and rolo gia

7/23/2019 And Rolo Gia

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Métodos y Técnicas enBiopatología Clínica:

Laboratorio de AndrologíaJosé Luis Girela López

Dpto. de BiotecnologíaUniversidad de Alicante

[email protected]

De media, un hombre produce 200 millones de espermatozoides diarios.

Aproximadamente cada 75 días, una cohorte de espermatozoides enmaduración pasan a través de diferentes fases de desarrollo. De célulasprimordiales a espermatocitos , a espermátides , y finalmente aespermatozoides maduros.

M E I O S I S



Los fluidos producidos por las vesículas seminales y la próstata sonañadidos justo antes de la eyaculación.

Los espermatozoides acaban su paso por el epidídimo después de unos12 días . Aquí es donde llevan a cabo sus últimas fases de desarrollo ydonde son finalmente almacenados.

VALORACIÓN ENDOCRINA:



Principales hormonas implicadas:

GnRH: Hormona liberadora de gonadotropinas.

FSH: Hormona foliculo estimulante.

LH: Hormona luteinizante o ICSH: hormonaestimulante de las células intersticiales.

Testosterona

Inhibina

Hipotálamo

Hipófisisanterior

Leydig Sertoli

Espermatogénesisy maduración espermática

FuncionesSistémicas de la

testosterona

TestosteronaABP

Inhibina B

- -

-

LH / ICSHFSH

FSH

GnRH



AltaBajaNormal/BajaNormal/BajaTumor hipofisario

productor de prolactina

NormalNormal/Baja Alta AltaFallo testicular.Hipogonadismo

hipergonadotropo

NormalNormalNormal Alta/NormalEspermatogénesisanormal

NormalBajaBajaBajaHipogonadismohipogonadotropo

NormalNormalNormalNormalEspermatogénesis normal

PROLACTINATESTOSTERONALHFSHVALORACIÓN CLINICA

VALORACIÓN ENDOCRINA BÁSICA EN ESTERILIDAD MASCULINA

ANÁLISIS DE SEMEN:



SEMEN:

Fluido biológico que se observa tras la estimulaciónsexual y que recibe el nombre de eyaculado.

El eyaculado esta compuesto por:

• Un componente sólido:los espermatozoides.

• Un componente líquido: el plasma seminal , quetiene origen multiglandular y que vehiculiza alanterior.

SECUENCIA Y COMPONENTES DEL EYACULADO

Orden GlándulaComponentesfundamentales Volumen (%) pH

1 Uretral ybulbouretral

Mucoproteinas 0,1-0,2 ml

2 Próstata Ac. Cítrico.Fosfatasas.

Esoermina.Iones.α -amilasa...

0,5-1 ml.15-30%

Ácido

3 Epidídimo.Deferente.

Ampolla deferencial

Glicerilfosforilcolina. Ac. Siálico.Fosfolípidos.Carnitina.Proteinas.ESPERMATOZOIDES

0,1-0,3 ml.10%

4 Vesículas seminales Fructosa. Proteinas.prostaglandinas

2-2,5 ml.50-80%

Alcalino



ESTUDIO DE SEMEN BASAL O SEMINOGRAMA:

Estudio de las características citomorfológicas yfuncionales de los espermatozoides.

CONSIDERACIONES PRÉVIAS (I):

• Existencia de una gran variabilidad intraindividual,debido a que el proceso de producción celular, laespermatogénesis , es un proceso cíclico. El ciclode la espermatogénesis dura aproximadamenteunos 75 días.

• Posible existencia de factores, tanto endógenoscomo exógenos, que pueden producir alteracionesen la calidad seminal (ocupacionales, ambientales,estados de salud,...)



CONSIDERACIONES PRÉVIAS (I):

CONSIDERACIONES PRÉVIAS (II):

Se deben seguir unas pautas estrictas en la obtencióny procesamiento de las muestras. Estas pautas estánestablecidas mediante la publicación periódica, porparte de la Organización Mundial de la Salud (OMS)del "Manual de laboratorio de la OMS para elexamen del semen humano y la interacción entreel semen y el moco cervical" (OMS, 1999)




Examen macroscópico Examen microscópico

• Aspecto.

• Viscosidad.

• pH.

• Volumen .

• Concentración.

• Motilidad.

• Viabilidad.

• Morfología.

VOLUMEN:

Debe ser > 2ml

EXAMEN MACROSCÓPICO (IV)



EXAMEN MACROSCÓPICO (I)

ASPECTO:

NORMAL TRANSPARENTE

VISCOSIDAD Y FILANCIA:

NORMAL AUMENTADAHilos de filancia

EXAMEN MACROSCÓPICO (II)



pH:

Rango de pH normal: > 7,2

EXAMEN MACROSCÓPICO (III)

ALGORITMO DIAGNOSTICO MACROSCOPICO DEL EYACULADO

pH Licuefacción Coagulación Volumen

< 6,9 6,9-8 > 8 Retardada Normal Retardada <1,5ml >1,5ml

Insuficiencia Prostática

Vesiculitis Prostática

Normal

Insuficiencia o agenesia devesiculas seminales

Esperma diluido por orina Fructosa ↓↓



EXAMEN MICROSCÓPICO:

• Motilidad.• Viabilidad.

• Recuento de espermatozoides ycélulas redondas (Concentración).

• Presencia de aglutinaciones.

• Ensayo hipoosmótico (HOS-test).

En el que se valora:

MOTILIDAD:Podemos encontrar 4 patrones de motilidad



MOTILIDAD (II):

Los valores de referencia son:• Al menos un25 % de tipo +++ o

• al menos un 50 % suma de tipos ++ y +++

En caso de no cumplir estos valores la muestra sedenomina ASTENOZOOSPERMIA.

VIABILIDAD:

Muestra el % de espermatozoides vivos.

Existen diferentes técnicas para valorarla. Lasprincipales son:

• Tinción supravital.• Marcadores del núcleo.• HOS test



VIABILIDAD (II):

TINCIÓN SUPRAVITAL(Eosina-Nigrosina)

• Eosina : Colorante vital.Penetra en las célulasmuertas que tienen lamembrana dañada.• Nigrosina: Colorantepara realzar el contraste.

VIABILIDAD (III):

MARCADORES DEL NÚCLEO

• Bromuro de Etidio.

• Naranja de Acridina.Observación enel microscopiode fluorescenciaa 500 nm delongitud de onda.



VIABILIDAD (IV):

HOS Test: Prueba de lahinchazón de losespermatozoides enmedio hipoosmótico.

Interpretación:

• HOS +: Cola arrollada.• HOS -: Cola recta.

VIABILIDAD (V):

La viabilidad debe ser del 75% o superior.

Si todos los espermatozoides de la muestra están muertosla muestra se denomina NECROZOOSPERMIA .



CONCENTRACIÓN:Se expresa en millones de espermatozoides por

mililitro (mill/ml), y se valora mediante unacámara de recuento Makler.

CONCENTRACIÓN (II):

La concentración debe ser mayor de 20 mill/ml.En caso de ser menor se denomina a la muestraOLIGOZOOSPERMIA .



CONCENTRACIÓN (III):

Como método alternativo se puedeutilizar la cámara de Neubauer.

CONCENTRACIÓN:

Nº SPZ EN UNA REGIÓN Ax 10 x FACTOR DE DILUCIÓNx 1000.

(Nº SPZ EN UN CUADRADO A) x (FACTOR DE DILUCIÓN)VOLUMEN EN UN CUADRADO A (0,1µL)

= Nº SPZµl

A

C

B

B

B B

A

A

A

PRESENCIA DE ELEMENTOS CELULARES DIFERENTESDE LOS ESPERMATOZOIDES:

Denominadas “Células Redondas”, entre las quese incluyen:

• Células de la Espermatogénesis.• Leucocitos.• Células del tracto uretral.

Su concentración no debe exceder de los 5 mill/ml,y la concentración de leucocitos no debe sersuperior a 1 mill/ml.



PRESENCIA DE AGLUTINACIONES:

Consiste en la unión específica espermatozoide-espermatozoide. Pueden ser de varios tipos:

• Cabeza-Cabeza.• Pieza Intermedia-Pieza Intermedia.• Cola-Cola.• Otras combinaciones.

La unión de espermatozoides con restos celulares o

detritus se denomina Pseudoaglutinación .



MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA

Se valoran los defectos morfológicos de los espermatozoides,fijados y teñidos (Tinción de Papanicolau modificada paraespermatozoides).

< 1 x 106 / mlLeucocitos

≥ 75% de espermatozoidesvivos

Viabilidad

≥ 50% con movilidadprogresiva (tipos +++ y ++) ó ≥

25% con progresión rápida(tipo +++) a los 60 minutos dela eyaculación

Motilidad≥ 40 x 106Nº total de espermatozoides

≥ 20 x 106 / mlConcentración7,2 o superior pH≥ 2,0 mlVolumen

RESUMEN VALORES DE REFERENCIA



RESUMEN DIAGNOSTICO MICROSCOPICO DEL EYACULADO

Obstrucción del tracto genital.Fallo primario de tubulosseminiferos.Fallo secundario de túbulosseminiferos con tratamientocon androgenos.

Fructosa 15µmol/l--04

Flagelos inmoviles.Contaminación o recogidamediante condon.

70% vivos3501003

Ausencia congénita de vasosdeferentes.Obstrucción del conductoeyaculador.Eyaculación retrógrada parcial.Fallo testicular con deficienciade andrógenos.Perdida de parte de la muestra.

Fructosa 1 µmol/l(Baja)pH 6,5 (ácido)

--00,4

Posible causaComentariosMorfologíanormal(%) > 14

Motilidad(%) > 50

Concentración(mill /ml) > 20

Volumen(ml) > 2

RESUMEN DIAGNOSTICO MICROSCOPICO DEL EYACULADO

Oligozoospermia.Morfologíaanormal.103043

Astenozoospermia idiopática. Autoinmunidad.Prostatitis.Tiempo excesivo antes delanálisis.

Licuefacciónincompleta. Aglutinaciones.40% vivos> 1 mill/ml deleucocitos.

10251003

TeratozoospermiaGlobozoospermia

Pequeñascabezasredondas

0651003

Criptozoospermia.Fallo 1º túbulos seminiferos.

Obstrucción parcial.

Espermatozoidesmoviles.--<13

Contaminacion o tiempoexcesivo antes del análisis.Necrozoospermia. Autoinmunidad.

20% vivos3551003

Posible causaComentariosMorfologíanormal(%) > 14

Motilidad(%) > 50

Concentración(mill /ml) > 20

Volumen(ml) > 2



AZOOSPERMIA

Aumentada 2 veces

Patologíatesticular 1ª.

IAD.Resignación

Sospecha dealteracióngenética

Cariotipo

LH, T.

T↓

Tratamientosustitutivo

Disminuida

Hipogonadismohipogonadotropo

FSH-LH

Normal o ligeramenteaumentada o disminuida

Biopsia ?. PAAF ?Diagnóstica terapéutica

Bloqueo de laespermatogénesis

FSH-LH

No respuesta

IAD.Resignación

Espermatogénesisconservada

Vol. 1mlVol. normal

Obs. eyaculadores

REP

Obs. Deferncial Obs.intratesticular

Agenesiavesículasseminales

REP TRATRA

FSH

OLIGOZOOSPERMIA

Moderada-severa( 10 mill./ml.)

FSH

Aumentada. 2 veces

Patologíatesticularprimaria

Test deselección

espermática

TRA

Disminuida

Hipogonadismohipogonadotropo

FSH-LH

Test deselección

espermática

TRA

Normal.

Idiopática.Biopsia???.

Tratamiento???

Descartar factoresasociados: Infección,Tóxicos, Varicocele,Alt. Citogenéticas....

Test de selecciónespermática

TRA

Leve.( 10mill./ml)

FSH

Aumentada

Test deselección

espermática

TRA: IAC

Ligeramente ↓

FSH-LH

Test deselección

espermática

TRA: IAC



ASTENOZOOSPERMIA

DESCARTAR PATOLOGÍASASOCIADAS MÁS FRECUENTES:

Cultivo seminal y secreciónprostática. Estudio inmunológico.(mar test, IBT.)

Varicocele.

Va unida frecuentemente ateratozoospermia.

ALTERACIONES MICROESTRUCTURALESDEL CITOESQUELETO:

-Ausencia de mitocondrias.

-Alteración de la vaina externa de la cola delespermatozoide. Gen Oppo 1 del cromosoma17, la proteina de este gen interviene en elbatido del flagelo.

-Falta de algún microtúbulo.

-Ausencia de uno o dos brazos de dineina. (sd.De Cartagener.) Etiologia genética, pero gendesconocido

ASPERMIA HIPOSEPERMIA

Estudio de orina post-orgasmo

Seminograma

Azoospermia

PRESENCIA deespermatozoides

Estudio y tratamiento delas causas (si es posible)

Eyaculacióncon vejiga llena

Emisión de esp.

TRA

AUSENCIA deespermatozoides

FSH

Protocolo deAzoospermia

No emisión

Recuperación espermática dela orina post-orgasmo.

+ -TRA: ICSI

REP- PAAF



EYACULACIÓN RETRÓGRADAASPERMIA

AZOOSPERMIA

• OBSTRUCTIVA:

Se mantiene la producción de espermatozoidesen los túbulos seminíferos.

• FALLO TESTICULAR PRIMARIO:

Generalmente asociado a factores genéticos.

Arresto de la espermatogénesis. Síndrome de “solo células de sertoli”.



AZOOSPERMIA

TÉCNICAS QUIRURJICAS PARA LA OBTENCIÓN DEESPERMATOZOIDES:

1. MESA, Microsurgical epididymal sperm aspiration

2. PESA, Percutaneous epididymal sperm aspiration

3. TESA, Percutaneous testicular sperm aspiration

4. TESE, Testicular sperm extraction

AZOOSPERMIA1. MESA, Microsurgical epididymal sperm aspiration



AZOOSPERMIA2. PESA, Percutaneous epididymal sperm aspiration

AZOOSPERMIA3. TESA, Percutaneous testicular sperm aspiration



AZOOSPERMIA4. TESE, Testicular sperm extraction

INMUNOLOGÍA DEL SEMEN:



BARRERA HEMATO-TESTICULAR

BARRERA HEMATO-TESTICULAR

• Previene que las células testiculares que muestran antígenos“extraños” entren en contacto con el tejido linfoide.

• Previene que las células inmunocompetentes entren en lostúbulos seminíferos.



Condiciones en las que se puede romper la barrerahemato-testicular:

• Varicocele

• Cirugia testicular

• Torsión o traumatismo testicular

• Agenesia de vasos deferentes

• Biopsia testicular

• Criptorquidismo

• Cancer testicular

• Infecciones (orquitis, prostatitis, epididimitis,…)• Hernia inguinal

• …

Inmunología

Otros mecanismos inmunosupresores:

• Tolerancia inmunológica inducida por la escasa presencia deantígenos espermáticos.

• Mecanismos inmunomoduladores en los testículos . (Esteroides,macrofagos, T-supresoras,…)

• Inmunomodulación fuera del testículo (T-supresoras enepidídimo, efecto inmunosupresor del plasma seminal,…)



Inmunología y esterilidad masculina:

Anticuerpos anti-espermatozoide (ASAb)

Inmunoglobulinas de los isotipos IgG, IgA y/oIgM dirigidas contra varias partes delespermatozoide (Cabeza, pieza intermedia ocola).


Podemos encontrarlos tanto en el hombre comoen la mujer.

Pueden aparecer en suero , semen y en elmoco cervical .

Anticuerpos anti-espermatozoide (ASAb)




Problemas causados por los ASAb:

• Desordenes de la espermatogénesis que provocan oligo o

azoospermia.• Unión a espermatozoides maduros e inhibición del correctotransporte a través del tracto genital masculino .

• Aglutinación de espermatozoides eyaculados.

• Citotoxicidad espermática mediada por ASAb.

• Inmobilización de los espermatozoides en el tracto genitalfemenino por efecto de los ASAb.

• Aumento de la fagocitación de espermatozoides pormacrofagos.


Problemas causados por los ASAb:

• Paso inadecuado de los espermatozoides a través del mococervical .

• Desórdenes en la capacitación espermática y la reacción

acrosómica .

• Bloqueo de la interacción ovocito-espermatozoide .(IgA)

• Inducción de inmunidad frente a espermatozoides en la mujer.

• Fallos reproductivos posfecundación y abortos .




Examen macroscópico Examen microscópico

• Aspecto.

• Viscosidad.

• pH.

• Volumen .

• Concentración.

• Motilidad.

• Viabilidad.

• Morfología.



PRESENCIA DE AGLUTINACIONES:Consiste en la unión específica espermatozoide-espermatozoide. Pueden serde varios tipos:

• Cabeza-Cabeza.• Pieza Intermedia-Pieza Intermedia.• Cola-Cola.• Otras combinaciones.

La unión de espermatozoides con restos celulares o detritus se denomina

Pseudoaglutinación .




BAJA VIABILIDAD:Valoración mediante tinción supravital conEosina- Nigrosina :


IMMUNOBEAD Test (IBT):Para detección de IgG e IgA.

Más del 20 % positivo.




Mixed Antiglobulin Reaction (MAR Test): Para detectar IgG.

Sospecha si hay entre 10 y 39% de spz móviles adheridos.

Más del 40% supone un a muy alta probabilidad de causa inmunológica.


OTROS MÉTODOS PARA DETECTAR ASAb:

• Interacción semen-mucus cervical.

• ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

• RIA (Radioimmunoassay)




TRATAMIENTO:

• Tratamiento con corticoides.

• Lavado seminal. Inmunoadsorción.

•Tratamiento con proteasas.

• Técnicas de reproducción asistida.( FIV / ICSI)

Técnicas avanzadas en ellaboratorio de Andrología.

José Luis Girela LópezDpto. de Biotecnología

Universidad de Alicante



TÉCNICAS AVANZADAS EN ELLABORATORIO DE ANDROLOGÍA.

Técnicas de selección espermática (Capacitación)

CAPACITACIÓN:

Serie de cambios bioquímicos y físicos, que afectan a lasmembranas y al metabolismo energético, requeridos por elespermatozoide para estar en condiciones de liberar elcontenido acrosomal.



En el Laboratorio de Andrología se pueden utilizardiferentes técnicas para inducir este proceso “invitro”.Estas técnicas se denominan en su conjunto“técnicas de selección espermática ”, ya que nosolo inducen la capacitación, sino que ademasrecogen de forma específica los “mejores ”espermatozoides en base a diferentes criterios.

TÉCNICAS DE SELECCIÓN ESPERMÁTICA:

• SWIM-UP.

• GRADIENTES.



SWIM-UP o migración ascendente:

Se basa en el principio de que “Solo losespermatozoides móviles son capaces de pasar delpellet al sobrenadante”.

LAVADO MEDIANTE CENTRIFUGACIÓN



SE AÑADE MEDIO SOBRE EL PELLET

INCUBACIÓN (1 HORA A 37ºC Y 5% CO2)



GRADIENTES:

Los mejores espermatozoides ( morfología ) seráncapaces de atravesar los gradientes de densidad yllegar al fondo del tubo.



Comprobación de la Capacitación:

• Hiperactivación espermática

• Fosforilación de residuos de tirosina

• Contenido de Glucosa-6-fosfato

• Contenido de NADPH

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