalización del proyecto un año antes de lo previsto por falta de financiación no se han podido realizar algunas actividades previstas para completar nuestro trabajo. Creemos necesario realizar estudios adicionales en los próximos años no solo para evaluar el éxito sino también el impacto genético de las repoblaciones en las poblaciones naturales.

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USO DE MARCADORES FÍSICOS Y QUÍMICOS EN REPOBLACIONES CON JUVENILES DE CRIADERO DEL ERIZO DE MAR Paracentrotus lividus EXPERIENCIA DE MARCADO Y RECAPTURA 1: Testando diferentes métodos de marcaje para repoblaciones con juveniles de erizo de criadero

MATERIAL Y MÉTODOS

Establecimiento de contacto y adquisición de los erizos juveniles

El primer paso en el desarrollo de este trabajo fue el establecimiento de contacto con los centros de cultivo participantes con objeto de conocer la disponibilidad de juveniles de P. lividus. Los criaderos más cercanos y que mantenían stocks de cultivo susceptibles de ser utilizados para nuestra experiencia de marcado y recaptura fueron el Centro de Cultivos Marinos en Ribadeo, Lugo (CIMA en adelante), y el Centro de Experimentación Pesquera en Castropol, Asturias (CEP en adelante). Ambos criaderos CIMA y CEP nos suministraron un total de 511 erizos juveniles. El conjunto de erizos mostró un diámetro medio de 17.84 ± 1,84 mm y una aceptable homogeneidad de tallas, con la mayor parte de los erizos agrupados entre los 15 y los 21 mm de diámetro. Aunque los erizos proporcionados por ambos centros mostraron diferencias estadísticamente significativas en sus diámetros medios (T-Student, p<0.01), estas diferencias se consideraron de relevancia biológica nula al ser de <2 mm (Figura 1), y se trataron ambos grupos de manera homogénea.

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Figura 1. Distribución de tallas de los erizos juveniles proporcionados por el por el Centro de Cultivos Marinos de Ribadeo (Galicia, figura superior) y del Centro de Experimentación Pesquera del Principado de Asturias (figura inferior).

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Diseño del sistema de marcaje, ¿Químico o físico?

Se establecieron los siguientes criterios utilizados previamente por Ellers y Jonhson (2009) para evaluar los distintos sistemas de marcaje existentes: 1) Marcado de muchos animales simultáneamente 2) y de todos los tamaños, 3) larga duración de las marcas, 4) alto porcentaje de retención, 5) alto porcentaje de marcas, 6) no causar mortalidad o causar muy poca mortalidad, 7) poco efecto en el crecimiento o en la producción gonadal. y también tres características adicionales: 8) que posibilite la realización de mediciones del crecimiento, 9) marcas únicas 10) verse externamente. La realización de marcas en erizos presenta algunas dificultades intrínsecas que hace que no exista un método totalmente satisfactorio para este tipo de organismos (Duggan y Miller, 2001). Se podrían diferenciar dos grandes grupo de marcadores:

• Marcadores externos: Etiquetas más o menos visibles desde el exterior unidas a las espinas, atadas al caparazón o incorporadas al erizo mediante pequeños orificios en el caparazón como son los implantes de plástico visibles (VIE). Presentan la ventaja de permitir el seguimiento visual, pero son muy invasivas y poco duraderas.

• Marcadores internos. Hay dos grupos diferenciados: 1) fragmentos de alambre codificados (o Coded Wire Tags - CWT) y microchips (o PITs - transmisores pasivos integrados). Se introducen a través de la membrana peristomial del erizo y se localizan con un detector de metales y 2) marcadores fluorescentes. Son fluorocromos que se unen a las estructuras óseas en la zona de calcificación, y que emiten en colores fluorescentes (dependiendo del fluorocromo) cuando se ve bajo luz azul o ultravioleta.

Estos últimos marcadores, los fluorocromos, cumplen ocho de los diez criterios descritos anteriormente mejor que las demás metodologías (Ellers y Jonhson, 2009), siendo así los marcadores que consideramos mas idóneos. El marcaje con fluorocromos, tales como la tetraciclina y la calceina, es una valiosa herramienta para el seguimiento y control de las repoblaciones. Ambos fluorocromos, se usan desde hace décadas para el marcaje de animales marinos incluyendo peces, moluscos, equinodermos y gusanos nemertinos (Stricker, 1985; Stricker, 1985; Wilson

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et al., 1987; Day et al., 1995; Stewart, 1996; Kaehler y McQuaid, 1999; Purcell el al., 2006, Purcell y Simutoga, 2008). La USFDA (US Food and Drug Administration) permite su utilización para marcar animales destinados a consumo humano. La metodología óptima para su administración y la eficacia del marcaje varían entre taxones. En erizos de mar se han usado extensamente ambos, tetraciclina y calceina (Russell et al., 1998; Russell, 2000; Russell y Meredith, 2000; 18 estudios citados en Ebert 2001; Dumont et al., 2004; Russell y Urbaniak, 2004). Únicamente, si se requieren marcas únicas o el reconocimiento de la marca externamente, es mejor utilizar marcadores físicos como los VIEs, PITs o CWTs (Haggen, 1996; Woods y James, 2005). Las marcas VIE y PIT tienen el inconveniente de que no se pueden usar en erizos menores de 25mm de diámetro (Ellers y Jonhson, 2009). De hecho, solo se pueden usar en juveniles de erizo los fragmentos de alambre codificados o CWTs y únicamente si el diámetro de los mismos supera los 15 mm (De la Uz et al., 2008). Resumiendo, los métodos potenciales de monitoreo para las repoblaciones con juveniles de erizo pueden ser los marcadores químicos o fluorocromos o el marcadores físico CWT.

Marcaje con el fluorocromo tetraciclina

En esta primera experiencia de marcaje con fluorocromos se decidió usar la tetraciclina por ser el más empleado en la bibliografía, si bien en futuros experimentos no se descarta el empleo de otros fluorocromos como la calceina. Para el marcaje con tetraciclina se inyectó (Figura 2) a la mitad de los juveniles de ambos centros una solución de tetraciclina compuesta por 1 g de sustancia por cada 100 ml de agua de mar. Figura 2. Imagen del proceso de

marcado mediante inyección de tetraciclina.

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El peso medio de los erizos de mar procedentes del CIMA fue de 1.97 ± 0.93 gramos, mientras que los erizos procedentes del CEP tuvieron un peso medio de 3.21 ± 0.79 gramos. Debido a estas diferencias en peso, las dosis suministradas fueron distintas. Mientras que a los erizos del CIMA se les inyectó 0.05 ml de agua de mar con tetraciclina, a los erizos del CEP se les inyectaron 0.1 ml de esta solución. La dosis final aproximada por erizo vario por lo tanto entre 48.10 mgkg-1 y 25.00 mgkg-1, valores dentro del rango de 11-286 mgkg-1 empleado en otros trabajos (Turon et al, 1995; Russel et al, 1998; Purcel et al, 2006).

Marcaje con CWT

En la otra mitad de juveniles se inyectó el marcador CWT suministrado por el CEP y consistente en un fino alambre imantado de 0.25 mm de diámetro (Figura 3, ver http://www.nmt-inc.com/products/cwt/cwt.htm para más información). Este marcador había sido empleado anteriormente por el CEP con buenos resultados.

Figura 3. Imagen del marcador (imagen A) y del detector (imagen B) CWT.

B A Tras el marcado, los erizos se mantuvieron en cultivo durante un mes, para facilitar la adaptación de los juveniles a la marca.

Elección de la zona de estudio

Una vez establecida la disponibilidad de juveniles y habiendo marcado los mismos se comenzó a planificar el desarrollo de la siembra. En primer lugar se eligió la zona de trabajo. La experiencia previa del Grupo de Ecología en el estudio de las poblaciones naturales cántabras (González-Irusta, 2009; González-Irusta et al, 2010) favoreció la elección de la cala de “la Soledad”, situada en la localidad cántabra de Laredo (Figura 4, ver González-Irusta, 2009 para una descripción más extensa de la zona de estudio).

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Figura 4. Localización de la cala de La Soledad. En la imagen A se muestra una imagen aérea de la localidad cántabra de Laredo, mientras que en la imagen B se muestra en detalle la cala donde se realizó la siembra deerizos, junto con la zona donde se realizó la siembra, enmarcada en un rectángulo rojo.

La dinámica poblacional de esta cala ha sido estudiada durante más de tres años y además reúne unas condiciones de accesibilidad, hidrodinamismo y densidad de erizos idóneas para este tipo de trabajos. De manera previa a la realización de las siembras se realizó un muestreo para analizar la estructura poblacional de la población de erizos presente en la zona de estudio (Figura 5). Como se observa en la figura 5, la población de erizos presenta una distribución unimodal, dominada por erizos adultos con tallas comprendidas entre los 50 y los 70 mm de diámetro. Se trata de una población estable, que ha mantenido densidades constantes durante más de cuatro años. Además, no está sometida a explotación, por lo que no hay riesgo de que la extracción comercial reduzca drásticamente las poblaciones.

Figura 5. Distribución de tallas en la población de erizos de la cala de La soledad antes derealizarse las siembras. Las líneas rojas indican el porcentaje de erizos con tallas similares alas de los erizos sembrados.

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Liberación de los juveniles de erizo en el medio natural y recapturas La suelta de los erizos marcados se realizó el 16 de junio del 2010, en la cala elegida, La Soledad, en la localidad cántabra de Laredo. Se realizó en dos zonas diferenciadas:

• Una zona de charcos de marea. • Una zona submareal.

De los 511 erizos iniciales disponibles para el marcado, finalmente solo se dispuso de 440. La razón de esta reducción fue diversa e incluyó la mortalidad tras el marcado, la perdida de la marca y la necesidad de matar un nº determinado de erizos para comprobar la fijación de la tetraciclina.

74.12 %

21.57 %

4.31 %

0

Con marca Perdida de marcaMuertos Sacrificados

95.35 %

0.77 %

3.88 %

Con marca Perdida de marca

Muertos Sacrificados

Figura 6. Destino en porcentaje de los erizos marcados con tetraciclina (A) y con CWT (B).

Es importante destacar el elevado porcentaje de pérdida del marcador observada en los erizos a los que se les introdujo el alambre imantado. Este porcentaje fue muy superior en los erizos suministrados por el CIMA (29,23%) que en los erizos del CEP (13,6%). De los 440 erizos finales de los que se dispuso para realizar la siembra, 340 erizos se sembraron en la zona submareal (164 con alambre y 176 con tetraciclina), mientras que 100 se sembraron en la zona intermareal (75 con tetraciclina y 25 con alambre). El diámetro medio de los erizos sembrados fue de 18,69 ± 1,86 mm. La siembra submareal se realizó en las inmediaciones de una roca que emerge claramente durante la bajamar y que sirve como señalizador de la zona escogida. La extensión de esta zona es de aproximadamente de 5*20 metros, con una densidad aproximada de 2 erizos por metro cuadrado para tallas comprendidas entre los 15 y los 30 mm de diámetro. Por lo tanto, teniendo en cuenta que la zona de siembra tiene una extensión de unos 100 metros cuadrados y que la densidad media para la talla

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sembrada era de aproximadamente 2 erizos por metro cuadrado, los erizos marcados se añadieron a una población inicial aproximada de 200 erizos (con tallas similares a las de los erizos sembrados). De esta forma, en la zona submareal sembrada, la población marcada paso a ser de aproximadamente el 63% del total, de los cuales el 30% eran erizos marcados con alambre mientras que el 33% restante estaban marcados con tetraciclina. Las densidades iniciales en la zona intermareal no fueron medidas previamente a la liberación de juveniles, ya que está zona fue usada únicamente como un reservorio de ejemplares marcados y no tanto como una zona donde analizar la mortalidad. Los erizos se transportaron hasta la zona de siembra en bandejas plásticas y después fueron depositados en la zona de siembra uno a uno, en lugares apropiados para su supervivencia (Figura 7). Figura 7. Imagen de la siembra.

Debido a la escasa profundidad de la zona de estudio (con profundidades máximas de 2 metros), la siembra se hizo sin necesidad de utilizar equipo autónomo de buceo.

Se realizaron dos experiencias de recaptura; la primera 15 días después de realizada la siembra (el 1 de julio de 2010) con objeto de estimar la tasa de supervivencia tras la siembra (periodo crítico en este tipo de experimentos) y la segunda seis meses después (el 22 de diciembre de 2010). La recaptura fue realizada por dos miembros del Grupo de Ecología mediante buceo a pulmón libre, acompañados de un tercer miembro que se encargaba de almacenar los erizos muestreados y sacarlos a tierra para comprobar la presencia de la marca CWT con el detector. Además, de manera simultánea, miembros del Grupo de Ecología muestreaban la zona de intermareal con el detector de CWT y extraían erizos para el análisis de sus caparazones en el laboratorio. Tan solo se muestreaban erizos de tallas similares a las de los erizos sembrados. En el caso de la primera recaptura, esto fue sencillo, ya que apenas había transcurrido tiempo desde la siembra y por lo tanto la recaptura fue sencilla. Por el contrario, en la segunda recaptura, hubo que estimar las tallas aproximadas de los erizos sembrados. Para ello se emplearon los modelos de crecimiento desarrollados por González-Irusta

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(2009) mediante el seguimiento de cohortes de la población de erizos de esta misma cala. Como veremos en el apartado de resultados es posible que el crecimiento fuese subestimado, lo que pudo provocar el muestreo de tan solo una fracción de los erizos marcados.

B A

Figura 8. A) Imagen de dos investigadores del CEP en la cala de La Soledad durante la recaptura de erizos del 1-07-2010. El investigador de la izquierda extrae ejemplares del charco de marea para su posterior análisis en el laboratorio, mientras que el investigador de la derecha rastrea los charcos con el detector en busca de erizos marcados con CWT. B) Investigador del grupo de trabajo de la CA de Cantabria extrayendo erizos de la zona submareal. En la extracción se usaban un cuchillo para facilitar la liberación de los erizos más firmemente agarrados.

Una vez capturados los erizos eran llevados al laboratorio donde se procedía a su tratamiento. Una vez muertos se limpiaban el caparazón y la linterna de Aristóteles con lejía diluida al 5% (Turon et al, 1995). Tras retirar todos los restos de materia orgánica, se analizaba la presencia de tetraciclina exponiendo placas del caparazón a luz ultravioleta. Para ello, se utilizó un microscopio Leitz Lavorloux D con lampara de mercurio y el paquete de filtros leica L5 (fitro de excitación: BP 480/40, dicroico: 505, filtro de supresión 527/30).

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Figura 9. Pirámides de linterna de Aristóteles pertenecientes a dos juveniles de erizo P. lividus uno marcado con tretraciclina (arriba) y otro no marcado (abajo).

RESULTADOS

Se realizaron dos recapturas con resultados positivos en ambos casos, aunque la recaptura de individuos marcados se ha reducido de manera importante en el último muestreo. Del porcentaje inicial aproximado de 63% de erizos marcados dentro del rango de tallas sembrado, se pasó tan solo 15 días después a un 23,53% (12 erizos marcados de los 51 muestreados, Figura 10).

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

01/06/2010 01/08/2010 01/10/2010 01/12/2010

Figura 10. Evolución del porcentaje de ejemplares marcados en las distintas recapturas.

El siguiente muestreo no se realizó hasta unos seis meses después. Aunque lo ideal habría sido realizar algún muestreo más, el hecho de que sea necesario matar a los

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erizos muestreados para comprobar la marca de tetraciclina, unido al reducido número de erizos sembrados con marcas de tetraciclina (176 erizos) desaconsejó una mayor frecuencia. En la segunda recaptura, se recuperaron un 6,56% de erizos marcados con respecto al total de erizos recogidos (4 erizos con marca de 61). Este porcentaje revela una importante disminución de los erizos recapturados con marcas (Tetraciclina y CWT). Si analizamos la evolución de erizos recapturados marcados con los dos sistemas de marcaje por separado (Figura 11), podemos observar que en la primera recaptura fue mayor el porcentaje de erizos con CWT y en la segunda sin embargo, ocurrió lo contrario.

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

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70.00%

01/06/2010 01/08/2010 01/10/2010 01/12/2010

CWT Tetraciclina

Figura 11. Proporción de erizos recapturados rizos con marcas: tetraciclina y CWT.

El porcentaje de recaptura de erizos marcados con CWT se redujo desde un 15.69% en la primera recaptura a un 1.64% en la segundo (solo se recapturó un erizo con alambre), una reducción superior a la observada en los erizos marcados con tetraciclina, que paso de un 7,84% a un 4,92% en el segunda recaptura. Las diferencias observadas entre ambos marcadores son especialmente importantes si tenemos en cuenta que los erizos marcados con CWT perdieron la marca en un 21,57% de los casos durante el mes que pasaron en el laboratorio tras el marcado.

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Este trabajo se desarrolló para la puesta a punto de las distintas metodologías de marcaje y recaptura de erizos juveniles que podrán llevarse a cabo de manera más intensiva (con un mayor número de juveniles) en años posteriores. Ambos marcadores han demostrado ser metodologías validas en el marcaje de erizos juveniles y ambos han mostrado una series de ventajas y desventajas que se muestran en la Tabla 5.

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Tabla 1. Ventajas y desventajas de los marcadores testados

TETRACICLINA ALAMBRE IMANTADO (CWT)

VENTAJAS

- Permanente - Permite calcular crecimientos individuales - Permite observar la periodicidad de las marcas de crecimiento

- Se puede leer la marca sin matar al individuo. - Fácil y rápido - No afecta al crecimiento

DESVENTAJAS - Afecta al crecimiento - Es necesario matar al individuo para leer la marca - Detección compleja

- No es permanente (perdida de marca) - Limitaciones en el medio submareal (lector) - No permite calcular crecimientos individuales ni estimar la periodicidad de las marcas de crecimiento. – No se puede utilizar en juveniles <15mm

EXPERIENCIA DE MARCADO Y RECAPTURA 2: Evaluando el éxito de las repoblaciones con juveniles de erizo de criadero

MATERIAL Y MÉTODOS

Producción de juveniles�

En esta segunda experiencia de marcado y recaptura los juveniles de erizo fueron suministrados por el CIMA en dos lotes: un lote de aproximadamente 1000 erizos y un segundo lote de alrededor de 2000. El conjunto de erizos mostró un diámetro medio de 16.53 ± 1.52 mm, con la mayor parte de los erizos agrupados entre los 14 y 18 mm (valores mínimo 11.75 y máximo 20.50 mm).

Áreas de estudio

Se eligió nuevamente la cala de La Soledad, situada en la localidad cántabra de Laredo teniendo en cuenta el éxito en la experiencia de marcado-recogida realizada en el sublitoral rocoso de esta cala durante el 2010.

Además, se añadió en esta experiencia otra localidad; una extensa rasa intermareal conocida como “Llaranza”, en la base de los acantilados rocosos de Langre en el termino municipal de Ribamontán del mar (Figura 12). En esta rasa existen una gran cantidad de charcas intermareales en las que existe una importante riqueza biológica y donde abunda entre otras, la especie objeto de este estudio, el erizo de mar.

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Marcaje con un fluorocromo diferente a la tetraciclina, la calceina

Después de la experiencia 1, abandonamos la investigación siguiente con el marcador CWT por resultarnos menos práctico y presentar una menor retención de marcas. Además, tenía el inconveniente de no poder usarse en ejemplares <15mm (De la Uz., 2008). Decidimos continuar únicamente con los marcadores químicos. Sin embargo, en esta experiencia utilizamos calceina por varios motivos. La marca de la calceina tiene una fluorescencia mas luminosa (Figura 13); en holoturias se ha demostrado que marca mayor proporción de espículas que la tetraciclina. Además, por ser un fluorocromo diferente al usado en la primera experiencia se podría usar en la misma área de estudio. La dosis para inyección de calceina se expresa en mg Kg1 para ser comparable con la literatura de vertebrados. Nosotros hemos usado una dosis de 100 mg por Kg de peso. Esta dosis es la dosis máxima de calceina por inyección usada en equinodermos en otros estudios (11 a 100 mg .Kg1; Stewart 1996, Purcell 2006, Ellers and Johnson 2009).

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Figura 12. Localización de la rasa marina de Llaranza en la Bahía de Sanander

Figura 13. Pirámide de la linterna de Aristóteles de un juvenil de erizo marcado con calceina en esta experiencia de marcado y recaptura (arriba) y otra pirámide de un erizo sin marcar (abajo).

Liberación de juveniles de erizo en el medio natural y recapturas

Se liberaron 1066 juveniles de erizo el día 22 de febrero del 2011 en la misma área del sublitoral rocoso de la cala de la Soledad, en Laredo, donde se desarrolló la primera experiencia de marcado y recaptura. En esta nueva experiencia se llevaron a cabo un total de cuatro recapturas; la primera fue 15 días después de la suelta, una segunda a los tres meses, después a los seis meses y la última al año. En la primera recaptura se recogieron erizos de tallas similares a las de los erizos sembrados. Para las demás recapturas, hubo que estimar las tallas aproximadas de los erizos sembrados del mismo modo que se hizo en la experiencia 1; empleando los modelos de crecimiento desarrollados por González-Irusta (2009) mediante el seguimiento de cohortes de la población de erizos de esta misma cala. Con el fin de asegurarnos un éxito mayor en las recapturas a lo largo del tiempo (1 año y hasta 2 años) se decidió hacer una nueva experiencia mas controlada en distintas charcas intermareales. Se eligieron siete charcas intermareales de dimensiones muy similares (>2m2), separadas por una distancia que varía entre 50 y 500 metros, en una extensa rasa marina cercana a la localidad de Langre. Se liberaron un total de 200 juveniles de erizo en cada charca durante las bajamares de los días 30 y 31 de julio de 2011. En todas ellas, se realizó una primera recaptura a los 15 días después de realizada la siembra para estar seguros de la supervivencia de los juveniles de erizo una vez introducidos en el medio natural (periodo crítico en este tipo de experimentos). Posteriormente, se han capturado todos los ejemplares de erizo dentro del rango de talla que podrían haber alcanzado los juveniles introducidos. En primer lugar, se vaciaron tres charcas a los 180 días y posteriormente, a los 365 días dos charcas mas. Estaba previsto vaciar las dos últimas a los 730 días. Las recapturas fueron realizadas a pie (Figura 14), en días de mareas vivas en los que el coeficiente presentaba valores cercanos a 100.

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Figura 14. Vista panorámica de la rasa marina de Llaranza en Langre (arriba) e imágenes quemuestran en detalle sus charcas intermareales (abajo).

Los erizos capturados se llevaron al laboratorio. Una vez en el laboratorio, se retiraron las púas y se midieron sus diámetros (en mm) con un calibre. Las estructuras óseas (caparazones y aparatos masticadores) se limpiaron depositándolas en pequeños recipientes para bañarlas en lejía al 12% (NaHCl4) durante 30 minutos y se aclararon posteriormente con agua para retirar los restos de materia orgánica. Una vez secas, se almacenan en la oscuridad, para no perder la fluorescencia y a temperatura ambiente. Para detectar las marcas de calceina en las placas calcáreas del caparazón o en las pirámides del aparato masticador, se utilizó un microscopio Leitz Lavorloux D con lampara de mercurio y el paquete de filtros de Leica específico para la calceina -I3- (fitro de excitación BP 450-490:, dicroico 510:, filtro de supresion: LP 515).

RESULTADOS

En el submareal de la cala de La Soledad de Laredo hemos recapturado tan solo un erizo marcado después de seis meses (de 1066 juveniles que se liberaron) (Tabla 2). Al año no recuperamos ninguno.

Tabla 2. Número de juveniles del erizo P.lividus que formaron parte de las experiencias de marcado y recaptura en la cala de La Soledad de Laredo y en distintas charcas intermareales de la rasa marina de Llaranza en Langre.

Área de estudio

No. erizos liberados

No. días en el medio natural

No. erizos recapturados

No. erizos marcados

recapturados

Laredo 1066 180 61 1

Langre L1 200 180 86 8

Langre L2 200 180 56 17

Langre L3 200 180 28 3

En las charcas intermareales de la rasa marina de Llaranza, en Langre, hemos obtenido mejores resultados, recuperando un porcentaje de erizos marcados que oscila entre 1,5 y 8,5%. En algunos casos la intensidad de la marca ha disminuido con el tiempo pero se diferencia claramente (Figura 15).

Figura 15. Diferentes intensidades de la marca de calceina en las pirámides del aparato masticador de dos erizos diferentes liberados en la misma charca intermareal (a los 180 días).

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DISCUSIÓN

Los porcentajes de recaptura registrados en la bibliografía varían ampliamente en función del marcador empleado, el tipo de experimento, el tiempo transcurrido entre la siembra y la recaptura, el tamaño de los erizos marcados o el área de siembra utilizada (intermareal o submareal). Russel y Meredith (2000) marcaron un total de 553 ejemplares del erizo de mar Strongylocentrotus droebachiensis de un charco de marea en la costa de Maine (USA) y un año después realizaron la recaptura obteniendo 262 erizos marcados (57% del total). Aunque en nuestra experiencia en los charcos intermareales de la rasa marina de Llaranza no se llegaron a recuperar la mitad de erizos marcados, se obtuvo un porcentaje de recaptura de casi un 10% en una de las charcas (Tabla 2). Hay que tener en cuenta que tratamos de recuperar juveniles de erizo (de un tamaño dentro de un rango entre 12 y 30 mm) lo que lógicamente reduce la tasa de recaptura. La mortalidad natural en los juveniles es muy superior a la observada en los adultos (Sala y Zabala,1996; Sala, 1997; Guidetti, 2004, 2006; Hereu et al., 2005, Guidetti y Dulcic, 2007, Clemente et al., 2012) ya que son más sensibles a la acción de los predadores. Existe un estudio reciente (Clemente et al., 2012) que demuestra que los juveniles del erizo Strongylocentrotus purpuratus (y principalmente los <14mm de diámetro) son los mas afectados por la predación de uno de sus depredadores mas abundante el cangrejo Pachygrapsus crassipes. La talla, junto a otras mecanismos para escapar de los depredadores como la cubierta de espinas o el uso de refugios son sin duda importantes estrategias ecológicas que favorecen la supervivencia del erizo. El hecho de que los juveniles introducidos en las charcas se añadan a una población autóctona estable (en lugar de marcar los erizos que ya estaban en el medio como es habitual en la bibliografía) hace que los nuevos erizos deban competir tanto por el espacio (refugio) como por el alimento con los erizos que ya estaban presentes, lo que también puede dificultar su supervivencia. Además, estos juveniles han sido criados en cautividad, y puede ser que no se adapten al nuevo medio lo suficientemente rápido como para sobrevivir. En un área submareal amplia y con una densidad de erizos elevada, como es la estudiada en la cala de La Soledad, se necesitaría hacer un esfuerzo de muestreo aun mayor, que supondría coger todos erizos existentes en ese área y que no creímos conveniente en este caso, o realizar una siembra con un número mayor de erizos para poder evaluar el éxito de la repoblación a largo plazo. Hasta el momento no sabemos de la existencia de otros estudios en los que se evalue el éxito de repoblaciones con juveniles de erizo procedentes de criadero. Sin embargo, existe un estudio de marcado y recaptura muy interesante con juveniles de langosta de criadero (Agnalt, 2008) en el que se obtuvo una tasa de recaptura de juveniles

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marcados de 6% (Figura 16). Es importante resaltar que se liberaron un total de 128.000 ejemplares en el medio natural.

Figura 16. Recaptura total acumulada (%) de 128.000 juveniles de langosta Homarus gammarus liberados en las islas Kvitsøy, Noruega. Las siembras fueron llevadas a cabo entre 1990 y 1994.

BIBLIOGRAFÍA

Agnalt AL, 2008. Stock enhancement of European lobster (Homarus gammarus) in Norway; Comparisons of reproduction, growth and movement between wild and cultured lobster. Dr.� scient. Thesis, Department of Biology, University of Bergen, Norway.

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21

CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LOS STOCKS NATURALES Y DE CULTIVO DEL ERIZO DE MAR (Paracentrotus lividus) EN EL NORTE DE LA PENÍNSULA IBÉRICA

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestreo y extracción de ADN

Los ejemplares de P. lividus (50 individuos por localidad) se recolectaron de charcos intermareales o del submareal somero mediante buceo con escafandra autónoma o en apnea, dependiendo de la localidad. Dos de las localidades que se eligieron para este trabajo son bancos naturales de procedencia de los reproductores de los criaderos: Fisterra, del Centro de Cultivos Marinos de Ribadeo (CIMA en adelante) y Punta de la Cruz, del Centro de Experimentación Pesquera del Principado de Asturias. La tercera y última localidad, Laredo se encuentra en la CA de Cantabria donde se han realizado posteriormente repoblaciones experimentales (Figura 17). Además, el criadero CIMA nos facilitó 50 juveniles de su stock de cultivo.

Figura 17. Localización de los sitios de muestreo. Criadero CIMA; Bancos naturales en las Comunidades Autónomas de Galicia, Fisterra (GFI), Asturias, Punta de la Cruz (APC), y Cantabria, Laredo (CLA).

APC CLA

CIMAA GFI

De cada ejemplar se tomó una porción de tejido muscular de la linterna de Aristóteles (Figura 18), que se conservó en alcohol absoluto.

22

23

En el caso concreto del locus Pl-15 se modificó el ciclo, siendo de 95ºC durante 5 minutos, 8 ciclos de desnaturalización a 92ºC durante 45 segundos, anillado a la temperatura apropiada (Tabla 3) durante 45 segundos y extensión a 72ºC durante 45 segundos, otros 25 ciclos de desnaturalización a 92ºC durante 30 segundos, anillado a la temperatura apropiada durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos seguidos por cinco minutos de extensión final a 72ºC.

Se utilizó un termociclador 2720 (Applied Biosystems) programado para una temperatura inicial de desnaturalización a 95ºC durante 3 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 50 segundos, anillado a la temperatura apropiada (Tabla 1) durante 50 segundos y extensión a 72ºC un minuto seguido de cinco minutos de extensión final a 72ºC.

El volumen de la reacción de PCR fue 25 ul, con 1 ul de DNA, 2.5 ul de 10X buffer; 2.5-3.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.12 μm de cada primer (usando cebadores forward (F) marcados con los fluorocromos FAM (SIGMA) y HEX (SIGMA) (Applied Biosystems)); 1 U of Taq polymerase (Ecogen).

Después de la extracción del ADN, se procedió a la amplificación enzimática mediante PCR, utilizando los cebadores específicos de siete microsatélites, seleccionados en razón de su especificidad en cuanto a especie y a su nivel de polimorfismo: Pl-B, Pl-C, Pl-L, PI-T, Pl-Hist, Pl-15 y Pl-28 (Calderón et al., 2009a).

Amplificación de PCR y genotipado

La extracción de ADN se realizó según el protocolo de Sambrock et al., (1989). El ADN final se diluyó en diferentes concentraciones antes de ser utilizado para las PCRs, de acuerdo a la cantidad de ADN extraída. Estas diluciones estuvieron entre 1:50 y 1:400, aunque normalmente se utilizaron diluciones de 1:100 y 1:200.

Figura 18. Músculo de la linterna de Aristóteles en un erizo P. lividus.

24

Tabla 3. Caracterización de los 7 loci microsatélites.

Locus Referencia Secuencia repetida Secuencia de cebadores F y R (5´-3´) y fluorocromo usado en cebadores F

Tª anillamiento

(ºC)

Nº alelos

Rango de talla (bp)

Pl-B Calderón et al., (2009a) (TC)12 F: FAM-CCATCCTCTCTTGCGACTTC 54 25 178-240

R: ACGGGGTCTTGATGTCAGTT

Pl-C Calderón et al., (2009a) (AG)13AT(AG)7AT(AG)8 F: HEX-GCGGGTGTGTCCTGTAAAGT 54 35 273-413

R: GACAAGCAAAAAGTGGCACA

Pl-L Calderón et al., (2009a) (CT)5CC(CT)11 F: FAM-TATTGCGCATGAGTCAGCTT 56 34 151-267

R: CGACTATCACAGCTCGCATT

Pl-T Calderón et al., (2009a) (AG)11CG(AG)4 F: HEX-AAAGCGAGAACGGATGACTG 58 24 174-272

R: CTCTCCGTGTACGTCTGTCG

Pl-Hist Calderón et al., (2009a) AGT(AAT)2(GAT)4AAC(AGT)2 F: HEX-ATGCACAAACGGCTCTTTTC 57 34 310-408

AGCAGTACA(AGT)9CTAGTC(GTA)5 R: TTGCACGTTGTTCATTGTCA

Pl-15 Calderón et al., (2009a) (TC)24 F: FAM-ACCGCCCTTTAATCTGTCTC 57 33 100-174

R: GAGTGGCTACGAGAGAGTGG

Pl-28 Calderón et al., (2009a) (GT)2GG(GT)4GC(GT)26 F: HEX-TGTATGTTCGCTCGGACTTG 54 28 140-210

R: GTATTGCCACACGACTCTCG

Los productos de las PCRs fueron genotipados según los protocolos del Servicio de Biología Molecular (Centro de Ciencias Marinas, Faro, Portugal) en un secuenciador automático ABI Prism 3130 y se les asignó un tamaño de alelos usando el software Strand versión 2.4.59 (Figura 19).

Figura 19. Analisis de los microsatélites usando el programa Strand.

Análisis estadístico

Se calcularon las frecuencias alélicas, el número de alelos por locus y la heterocigosis esperada con desviación (He) y observada (Ho) con el programa Genetix v. 4.03 (Belkhir et al., 2004). También se calculó la riqueza alélica por locus y por localidad con la ayuda del programa ARLEQUIN v. 3.11 (Excoffier et al. 2005).

Las desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg se estimaron a partir de los valores FIS usando tests exactos con el software Genepop v.4.0.10 (Raymond and Rousset 1995, Rousset 2008). También se calcularon los valores Fis por localidad y locus estimando el valor exacto P con el método de la cadena de Markov. Además, cuando dichas desviaciones fueron significativas se utilizó el programa Micro-Checker v.2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) para comprobar la presencia de alelos nulos. Algunos autores han demostrado que la presencia de alelos nulos pueden llevar a una sobreestimación tanto de los valores de Fst como de distancias genéticas de Nei (Chapuis y Estoup, 2006), es por ello recomendable el uso de las distancias genéticas de Cavalli-Sforza que minimiza el efecto de la presencia de alelos nulos.

El equilibrio de ligamiento se testó para todos los pares de loci de acuerdo a Weir and Cockerham (1979) con tablas de contingencia bajo la hipótesis nula de independencia (P < 0.05).

La estructura genética espacial se estudió con varias aproximaciones estadísticas porque como los microsatélites son unos marcadores muy variables, se necesitan

25

distintas metodologías para detectar una mínima diferenciación genética significativa entre poblaciones.

En primer lugar, la diferenciación genética entre localidades se evaluó con el índice de diferenciación genética Fst (usando el estimador Θ de Weir y Cockerham,1984). Se testó la hipótesis nula de no diferenciación genética entre localidades mediante un análisis de permutaciones de individuos, usando Genetix v. 4.03. Usamos Genepop v.4.0.10 para corroborar la diferenciación genotípica (G-based) y génica para todos los pares de poblaciones. La corrección de Bonferroni (Rice, 1989) se aplicó a los casos de comparaciones múltiples para compensar el posible error de tipo I. En segundo lugar, las distancias de Cavalli-Sforza se calcularon entre pares de muestras (Cavalli-Sforza y Edwars, 1967). En tercer lugar, la estructura genética poblacional se examinó mediante el método de Pritchard et al., (2000) para datos multilocus con el programa Structure v.2.3. Cada K fue replicada 20 veces para 100.000 iteraciones sin ninguna información previa del origen de los individuos de las distintas muestras. Se escogió el valor de K que maximiza ∆K (Evanno et al., 2005), un estadístico basado en la tasa de cambio de la probabilidad de los datos entre valores sucesivos de K. Finalmente, las distancias genéticas se compararon también usando un análisis de componente principal (PCA) en las frecuencias alélicas de las muestras. Estos análisis se calcularon con el paquete (Chessel 1992) “ade4” del programa estadístico R (R development Core Team, 2007).

Considerando que la muestra CIMA procede de criadero, se testó la presencia de cuellos de botella. Estos pueden ser detectados por un descenso en el números de alelos y un exceso de heterocigosis. Para determinar si la población muestra un numero significativo de loci con exceso de heterocigosis, usamos los tests de Sign y Wilconxon (S-W) mediante el programa Bottleneck v 1.2.2. (Piri et al., 1999). Los cálculos se basaron en el modelo de alelos infinito (IAM) y el modelo en dos fases de mutación (TPM). El modelo TPM es el intermedio al modelo de permutación por pasos (SMM) y IAM. La mayor parte de los datos derivados de microsatélites se corresponden mejor con el modelo TPM que con los SMM y IAM (Di Rienzo et al, 1994).

Para evaluar la posible selección en la población de acuicultura y en las poblaciones naturales usamos LOSITAN v.1.0.0 (Antao et al. 2008) (http://popgen.eu/soft/lositan/). Este programa analiza la relación entre Fst y Heterocigosis esperada (He) para evaluar la neutralidad de microsatélites usando intervalos de confianza del 99%.

RESULTADOS

Diversidad genética y equilibrio Hardy-Weinberg

La tabla 2 muestra la variabilidad genética por locus, localidad y global para los 7 loci microsatélites analizados. El número total de alelos por locus varió entre 11 (Pl-28/CIMA) y 31 (Pl-15/Fisterra). La muestra procedente del criadero CIMA perdió 21

26

alelos que estaban presentes en todas las demás localidades. El número medio de alelos por locus osciló entre 15.3 (CIMA) y 22.9 (Fisterra). Todas las localidades mostraron alelos exclusivos, observándose el menor valor en CIMA (6). La heterocigosis esperada (He) varió de 0.80 (Pl-15/CIMA) a 0.98 (Pl-15/GFI). La media de la Ho fue de 0.05 (Pl-28/Punta de la Cruz) a 0.91(Pl-C/CIMA). En general, la menor diversidad genética (He, número total y medio de alelos y número de alelos exclusivos) se observó en la muestra procedente del criadero CIMA y la mayor en la localidad Fisterra.

Se observaron desviaciones significativas del equilibrio de H-W en todas las localidades (Tabla 4). Al analizar los loci por separado se observó desviación principalmente en 3 loci (Pl-Hist, Pl-B y Pl-28). El programa Micro-Checker detectó la presencia de alelos nulos en algunos loci pero nunca en todas las localidades. La presencia de alelos nulos podría ser problemática en la estimación de las distancias genéticas (Nei, 1978) y por esta razón se usaron las distancia de Cavalli-Sforza (Cavalli-Sforza y Edwars, 1967).

Tabla 4. Nivel de variación genética observada en los 7 loci microsatélites.

CIMA GFI APC CLA Locus (N=48) (N=48) (N=41) (N=48) Pl-T No. de alelos 16 20 21 19 Ho 0.7872 0.7813 0.9000 0.8780 He 0.8608 0.9292 0.9297 0.9230 Fis 0.0961 0.1747*** 0.0446 0.0610 Pl-L No. de alelos 15 24 22 26 Ho 0.8750 0.7391 0.8095 0.8919 He 0.8570 0.9116 0.9221 0.9288 Fis -0.0105 0.1998*** 0.1339** 0.0534* Pl-Hist No. de alelos 21 26 23 24 Ho 0.7500 0.7317 0.7895 0.6389 He 0.8519 0.9408 0.9245 0.9498 Fis 0.1334*** 0.2340*** 0.1591*** 0.3399*** Pl-B No. de alelos 14 17 16 19 Ho 0.4773 0.2821 0.2941 0.3438 He 0.8084 0.8738 0.8841 0.8989 Fis 0.4191*** 0.6842*** 0.6755*** 0.6273*** Pl-28 No. de alelos 11 18 13 12 Ho 0.1538 0.0769 0.0500 0.3846 He 0.8180 0.9201 0.9113 0.8935 Fis 0.8185*** 0.9195*** 0.9478*** 0.5960*** Pl-15 No. de alelos 16 31 26 20

27

Ho 0.5581 0.7568 0.6667 0.8889 He 0.7872 0.9627 0.9494 0.9287 Fis 0.3017 0.2270*** 0.3132* 0.0617 Pl-C No. de alelos 14 24 25 15 Ho 0.9063 0.8649 0.8889 0.6538 He 0.8394 0.9215 0.9128 0.7996 Fis -0.0639 0.0751*** 0.0403 0.2011*** Todos No. de alelos total 107 160 146 135

Alelos exclusivos

6 24 16 15

No. de alelos medios 15.2857 22.8571 20.8571 19.2857 Ho 0.6440 0.6047 0.6284 0.6686 He 0.8318 0.9228 0.9191 0.9032 Fis 0.2389*** 0.3575*** 0.3312*** 0.2784***

El análisis de desequilibrio de ligamiento no encontró evidencias de asociaciones no aleatorias entre ningún par de loci.

Diferenciación genética

La observación mas relevante es la clara diferenciación de la muestra del criadero CIMA con todas las demás siendo los valores de Fst alrededor de 0,05 y altamente significativos. El valor negativo entre Fisterra y Punta de la Cruz implica que las muestras de ambas localidades son muy similares y con un alto flujo génico (como indica el número de migrantes Nm) (Tabla 5). Además, Laredo mostró diferencias genéticas significativas con ambas localidades: Fisterra y Punta de la Cruz, aunque con valores Fst menores (de 0.003 a 0.008).

Tabla 5. Estimaciones multilocus de Fst (encima) y Número de migrantes (Nm) por generación (abajo).

Fst Localidades APC CIMA CLA GFI APC ------- 0.0537*** 0.0035* -0.0009 Nm CIMA 4.40 ------- 0.0540*** 0.0563*** CLA 71.54 4.38 ------- 0.0070* GFI 999999 4.19 35.34 -------

Se corroboraron los resultados anteriores usando las distancias Cavalli-Sforza (Tabla 6).

28

Tabla 6. Distancias genéticas (Cavalli-Sforza y Edwards, 1967) entre las muestras de P. lividus.

Distancias Cavalli-Sforza Muestras APC CIMA CLA GFI

APC 0.046* 0.033 0.026 CIMA 0.045* 0.048* CLA 0.032

Los resultados obtenidos del análisis basado en el modelo de agrupamiento fueron similares y confirmaron la existencia de diferenciación genética (Figura 20). El programa Structure sugirió un valor K=2 como el modelo que mejor describe la situación entre las 4 muestras, indicando así, la existencia de 2 grupos diferenciados: 1) la muestra procedente del criadero CIMA (verde) y 2) todas las demás muestras que corresponden a las 3 localidades del norte de la PI estudiadas: Fisterra, Punta de la Cruz y Laredo (rojo).

Figura 20. Análisis bayesiano de la estructura genética de las poblaciones estudiadas.

El análisis de componentes principales corroboró todos los resultados previos. Los dos ejes del PCA representaron casi el 80% de la varianza total. El PCA discriminó la muestra de CIMA con respecto a todas las demás (Figura 21). Las muestras de las localidades Fisterra y Punta de la Cruz fueron agrupadas en el segundo cuadrante.

29

Figura 21. Gráfico de ordenación de la frecuencia alélica de P. lividus basado en 7 loci microsatélite.

LOSITAN detectó un microsatélite bajo selección positiva Pl-28 y otro bajo selección balanceante Pl-T (Figuras 22 y 23) independientemente de la inclusión de todas las poblaciones o solo de las poblaciones naturales.

Fst /He

Markers Candidate balancing selection Candidate neutral Candidate positive selection

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00H e

-0.10

-0.09

-0.08

-0.07

-0.06

-0.05

-0.04

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

Fst

PIT

PIBPI28

PIC

Figura 22. Comparación del Fst y la heterocigosis esperada (He) en los 7 loci polimórficos de P. lividus para identificar outliers y candidatos potenciales de selección usando el programa LOSITAN. En este análisis se incluyeron todas las poblaciones.

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Fst /He

Markers Candidate balancing selection Candidate neutral Candidate positive selection

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00H e

-0.10-0.09-0.08-0.07-0.06-0.05-0.04-0.03-0.02-0.010.000.010.020.030.040.050.060.070.080.090.10

Fst

PITPIL

PI28

Figura 23. Comparación del Fst y la heterocigosis esperada (He) de los 7 loci polimorficos de P. lividus en las poblaciones naturales.

DISCUSIÓN

En general, los análisis ponen de manifiesto la existencia de diferenciación genética significativa entre el criadero y las poblaciones naturales. Se observó una reducción significativa en el numero de alelos de la muestra de cultivo (28, de los cuales 21 se encontraron en todas las demás localidades); esta pérdida de alelos podría indicar la existencia de cuello de botella, endogamia o ambos. Nuestros análisis detectaron la existencia de cuello de botella en la muestra del CIMA que podría explicar esa pérdida de alelos comunes. Además, se encontraron 6 alelos exclusivos en el criadero, los cuales pueden ser candidatos potenciales de introgresión en las poblaciones naturales.

Se encontraron diferencias genéticas también entre la localidad de Laredo y las localidades restantes (Fisterra y Punta de la Cruz). Dicha diferenciación no parece que se justifique por la distancia geográfica. El litoral más noroccidental de la Península (Cantabria y País Vasco) presenta ciertas peculiaridades comparado con el resto del Golfo de Vizcaya como son su reducida plataforma continental debida a varios cañones submarinos Cap Breton, Santander y Torrelavega, y su situación, la más protegida en el golfo. Además, las diferencias incluyen algunos parámetros medioambientales: temperatura, salinidad y corrientes (Díez et al., 2000; Lavín et al., 2004; Mason et al., 2005) que afectan directamente el establecimiento de una diversidad faunística y su evolución (Borja et al., 2004; Garmendia et al., 2009).

Sin embargo, las localidades de Fisterra y Punta de la Cruz son muy similares. El flujo génico entre ellas es tan alto que se puede considerar una única población. El sistema de corrientes que presentan las costas de Galicia posiblemente favorece la conectividad entre ambas localidades.

31

Los microsatélites usados en este trabajo mostraron altos niveles de polimorfismo en las localidades estudiadas. El número de alelos y los valores de heterozigosis observada y esperada fueron muy similares a los detectados previamente en las poblaciones del erizo de mar P. lividus del Noroeste Mediterráneo por Calderón et al. (2009).

Se detectó un exceso de homocigotos y valores Fis significativos para todos los loci (entre 0,24 y 0,36). Valores muy similares fueron registrados también en las poblaciones Mediterráneas estudiadas por Calderón y colaboradores (2009). Este desequilibrio podría explicarse por la presencia de alelos nulos, selección en contra de heterocigotos, efecto Wahlund, endogamia o una combinación de todos ellos. Los resultados obtenidos con Micro-Checker, no mostraron evidencia de una gran perdida de alelos ya que el exceso de homocigotos está distribuido homogéneamente entre todas las clases de tamaño de los alelos. Aunque, los alelos nulos podrían contribuir al exceso de homocigotos, teniendo en cuenta que no se observaron amplificaciones fallidas en los individuos examinados y que todos los loci presentaron coeficiente de endogamia significativo no parece que sean la causa principal de la desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg. Otros marcadores nucleares que se han usado en P. lividus anteriormente ya detectaron déficit de heterocigotos (ANT gene, Calderón et al., 2008 y bindin gene, Calderón et al., 2009b). Además se han obtenido resultados similares en otras especies de erizos de mar (McCartney el at 2004). En la opinión de Calderón y colaboradores la explicación más probable que explique dicho déficit es la existencia de una sub-estructura a nivel poblacional debida al apareamiento no aleatorio y posiblemente asociado al polimorfismo de un gen que codifica la proteína responsable en el reconocimiento de gametos (Palumbi 1999, Zigler 2008).

CONCLUSIONES

Nuestros resultados muestran una pérdida de diversidad genética en el stock de erizos de cultivo y una diferenciación genética importante con los stocks naturales. Además, existen dos poblaciones naturales diferenciadas: 1) Fisterra-Punta de la Cruz y 2) Laredo.

Recomendamos para las futuras repoblaciones o planes de mejora de stock usar un número más alto de reproductores y siendo estos siempre de la misma población en la que se pretenda repoblar o implementar los planes de mejora. Es necesario realizar estudios adicionales para evaluar el impacto genético de las mismas en las poblaciones naturales.

Idealmente el estudio genético debería planearse desde un principio, al mismo tiempo que el cultivo, para intentar minimizar el impacto genético potencial produciendo un stock en el criadero lo más parecido posible al stock natural.

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