anatomÍa, viabilidad y germinaciÓn de la semilla de …

ANATOMÍA, VIABILIDAD Y GERMINACIÓN DE LA SEMILLA DE ÉBANO (Caesalpinia ebano H. Karst).

CHIARA MARÍA GOMEZ GALARCIO DIANIS KARINA PUCHE MADRID

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA MONTERÍA - CÓRDOBA

2020

ANATOMÍA, VIABILIDAD Y GERMINACIÓN DE LA SEMILLA DE ÉBANO

(Caesalpinia ebano H. Karst).

CHIARA MARIA GOMEZ GALARCIO DIANIS KARINA PUCHE MADRID

Estudiantes del programa de Ingeniería Agronómica

Propuesta de trabajo de grado en la modalidad de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Agrónomo.

Director: MIGUEL MARIANO ESPITIA CAMACHO, I.A., Ph.D. Fitomejoramiento

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

PROGRAMA INGENIERÍA AGRONÓMICA MONTERÍA - CÓRDOBA

2020

3

La responsabilidad ética, legal y científica de las ideas expresadas, conceptos y resultados del proyecto son responsabilidad de los autores.

Artículo 17, acuerdo No. 039 del 24 de junio de 2005 del Consejo Superior de la Universidad de Córdoba.

Los derechos de propiedad intelectual y confidencialidad de los resultados de investigación se rigen por la política de propiedad intelectual de la

Universidad de Córdoba: Acuerdo No. 045 de 2018.

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Nota de Aceptación

________________________________

________________________________

________________________________

___________________________________

Rosalba Ruiz Vega, Ph.D., Jurado.

___________________________________

Fernando Barraza Álvarez, Ph.D., Jurado.

__________________________________

Miguel Espitia Camacho, Ph.D., Director.

Montería, octubre de 2020

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DEDICATORIA

A Dios por guiarme y acompañarme en el transcurso de mi vida.

A mi maravillosa madre Enilda Galarcio Ayala, por su apoyo incondicional y esfuerzo en todos estos años, por ser un gran ejemplo de mujer, madre y ser humano, por ser la luz de mi vida, por ser tan ella y por nunca cortarme las alas.

A la memoria de mi padre Roberto Gómez Agámez, quien ha sido siempre mi gran ejemplo de profesional y ser humano.

Chiara María Gómez Galarcio

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DEDICATORIA

A Dios, por guiarme en este camino, por ser la fortaleza en los momentos de dificultad.

A mi madre Dianis Madrid Ayala quien con su amor, paciencia y esfuerzo me permitió cumplir un sueño más, por ser la principal promotora, por confiar y creer, y sobre todo por su apoyo incondicional y consejos.

A mis abuelos Bartolo Madrid y Elena Espinosa, dedicada a sus memorias, por inculcar en mí el ejemplo de dedicación y valentía para no temer a las adversidades.

Dianis Karina Puche Madrid

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AGRADECIMIENTOS

A nuestro Dios, por sus infinitas bendiciones, por ser nuestro apoyo y fortaleza.

Al Dr. Miguel Espitia Camacho nuestro director de tesis, por su acertada orientación, por todo su apoyo, enseñanzas, paciencia y dedicación durante este proceso.

Al Programa de Ingeniería Agronómica de la Facultad de Ciencias Agrícolas y al Departamento de Ingeniería Agronómica de la Universidad de Córdoba.

Al personal de los laboratorios de Genética y Fitomejoramiento, especialmente al Ingeniero Henry Hernández, quien nos brindó su apoyo profesional.

A nuestros compañeros de estudio, docentes y demás personas que aportaron sus conocimientos y enseñanzas de forma desinteresada para nuestra formación profesional.

8

CONTENIDO

Pág.

RESUMEN GENERAL ........................................................................................... 15

ABSTRACT GENERAL .......................................................................................... 16

CAPÍTULO I ........................................................................................................... 17

INTRODUCCIÓN GENERAL ................................................................................. 17

CHAPTER I ............................................................................................................ 18

GENERAL INTRODUCTION ................................................................................. 18

1.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 19

1.2 DEFINICIÓN DE PROBLEMA ......................................................................... 21

1.3 GENERALIDADES DE LA TEMÁTICA ............................................................ 24

1.3.1 Importancia de las plantaciones forestales. ........................................ 24

1.3.2 Importancia de las especies forestales nativas. .................................. 25

1.3.3 Sector forestal en Colombia. ............................................................... 25

1.3.4 El sector forestal en el departamento de Córdoba. ............................. 26

1.3.5 Situación actual del ébano en el Caribe colombiano. ......................... 27

1.3.6 Generalidades del ébano. ................................................................... 27

1.3.6.1 Descripción taxonómica: .................................................................... 28

1.3.7 Generalidades de las semillas. ........................................................... 29

1.3.7.1 Concepto de semilla. .......................................................................... 29

1.3.7.2 Proceso de Germinación. ................................................................... 29

1.3.7.3 Fase de imbibición. ............................................................................ 29

1.3.7.4 Fase de germinación. ......................................................................... 29

1.3.7.5 Fase de crecimiento. .......................................................................... 29

1.3.8 Factores que afectan la germinación en semillas de especies forestales.

............................................................................................................ 30

9

1.3.9 Estudios de anatomía, viabilidad y germinación en especies forestales

............................................................................................................ 30

1.3.9.1 Estudios sobre anatomía de las semillas de especies forestales. ...... 30

1.3.9.2 Prueba bioquímica de Tetrazolio y viabilidad de semillas de especies

forestales. ........................................................................................................ 31

1.3.9.3 Estudios sobre parámetros de la germinación de las semillas de

especies forestales. ......................................................................................... 32

1.4 OBJETIVOS ..................................................................................................... 34

1.4.1 Objetivo general .................................................................................. 34

1.4.2 Objetivos específicos .......................................................................... 34

1.5 LITERATURA CITADA .................................................................................... 35

CAPÍTULO II .......................................................................................................... 42

DESCRIPCIÓN E ILUSTRACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS ANATÓMICAS

EXTERNAS E INTERNAS DE LAS SEMILLAS DE ÉBANO (Caesalpinia ebano H.

Karst) ..................................................................................................................... 42

CHAPTER II ........................................................................................................... 43

DESCRIPTION AND ILLUSTRATION OF THE EXTERNAL AND INTERNAL

ANATOMY CHARACTERISTICS OF EBONY (Caesalpinia ebano H. Karst) SEEDS

............................................................................................................................... 43

RESUMEN ............................................................................................................. 44

ABSTRACT ............................................................................................................ 45

2.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 46

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 49

2.2.1. Localización. ....................................................................................... 49

2.2.2. Material genético. ................................................................................ 49

2.2.3. Procedimiento. .................................................................................... 49

2.2.3.1. Anatomía de semillas. ........................................................................ 49

2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 50

2.3.1. Descripción de la anatomía externa e interna de la semilla. ............... 50

2.4 CONCLUSIONES ............................................................................................ 52


10

CAPÍTULO III ......................................................................................................... 56

DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD CON TETRAZOLIO EN SEMILLAS DE ÉBANO

(Caesalpinia ebano H. Karst) ................................................................................. 56

CHAPTER III .......................................................................................................... 57

FEASIBILITY DETERMINATION TETRAZOLIUM SEEDS OF EBONY (Caesalpinia

ebano H. Karst) ...................................................................................................... 57

RESUMEN ............................................................................................................. 58

ABSTRACT ............................................................................................................ 59

3.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 60


3.2.1 Localización. ....................................................................................... 62

3.2.2 Material genético ................................................................................. 62

3.2.3 Procedimiento. .................................................................................... 62

3.2.3.1 Determinación de patrones topológicos. ............................................ 62

3.2.3.2 Evaluación de concentraciones de 2,3,5 cloruro de tetrazolio y tiempos

de tinción. ........................................................................................................ 63

3.2.4 Análisis de datos. ................................................................................ 63


3.3.1 Determinación de patrones topológicos. ............................................. 65

3.3.2 Evaluación de la viabilidad de las semillas. ........................................ 67

3.4 CONCLUSIONES ............................................................................................ 72


CAPÍTULO IV ......................................................................................................... 77

PARÁMETROS FISIOLÓGICOS DE LA GERMINACIÓN EN SEMILLAS DE ÉBANO

(Caesalpinia ebano H. Karst). ................................................................................ 77

CHAPTER IV ......................................................................................................... 78

PHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF GERMINATION IN Caesalpinia ebano H.

Karst SEEDS. ........................................................................................................ 78

RESUMEN ............................................................................................................. 79

ABSTRACT ............................................................................................................ 80

4.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 81

11


4.2.1 Localización ........................................................................................ 84

4.2.2 Material genético ................................................................................. 84

4.2.3 Procedimientos y variables de respuesta ........................................... 84

4.2.4 Diseño experimental y análisis estadístico de datos ........................... 86


4.3.1 Análisis de Varianza ........................................................................... 87

4.3.2 Valores promedios para los parámetros fisiológicos de la germinación

............................................................................................................ 88

4.4 CONCLUSIONES ............................................................................................ 95


DISCUSIÓN GENERAL ....................................................................................... 102

CONCLUSIÓN GENERAL ................................................................................... 104

LITERATURA CITADA ........................................................................................ 105

12

LISTA DE TABLAS

CAPÍTULO 3

Pág.

Tabla 3.1. Descripción de tratamientos evaluados en la viabilidad de semillas de C. ebano mediante la prueba de tetrazolio. ................................................................ 63

Tabla 3.2. Valores medios según la prueba de Tukey al 95%, para categorías asociadas a la calidad de semillas en diferentes concentraciones de tetrazolio y tiempos de tinción en C. ebano.............................................................................. 68

CAPÍTULO 4

Pág.

Tabla 4.1. Análisis de varianza y nivel de significancia para ocho parámetros

fisiológicos de la germinación, bajo dos ambientes germinativos de las semillas de

árboles de Caesalpinia ebano Karst……………………………………………………89

Tabla 4.2. Promedios para ocho parámetros fisiológicos de la germinación de las

semillas de C. ebano en cámara germinativa y casa malla………………………… 91

13

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 2

Pág.

Figura 2.1. Anatomía interna y externa de la semilla de Caesalpinia ebano H. Karst.

a) Semillas enteras y su testa: te = testa, fu = funículo; b) corte longitudinal: em =

embrión, ra = radícula, co = cotiledón; c) extrusión radicular; d) elongación radicular:

hi = hipocótilo. ........................................................................................................ 50

Figura 2.2. Estructura externa al embrión de la semilla de Caesalpinia ebano H.

Karst. ..................................................................................................................... 51

CAPÍTULO 3

Pág.

Figura 3.1. Patrones topológicos identificados en el test de tetrazolio en semillas de

C. ebano. ............................................................................................................... 66

Figura 3.2. Semillas de C. ebano sometidas a la prueba de tetrazolio;

*concentración de tetrazolio en porcentaje (%); **tiempo de tinción en horas ....... 69

Figura 3.3. Valores medios para las categorías viables y potencial (V+0,5) de

semillas de C. ebano. ............................................................................................ 70

Figura 3.4. Valores medios para las categorías dudosas e inviables de semillas de

C. ebano. ............................................................................................................... 70

14

CAPÍTULO 4

Pág.

Figura 4.1. Montaje de semillas de C. ebano en cámara germinativa. .................. 85

Figura 4.2. Montaje de semillas de C. ebano en casa malla. ................................ 86

Figura 4.3. Valores medios de DIG, DFG, DDG, PG, VG, IVG, GDM y VP para la

germinación de semillas de C. ebano en condiciones de casa malla y laboratorio.

Letras distintas indican diferencias significativas con la prueba de Tukey, a un nivel

α = 0,05. ................................................................................................................. 94

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RESUMEN GENERAL

El ébano (Caesalpinia ebano H. Karst.), es una especie endémica de la región Caribe Colombiana y declarada en peligro crítico de extinción desde 1995, con un alto potencial en sistemas agroforestales, imprescindible para la recuperación y conservación del Bosque Seco Tropical. Sin embargo, el escaso conocimiento básico sobre las especies forestales nativas repercute en el mantenimiento de la calidad de las semillas para los programas de conservación, uso sostenible de los recursos genéticos y recuperación de bosques naturales. Los objetivos de este proyecto de investigación fueron; determinar la anatomía, viabilidad y la germinación de la semilla de esta especie forestal, provenientes de los municipios de Montería, Tierralta y Berastegüi. El estudio se llevó a cabo durante el segundo semestre de 2018 y el primer semestre del año 2019 en la Universidad de Córdoba (Colombia). La anatomía externa e interna se estudió realizando cortes longitudinales de la semilla, y posterior observación por medio de estereoscopio y registro fotográfico. Subsecuentemente, se determinó la viabilidad de la semilla mediante la prueba bioquímica de tetrazolio, para ello, se estandarizó el procedimiento con un diseño completamente al azar, con seis tratamientos y tres réplicas de 20 semillas cada una, originados de tres concentraciones de tetrazolio (0,5%, 1,0% y 1,5%) y dos tiempos de inmersión (2 y 3 horas) de las semillas; en cada unidad experimental se calculó la cantidad de semilla viable, dudosa y no viable. Finalmente, se evaluó la germinación de la semilla en cámara germinativa y casa malla. Toda la semilla fue pre-acondicionada antes de la siembra, se realizaron lecturas diarias hasta que se estabilizó la germinación. Se estimaron los parámetros: porcentaje de germinación (PG), días a inicio de la germinación (DIG), días durante la germinación (DDG), días al final de la germinación (DFG), índice de velocidad de germinación (IVG), germinación diaria media (GDM), valor pico (VP) y valor de germinación (VG). La semilla es de forma ovoide y lisa, con un embrión envuelto en una membrana gruesa traslúcida y una cubierta seminal rígida. Los porcentajes de semillas viables estuvieron entre 73,3 y 95,0%, inviables entre 0,0 y 8,3% y dudosas se mantuvieron entre 5,0 y 18,3%, y la viabilidad total entre 82,5 y 97,5%. Se recomienda el tratamiento de 1,0 % de tetrazolio durante dos horas para determinar la viabilidad de las semillas de esta especie. Los porcentajes de germinación estuvieron entre 91,0% y 55,5%, el IVG fue superior para las condiciones de laboratorio con 5,5 plantas/día, en comparación con las condiciones de casa malla, con sólo 3,5 plantas/día. Por su parte, el VG fue la variable que presentó mayores diferencias con 18,5 unidades para las condiciones de laboratorio, y apenas 11,5 unidades para las condiciones de casa malla. La variabilidad entre los tratamientos en favor de las condiciones de laboratorio, obedece a las condiciones controladas del mismo, favoreciendo la germinación de las semillas de ébano.

Palabras claves: anatomía externa e interna, germinación, prueba química.

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ABSTRACT GENERAL

The ebony (Caesalpinia ebano H. Karst.), is an endemic specie of the Colombian Caribbean region and declared in critical danger of extinction since 1995, with a high potential in agroforestry systems, essential for the recovery and conservation of the tropical dry forest. However, the basic knowledge about native forest species has repercussions on the maintenance of seed quality for conservation programs, sustainable use of genetic resources and recovery of natural forests from trees of the Montería, Tierralta and Berastegüi township in the Cordoba department of Colombia. The objectives of this research project were to determine the anatomy, viability and germination of the seed of this forest species. The study was carried out during the second semester of 2018 and the first semester of 2019 at the University of Córdoba (Colombia). The external and internal anatomy was studied by making longitudinal cuts of the seed, and subsequent observation by means of a stereoscope and photographic record. Subsequently, the viability of the seed was proposed by means of the biochemical tetrazolium test, for this, the procedure was standardized with a completely random design, with six treatments and three replicates of 20 seeds each, originating from three concentrations of tetrazolium (0.5%, 1.0% and 1.5%) and two immersion times (2 and 3 hours) of the seeds; In each experimental unit, the amount of viable, doubtful and non-viable seed observed under a stereoscope was calculated. Finally, seed germination was evaluated in the germination chamber and mesh house. All the seed was preconditioned before planting, daily readings were made until germination stabilized. The parameters were estimated: percentage of germination (PG), days at the beginning of germination (DIG), days during germination (DDG), days at the end of germination (DFG), germination speed index (IVG), germination daily average (GDM), peak value (VP) and germination value (VG). The seed is ovoid and smooth, with an embryo wrapped in a thick translucent membrane and a rigid seminal covering. The percentages of viable seeds were between 73.3 and 95.0%, infeasible between 0.0 and 8.3% and doubtful remained between 5.0 and 18.3%, and the total feasibility category between 82.5 and 97.5%. Treatment of 1.0% tetrazolium for two hours is recommended to determine the viability of the seeds of this species. The previous data was worked under tests of ANAVA and Tukey at 95% reliability. Germination percentages were between 91.0% and 55.5%, IVG was higher for laboratory conditions with 5.5 plants / day, compared to mesh house conditions, with only 3.5 plants / day. By another hand, the VG was the variable that presented the greatest differences with 18.5 units for laboratory conditions, and only 11.5 units for house mesh conditions. The variability between treatments in favor of laboratory conditions is due to its controlled conditions, favoring the germination of ebony seeds.

Keywords: external and internal anatomy, germination, chemical test.

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CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN GENERAL

18

CHAPTER I

GENERAL INTRODUCTION

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1.1 INTRODUCCIÓN

La Cadena Forestal colombiana tiene como visión generar un sector forestal competitivo para el año 2025, que genere desarrollo y bienestar rural (MADR, 2005; CFC, 2011; Correa, Espitia, Araméndiz, Murillo y Pastrana, 2013; Espitia-Camacho, Cardona-Ayala, Campo-Arana, Araméndiz-Tatis y Correa-Álvarez, 2017a). Los problemas ocasionados por la deforestación de bosques naturales y la necesidad de aumentar la producción de madera proveniente de bosques plantados, es una oportunidad para países como Colombia, dada sus ventajas comparativas por posición geográfica y condiciones edafoclimáticas, que le permite producir maderas de alta calidad durante cualquier época del año (MADR, 2005; CFC, 2011). El sector forestal comercial de Colombia y Córdoba tiene como propósito fundamental incrementar las áreas plantadas, rendimientos y calidad de la madera sólida, mejorar la productividad, competitividad y sostenibilidad de las plantaciones y los productos de la madera (Murillo-Gamboa, Espitia-Camacho y Castillo-Pinedo, 2012; Espitia-Camacho et al. 2017a).

Ahora bien, ya que la mayoría de las especies forestales del trópico, se propagan mediante semilla sexual, el conocimiento e interpretación de la viabilidad y los parámetros de la germinación y las plántulas en laboratorio, invernadero o casa-malla es indispensable para la comprensión de la autoecología, colecta, conservación, manejo, uso sostenible y el desarrollo de prácticas silviculturales exitosas de las especies forestales (Niembro-Rocas y Ramírez-García, 2006; Nascimento, 2013; Caravita-Abbade y Takaki 2014; Deminicis, Rodrigues, Faria, Vieira y Freitas, 2014; Guimarães-Rezende, Leão-de Jesus, Carlota-Nery, de Souza-Rocha y Michelly-Cruz, 2015; Espitia, Araméndiz y Cardona, 2016).

El conocimiento e interpretación de la calidad integral de la semilla y su manejo óptimo en vivero, es importante en la producción agrícola y forestal, dado que es el primer paso para lograr el éxito en el manejo silvícola, crecimiento, rendimiento, calidad, productividad, competitividad y sostenibilidad de las plantaciones y producción de madera (Pooter y Rose, 2005; Murillo-Gamboa et al. 2012; Espitia-Camacho, Cardona-Ayala y Araméndiz-Tatis, 2017b). Los parámetros de germinación como: tiempo promedio de germinación, velocidad de germinación o la capacidad de germinación y sincronía de germinación son aspectos importantes en el manejo de plántulas, así como también para optimizar los costos de producción (Palomeque et al. 2017).

En Córdoba, las especies forestales nativas de interés han sido poco investigadas en su respuesta y diferencia en los parámetros fisiológicos de la germinación, cuando las pruebas se realizan en cámara germinativa comparadas con las mismas en casa-malla. Estos estudios, se han reconocido como de fundamental importancia para el uso sostenible, conservación, multiplicación, reforestación y mejoramiento

20

genético de tales especies promisorias de Córdoba y Colombia (Correa et al. 2013; Espitia et al. 2016).

La importancia de realizar este trabajo radica en que la especie forestal ébano (Caesalpinia ebano H. Karst), se encuentra en peligro de extinción (Cárdenas y Salinas, 2006) tiene una desaparición progresiva en algunas zonas del país como consecuencia de la deforestación, y entre otras causas, la expansión de las fronteras ganaderas y agrícolas, razón por la cual se propone el estudio de la anatomía, viabilidad y germinación de la semilla, para desarrollar conocimiento básico y aplicado para la conservación, manejo, uso sostenible y de interés para los proyectos de reforestación y de futuro aprovechamiento de esta especie en la región Caribe.

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1.2 DEFINICIÓN DE PROBLEMA

En el Caribe húmedo, es limitada la investigación básica y aplicada sobre semillas de especies forestales nativas, vacíos del conocimiento que repercuten en el mantenimiento de la calidad de las semillas para los programas de conservación y uso sostenible de los recursos genéticos forestales; así mismo, para la satisfacción de la demanda de material de siembra en proyectos de plantaciones forestales comerciales, recuperación de bosques naturales y cuencas hidrográficas, entre otros. Se estima que este problema origina pérdidas del 25% de la semilla en almacenamiento y un 20% en el proceso de viverización (Rodríguez y Nieto, 1999; Correa et al. 2013; Espitia-Camacho et al. 2017a).

El Ministerio del medio Ambiente de Colombia estimó una deforestación entre 1990

y 2010 de 120 mil ha por año, sin embargo, para el 2016 el Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales determinó una deforestación de 178.597 ha de bosque (SIAC, 2016) y en 2017 aumento a 219.973 ha, aumentando en un 23% la superficie deforestada en comparación con el año anterior (IDEAM, 2018).

Dada la importancia en la reforestación, uso industrial, existencia de bosques naturales y el peligro de extinción de las especies forestales nativas, en Colombia se han realizado varios procesos de identificación y priorización de especies estratégicas potenciales para el sector forestal a nivel ambiental y comercial, los cuales han definido un listado de 29 especies forestales nativas potenciales (Rodríguez y Nieto,1999; Rodríguez, 2000; Nieto, 2004). La mayoría de estas especies no han sido suficientemente investigadas, no tienen paquete tecnológico, se encuentran amenazadas y en peligro de desaparición, debido a la alta presión y al uso indiscriminado del bosque natural por madera, quema y deforestación para otros diversos usos (CONIF-MMA-OIMT, 1998; CFC, 2011).

Por otra parte, en el departamento de Córdoba en particular, los procesos de reforestación se encuentran limitados por la disposición de las semillas certificadas, conduciendo a los reforestadores a la colecta de semillas en campos comerciales para el establecimiento de viveros y no tienen en cuenta los criterios fitosanitarios. Sumado a esto, se desconoce la respuesta y diferencia entre los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas de especies forestales nativas, cuando las pruebas de germinación se realizan en laboratorio (cámara germinativa) comparadas con las mismas en casa malla (CFC, 2011; Espitia, Araméndiz y Montiel, 2014; Espitia et al. 2016).

En el caso de C. ebano, que es una especie nativa del Bosque Seco Tropical, refleja la depresión del área forestal en el Caribe colombiano, tanto así, que se ha reportado como una especie forestal silvestre en peligro de extinción, encontrada en zonas específicas y en pequeñas cantidades. Es una especie de la que existen escasas investigaciones relacionadas con las características anatómicas,

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parámetros fisiológicos de la germinación en cámara germinativa y casa malla, y viabilidad de las semillas a través del patrón de tinción con tetrazolio (Cárdenas y Salinas, 2006).

A pesar de su importancia biológica como especie endémica y nativa de la región Caribe colombiana, esta especie, aún carece de estudios que reporten información básica en las áreas de genética y mejoramiento vegetal, fisiología, sanidad, entre otras. Ello subyace en que no se han adelantado trabajos de relevante rigor científico sobre determinación de la viabilidad de las semillas y/o parámetros fisiológicos de la germinación en cámaras germinativas y casa mallas; por todo lo anterior, se genera un vacío de conocimiento que compromete la autoecología y biología de una especie arraigada a la cultura caribeña colombiana (López y Cárdenas, 2002; Espitia-Camacho et al. 2017a).

Como es sabido, la germinación es la etapa inicial y crucial en la ontogenia de las plantas, sea en los procesos de regeneración de especies silvestres (Durr, Dickie, Yang y Pritchard, 2015), así como también para la producción de plántulas para la restauración activa, que implica un esfuerzo humano activo para acelerar e influir en la trayectoria sucesional de los ecosistemas en recuperación (Holl y Aide, 2011). Varios aspectos morfológicos (ejemplo: color, forma, tamaño, peso) y fisiológicos de semillas (ejemplo: dormancia) deben ser caracterizados a nivel de árboles y poblaciones de una especie y relacionar con la germinación y el crecimiento inicial de plántulas.

Se conoce que la germinación de semillas está asociada a factores como: temperatura, agua, salinidad (Wang et al. 2016); no obstante, hay relaciones entre factores ecológicos, morfológicos y fisiológicos, como por ejemplo, entre el requerimiento de la luz y la masa de las semillas (Milberg, Andersson y Thompson, 2000), temperatura y peso con la germinación (Yang et al. 2008; Barboza-Nogueira, Lobo-Pinheiro, Medeiros-Filho y da Silva-Matos, 2014; Souza, Gasparetto, Lopes y Barros, 2016), absorción de agua de semillas con la dinámica de germinación (Wierzbicka y Obidzinska, 1998). Según Dedefo, Derero, Tesfaye y Muriuki, (2016) y Palomeque et al. (2017), la provisión de semillas y el conocimiento de su calidad han sido identificados como los principales retos en la producción de plántulas de calidad por viveristas en otros países tropicales.

La determinación de calidad de semillas es necesaria para garantizar una reproducción eficiente de plántulas sanas, resistentes, vigorosas que puedan ser utilizadas en programas de restauración. El proceso de la colecta y el mercado de semillas forestales está bajo normas nacionales, pero hay déficits en la aplicación y en el conocimiento sobre las características específicas de las semillas de muchas especies nativas que obstaculiza su potencial para suplir necesidades en procesos como el de la restauración de bosques naturales para fines biológicos, ambientales y comerciales (Palomeque et al. 2017).

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En el marco del presente proyecto se pretende responder a las siguientes preguntas problemas: ¿Cuáles son las características anatómicas de las semillas de ébano?; ¿Cuáles son los patrones topológicos de tinción, concentración adecuada de tetrazolio y el tiempo de inmersión en la solución de las semillas para determinar su viabilidad?; ¿Cuál es la respuesta de los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas de ébano en cámara germinativa y casa malla?

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1.3 GENERALIDADES DE LA TEMÁTICA

1.3.1 Importancia de las plantaciones forestales. Las plantaciones forestales constituyen una opción importante de uso de tierras en el mundo tropical. Las reforestaciones actualmente se establecen con la finalidad del doble proposito: productor-protector, cumpliendo con muchas de las funciones de los bosques naturales. Si las plantaciones forestales se planifican correctamente, pueden ayudar a estabilizar y mejorar el medio ambiente (CONIF-MMA-OIMT, 1998). Los bosques naturales eran manejados principalmente para la producción de madera y energía (leña y carbón). Lo que condujo en algunos casos en forma excesiva el aprovechamiento, ocasionando consecuentemente fuertes presiones hacia su protección, porque generó la pérdida de importantes superficies de bosques, selvas y matorrales (Aguirre-Calderón, 2015).

Los bosques tropicales son especialmente importantes por los múltiples servicios ambientales que ellos proveen. Las emisiones de carbono son un importante factor que contribuye al cambio climático. Los bosques del mundo actúan como un importante depósito de carbono capturando 650.000 millones de toneladas de carbono, estos almacenan tanto carbono como la atmósfera. Por otra parte luchan contra la erosión de los suelos, estabilizan las crestas de las montañas, las colinas y las pendientes de montañas proporcionando al suelo apoyo mecánico necesario para impedir movimientos superficiales de tierra, en la conservación de suelos y su protección fundamental para las zonas áridas y semiáridas (James, Gaston y Balmford, 2001; Hartshorn, 2016; Booth, 2016).

En el pasado no tuvieron en cuenta la importancia de estos efectos y actualmente se siguen talando los bosques, exponiendo el suelo a procesos erosivos por la acción de viento, lluvias y la degradación de la tierra, siguen disminuyendo la base de recursos agrícolas (FAO, 2015). Los bosques modulan la corriente del río, manteniendo el caudal basal en la estación seca o verano y reduciendo las inundaciones durante las altas precipitaciones del invierno. Sin bosques tropicales, las inundaciones y sequías son extremas (Hartshorn, 2016).

La tendencia en el siglo XXI es manejar el bosque en el marco de una visión ecosistémica, paisajista, integral, participativa y de uso múltiple, orientado a la obtención del rendimiento sostenido de los diversos productos, bienes y servicios que ofrece, con el fin de mejorar las condiciones y calidad de vida de la sociedad, dando origen al concepto de Manejo Forestal Sustentable o Manejo Forestal Sostenible (MFS). El manejo forestal sustentable moderno se concibe entonces como un sistema de toma de decisiones multiobjetivo que atiende los factores ecológico, económico y social (Aguirre-Calderón, 2015). Actualmente los procesos de reforestación tienen como objetivo proteger los árboles y bosques buscando proteger los suelos, recurso fundamental para el desarrollo de la seguridad alimentaria y la salud del medio ambiente (FAO, 2015).

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1.3.2 Importancia de las especies forestales nativas. Las especies nativas generan ingresos y promueven la biodiversidad en las comunidades rurales de las regiones (García-de la Cruz, Ramos y Becerra, 2011). El aumento de las especies forestales nativas, incrementa consigo el número de nichos ecológicos de numerosas especies de la fauna autóctona que con los procesos de deforestación han visto reducido ampliamente su hábitat (Frassón et al. 2017). En general, las especies nativas además de adaptarse a las condiciones bióticas y abióticas locales, mantienen interrelaciones ecológicas con vectores de polinización y agentes de dispersión (Du, Mi, Liu, Chen y Ma, 2009) y, consecuentemente, contribuyen a la conservación de la biodiversidad y otros servicios ecosistémicos (Baral, Guariguata y Keenan, 2016).

1.3.3 Sector forestal en Colombia. En Colombia, en la Amazonia se concentra el 67,2 % del total de bosque natural, la región Andina comprende el 17,2 %, la región Pacífica un 8,9 %, región Orinoquía con un 3,7 % y en último lugar la región Caribe con un 3 %. Cabe resaltar que la región Pacífica aunque ocupe el tercer lugar a nivel nacional es considera una región conservadora de bosques dado a que su área boscosa ocupa el 78,6 % de la región (CVS, 2016).

En el año 2013, se identificó que los departamentos de Amazonas, Guainía, Caquetá, Vaupés y Guaviare registraron el 57 % de los bosques totales en Colombia y conservan un 73 % y 97 % su cobertura forestal en sus grandes extensiones (CVS, 2016). En Colombia se registraron en bosque seco 8.882.854 ha, donde en la región Caribe se encontraron 367.761 ha, reflejadas en bosque natural 202.423 y 165.338 de bosques implementados para uso agrícola (García, Cubides, Corzo y Etter, 2014).

El Ministerio del Medio Ambiente de Colombia estimó una deforestación de 120 mil ha por año que constituye el 32 % del territorio nacional y afecta en un 55 % la región Andina, 40 % la región Pacífica, 30 % la región Caribe, 15 % la región de la Orinoquía y 10 % la Amazonia, por lo cual se considera que los bosques naturales se encuentran amenazados de forma intensiva por la deforestación (MAVDT, 2011). La problemática generada por la deforestación le brinda a Colombia gran ventaja comparativa por sus condiciones edafoclimáticas dado que le permite producir maderas de alta calidad durante todo el año (MADR, 2005; CFC, 2011; Espitia-Camacho et al. 2017a).

Para la sostenibilidad de la producción de la madera el sector forestal comercial de Colombia opta por incrementar las áreas plantadas y así mejorar la productividad, la competitividad y sostenibilidad de las plantaciones, aunque cuente con recursos genéticos limitados que sean de buena calidad (Murillo-Gamboa et al. 2012). En Colombia sólo se está usando el 2,06 % del potencial forestal. De las 114 millones de hectáreas de extensión del país, existe un potencial para el desarrollo de proyectos forestales de 17 millones de hectáreas, de las cuales sólo están siendo utilizadas en plantaciones forestales comerciales 350.000 ha (PROEXPORT, 2012).

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El sector forestal en Colombia y el departamento de Córdoba se encuentra en uno de los componentes agrarios más competitivos del mercado. Como consecuencia de esto, el gobierno colombiano optó por aprovechar las ventajas comparativas de este mundo de economías abiertas, por lo cual definió ciertas políticas estratégicas en consenso con sectores académicos, reforestadores, comercializadores, y transformadores de la madera, para así generar un sector forestal competitivo, generador de desarrollo y bienestar rural (Espitia-Camacho et al. 2017a).

1.3.4 El sector forestal en el departamento de Córdoba. Córdoba cuenta con un área de extensión de 2.502.060 hectáreas, distribuidas de acuerdo al uso potencial del suelo de la siguiente manera: 595.000 has. potencialmente agrícolas; 260.000 has. potencialmente ganaderas; 983.000 has potenciales para sistemas agroforestales; y 181.000 has. para sistemas forestales. Sin embargo, actualmente se presentan las siguientes distribuciones: su mayor disposición de suelo es para el sector pecuario con 1.748.121 has.; 556.627 has. forestales: entre estos los bosques naturales y plantados; el sector agrícola solo cuenta con 140.923 has.; y por otra parte la infraestructura ganadera, porcina, avícola, piscícola, agrícola y agropecuaria, cuerpos de agua y otros fines ocupan 56.389 has. (CVS, 2016).

El departamento de Córdoba tiene una meta de 100 mil hectáreas plantadas de forestales para el 2025, buscando ampliar así la oferta de especies en la Cadena Forestal del departamento, todo esto con apoyo gubernamental e investigación intensiva continua de las especies nativas y exóticas. En estudios realizados hasta el 2014, se determinó que el departamento cuenta con 32.800 ha de forestales, que representan el 9% a nivel nacional, donde se destacó las especies forestales Tabebuia rosea (Bertol.) y Bombacopsis quinata, que ocuparan 11.800 ha (36%) del área forestal plantada (Correa et al. 2013; Espitia et al. 2014; CFC, 2015; Espitia-Camacho et al. 2017a).

Dentro de las 15 especies nativas que han sido seleccionadas por la Cadena Forestal del departamento, por su adaptación a las condiciones agroecológicas, priorizadas por su potencial de reforestación e industrial y desarrollo para el sector comercial en la calidad de madera y su alto potencial para incrementar rendimientos con trabajos de biotecnología y mejoramiento genético en el departamento de Córdoba se encuentran; Cedro (Cedrela odorata L.), Abarco (Cariniana pyriformis Miers), Ceiba roja (Bombacopsis quinata [Jack.] Dugand), Roble (Tabebuia rosea), Chingalé (Jacaranda copaia), Caracolí (Anacardium excelsum L.), Cedro sabanero (Juglans neotropica), Floramarillo (Vochysia tetraphylla) y Tambor (Schizolobium parahyba [Vell.] Blake).

La mayoría de estas especies se encuentran en amenaza y peligro de extinción por su uso indiscriminado del bosque natural por su madera, quema y deforestación para otros usos, son especies que no cuentan con paquete tecnológico debido a su poca investigación (CONIF-MMA-OIMT, 1998; CFC, 2011; Espitia-Camacho et al. 2017a; Espitia-Camacho et al. 2017b; Espitia-Camacho et al. 2017c). Por otro lado,

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en el departamento de Córdoba los procesos de reforestación se encuentran limitados por la disposición de las semillas certificadas, conduciendo a los reforestadores a la colecta de semillas en campos comerciales para el establecimiento de viveros y no tienen en cuenta los criterios fitosanitarios (CFC, 2011; Espitia et al. 2014).

Entre las ventajas de plantar especies forestales nativas cabe resaltar que la plasticidad que poseen les permite adaptarse a las condiciones del trópico, en los que se encuentran los bosques primarios, secos y húmedos. Otras características importantes son alta producción y calidad de sus maderas, la participación en la reducción del deterioro ambiental; además de ser fuentes generadoras de empleo e ingresos en las zonas rurales más pobres del país además de proporcionar múltiples servicios ecosistémicos (FAO, 2010; Araméndiz-Tatis, Espitia-Camacho y Cardona, 2010; MAVDT, 2011; Baral et al. 2016; Espitia-Camacho et al. 2017a).

1.3.5 Situación actual del ébano en el Caribe colombiano. Según Cárdenas y Salinas (2006), C. ebano se encuentra en el registro del libro rojo de las plantas de Colombia en peligro de extinción, debido a su baja población como consecuencia de la explotación de su madera para fines comerciales.

Esta especie se encuentra en la lista de especies de plantas del Bosque Seco Tropical endémicas de Colombia, pero se conocen sólo de registros para Neguanje y sur de la Guajira. Se pueden encontrar estas especies en zonas urbanas, periurbanas, rurales y bosques naturales en el municipio de Montería y municipios aledaños a la capital del departamento de Córdoba de manera esporádica, además, recientemente se ha reportado su uso y multiplicación con fines de embellecimiento urbano como planta ornamental en el departamento de Antioquia (López y Cárdenas, 2002; García et al. 2014).

1.3.6 Generalidades del ébano. Según Salamanca (2016), el ébano es un árbol de bosques bien conservados que puede llegar a crecer hasta 25 metros. Su tronco es liso y de color grisáceo, aproximadamente a los 4 años la corteza del tronco empieza a caer, dando una apariencia multicolor de parches blanquecinos, grises y verde oliva. Regularmente tienen un fuste muy recto y las ramas empiezan a crecer desde 1 m de altura. Tiene una copa aparasolada y de follaje translúcido, la corteza es moteada. Las hojas son bipinnadas, alternas y dísticas; los foliolos elípticos, miden cerca de 1 cm de largo. Las flores pequeñas se disponen en racimos axilares, de color amarillo con pintas rojizas. Los frutos son legumbres cortas y engrosadas, de unos 6 a 8 cm de largo (Restrepo-Urango y Torres-Ospina, 2014).

Las flores son amarillas y pequeñas, productoras de néctar por lo que atrae mariposas y abejas. Los frutos del ébano son unas legumbres comprimidas, de textura brillante y lisa, muy duras por lo que se dificulta sacar la semilla. Dependiendo de la localidad y sus condiciones ambientales las legumbres y las semillas pueden variar de tamaño y grosor. Cada legumbre regularmente puede contener de dos a seis semillas con diferencias en tamaño y en color. Se ha

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observado que las semillas más grandes (4-6 mm) germinan más rápidamente que las de tamaño más pequeño (2-3 mm) (Salamanca, 2016).

Los árboles de ébano se encuentran generalmente aislados, muchos en riesgo de tala, razón por la cual este árbol es considerado un árbol nativo en vía de extinción (Cárdenas y Salinas, 2006). El ébano es una madera muy fina y dura, puede llegar a doblar las hojas de las motosierras (Salamanca, 2016).

Por su brillo y dureza la madera se utiliza para alta ebanistería y para incrustaciones en madera. No es atacada por el comején, la corteza es delgada y ha mostrado buena adaptación a los ambientes urbanos. Su importancia para la fauna es que muchos animales tienen comedero bajo su sombra, este árbol permite combinarlo con potreros o con cultivos porque su sombra no es tan densa (Arroyave, Morales y Moreno, 2015).

Dentro de las condiciones edafoclímaticas que exige esta especie para su crecimiento, se reporta que es un árbol que se desarrolla de manera óptima en alturas que van desde los 0 a 1000 m.s.n.m. en zonas secas y se adapta hasta los 1500 m.s.n.m. en zonas húmedas. El ébano es un árbol longevo y caducifolio (pierde dos veces al año sus hojas), tolera la plena exposición solar. Su crecimiento inicial es rápido (en promedio un metro/año), luego de medio a lento, sin embargo, no se conoce el lapso vital de esta especie (Herrera-Ramírez, 2014; Hernández-Gómez, Osorio-Vega y León-Peláez, 2018).

1.3.6.1 Descripción taxonómica:

De acuerdo a la descripción realizada por Gustav Karsten (1863), la especie se clasifica como:

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Fabales

Familia: Caesalpinoideae - Fabaceae

Género: Caesalpinia

Nombre científico: Caesalpinia ebano

Nombre común: Ébano

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Categoría nacional: En peligro (Cárdenas y Salinas, 2006).

La especie Libidibia ebano (Karst) Britt & Killip está íntimamente emparentada con C. ebano, tanto que se consideran sinónimos para muchos casos.

1.3.7 Generalidades de las semillas.

1.3.7.1 Concepto de semilla. La semilla es el sitio donde el esporofito o embrión se desarrolla parcialmente. Es una etapa crítica intermediaria en el ciclo de vida de las angiospermas y gimnospermas, lo cual garantiza la propagación y supervivencia de las especies. Las semillas son entidades dinámicas y tridimensionales, y su morfología es el resultado de procesos fisiológicos y ambientales (Flores, 2010).

1.3.7.2 Proceso de Germinación. La germinación es la etapa inicial y crucial en la ontogenia de las plantas, sea en los procesos de regeneración de especies silvestres (Durr et al. 2015; Palomeque et al. 2017), así como también para la producción de plántulas para la restauración activa, que implica un esfuerzo humano activo para acelerar e influir en la trayectoria sucesional de los ecosistemas en recuperación (Holl y Aide, 2011). Para que el proceso de germinación tenga lugar, es necesario que se den una serie de condiciones ambientales favorables como son: un sustrato húmedo, suficiente disponibilidad de oxígeno que permita la respiración aerobia y una temperatura adecuada (Restrepo-Urango y Torres-Ospina, 2014). Las semillas de la especie forestal C. ebano deben ser sometidas a tratamientos de escarificación como inmersión en agua a 70 ºC durante 5 minutos, se siembran posteriormente a 0.5 cm de profundidad y distancias de 5 x 10 cm (Devia, Moncaleano y Niño, 2014).

1.3.7.3 Fase de imbibición. En forestales la absorción de agua es el primer paso de la germinación. Durante este proceso se realiza una alta absorción de agua por aquellos tejidos constituyentes de la semilla, acompañado de un aumento proporcional en la actividad respiratoria (Restrepo-Urango y Torres-Ospina, 2014). Esta absorción de agua genera en las semillas la hinchazón y ruptura de la testa (Doria, 2010). Las semillas son sensibles a la luz y están expuestas al daño por la influencia de la humedad (Ceballos y López, 2007).

1.3.7.4 Fase de germinación. Se considera germinación la aparición de la radícula y plúmula a partir del embrión (Ceballos y López, 2007). En este proceso la absorción de agua se reduce, llegando incluso a detenerse, en esta fase se producen las transformaciones metabólicas (Restrepo-Urango y Torres-Ospina, 2014), absorción del agua, con ayuda de la respiración, genera la síntesis proteica y movilización de reservas (Doria, 2010).

1.3.7.5 Fase de crecimiento. Última fase de la germinación y se asocia a la emergencia de la radícula y se caracteriza por la absorción de agua que aumenta, al igual que la actividad respiratoria (Restrepo-Urango y Torres-Ospina, 2014). En

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esta fase post-germinativa la radícula se ve interrumpida por la cubierta seminal, se consume las reservas alimentarias y el endospermo se degrada.

1.3.8 Factores que afectan la germinación en semillas de especies forestales. Varios aspectos morfológicos (por ejemplo color, forma, tamaño, peso) y fisiológicos de semillas (ejemplo; dormancia) deben ser caracterizados a nivel de árboles y poblaciones de una especie y relacionar con la germinación y el crecimiento inicial de plántulas, pues todos estos ejercen influencia en el proceso de germinación de las especies vegetales (Palomeque et al., 2017).

Se ha visto que la masa o el tamaño de la semilla es en general el predictor más fuerte de las tasas demográficas en los árboles tropicales y es definida como la cantidad de reservas de alimentos disponibles para el establecimiento de un individuo. Las especies con una masa de semilla con pocas reservas suelen establecerse y germinar menos en ambientes con altos recursos por lo que estas especies suelen tener altas tasas de crecimiento y mortalidad (Álvarez et al. 2015). Estudios reportan que semillas grandes tienen mayor capacidad germinativa y que el peso de la semilla en forestales puede ser usado como una estrategia para incrementar la probabilidad de éxito en el establecimiento de viveros (Jacquemyn, Brys y Hermy, 2001; Barboza-Nogueira et al. 2014).

Por otra parte, la germinación de semillas está asociada a factores como temperatura, agua, salinidad (Wang et al., 2016); no obstante, hay relaciones entre factores ecológicos, morfológicos y fisiológicos (Milberg et al. 2000), temperatura y peso con la germinación (Yang et al. 2008; Barboza-Nogueira et al. 2014; Souza et al. 2016), absorción de agua de semillas con la dinámica de germinación (Wierzbicka y Obidzinska, 1998).

Otro factor reportado en la literatura es la pureza, en el trabajo de Palomeque et al. (2017), evaluando la variabilidad intraespecífica en la calidad de semillas de especies forestales nativas en bosques montanos en el sur del Ecuador, se encontró que los individuos que presentaron mayor pureza también mostraron mayor porcentaje de germinación. Tal comportamiento podría atribuirse al estado de las semillas colectadas, pues se observó que las semillas con menor pureza presentaron daños ocasionados por larvas de insectos, lo que implicaría una reducción en la calidad del embrión y, posteriormente, en los porcentajes de germinación.

1.3.9 Estudios de anatomía, viabilidad y germinación en especies forestales.

1.3.9.1 Estudios sobre anatomía de las semillas de especies forestales. El estudio de las características anatómicas, morfológicas, dimensiones y peso de las semillas de especies forestales nativas y exóticas, ha sido realizado por varios autores, los cuales se han centrado en determinar la viabilidad, germinación, conservación, uso en viveros y silvicultura en semillas (Alves-de Azerêdo, Cesar-de Paula y Valiengo-Valeri, 2011; Ribeiro-Reis, Pelacani, Cardoso-Antunes y De

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Castro, 2012; Brenha, De Oliveira, Cândido, Godoy y Alves, 2012; Nascimento, 2013; Hössel, Alves-de Oliveira, Fabiane, Wagner-Júnior y Citadin, 2013; Deminicis et al. 2014; da Silva-e Silva, de Oliveira-e Silva, Vitti-Moro y Daiton-Vieira, 2015). En Colombia los estudios más mencionados en este tópico en especies forestales nativas, son los realizados por Rodríguez y Nieto (1999), Rodríguez (2000) y Gómez-Restrepo y Toro-Murillo (2007) en semillas de las especies Alnus jorullensis, Cariniana piryformis, Cedrela odorata, cordia alliodora, Tabebuia rosea, Anacardium excelsum, Cedrela montana, Enterolobium cyclocarpum, Erythrina edulis, Erythrina fusca, Jacaranda copaia, Juglans neotropica, Lafoensia speciosa, Samanea saman y Tabebuia chrysantha.

Recientemente, los trabajos de Espitia-Camacho et al. (2017a; 2017b; 2017c), sobre anatomía y morfología de especies forestales nativas (Bombacopsis quinata, Cedrela odorata L., Cariniana pyriformis Miers, Schizolobium parahyba (Vell.) Blake y Anacardium excelsum), han puesto en evidencia las variaciones entre las especies estudiadas y han contribuido de manera significativa a incrementar el conocimiento fundamental de la anatomía, biología, fisiología y germinación de tales especies.

1.3.9.2 Prueba bioquímica de Tetrazolio y viabilidad de semillas de especies forestales. El análisis de la calidad de semillas de especies forestales contribuye a conservar la identidad de la calidad genética de un lote de semillas, además sirve para determinar el máximo potencial de germinación de una muestra de semillas en el menor tiempo posible bajo condiciones microambientales óptimas. Las pruebas de calidad también permiten asegurar la probabilidad de incrementar la productividad de la cosecha (Piedrahita, 2008). Los análisis de calidad integral de las semillas se basan en normas y metodologías nacionales e internacionales estandarizadas y aceptadas en su mercadeo y comercialización. Estas pruebas involucran principalmente el análisis de pureza, sanidad, peso, humedad, viabilidad, vigor y varios parámetros fisiológicos de la germinación en condiciones controladas de laboratorio (ISTA, 2014; Espitia-Camacho et al. 2017a).

El control de calidad de las semillas a través de metodologías de laboratorio rápidas permite alcanzar un importante grado de confiabilidad en la toma de decisiones comerciales, en el momento de la siembra, o bien para evaluar su posibilidad de conservación o almacenamiento. En particular, la prueba de tetrazolio constituye una herramienta de gran utilidad para productores de semilla, seleccionadores y comerciantes, ya que puede ayudar a la toma de decisiones oportunas, especialmente durante los meses de verano, inmediatamente a la cosecha, en razón a que muchas semillas de gramíneas forrajeras, leguminosas, arbóreas y forestales poseen un alto nivel de dormancia que causa una baja germinación que no debe confundirse con mala calidad de la semilla (Espitia-Camacho et al. 2017a).

La prueba de viabilidad de tetrazolio (TZ) permite conocer la calidad de cada lote o accesión, sino que también puede servir de guía para identificar otros factores que afectan la germinación de las semillas (Ruiz, 2009). En la prueba de tetrazolio se

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usa una solución incolora de 2, 3, 5 trifenil cloruro de tetrazolio y trifenilformazan como un indicador de respiración celular, donde el tetrazolio queda reducido cambiando de color dentro de las células vivas. El indicador se embebe por la semilla dentro de sus tejidos, en los que interactúa con procesos de reducción de las células vivas y se produce en ellas una sustancia roja, estable y no difusible (ISTA, 2005; 2014). Esto hace que sea posible distinguir las partes vivas de la semilla, el color rojo tenue una semilla con tejido vivo y vigoroso; rojo intenso con tejido vivo y dañado; e incolora en tejido muerto (Moore, 1973; França-Neto y Krzyzanowski, 2019).

La concentración de la solución de TZ y el tiempo de tinción, además de la adecuada evaluación de la prueba son fundamentales para que se obtengan resultados confiables en cuanto a la viabilidad y el vigor de la semilla (Pinho, De Lima, Vilela y Borges, 2011).

En muchas especies arbóreas la prueba bioquímica de tetrazolio ha sido utilizada para la determinación de la viabilidad en semillas, sólo por mencionar algunas: Gliricidia sepium (Jacq.) Steud. (Ribeiro-Reis et al. 2012), Plinia trunciflora (O. Berg) Kausel (Hössel et al. 2013), Tabebuia roseoalba (Ridl.) Sandwith (Caravita-Abbade y Takaki 2014), Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz (Souza et al. 2016), Schizolobium parahyba y otras (Espitia-Camacho et al. 2017a), Cedrela odorata L. y Cariniana pyriformis Miers (Espitia-Camacho et al. 2017b), Bombacopsis quinata y Anacardium excelsum (Espitia-Camacho et al. 2017c), Platymiscium floribundum, Lonchocarpus muehlbergianus y Acacia polyphylla DC. (Masullo, Piña-Rodrigues, Figliolia y Américo, 2017), entre otros.

1.3.9.3 Estudios sobre parámetros de la germinación de las semillas de especies forestales. Para los procesos de conservación, colecta, manejo, autoecologia, prácticas silviculturales exitosas es fundamental el conocimiento e interpretación de los parámetros de germinación y plántulas en laboratorio, invernadero o casa-malla (Caravita-Abbade y Takaki 2014; Deminicis et al. 2014; Guimarães-Rezende et al. 2015; Espitia et al. 2016).

La calidad fisiológica en lotes de semillas generalmente es determinada por la germinación; al respecto, Copeland y Mcdonlad (2001), argumentan que la sola estimación del porcentaje de germinación resulta deficiente para discriminar lotes de semilla en relación con la rapidez y uniformidad de la germinación, por ello autores como Matthews (1981) y Perry (1984), anotan que además del porcentaje de germinación otros parámetros como el índice de velocidad de germinación (IVG), germinación diaria media (GDM), valor pico de la germinación (VP), valor de germinación (VG), vigor y la energía germinativa, entre otros, son importantes para la cuantificación de la calidad fisiológica de las semillas.

Por otra parte, la velocidad de germinación provee información útil sobre el grado de pérdida de dormancia de semillas y las condiciones favorables de germinación; así mismo, el tiempo de germinación de una semilla en relación con otras semillas

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puede influir en la cantidad de recursos disponibles para una plántula (Baskin y Baskin, 2014).

Para viveristas, los parámetros de germinación como: tiempo promedio de germinación, velocidad de germinación o la capacidad de germinación y sincronía de germinación son aspectos importantes en el manejo de plántulas, así como también para optimizar los costos de producción. Además, la variabilidad intraespecífica de estos parámetros resulta importante en la producción masiva de plántulas; por ejemplo, grandes diferencias en los porcentajes de germinación entre individuos de una especie y la poca sincronía de la germinación podrían repercutir en el manejo de las plántulas a nivel de viveros (Palomeque et al. 2017).

Las especies forestales nativas de interés para el departamento de Córdoba han sido poco investigadas en su respuesta y diferencia en los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas, cuando las pruebas se realizan en cámara germinativa en comparación con las mismas en casa-malla. Se han reconocido estos estudios, por el aporte fundamental para el uso sostenible, conservación, multiplicación, reforestación y mejoramiento genético de tales especies promisorias de Córdoba y Colombia (Correa et al. 2013; Espitia et al. 2016).

Varias investigaciones han reportado diferencias estadísticas en los parámetros de calidad fisiológica de las semillas en diferentes especies, lotes familiares de una misma especie o diferentes procedencias en varias especies forestales o arbustivas (Silva, Ursulino-Alves, Pontes-Matos y Alcântara-Bruno, 2012; Ferreira, Souto, Lúcio, Souto y de Souza, 2012; Correa et al. 2013; Zohra, Ali y Moulay, 2014; Barboza-Nogueira et al. 2014; Souza et al. 2016). Adicionalmente, otros estudios en Cotinus coggygria (Olmez, Gokturk, Karasah y Yilmaz, 2009), Punica granatum (Gokturk, Olmez, Karasah y Surat, 2012), Bromus tomentellus, Bromus inermis y Bromus persicus (Armaki, Hashemi y Azarnivand, 2013) y en Poa bulbosa, Poa annua y Poa pratensis (Armaki, 2014) han detectado diferencias estadísticas en los parámetros de la germinación de la semillas, a nivel de especies y con valores más altos en las condiciones de cámaras germinativas, en comparación con las obtenidas en invernaderos (Espitia et al. 2016).

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1.4 OBJETIVOS

1.4.1 Objetivo general

Contribuir a generar información básica sobre la anatomía externa e interna, viabilidad y parámetros fisiológicos de la germinación de la semilla de ébano (Caesalpinia ebano H. Karst.) en el Valle del Sinú Medio, Montería, Colombia.

1.4.2 Objetivos específicos

Describir e ilustrar las características anatómicas externas e internas de las semillas.

Determinar un patrón óptimo de tinción para definir la viabilidad de las semillas de ébano mediante la prueba de tetrazolio.

Estimar los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas de ébano en cámara germinativa y casa malla.

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1.5 LITERATURA CITADA

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CAPÍTULO II

DESCRIPCIÓN E ILUSTRACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS ANATÓMICAS EXTERNAS E INTERNAS DE LAS

SEMILLAS DE ÉBANO (Caesalpinia ebano H. Karst)

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CHAPTER II

DESCRIPTION AND ILLUSTRATION OF THE EXTERNAL AND INTERNAL

ANATOMY CHARACTERISTICS OF EBONY (Caesalpinia ebano H. Karst)

SEEDS

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RESUMEN

El ébano es un forestal registrado en el libro rojo de las plantas en peligro de extinción. La especie es endémica del Bosque Seco Tropical colombiano y su uso se reporta en la reforestación urbana y artesanías. El conocimiento de la anatomía externa e interna de las semillas es fundamental para comprender su viabilidad, dormancia y germinación. El objetivo del estudio fue describir las características anatómicas de la semilla Caesalpinia ebano H. Karst. El trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Fitomejoramiento de la Universidad de Córdoba (Colombia), en el período comprendido entre febrero y marzo del 2019. Para lograr el objetivo propuesto, se utilizaron treinta semillas completas y sanas, tomadas al azar de un compuesto balanceado de las tres procedencias. En razón a que la semilla presentó una cubierta muy dura, se realizó escarificación mecánica con ayuda de una lima, en la cubierta externa distal de donde emerge la radícula, adicionalmente, un pre-acondicionamiento basado en remojo e inmersión de las semillas por 12 horas en agua destilada a temperatura ambiente (27 ºC). Posteriormente se realizó un corte longitudinal y con ayuda del estereoscopio, se identificaron en su estructura interna la presencia de un embrión de tipo axial, subtipo lineal, de color verde claro, cubierto por una membrana gruesa traslúcida. En su estructura externa presenta una cubierta seminal rígida lisa y seca de color pardo oscuro a negro, de forma ovoide y lisa.

Palabras claves: anatomía, estructura externa, estructura interna.

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ABSTRACT

Ebony is a forest registered in the red book of endangered plants. The species is endemic from the Colombian tropical dry forest and its use is reported in urban reforestation and handicrafts. Knowledge of the external and internal anatomy of seeds is essential to understand their viability, dormancy and germination. The objective of the study was to describe the anatomical characteristics of the Caesalpinia ebano H. Karst seed. The work was carried out in the Plant Breeding Laboratory of the University of Córdoba (Colombia), in the period between February and March 2019. To achieve the proposed objective, thirty complete and healthy seeds were used, taken at random from a balanced compound from the three provenances. Due to the fact that the seed had a very hard cover, mechanical scarification was carried out with the help of a file, in the distal external cover where the radicle emerges, additionally, a pre-conditioning based on soaking and immersion of the seeds for 12 hours in distilled water at room temperature (27 ºC). Subsequently, a longitudinal cut was made and with the help of the stereoscope, the presence of an axial type, linear subtype, light green in color, covered by a thick translucent membrane, was identified in its internal structure. In its external structure it presents a smooth and dry rigid seminal covering from dark brown to black, ovoid and smooth.

Keywords: anatomy, internal structure, external structure.

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2.1 INTRODUCCIÓN

En Colombia, al igual que otros países, ha aumentado el interés por el uso de especies nativas para proyectos de reforestación y restauración debido a su fácil adaptación a las variaciones edafo-climáticas, no obstante, los estudios sobre procesos germinativos, descripción e ilustración morfológica y cuantitativa de semillas y plántulas; esenciales para comprender diversos aspectos en especies forestales tropicales, son escasos (López-Vargas y Macías-Pinto, 2017; Espitia-Camacho et al. 2017a).

El ébano es un forestal de la familia Fabaceae registrado en el libro rojo de las plantas de Colombia en peligro de extinción, a razón de su baja población por la explotación de su madera (Cárdenas y Salinas, 2006). Es un árbol categorizado en la lista de especies del Bosque Seco Tropical endémicas de Colombia, solo se encuentran registros para Neguanje y sur de la Guajira. Sin embargo, pueden ser encontrados en zonas urbanas, periurbanas, rurales y bosques naturales en el municipio de Montería y municipios aledaños a la capital del departamento de Córdoba de manera esporádica, además, recientemente se ha reportado su uso y multiplicación con fines de artesanías, embellecimiento urbano como planta ornamental en el departamento de Antioquia (López y Cárdenas, 2002; García et al. 2014).

Algunas familias de especies forestales presentan en sus semillas problemas de permeabilidad al agua. El efecto de la testa puede ser mecánico o químico debido a la presencia de inhibidores fenólicos, impidiendo el flujo necesario de agua y oxígeno para la germinación (Bewley y Black, 1994; Maldonado-Arciniegas, 2015).

Según Navarro et al. (2003), el desarrollo del embrión es un proceso bastante complejo y empieza posteriormente a la fecundación. Las semillas de la mayoría de las especies vienen contenidas al interior del fruto. La semilla consta de tres partes básicas: embrión, endospermo, y las cubiertas seminales:

La cubierta seminal: cuya función es proporcionar al embrión protección mecánica, obteniendo con esto un eficiente proceso de dispersión y almacenamiento (dormancia). La mayor parte de las especies están conformadas por una cubierta seminal designada testa, y generalmente, una capa interior fina y membranosa denominada tegman. El endospermo: es un tejido de almacenamiento organizado (semillas endospérmicas o albuminosas) o es sustituido por los cotiledones como órganos de reserva (semillas no endospérmicas), utilizadas por el embrión para la germinación, y las primeras etapas de crecimiento y desarrollo por la plántula. El embrión: es el órgano fundamental de la semilla, debido a que permite el origen de la nueva planta. En él se diferencian la radícula, la plúmula o epicotilo y los cotiledones, fijados en el eje embrionario (hipocotilo) (Navarro et al. 2003).

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Cuando la semilla está cubierta superficialmente por una capa dura que impide el acceso de agua y oxígeno al embrión, esto se conoce como dormancia (Rodríguez, Eguiatre y Hernandes, 1982; Maldonado-Arciniegas, 2015). La dormancia depende tanto de las características fisiológicas como de las características morfológicas de la semilla. Existen diferentes tipos de dormancia: fisiológica, morfológica, física y combinatoria. La dormancia más común es la física y se debe a la impermeabilidad al agua de las células del tejido en empalizada de la cubierta seminal, responsable del control del movimiento del agua de imbibición. Para provocar la germinación en semillas y romper la dormancia física, es preciso proceder a la escarificación física o química de la cubierta (Matilla, 2008; Maldonado-Arciniegas, 2015).

En diferentes países las especies arbóreas han retomado algún grado de interés, trascendiendo con esto los estudios sobre anatomía, morfología de frutos y semillas. Algunas de estas investigaciones han sido reportadas por Venier, Funes y Carrizo-García (2012) en Acacia aroma, A. caven, A. atramentaria, A. gilliesii y A. praecox, Escapa, Rothwell, Stockey y Cúneo (2012) en Pararaucaria patagonica Wieland., Varela y Albornoz (2013) en Anadenanthera colubrina var. Cebil., Bruno-Loureiro et al. (2013) en Amburana cearensis (Fr. All.) A.C. Smith., Souza-Reis, Dias-de Freitas, Martins-Leão y dos Santos-Filho (2016) en Apuleia molaris Spruce ex Benth., Geisler, Pinto, Santos y Silveira-Paulilo, (2016) en Peltophorum dubium (Spreng.) Taub. y Mimosa bimucronata (DC) O. Kuntze, Khan y Javed-Zaki (2019) en Cassia fistula L. Binderiya y Kweon (2016) en Berberis amurensis, B. dictyophylla y B. sibirica; entre otras especies cercanas taxonómicamente al ébano: Libidibia ferrea Mart. ex Tul. (L.P. Queiroz) (Batista-Matos, Mata-Ataíde y de Lima-e Borges, 2015).

En Colombia, estudios afines utilizando semilla botánica de especies forestales nativas y exóticas han sido realizados por Rodríguez y Nieto (1999) en Tabebuia rosea (Bertol.) D.C., Cordia alliodora (Ruiz & Pav.) Cham., Cedrela odorata L., Cariniana piryformis Miers., Alnus jorullensis Kunth., y Genipa americana L; Rodríguez (2000) y Gómez-Restrepo y Toro-Murillo (2007) en Anacardium excelsum L., Cedrela montana Moritz ex Turcz., Enterolobium cyclocarpum (Jacq.) Griseb., Erythrina edulis Triana ex Micheli., Erythrina fusca Lour., Jacaranda copaia (Aubl.) D. Don., Juglans neotropica Diels., Lafoensia speciosa (Kunth) DC., Samanea saman (Jacq.) Merr. y Tabebuia chrysantha (Jacq.) G. Nicholson; Reino-Causil (2017) en Swietenia macrophylla King., y Espitia-Camacho et al. (2017a; 2017b; 2017c) en Cedrela odorata L., Cariniana pyriformis Miers., Schizolobium parahyba L., Bombacopsis quinata (Jacq.) W.S.Alverson., y Anacardium excelsum. Algunas investigaciones recientes se han desarrollado por Espitia-Camacho, Araméndiz-Tatis y Cardona-Ayala (2020) en Schizolobium parahyba (Vell.) SF Blake., y Villena-Velásquez, Seminario-Cunya y Valderrama-Cabrera (2019) en Ceasalpinia spinosa (Molina.) Kuntze. El interés por el conocimiento de la caracterización morfométrica, anatomía y protocolos de conservación de las semillas de las especies forestales nativas se reflejan en los estudios antes mencionados; lo que amplía la información base necesaria para posteriores

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estudios que contribuyan a la supervivencia y manejo de especies de interés biológico y/o comercial.

Las características anatómicas de las semillas de especies forestales nativas y exóticas realizados en estudios, por varios autores, son útiles para la determinación de la viabilidad, germinación, manejo sostenible, desarrollo de prácticas silvícolas y adaptación de las especies en diferentes ecosistemas, conservación, uso en viveros y silvicultura (Gaspar-Oliveira, Martins y Nakagawa, 2009; Espitia-Camacho et al., 2017b). Trabajos realizados por Espitia-Camacho et al. (2017a; 2017b; 2017c), sobre anatomía y morfología de especies forestales nativas (Bombacopsis quinata, Cedrela odorata L., Cariniana pyriformis Miers, Schizolobium parahyba (Vell.) Blake y Anacardium excelsum), han expuesto variaciones entre las especies estudiadas y han aportado de manera significativa al aumento del conocimiento fundamental de la anatomía, biología, fisiología y germinación de tales especies.

El presente estudio tuvo como objetivo describir e ilustrar las características anatómicas externas e internas de la semilla de ébano (Caesalpinia ebano H. Karst), bajo las condiciones edafo-climáticas del departamento de Córdoba, con el fin de generar información básica para la conservación, reproducción, estudios de población a nivel de fitomejoramiento, multiplicación y uso sostenible de la especie.

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2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1. Localización. El estudio se realizó entre febrero de 2019, en el Laboratorio de Genética y Fitomejoramiento - LAGEFI, ubicado en la Universidad de Córdoba (Montería, Colombia), en el Valle del Sinú medio, con latitud norte 8° 47′ 16.01″ y 75° 51′ 28.08″ longitud oeste respecto al meridiano de Greenwich. La zona ecológica corresponde al bosque seco tropical con temperatura promedio de 28 ºC, humedad relativa de 84% y precipitación anual de 1.200 mm altitud de 15 msnm y un brillo solar de 5,5 horas luz/día (Palencia, Mercado y Combatt, 2006)

2.2.2. Material genético. Se utilizó semilla sexual de libre polinización de sendos árboles de C. ebano, las cuales fueron colectadas en los municipios de Montería, Tierralta y Berastegüi, en el departamento de Córdoba. La toma de las muestras de semillas, se realizó con base en los protocolos específicos propuestos por Gold et al. (2004).

2.2.3. Procedimiento.

2.2.3.1. Anatomía de semillas. Para la identificación y descripción de los tejidos seminales, en el laboratorio se utilizaron treinta semillas completas y sanas, tomadas al azar de un compuesto balanceado de las tres procedencias. En razón a que la semilla presentó una cubierta muy dura, se realizó escarificación mecánica con ayuda de una lima, en la cubierta externa distal de donde emerge la radícula, el cual no presentó alteraciones internas de la estructura y composición de la semilla en la especie Caesalpinia spinosa (Neri-Chávez, Collazos-Silva, Oliva, Huamán-Huamán y Vásquez-García, 2018), adicionalmente, un pre-acondicionamiento basado en remojo e inmersión de las semillas por 12 horas en agua destilada a temperatura ambiente (27ºC) recomendado por el ISTA (2014).

Posteriormente, se retiró con cuidado la testa sin causar daño a los cotiledones y embriones, luego, se realizó un corte longitudinal a través del embrión, para permitir una total exposición del embrión e identificar de forma precisa las partes esenciales de las semillas a evaluar en la prueba, tales como embrión, endospermo y radícula. Para ello, se apoyó en las descripciones reportadas por Martin (1946) y Niembro (1988) para semillas de estas especies.

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2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.3.1. Descripción de la anatomía externa e interna de la semilla. Las semillas de C. ebano tiene forma ovoide y lisa, con presencia de funículo en la estructura externa donde se presenta la emergencia de la radícula (Figura 2.1a). El corte longitudinal permite la apreciación de las partes esenciales del embrión. En su estructura interna, presenta un embrión que se puede clasificar de tipo axial, subtipo lineal (Martin, 1946), de color verde claro (Figura 2.1b), presenta dos cotiledones de color verde claro, son ovoides y de igual tamaño, uno con respecto del otro, con una germinación epigea (Figura 2.1d).

Figura 2.1. Anatomía interna y externa de la semilla de Caesalpinia ebano H. Karst. a) Semillas enteras y su testa: te = testa, fu = funículo; b) corte longitudinal: em = embrión, ra = radícula, co = cotiledón; c) extrusión radicular; d) elongación radicular: hi = hipocótilo.

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La estructura externa al embrión de C. ebano cuenta con una cubierta seminal dura, seca e impermeable que impide la imbibición, similares a las semillas de Caesalpinia gilliesii reportadas por Moreno, Duplancic, Navas, Herrera-Moratta y Dalmasso (2018). La testa es de color pardo oscuro a negro cuando esta seca y se tornó café cuando se humedeció (Figura 2.2e; 2.2f), seguida de una capa gruesa membranosa de color pardo claro denominada tegmen y posteriormente una membrana gruesa traslúcida que protege al embrión (Figura 2.2c).

Figura 2.2. Estructura externa al embrión de la semilla de Caesalpinia ebano H.

Karst.

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2.4 CONCLUSIONES

Para la descripción de la anatomía interna de la semilla se requiere: realizar escarificación mecánica en la cubierta externa distal de donde emerge la radícula y pre-acondicionamiento basado en remojo e inmersión de las semillas por 12 horas en agua destilada a temperatura ambiente (27 ºC), adicionalmente, cortar longitudinalmente la semilla para la apreciación de las partes esenciales.

La semillas de Caesalpinia ebano H. Karst, cuenta con una testa color pardo oscuro, rígida y dura que permeabiliza al embrión, cuya función es evitar el rompimiento de dormancia en la semilla, un funículo en su estructura externa donde emerge la radícula. La anatomía interna está comprendida por cotiledones, un embrión color verde claro, de tipo axial y subtipo lineal, envueltos en una capa membranosa gruesa protectora.

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CAPÍTULO III

DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD CON TETRAZOLIO EN SEMILLAS DE ÉBANO

(Caesalpinia ebano H. Karst)

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CHAPTER III

FEASIBILITY DETERMINATION TETRAZOLIUM SEEDS OF EBONY

(Caesalpinia ebano H. Karst)

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RESUMEN

La prueba de tetrazolio es importante en la evaluación de la calidad fisiológica de la semilla, no solo por su rapidez, sino también por la cantidad de información que presenta la prueba, como los índices de viabilidad y vigor. El objetivo del estudio fue evaluar la efectividad de la prueba de tetrazolio y determinar el protocolo para medir la viabilidad de la semilla de ébano. El estudio se realizó en febrero de 2019 en el Laboratorio de Genética y Fitomejoramiento de la Universidad de Córdoba (Colombia). Inicialmente, se empleó una muestra de 20 semillas frescas de polinización libre, luego se sometieron a tinción con tetrazolio al 1,0% durante 2 horas y se definieron los patrones de tinción. Posteriormente se evaluó la viabilidad de las semillas usando dos tiempos de tinción (2 y 3 horas) y tres concentraciones de tetrazolio (0,5%, 1,0% y 1,5%), bajo un diseño completamente al azar (DCA) con seis tratamientos y tres repeticiones de 20 semillas. Para la evaluación de la viabilidad en los tratamientos con tetrazolio se implementó el patrón de semillas viables (V), inviables (I), dudosas (D) y una categoría viabilidad total (VIATO), definidos por cada tratamiento bajo la observación al estereoscopio. Los porcentajes de semillas viables estuvieron entre 73,3 y 95,0%, de semillas inviables entre 0,0 y 8,3%, mientras que para las semillas dudosas se mantuvieron entre 5,0 y 18,3%, y los porcentajes de (VIATO) entre 82,5 y 97,5%. La concentración de 1,0 % de tetrazolio durante dos horas, resultó ser efectiva para determinar la viabilidad de las semillas de esta especie.

Palabras clave: semillas, forestales, patrones topológicos, prueba química.

.

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ABSTRACT

The tetrazolium test is important in the evaluation of the seed physiological quality, not only due to its quickness, but also because of the amount of information that the test presents, such as the indexes of viability and vigor. The aim of the study was to the effectiveness the effectiveness of the tetrazolium test and determine the protocol to measure the viability of Caesalpinia ebano H. Karst seed. The study was conducted in February 2019 at the Laboratory of Plant Breeding, University of Cordoba (Colombia). Initially, a sample of 20 seeds was taken, then stained with 1.0% tetrazolium for 2 hours, and staining patterns defined. Subsequently the seed viability staining using two times (2 to 3 hours) and three concentrations (0.5%, 1.0% and 1.5%), under a completely random design (CRD) was assessed 6 treatments and 4 replicates of 20 seeds. For the evaluation of viability in the treatments with tetrazolium was used the pattern of viable (V), inviable (I), dubious (D) and a total feasibility category (VIATO) seeds, defined by each treatment under stereoscope observation. The percentages of viable seeds were between 73.3 and 95.0%, the percentages of non-viable seeds between 0.0 and 8.3%, while for doubtful seeds were maintained between 5.0 and 19.0% and the percentages of (VIATO) between 82.5 and 97.5%. The concentration of 1.0 % tetrazolium for two hours, proved to be effective to determine the seed viability of this specie.

Keywords: seeds, forest, topological patterns, chemical test.

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3.1 INTRODUCCIÓN

Las semillas como unidad de reproducción sexual de las plantas, tiene como función multiplicar y perpetuar la especie. Constituyen el proceso de supervivencia, es decir, que las plantas perduren de generación tras generación. Son conocidas como la unidad móvil de la planta porque permite que las plantas encuentran nuevos sitios y microambientes. Las semillas son el punto de partida para la producción y es indispensable que tenga una buena respuesta en las condiciones de siembra y que produzca plántulas vigorosas (Doria, 2010). Gran parte de las especies forestales del trópico se propagan por semilla sexual (Espitia-Camacho et al. 2017b).

La viabilidad de las semillas hace referencia a la capacidad de germinar y de originar plántulas normales en condiciones ambientales favorables; en consecuencia, la viabilidad de las accesiones se debe determinar antes de empacar y almacenar las semillas en el banco de germoplasma, y a intervalos regulares durante el almacenamiento (Rao et al., 2007; Espitia-Camacho et. al., 2017a). La implementación de semillas de alta calidad es extremadamente importante en un sistema de producción. Sin embargo, tener resultados rápidos de análisis de calidad también es esencial para tomar decisiones sobre las semillas. Por tal razón, a partir de que el análisis de semillas se convirtió en una disciplina científica, se ha buscado alcanzar un diagnóstico confiable de la calidad de las semillas sin necesidad de pruebas de germinación (Craviotto, Arango y Gallo, 2008). Las pruebas rápidas han sido esenciales para evaluar el potencial fisiológico de las semillas y la prueba de tetrazolio es una de las que han sido utilizadas por las empresas de semillas. Pero, en muchos casos no se tiene estandarizada la medición rápida de su viabilidad con pruebas bioquímicas, los cuales han mostrado una importancia en la implementación de ese conocimiento en la silvicultura (Espitia-Camacho et al. 2017b).

La prueba de tetrazolio permite realizar una determinación rápida de la viabilidad de semillas inactivas y recalcitrantes, y de aquellas que germinan lentamente durante las pruebas de rutina (MAPA, 2009; Auday-Costa, Cordeiro-Shimizu, Martins-Leão y Alves-Pinheiro, 2018). En esta prueba se usa una solución incolora de cloruro de tetrazolio 2,3,5-trifenil, como un indicador para revelar los procesos de reducción que tienen lugar dentro de las células vivas donde se produce en ellas una sustancia roja, estable y no difusible. Esto hace que sea posible distinguir las partes vivas de la semilla de color rojo de las muertas incoloras (ISTA, 2014). También evalúa el vigor de la semilla y contribuye a la identificación de factores que influyen en la calidad de la semilla, como los daños mecánicos, el secado, los insectos y el deterioro causado por la humedad (Valadares, De Paula y Môro, 2009; Auday-Costa et al., 2018). Se destaca por su velocidad, ya que los resultados se pueden obtener en aproximadamente 24 horas, y su fiabilidad ha sido probada en la evaluación de la calidad de semillas de soja, maíz, café, maní, tomate, entre otros (Gaspar-Oliveira

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et al., 2009). Los datos obtenidos a través de esta prueba se pueden utilizar para establecer las bases para la comercialización, la determinación del punto de recolección y el control de calidad durante el almacenamiento (Marcos-Filho, 1987; Auday-Costa et al., 2018).

Considerando lo anteriormente expuesto, el objetivo del estudio fue evaluar la efectividad de la prueba de tetrazolio para medir la viabilidad de las semillas de C. ebano y estandarizar sus patrones topológicos, como información básica para la conservación óptima del germoplasma de esta importante especie nativa en el Caribe colombiano.

62


3.2.1 Localización. La investigación se llevó a cabo en febrero del 2019 en el Laboratorio de Genética y Fitomejoramiento - LAGEFI, ubicado en la Universidad de Córdoba (Montería, Colombia), en el Valle del Sinú medio, con latitud norte 8° 47′ 16.01″ y 75° 51′ 28.08″ longitud oeste respecto al meridiano de Greenwich. La zona ecológica corresponde al Bosque Seco Tropical con temperatura promedio de 28 ºC, humedad relativa de 84% y precipitación anual de 1.200 mm altitud de 15 msnm y un brillo solar de 5,5 horas luz/día (Palencia et al. 2006).

3.2.2 Material genético. Se utilizó semilla sexual de libre polinización de sendos árboles de C. ebano, las cuales fueron colectadas en los municipios de Montería, Tierralta y Berastegüi, en el departamento de Córdoba. La toma de las muestras de semillas, se realizó con base en los protocolos específicos propuestos por Gold et al. (2004).

3.2.3 Procedimiento.

3.2.3.1 Determinación de patrones topológicos. Para esta especie que presenta una cubierta muy dura, se realizó una escarificación mecánica con lima en la cubierta externa distal de donde emerge la radícula, y posteriormente, se pre-acondicionó (remojo), 20 semillas replicadas tres veces por 12 horas, se dejaron las semillas inmersas en agua destilada a temperatura ambiente (entre 25 ºC y 30 ºC). Posteriormente, se realizó la tinción con 2, 3, 5 trifenil cloruro de tetrazolio, en semillas ya escarificadas en solución al 1%, con tiempo de tinción de 2 horas, se introdujo en un horno en ausencia de luz y a una temperatura de 40 ºC, que es la más ajustada teniendo en cuenta los periodos de tinción evaluados (MAPAB, 2009; Espitia-Camacho et al. 2017b). Después de esto, se sacaron las semillas del horno y se lavaron las partes de las semillas tres veces con agua destilada con el objetivo de remover el exceso del colorante y se evaluó la viabilidad con la ayuda de un estereoscopio (Vista Visión®) para mejorar la visualización de las estructuras internas (MAPAB, 2009). La evaluación de las semillas, se realizó mediante la identificación de tres categorías recomendadas por Rao et al. (2007), para la interpretación de patrones de tinción:

Categoría 1. Semillas viables:

Aquellas con el embrión y los cotiledones completamente teñidos.

Aquellas que presentan necrosis superficial en la mitad de los cotiledones, principalmente en las partes alejadas del embrión.

Aquellas con áreas no teñidas (muertas) en los cotiledones, en lugares opuestos a la radícula.

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Categoría 2. Semillas no viables:

Aquellas con el embrión y los cotiledones sin teñir (muertas),

Aquellas que presenten el embrión sin teñir aunque los cotiledones estén teñidos,

Aquellas que presenten necrosis aguda en el embrión,

Aquellas que presenten el embrión teñido y los cotiledones sin teñir,

Aquellas que presenten necrosis en la punta de la radícula y,

Aquellas con daños graves en más de la mitad de las partes esenciales de la semilla.

Categoría 3. Semillas dudosas:

Semillas parcialmente teñidas, producirán plántulas normales o anormales, dependiendo de la intensidad y patrón de la tinción. En esta categoría están las semillas que presentan menos de la mitad teñida y con partes esenciales sanas.

3.2.3.2 Evaluación de concentraciones de 2,3,5 cloruro de tetrazolio y tiempos de tinción. Las categorías antes descritas en los patrones de tinción fueron empleadas para la evaluación de la viabilidad, así mismo, el remojo, corte y exposición en cada tratamiento. La uniformidad del color y la intensidad se utilizaron para evaluar la eficiencia de la tinción de los embriones (Ferreira-Pinto, Marcos-Filho, Forti, De Carvalho y Gomes-Junior, 2009). Para esto se observaron las características de cada tratamiento y se analizaron los tipos de tinciones de las semillas de esta especie, los cuales fueron registrados fotográficamente con cámara digital. Según Rodríguez y Nieto (1999), el total de semillas de la categoría “Viables”, más la mitad de las semillas de la categoría “Dudosas” es considerada para conocer el porcentaje potencial de semillas viables, es decir, la categoría (VIATO).

Tabla 3.1. Descripción de tratamientos evaluados en la viabilidad de semillas de C. ebano mediante la prueba de tetrazolio.

3.2.4 Análisis de datos. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado (DCA) con 6 tratamientos y 3 repeticiones (cuadro 3.1.) de 20 semillas cada uno. Para la estimación de los efectos de los tratamientos con tetrazolio, se realizó un análisis

TRATAMIENTOS T1 T2 T3 T4 T5 T6

Concentración tetrazolio (%) 0,5 0,5 1,0 1,0 1,5 1,5

Tiempo (h) 2 H 3H 2 H 3 H 2H 3H

No. Tratamientos 1 2 3 4 5 6

64

de varianza de un factor con seis (6) niveles (tratamientos) y la prueba de rangos múltiples de Tukey al 5% de probabilidad, para esto se utilizó el programa computacional para Windows GENES V.2016.6.0 (Cruz, 2016).

65


3.3.1 Determinación de patrones topológicos. Los patrones de tinción reconocidos e identificados en las semillas de Caesalpinia ebano H. Karst., están descritos e ilustrados en el figura 3.1. Definidas en cuatro clases o patrones de tinción basadas en el porcentaje de tejido dañado: Clase 1: semillas viables (V), con tinción total, intensa y uniforme en todas las partes internas de la semillas (cotiledones, radícula y embrión); Clase 2: semillas viables (V), con más del 80% de las partes esenciales de las semillas teñido; Clase 3: semillas dudosas, con tinción roja o rosada del 50% de los cotiledones, embrión y radícula, y Clase 4: semillas inviables, sin tinción. Éstas variaciones en la tinción son similares a los reportados en Schizolobium parahyba por Ferreira, Oliveira, Toneƫ y Davide (2007), Fogaça, Krohn, de Aquino-Souza y de Paula (2011) y Espitia-Camacho et ál. (2020), Cicer arietinum L. por Alencar-Paraíso et ál. (2019), y en otras especies arbóreas, como Parkia multijuga (Auday-Costa et ál. 2018); Libidibia ferrea (Costa-Carvalho et ál. 2017); B. quinata y A. excelsum (Espitia-Camacho et ál. 2017a); Poincianella pyramidalis (Macedo-Sousa et ál. 2017); Cedrela odorata y Cariniana pyriformis (Espitia-Camacho et ál. 2017b); Crambe marítima (Guimarães-Rezende et ál. 2015); Linum usitatissimum (Salazar-Mercado, Maldonado-Bayona y Quintero-Caleño, 2018); Swietenia macrophylla y Handroanthus chrysanthus (Céspedes-Torres, 2018), Swietenia macrophylla (Quintana, Abreu-Naranjo, Crespo y Morán, 2019).

66

Figura 3.1. Patrones topológicos identificados en el test de tetrazolio en semillas de

C. ebano.

Las semillas presentaron variación en la intensidad en la tinción, debido a que la solución incolora de 2,3,5 cloruro de tetrazolio produce la tinción de color rojo para determinar la presencia y localización de los procesos de reducción en los tejidos vivos en la semilla (MAPAB, 2009; ISTA, 2014; Espitia-Camacho et al., 2017a; 2017b). La prueba con tetrazolio se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas del ácido málico que reduce la sal de tetrazolio de color incolora a un color rojo insoluble, indicando con esto el tejido vivo de las semillas (MAPAB, 2009; Prieto et al., 2015; Salazar-Mercado et al., 2018). Según Rodríguez-Quilón, Adam y Durán (2008), aquellas semillas que quedan débilmente coloreadas (tonalidad rosada), son semilla donde sus células tienen disminuida su actividad

Clase Viabilidad Descripción Fotografía Esquema

1 Viables

(V)

Semillas con tinción

total y uniforme.

2 Viables

(V)

Semillas con tinción en

más del 80% de la

radícula y el embrión.

3 Dudosas

(D)

Semillas teñidas en más

del 50% de los

cotiledones y tinción

rosada en el 50% de la

radícula.

4 Inviables

(I) Semillas sin tinción.

67

respiratoria y por ende, menor actividad hidrogenasa. Sin embargo, cuando hay ausencia de tinción, indica una falta completa de actividad metabólica relacionada con la respiración celular, una condición de muerte de los tejidos (Craviotto et al. 2008). El proceso de reducción se presenta por la actividad respiratoria mitocondrial, indicando que el tejido está vivo y presenta viabilidad celular (Rodríguez-Quillón et al. 2008; MAPAB, 2009; Macedo-Sousa et al. 2017). Por lo tanto, según un color rojo uniforme en los embriones representa a una semilla viable y vigorosa (Clase 1 y 2); semillas débilmente coloreadas o con lesiones que no afectan las partes esenciales de las semillas, son consideradas viables y no vigorosas (Clase 3). Finalmente, la Clase 4, no presentan coloración, son aquellos con tejidos embrionarios sin respiración (Alencar-Paraíso et ál. 2019).

3.3.2 Evaluación de la viabilidad de las semillas. El análisis de varianza entre tratamientos y los resultados de las pruebas de separación de medias se presenta en la tabla 3.2 se detectaron niveles de significancia estadística entre tratamientos para las distintas categorías (variables) de semilla de C. ebano, definidas con anterioridad. La categoría de semillas viables (V) presentó diferencia altamente significativas con P>F: 0,2538**; la categoría dudosas (D) y viabilidad total (VIATO = V+0,5D) presentaron diferencias significativas con P>F:3,5121* y P>F:1,5184*, respectivamente, evidenciando con esto que las concentraciones de tetrazolio y los tiempos de tinción, afectaron la estimación del efecto en términos de coloración de los tejidos esenciales de la semilla, siendo contrario el efecto para las semillas de la categoría no viables (Inviables), las cuales no presentaron diferencias significativas. Resultados similares han sido reportados en la evaluación de la viabilidad de semillas de especies forestales como Parkia multijuga (Auday-Costa et al. 2018), Libidibia ferrea (Costa-Carvalho et al. 2017), B. quinata y A. excelsum (Espitia-Camacho et al. 2017a), C. odorata y C. pyriformis (Espitia-Camacho et al. 2017b), Poincianella pyramidalis (Macedo-Sousa et al. 2017), Piptadenia moniliformis (Alves-de Azerêdo et al. 2011), Copaifera langsdorffii Desf., y Schizolobium parahyba (Vell.) S.F. Blake (Fogaça et al. 2011; Ferreira et al. 2007).

Al comparar las medias de las concentraciones de tetrazolio y tiempos de tinción (Tabla 3.2), se observó con la prueba de Tukey al 95% el mayor porcentaje de semillas de la categoría viables, en dos de los seis tratamientos: 1,0% de tetrazolio y dos horas (T3), 1,5% de tetrazolio y dos horas (T5), el porcentaje de semillas viables fue igual a 93,3 y 95,0%, respectivamente. Sin embargo, estos mismos presentaron diferencia significativa con respecto a la concentración de 0,5% en los dos tiempos de inmersión (T1 y T2). En la categoría de viabilidad total (VIATO), el T1 y T5 conservaron diferencia significativa. Por otro lado, la categoría inviable, presentó porcentajes estadísticamente similares, mientras que en la categoría de semillas dudosas la concentración de 0,5% en los dos tiempos (T1 Y T2), presentaron los mayores promedios, mostrando falta de uniformidad en la tinción, influyendo con esto en la dificultad de interpretación y diferenciación de los tejidos vivos (viables), deteriorados o muertos (inviables). Por lo tanto, para determinar la

https://es.wikipedia.org/wiki/Vell.

https://es.wikipedia.org/wiki/S.F.Blake

68

viabilidad de las semillas de C. ebano es necesario dos horas de inmersión en la solución de tetrazolio a concentraciones entre 1,0 % o 1,5 %.

Tabla 3.2. Valores medios según la prueba de Tukey al 95%, para categorías asociadas a la calidad de semillas en diferentes concentraciones de tetrazolio y tiempos de tinción en C. ebano.

ESPECIE TRATAMIENTOS VIABLES

(V) INVIABLES

(I) DUDOSAS

(D) VIATO

(V+0,5D)

Caesalpinia ebano H. Karst

[0,5]*+ 2 HORAS 73,3 c 8,3 a 18,3 a 82,5 b

[0,5]*+ 3 HORAS 75,0 bc 6,7 a 18,3 a 84,2 ab

[1,0]*+ 2 HORAS 93,3 a 0.0 a 6,7 ab 96,7 ab

[1,0]*+ 3 HORAS 85,0 abc 6,7 a 8,3 ab 89,2 ab

[1,5]*+ 2 HORAS 95,0 a 0,0 a 5,0 ab 97,5 a

[1,5]*+ 3 HORAS 91,7 ab 3,3 a 5,0 ab 94,2 ab

P>F (%) 0.2538** 39.70ns 3.5121* 1.5184*

Media (%) 85.56 4.17 10.28 90.69

CV (%) 7.16 41.42 37.33 5.77 **Diferencias altamente significativas; *Diferencias significativas; ns= No significativo; Letras distintas indican diferencias significativas según la prueba de Tukey 5%; VIATO (V+0,5D) = es el total de semillas viables (V) más la mitad de las semillas dudosas (D); CV= Coeficiente de variación.

Las distintas concentraciones y tiempos de inmersión en la sal de tetrazolio influye en los análisis para la determinación de la viabilidad de las semillas. Teniendo en cuenta lo anterior, al aumentar las concentraciones de tetrazolio los embriones muestran mayor intensidad de color, mostrando una baja tonalidad en los tratamientos con tetrazolio al 0,5% y una coloración muy intensa en los tratamientos con concentración de 1,5%, a razón de una mayor actividad de los tejidos con el tetrazolio. Así mismo, en la medida en que aumenta el tiempo de tinción, bajo una misma concentración, los colores se tornan más oscuros, mostrando que la duración de exposición al tetrazolio influye en la imbibición (Figura 3.2); lo que es coherente con lo reportado en semillas de Caracolí (Anacardium excelsum) en las que, con la concentración de tetrazolio al 1,0%, se logró una tinción adecuada del embrión (Espitia-Camacho et al., 2017b), y otras especies: Linum usitatissimum (Salazar-Mercado et al., 2018) y Pinus tropicalis (Bonilla-Vichot, 2014). La presencia de semillas inviables, obedece a la degradación de las membranas celulares por peroxidación de lípidos y peroxidación no enzimática, que son factores que contribuyen a la degradación de la viabilidad de las semillas (Ravikumar, Ananthakrishnan, Girija y Ganapathi, 2002).

La prueba de tetrazolio se considera un método colorimétrico confiable (Araméndiz-Tatis et al., 2013; Salazar-Mercado y Botello-Delgado, 2018). Para obtener

69

resultados relacionados con la viabilidad y el vigor de la semilla mediante la prueba de tetrazolio, son esenciales la concentración de la solución de tetrazolio, el tiempo de tinción y una evaluación adecuada de la prueba (Gaspar-Oliveira et al., 2009; Valadares et al., 2009; Oliveira-Pereira, 2020). La prueba de viabilidad de tetrazolio contribuye a la identificación de factores que influyen en la calidad de la semilla, como daños mecánicos, secado, insectos, deterioro causado por la humedad y vigor de la semilla (Valadares et al., 2009; Auday-Costa et al., 2018). Es el mejor método para evaluar la calidad fisiológica de la semilla, dado a que excluye las condiciones ambientales desfavorables que pueden afectar los resultados de otras pruebas de evaluación y diagnóstico del deterioro de semillas (França-Neto y Krzyzanowski 2019; Siqueira-Walter, Moreno-Gabira, Almeida-da Silva, Nogueira y Kratz, 2020).

Figura 3.2. Semillas de C. ebano sometidas a la prueba de tetrazolio;

*concentración de tetrazolio en porcentaje (%); **tiempo de tinción en horas

En la figura 3.3 y 3.4, están representados los valores medios para las diferentes categorías estudiadas de las semillas de ébano, comparados con la prueba de rangos múltiples de Tukey que permite identificar diferencias significativas a un α = 0,05. Esta prueba se encuentra simbolizada en el extremo externo de las barras verticales por las letras. Las categorías viables, dudosa y VIATO, presentaron

70

diferencias significativas, lo que concuerda con los resultados obtenidos en ANAVA de altamente significativo, significativo y significativo, respectivamente. Sin embargo, la categoría inviables no presentó diferencias significativas.

Figura 3.3. Valores medios para las categorías viables y VIATO de semillas de C.

ebano.

*Letras distintas indican diferencias significativas a un α = 0,05 de acuerdo con la prueba de Tukey.

Figura 3.4. Valores medios para las categorías dudosas e inviables de semillas de

C. ebano.

*Letras distintas indican diferencias significativas a un α = 0,05 de acuerdo con la prueba de Tukey.

Los coeficientes de variación obtenidos en el estudio para las categorías de semillas viables (V) y viabilidad total (VIATO), reflejan una alta homogeneidad, explicada por los bajos coeficientes de variación menores al 10%, señalando con esto que la

c bc

aabc

aab

0

20

40

60

80

100

(T1) (T2) (T3) (T4) (T5) (T6)

Viables (%)

bab

ab

ab

a

ab

75

80

85

90

95

100

(T1) (T2) (T3) (T4) (T5) (T6)

VIATO (%)

a a

abab

ab ab

0

5

10

15

20

(T1) (T2) (T3) (T4) (T5) (T6)

Dudosas (%)

a

a

a

a

a

a

0

2

4

6

8

10

(T1) (T2) (T3) (T4) (T5) (T6)

Inviable (%)

71

técnica experimental utilizada en la investigación fue excelente y que por tanto los resultados del estudio son confiables (Fantazzini et al. 2020).

Los resultados obtenidos son un aporte importante al control de calidad fisiológica de las semillas de la especie estudiada. Así mismo, permite agilizar decisiones de compra, venta, beneficio, conservación, almacenamiento o descarte de semillas en dicha especie.

72

3.4 CONCLUSIONES

Los cuatro patrones de tinción identificados en el test de tetrazolio permiten evaluar eficientemente la viabilidad de las semillas de Caesalpinia ebano, para ello es necesario: realizar una escarificación mecánica (con lima) y dejar la semilla en pre-acondicionamiento (remojo) durante 12 horas, retirar la testa y la película membranosa que protege el embrión para que este pueda ser teñido y usar una concentración de 1,0% de tetrazolio durante un tiempo de tinción de dos horas.

El test de tetrazolio se puede recomendar como alternativa a la prueba de germinación convencional para evaluar la viabilidad de las semillas de la especie estudiada, lo que permitirá obtener resultados de forma rápida, minimizar el número de semillas necesarias para el análisis y tomar decisiones de forma rápida en bancos de germoplasma.

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77

CAPÍTULO IV

PARÁMETROS FISIOLÓGICOS DE LA GERMINACIÓN EN SEMILLAS DE ÉBANO

(Caesalpinia ebano H. Karst).

78

CHAPTER IV

PHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF GERMINATION IN Caesalpinia ebano H.

Karst SEEDS.

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RESUMEN

Los estudios de germinación de semillas proporcionan información esencial para la conservación de la biodiversidad y los programas de restauración ecológica. El objetivo del estudio fue evaluar en semillas de Caesalpinia ebano H. Karst ocho parámetros fisiológicos de la germinación: porcentaje de germinación acumulado (PG), índice de velocidad de germinación (IVG), germinación diaria media (GDM), valor pico de germinación (VP), valor de germinación (VG), días a inicio de la germinación (DIG), días durante la germinación (DDG) y días a final de la germinación (DFG). En cada uno de los dos ambientes de germinación: cámara germinativa y casamalla, se utilizó un diseño completamente al azar, con dos tratamientos (ambientes) y cuatro repeticiones de 25 semillas cada una. Toda la semilla fue sumergida en agua destilada, a temperatura ambiente de 27°C, por 24 horas, antes de la siembra. Se encontró que todos los parámetros de la germinación, excepto GDM y VG son afectados significativamente (p<0.05 y p<0.01) por las condiciones en que son establecidas las semillas de ébano. Los porcentajes de germinación estuvieron entre 55,5 y 91,0%, el IVG fue superior para las condiciones de laboratorio con 5,5 plantas/día, en comparación con las condiciones de casa malla, con sólo 3,5 plantas/ día. La germinación inició temprano en CAGER, con 4,5 días y 3,3 días para CAMA. Por su parte, los DFG y los DDG fueron las variables que presentaron mayores diferencias con 31,0 y 18,5 y 39,32 para las condiciones de laboratorio, y apenas 21,17 para las condiciones de casa malla respectivamente. La variabilidad entre los tratamientos en favor de las condiciones de laboratorio, obedece a las condiciones controladas del mismo, favoreciendo la germinación de las semillas de C. ebano.

Palabras claves: parámetros germinativos, cámara de germinación, Fabaceae, semilla forestal.

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ABSTRACT

Seed germination studies provide essential information for biodiversity conservation and ecological restoration programs. The objective of this study was to evaluate the eight physiological parameters of germination of Caesalpinia ebano H. Karst seeds: cumulative germination percentage (GP), germination speed index (GSI), mean daily germination (MDG), peak value of germination (PV), germination value (VG), days to beginning of germination (DBG), days during germination (DDG) and days of final germination (DFG). A completely randomized design was used in each environment: germination chamber (CAGER) and greenhouse (CAMA) with two treatments (environments) and four replicates of 25 seeds each. All seeds were immersed in distilled water at room temperature of 27°C for 24 hours before planting. It was found that all germination parameters, except GDM and VG are significantly affected (p <0.05 and p <0.01) by the conditions in which ebony seeds are established. The percentages of germination were between 55.5 and 91.0%, the IVG was superior for laboratory conditions with 5.5 plants per day, compared to house mesh conditions, with only 3.5 plants per day. The germination was initiated early in CAGER from 4.5 days, and CAMA from 3.3 days. On the other hand, days during germination and days of final germination were the variables that showed greater differences with 26.5 and 15.3 and 31.0 for laboratory conditions, and only 18.5 for the home mesh conditions respectively. The variability among the treatments in favor of the laboratory conditions, obeys to the controlled conditions of the same, favoring the germination of the seeds of Mahogany.

Key words: germination chamber, germination parameters, Fabaceae, forest seed.

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4.1 INTRODUCCIÓN

La germinación de las semillas es una etapa crucial en el ciclo de vida de las plantas, y el establecimiento exitoso depende en gran medida del éxito en este proceso, la cual tiende a ser altamente impredecible en el espacio y el tiempo (Han, 2018). La germinación es un proceso irreversible y debe cronometrarse para que ocurra cuando el ambiente sea favorable para el establecimiento posterior de las plántulas

y que está controlado por señales ambientales (Tudela‐Isanta et al. 2018). La baja germinación puede tener repercusiones en la regeneración, ocasionando que esta sea escasa, lo que en consecuencia puede provocar problemas en la permanencia y conservación de la procedencia en un futuro (Viveros-Viveros, Quino-Pascual, Velasco-García, Sánchez-Viveros y Velasco-Bautista, 2017).

La germinación es un proceso bioquímico y fisiológico que comienza con la absorción de agua por la semilla y la activación del metabolismo. La absorción de agua es el factor principal que inicia el proceso de germinación, promoviendo la respiración celular, la síntesis de ADN y el crecimiento (Bewley, Bradford y Hilhorst, 2012). Para emerger, la radícula debe pasar a través del micrópilo. La emergencia de la radícula está precedida por el debilitamiento del endospermo micropilar y el alargamiento del eje embrionario (Yan, Duermeyer, Leoveanu y Nambara, 2014), suceso que involucra la acción de múltiples enzimas que son activadas por la acción de la temperatura y el agua, por lo tanto, las respuestas ecofisiológicas de las plantas varían según las condiciones a las que están expuestas, que a su vez influyen en la movilización de asimilados para la producción de energía y el crecimiento de los tejidos (Daibes y Cardoso, 2020; Duarte, de Lemos-Filho y Marques, 2018; Tesfay, Modi y Mohammed, 2016).

De acuerdo a Espitia-Camacho et al. (2017), la mayoría de las especies forestales del trópico, se propagan mediante semilla sexual y su calidad fisiológica, genética, física y sanitaria influye, de manera significativa, en el éxito de la producción y productividad de las plantaciones. El conocimiento e interpretación de la viabilidad y los parámetros de la germinación y las plántulas en laboratorio, invernadero o casa-malla es indispensable para la comprensión de la autoecología, colecta, conservación, manejo, uso sostenible y el desarrollo de prácticas silviculturales exitosas de las especies (Caravita-Abbade y Takaki, 2014; Deminicis et al. 2014; Guimarães-Rezende et al. 2015). Pereira-Reis, de Lima-e Borges, Aparecida-de Souza y Brito (2020), afirman que los estudios de germinación de semillas proporcionan información esencial para la conservación de la biodiversidad y los programas de restauración ecológica.

Recientemente, los parámetros fisiológicos de la germinación se han llevado en una amplia gama de semillas de especies forestales, demostrando así la importancia y relevancia de este tipo de investigaciones tanto en especies nativas como introducidas de importancia ecológica y silvícola. Algunos ejemplos de

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investigaciones tan solo en las especies arbóreas de la familia botánica de las fabáceas se hallan en los trabajos de Rodrigues-de Melo, Pessoa-Cavalcanti, Ursulino-Alves, Chalita-Martins y Rodrigues-de Araújo (2017), en Eriotheca gracilipes, Pereira-Reis et al. (2020), en Ormosia coarctata Jack., Dantas-de Medeiros, Lima-Nunes, Cardoso-Félix, dos Santos-Ferrari, Vasconcelos-Pacheco y Barros-Torres (2020), trabajando con semillas de Amburana cearensis, Daibes y Cardoso (2020), con Peltophorum dubium, Moreira-Santos, de Mata-Ataíde, de Oliveira-Pires, de Lima-e Borges y Kelli-Rocha (2020), con Melanoxylon brauna, Moura-Lima, Reis-Mendonça, Costa-da Paixão, Soares-de Freitas y Cunha-Moreira (2017), con Senegalia bahiensis, Viveros-Viveros et al. (2017), con semillas de la especie nativa Enterolobium cyclocarpum y en el departamento de Córdoba, Espitia et al. (2016), con la especie Schizolobium parahybum. Otras investigaciones relevantes en este campo fueron realizadas por Espitia et al. (2016), por las especies nativas Cedrela odorata, Cariniana pyriformis, Bombacopsis quinata, Anacardium excelsum, Maharana, Dobriyal, Behera, Gunaga y Thakur (2018), con Gmelina arbórea, y Dhaka y Jha (2017), buscando demostrar las razones de la baja germinación en proveniencias de Tectona grandis solo por mencionar algunas.

Las condiciones ideales para las pruebas de germinación, incluyen factores ambientales como la disponibilidad y calidad del agua, la exposición a la luz, los niveles de oxígeno y la temperatura difieren entre especies (Silva-Costa et al., 2013). Es por eso que es necesario llevar a cabo este tipo de evaluaciones. Además, estos trabajos son útiles para comprobar la calidad fisiológica de las semillas y muchas veces, ayudan a determinar la viabilidad de los lotes de semillas de especies forestales y por tanto son muy útiles para determinar la tasa de producción de plántulas (Soares, Elias, Gadotti, Garay y Villela, 2016; Al-Turki y Baskin, 2017), ayudan a determinar rangos de temperaturas óptimos y tipos de sustratos favorables para estandarizar los protocolos de germinación en especies poco conocidas (Pereira-Benedito, Cardoso-Ribeiro, Pereira-de Paiva y de Souza-Medeiros, 2019) y contribuyen a definir cuáles serán los mejores tratamientos para evaluar y mejorar la calidad de las semillas (Rodrigues-de Melo et al. 2017).

En el departamento de Córdoba, las especies forestales nativas de interés han sido poco investigadas, pues en la literatura científica a la fecha, solo figuran escasos trabajos relacionados con el análisis de parámetros fisiológicos de la germinación (Espitia et al. 2016; 2017). Situación aún más grave se presenta para el ébano, pues a pesar de ser una especie autóctona del Bosque Seco Tropical, con un alto potencial en la silvicultura urbana dado su atractivo estético y adaptabilidad al ambiente urbano (Arroyave et al. 2015; Arenas-Rubio, 2019), el vacío de conocimiento en torno a ella, ha dificultado la búsqueda de estrategias en pro de su conservación.

Por todo lo anterior, el presente estudio tuvo como objetivo principal estimar y comparar ocho parámetros fisiológicos de la germinación (PG, IVG, GDM, VP, VG, DIG, DDG y DFG) de las semillas de Caesalpinia ebano H. Karst, en condiciones

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de laboratorio (cámara germinativa) y casa malla, como información básica para ser usada en el manejo de viveros, futuros programas de mejoramiento genético y en los procesos de conservación ex situ del germoplasma existente.

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4.2.1 Localización. El estudio se realizó en casa malla y laboratorio (cámara germinativa) durante el segundo semestre de 2018 y el primer semestre del año 2019 en el Laboratorio de Genética y Fitomejoramiento - LAGEFI, ubicado en la Universidad de Córdoba (Montería, Colombia), en el Valle del Sinú medio, con latitud norte 8° 47′ 16.01″ y 75° 51′ 28.08″ longitud oeste respecto al meridiano de Greenwich. La zona ecológica corresponde al Bosque Seco Tropical con temperatura promedio de 28 ºC, humedad relativa de 84% y precipitación anual de 1.200 mm altitud de 15 msnm y un brillo solar de 5,5 horas luz/día (Palencia et al. 2006).

4.2.2 Material genético. Se utilizó semilla sexual de libre polinización de sendos árboles de C. ebano, las cuales fueron colectadas en los municipios de Montería, Tierralta y Berastegüi, en el departamento de Córdoba. La toma de las muestras de semillas, se realizó con base en los protocolos específicos propuestos por Gold et al. (2004).

4.2.3 Procedimientos y variables de respuesta. Para el estudio, se estimaron ocho variables de respuesta relacionadas con los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas en sendas pruebas de germinación en cámara germinativa (CAGER) (Figura 4.1) y casa-malla (CAMA) (Figura 4.2). Los parámetros fisiológicos de la germinación fueron: porcentaje de germinación acumulado (PG), índice de velocidad de germinación (IVG), germinación diaria media (GDM), valor pico (VP), valor de germinación (VG), días de inicio de la germinación (DIG), días a final de la germinación (DFG) y días durante la germinación (DDG).

A cada prueba de germinación se le hizo un pre-acondicionamiento (remojo) de las semillas recomendado por el ISTA (2014), (Figura 4.1a), este consistió en sumergir las semillas en agua destilada a temperatura ambiente (entre 25 °C y 28 ºC) durante 24 horas, tiempo que está dentro de los rangos aceptados para las especies arbóreas (Correa-Álvarez et al. 2013).

Las pruebas de germinación en cámara germinativa (CAGER) fueron realizadas en bandejas de aluminio, utilizando como sustrato cuatro capas de algodón quirúrgico blanco, previamente humedecido con agua destilada, encima del cual se colocaron las semillas (Figura 4.1b; 4.1c). Luego se cubrieron con cuatro capas de papel toalla blanco humedecido. Las bandejas con las semillas fueron ubicadas dentro de una cámara de germinación marca Dies®, a una temperatura de 28ºC, humedad relativa de 80%, con periodo de luz de 10 horas/día (Figura 4.1e), y regadas diariamente de forma uniforme.

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Figura 4.1. Montaje de semillas de C. ebano en cámara germinativa.

La prueba de germinación, en condiciones de CAMA, fue implementada con recubrimiento de polipropileno color negro y malla antiáfidos, temperatura media de 29 oC, humedad relativa del 70% y control de luz del 30%. Las semillas fueron dispuestas en bandejas de aluminio, empleando un sustrato uniforme 1:1 de arena cuarcítica y arcilla, ambos desinfectados con agua caliente (Figura 4.2b). Con distancia de siembra de 5 cm entre hileras y 3 cm entre semillas, a una profundidad de 2/3 del tamaño de la semilla, ubicando hacia abajo la parte apical por donde emerge la radícula (hipocótilo). Para mantener la humedad del suelo se realizaron dos riegos a las 10:00 a.m. y a las 4:00 p.m.

Ambas pruebas de germinación fueron valoradas diariamente durante 55 días, en cámara germinativa se consideró la germinación cuando los cotiledones emergen de la semilla y la germinación de casa malla cuando los cotiledones fueron levantados del nivel del sustrato.

El PG fue considerado como el porcentaje acumulado de semillas germinadas al final del ensayo; el IVG fue calculado mediante la fórmula recomendada por Maguire (1962):

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IVG =P1

T1+P2

T2+

P3

T3+…

Pn

Tn;

Dónde: P1, P2, P3…, Pn = número de plántulas normales, germinadas y completas en el primer, segundo, tercer y último conteo de la evaluación.

T1, T2, T3 …, Tn = tiempo en días para cada germinación.

Figura 4.2. Montaje de semillas de C. ebano en casa malla.

La GDM se consideró como la relación entre el porcentaje acumulado de semillas germinadas al final del ensayo y el número de días desde la siembra al término del ensayo, el VP como la GDM máxima alcanzada en el ensayo y, el VG correspondió al producto de la GDM por el VP (Czabator, 1962). Para estimar el DIG, DDG y DFG, se contaron los días necesarios para que en cada repetición apareciera la primera plántula emergida (DIG), hasta cuando no aparecieran más plántulas emergidas (DFG) y por diferencia entre (DFG-DIG) se obtuvieron los días al inicio de la germinación (DDG), tal como lo mencionan Espitia-Camacho et al. (2017).

4.2.4 Diseño experimental y análisis estadístico de datos. Para cumplir con los objetivos del estudio, se utilizó un diseño completamente al azar con dos tratamientos (ambientes de germinación: CAGER y CAMA) y cuatro repeticiones de 25 semillas/repetición. Se dispuso de 100 semillas de la especie de C. ebano por cada tratamiento. Los datos obtenidos en las ocho variables de cada tratamiento o condición de germinación, fueron sometidos a análisis de varianza (ANAVA) de una vía y pruebas de comparación de medias por el test de Tukey (α=0,05), mediante el programa estadístico computacional de libre acceso GENES versión 2016.6.0 para Windows, desarrollado por Cruz (2014).

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4.3.1 Análisis de Varianza. En el análisis de varianza (Tabla 4.1), se detectaron diferencias estadísticas significativas (p<0,01 y p<0,05) entre los dos ambientes germinativos, para los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas evaluados, a excepción de la germinación diaria media (GDM) y el valor germinativo (VG), lo que indica que, la especie en estudio presentó promedios estadísticamente diferentes y su respuesta cambió en uno de los dos ambientes germinativos para los días al inicio de la germinación (DIG), días al final de la germinación (DFG), días durante la germinación (DDG), porcentaje acumulado de la germinación (PG), índice de velocidad de germinación (IVG) y valor pico (VP). Este resultado evidencia las diferencias genéticas y ambientales y el comportamiento diferencial existentes entre las semillas de ébano procedentes de los diferentes municipios, cuando son sometidas a diferentes condiciones de germinación (Dantas-de Medeiros et al., 2020; Tudor et al., 2017; Viveros-Viveros et al., 2017). Resultados similares han sido reportados por Espitia et al. (2016), en lotes familiares o procedencias de semillas de Cedrela odorata L., Cariniana pyriformis Miers, Bombacopsis quinata (Jacq.) Dugand, Anacardium excelsum (Bert. et Balb) Skeels y Schizolobium parahybum (Vell.) Blake, Viveros-Viveros et al. (2017) en Enterolobium cyclocarpum, Dantas-de Medeiros et al. (2020), en Amburana cearensis, Moreira-Santos et al. (2020), evaluando semillas de Melanoxylon brauna Schot y Pereira-Reis et al. (2020) evaluando sustratos y temperaturas diferenciales en Ormosia coarctata Jack.

La ausencia de diferencias significativas entre ambientes para la germinación diaria media (GDM) y el valor germinativo (VG), con medias de 3,0% y 3,1% para GDM y 18,5 y 11,5 para VG en las pruebas de germinación en CAGER y CAMA, respectivamente (Tabla 4.2), sugiere que esta especie forestal, estos parámetros no son afectados por las dos condiciones de germinación. Esto permite clasificar a C. ebano como una especie de considerable energía y vigor germinativo, dado que el IVG, GDM, VP y VG estiman la energía y vigor para germinar de las semillas (Maguire, 1962; Espitia et al. 2016; Espitia-Camacho et al. 2017).

Las diferencias entre los resultados obtenidos en relación con los parámetros fisiológicos de la germinación, tanto en CAGER (laboratorio) como en CAMA, probablemente se deban, según lo mencionan Armaki, (2014), Zohra et al. (2014), Espitia-Camacho et al., (2017), Moya et al. (2017), Maharana et al. (2018), Vishal y Kumar (2018), Daibes y Cardoso (2020), Moreira-Santos et al. (2020), a la constitución genética propia de la especie; en cuanto al control genético de los parámetros germinativos, interacciones genéticas a nivel del núcleo y/o del citoplasma, efectos maternos, nivel de domesticación y/o mejoramiento genético, tipo de reproducción, nivel de alogamia, morfología, anatomía, histología, condiciones ambientales durante el desarrollo ontogénico de la semilla; estrés por

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calor o por sequía, luz, temperatura, humedad y condiciones propias de las semillas; expresión y regulación hormonal, colecta, madurez fisiológica, viabilidad y calidad fisiológica de la semilla, tratamientos pregerminativos, condiciones bajo las cuales se realizan las pruebas de germinación, entre otros, que muchas veces también varían notablemente de acuerdo con la especie y su procedencia (Viveros-Viveros et al., 2017).

4.3.2 Valores promedios para los parámetros fisiológicos de la germinación.

Los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas de ébano en promedio, mostraron mayor expresión en las pruebas realizadas en laboratorio (CAGER) que en casa malla (CAMA), sobresaliendo los DFG, DDG y PG, con diferencias aproximadas de 13, 11 y 36 puntos porcentuales, respectivamente (Tabla 4.2). Esto se explica por el mayor control y uniformidad en las condiciones óptimas para la germinación de las semillas que se ofrece en la cámara germinativa, comparado con la casa malla, en donde las condiciones son muy heterogéneas y cambiantes, ya que dependen de las variaciones de clima reinantes durante el periodo de realización de las pruebas de germinación, como lo señalan varios autores (Espitia et al. 2016; Espitia-Camacho et al. 2017). Ello se puede corroborar observando la mayor magnitud de los valores promedios presentados para dichas variables en CAGER (31,0, 26,5 y 91,0) comparados con los obtenidos en CAMA (18,5, 15,3 y 55,5) respectivamente y, distinguiendo la mayor magnitud de los coeficientes de variación presentados en tales ambientes (Tabla 4.2).

Inicio, duración y finalización de la germinación. El inicio en el tiempo de la germinación de las semillas (DIG) se presentó a los 4,5 días y a los 3,3 días para el ambiente CAGER y CAMA respectivamente, por su parte, los días al final de la germinación después de la siembra (DFG), fueron también superiores para CAGER e inferiores para CAMA. Resultados contrastantes fueron estimados por Reino-Causil (2017) en semillas de Swietenia macrophylla King y Payares-Díaz, Mario-Contreras, Medrano-Vélez y Millán-Romero (2014) evaluando semillas de Myroxylon balsamum (L.) Harms, donde el inicio y final de la germinación ocurrió entre los 7 y los 15 días después de la siembra.

Este comportamiento opuesto al esperado en esta especie para el DIG y DDG, se puede explicar por las características propias de las semillas de ébano, y por lo general, se presenta en aquellas semillas que resultan más pesadas, con testa dura y semi-impermeable, conlleva a mayor resistencia mecánica a la absorción de humedad, mayores días a inicio de la germinación, más días durante la germinación y mayores días para completar su germinación (Espitia et al. 2016).

Las diferencias entre los parámetros DIG, DFG y DDG, también pueden estar relacionadas con las condiciones genéticas, morfológicas y fisiológicas individuales de cada una de ellas, posiblemente no todas maduraron al mismo tiempo y fueron obtenidas de plantas madres distintas, lo que implica que estos factores han intervenido a nivel de la respuesta germinativa de las mismas (Veríssimo-dos

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Santos, Pereira-Benedito, Barros-Torres, Perreira-Leal y Costa-Alves, 2019 Payares-Díaz et al., 2014; Baskin y Baskin, 2014; Pérez, 2013).

Tabla 4.1. Análisis de varianza y nivel de significancia para ocho parámetros fisiológicos de la germinación, bajo dos ambientes germinativos de las semillas de árboles de Caesalpinia ebano Karst.

F.V: Fuentes de variación; CM: cuadrados medios; GL: grados de libertad; ns: no significativos; * y **: significativos al 5% y 1% de probabilidad, respectivamente; CV: Coeficiente de variación; DIG: días al inicio de la germinación después de la siembra; DFG: días al final de la germinación después de la siembra; DDG: días durante la germinación después de la siembra; PG: porcentaje acumulado de germinación; IVG: índice de velocidad de la germinación; GDM; germinación diaria media; VP: valor pico de la germinación; VG: valor germinativo (Índice de Czabator) = GDM * VP. Ambientes: cámara germinativa y casa-malla.

Además, como lo mencionan Pérez-Hernández, Ochoa-Gaona, Vargas-Simón, Mendoza-Carranza y González-Valdivia (2011), estudiando especies forestales de la familia fabácea, la siembra inmediata bajo condiciones ambientales adecuadas, puede evitar la entrada de latencia obligada para las semillas de especies que se consideran ortodoxas. Adicionalmente, bajo condiciones de campo (similares a las presentes en el ambiente CAMA), las semillas que son enterradas completamente, son menos susceptibles a la desecación y retienen humedad suficiente para asegurar la germinación en un menor tiempo medio. De acuerdo a Pereira-Reis et al. (2020), después de la imbibición de agua y activación del metabolismo de la semilla, la germinación es influenciada por la viabilidad de la misma y los factores ambientales, en especial la temperatura.

Estos resultados contrastantes también puede justificarse debido a que, muy probablemente, las altas temperaturas de hasta 30 °C registradas durante varios días en la zona, con respecto a las controladas en CAGER, pudieron haber influido también en el incremento de la velocidad de las reacciones fisiológicas y acelerar el proceso de germinación en unas semillas más que en otras, ya que como es sabido, la temperatura determina directamente la velocidad de las reacciones bioquímicas que participan en el proceso, afecta la tasa y la capacidad de germinación (Huerta-Paniagua y Rodríguez-Trejo, 2011; Muñoz, 2017; Espíndola, Romero, Díaz y Luna,

F.V. GL

CM

DIG DFG DDG PG

IVG

GDM

VP VG

(#) (#) (#) (%) Plantas.

día-1 (%) (%) (#)

Ambientes 1 3.125* 312.5** 253.13** 2520.5** 7.722** 0.0128ns 12.23* 98.0ns

Error 6 0,292 14,50 16,96 69,17 0,383 0,3907 1,08 22,94

Total 7

Medias 3,9 24,8 20,9 73,3 4,5 3,0 4,9 15,0

CV (%) 13,9 15,4 19,7 11,4 13,7 20,7 21,3 32,0

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2018). La temperatura de evaluación afectó la expresión de todas las enzimas involucradas en la germinación de semillas de Melanoxylon brauna Schott bajo condiciones controladas (Moreira-Santos et al. 2020).

Según Gil y Miranda, (2008), Han (2018), Souza et al. (2016) y Liu, Xu, Yang y Zhang (2017), las semillas poseen un rango de temperatura óptimo que afecta positivamente la germinación, pero los cambios de temperaturas pueden provocar la pérdida progresiva de la viabilidad y disminuyen el porcentaje de germinación, este factor abiótico posiblemente también afectó las variables DIG, DFG y DDG, las cuales difieren estadísticamente entre los ambientes (Tabla 4.2). Se puede observar además que la semilla requiere más días para la germinación en CAGER comparado con CAMA (Tabla 4.2), este hecho posiblemente se puede explicar por el efecto que tiene la menor temperatura en CAGER haciendo la germinación más lenta, mientras que la mayor temperatura y sus oscilaciones en CAMA, hacen la germinación más rápida, lo que le confiere, a su vez, rápida absorción de humedad, mayores DIG, DDG y DFG, igualmente mayor PG, IVG y VP.

Porcentaje de germinación acumulado (PG). En la tabla 4.2, se observa que la media general para el PG en la especie de ébano, osciló entre 91,0% y 55,5% con una media general para todo el estudio de 73,3%, existiendo diferencias estadísticas entre los ambientes. Los promedios en PG para cámara germinativa (CAGER) y casa-malla (CAMA), respectivamente, corroboran lo obtenido en el ANAVA (Tabla 4.1). Estos resultados sugieren que las semillas de esta especie forestal germinaron de manera diferencial, a nivel general y en cada ambiente germinativo; no obstante, se observa que en CAGER germinó un 63,9% mayor número de semillas que en CAMA. Esta tendencia, con incrementos estadísticamente significativos a favor de CAGER, puede ser explicada por el mejor control de las condiciones relacionadas con la influencia de los factores esenciales para la germinación, principalmente

temperatura y humedad (Pereira-Reis et al. 2020; Tudela‐Isanta et al. 2018). El porcentaje de germinación también se mostró significativamente variable en respuesta a los ambientes de germinación a los que fueron sometidas las semillas en los estudios de Espitia-Camacho et al. (2017), Reino-Causil (2017) y Pereira-Reis et al. (2020).

Índice de velocidad de la germinación (IVG). Los valores promedios (Tabla 4.2) corroboran los resultados obtenidos en el ANAVA, a nivel de ambientes. A pesar que cuando se presenta una diferencia estadísticamente significativa, se deben analizar los resultados por separado en cada ambiente germinativo; vale la pena resaltar que, en general, las semillas sembradas en CAMA registraron los valores más bajos de IVG, con 3,5 plántulas/día, en su orden, mientras que en CAGER se registró el mayor valor promedio de IVG, con 5,5 plántulas/día; este valor fue superior a la media general en 4,5 plántulas/día y destaca C. ebano, como una especie con alta energía germinativa, en razón a que, de acuerdo con Maguire (1962), los mayores valores de IVG están relacionados con mayor energía para germinar de las semillas, mientras que menores valores indican lo contrario.

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Tabla 4.2. Promedios para ocho parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas de C. ebano en cámara germinativa y casa malla.

AMBIENTE DIG DFG DDG PG IVG GDM VP VG

(#) (#) (#) (%) (plantas/día) (%) (%) (#)

CAGER 4.5a 31.0a 26.5a 91.0a 5.5a 3.0a 6.1a 18.5a

CAMA 3.3b 18.5b 15.3b 55.5b 3.5b 3.1a 3.6b 11.5a

MEDIA 3,9 24,8 20,9 73,3 4,5 3,0 4,9 15,0

CV (%) 13,9 15,4 19,7 11,4 13,7 20,7 21,3 32,0

Promedios con la misma letra no difieren estadísticamente, según la prueba Tukey al 5% de probabilidad; comparación vertical entre ambientes; CV: Coeficiente de variación; DIG: días al inicio de la germinación después de la siembra; DFG: días al final de la germinación después de la siembra; DDG: días durante la germinación después de la siembra; PG: porcentaje acumulado de la germinación; IVG: índice de velocidad de la germinación; GDM; germinación diaria media; VP: valor pico de la germinación; VG – (Índice de Czabator): valor germinativo = GDM * VP; Media: media general / ambiente; CAGER: cámara germinativa; CAMA: casa-malla.

Para explicar los resultados obtenidos en IVG, también hay que tener en cuenta factores como la imbibición como primera etapa de la germinación, ya que la velocidad de imbibición depende de la composición química de la semilla, permeabilidad de cubierta de la semilla, la diferencia de potencial hídrico y el espesor de los tejidos de almacenamiento, por lo que la disponibilidad hídrica en cada uno de los ambientes pudo haber influido de manera específica en cada semilla. La absorción de agua promueve la respiración celular, la síntesis de ADN y con ellas las reacciones metabólicas (Daibes y Cardoso, 2020; Moreno et al., 2018). Se observó diferencia de considerable magnitud entre ambos ambientes en el IVG y mayor expresión de este parámetro en condiciones de laboratorio en CAGER comparado con CAMA. Estos resultados son similares a los reportados por Pereira-Reis et al., (2020) y Morbeck-Oliveira, Santos-Souza, Braga-Carvalho, Alves-Souza y Anghinoni-Bocchese (2016), quienes mencionan que en las especies arbóreas de la familia fabácea, Ormosia coarctata Jack. y O. arborea respectivamente, se obtuvieron los IVG más altos utilizando rollos de papel o arena como sustrato y una temperatura entre 30 y 35 °C.

Germinación diaria media (GDM). En la tabla 4.2, se observa que, en general, las semillas de ébano presentaron promedios de GDM, con 3,0% y 3,1% de las semillas germinadas por día para CAGER y CAMA respectivamente; estos valores son muy similares a la media general (3,0%), sin acusar diferencias significativas entre ambientes. Esta ausencia de significancia, puede ser explicada, posiblemente, por las características morfológicas y anatómicas propias de las semillas, lo cual, permite una absorción rápida de agua, lo que provoca, por ende, que se inicie y genere una germinación total y homogénea de las semillas en distintos ambientes.

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Los resultados de este trabajo para este parámetro fisiológico, son inferiores a los estimados en especies como Enterolobium cyclocarpum por Viveros-Viveros et al. (2017), pero superiores a los reportados por Maharana et al., (2018) en Gmelina arborea Roxb.

Valor pico de la germinación (VP). En la tabla 4.2, se detalla que la media general para el VP, entre los ambientes, osciló entre 3,6%, para CAMA y 6,1%, para CAGER; este último superó en 1,2 puntos a la media general para todo el estudio, que fue de 4,9%. Esta especie en CAGER, bajo condiciones de laboratorio mostró estadísticamente el valor de mayor magnitud del VP, con un máximo de semillas germinadas/día de 6,1%. En CAMA, el máximo porcentaje de semillas germinadas en un día, se presentó con un valor de 3,6%. Los datos indican, además, que C. ebano fue también una especie poco estable y muy afectada en este parámetro, por las condiciones de germinación, dado que su VP fue diferencial en CAGER y en CAMA respectivamente, con un máximo promedio de 4,9% semillas germinadas en un día, durante la prueba. Estos resultados fueron similares a los reportados por Gálvez-López et al. (2018) en Tabebuia rosea y Barone, Duarte y Luna (2016) en Cedrela fissilis.

Valor de germinación (VG). La prueba de comparación de medias para este parámetro fisiológico de la germinación señala ausencia de diferencias estadísticas entre los ambientes germinativos (Tabla 4.2). Sin embargo, entre los ambientes germinativos, CAGER registró estadísticamente el mayor valor medio de VG, con 18,5 unidades, mientras que el menor valor promedio se registró en CAMA con 11,5 unidades. Adicionalmente, los datos señalan que C. ebano fue una especie consistente y menos afectada por las condiciones de germinación, dado que su VG exhibió promedios similares en CAGER y CAMA, lo cual, no representa diferencias importantes en los dos ambientes. En promedio, se observó, una vez más, mayor expresión del VG, en condiciones de CAGER, comparado con CAMA, lo que representó un incremento promedio del 60,9%. Los resultados obtenidos permiten clasificar a C. ebano como una especie de considerable energía y vigor germinativo (Maguire, 1962; Espitia et al. 2016).

La mayor expresión promedio de los parámetros fisiológicos de la germinación de las semillas IVG, GDM, VP y VG de esta especie forestal nativa de la región Caribe Colombiana, en las pruebas realizadas en CAGER, se explica en función del mayor control y uniformidad en las condiciones de sustrato, humedad, oxígeno, temperatura y luz para la germinación de las semillas, que se ofrece en el ambiente de la cámara germinativa. En casa-malla, las condiciones son muy heterogéneas y cambiantes, ya que dependen de las variaciones de clima reinantes durante el periodo de realización de las pruebas de germinación, como lo reportan varios autores: Gokturk et al. (2012), Correa et al. (2013), Armaki et al. (2013) y Armaki (2014), Espitia-Camacho et al. (2017). Adicionalmente, en términos de tiempo y economía, la evaluación en cámaras de germinación es más fácil y completa que en invernadero o casa malla (Hashemi, 2016).

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Los efectos maternos también pueden estar influyendo en la diferenciación en los parámetros fisiológicos de la germinación, la posición de la semilla en el fruto y del fruto en el árbol, la edad del árbol madre, y el tamaño de la semilla influyen también en la germinación de la semilla. Como las semillas fueron recolectadas en bosques espontáneos de la especie, es de esperar que los árboles madres no fueran de la misma edad (Viveros-Viveros et al. 2017; Moya et al., 2017; Gutterman, 2000). Las ventajas evolutivas también entran como un factor a considerar y que apoyan los resultados obtenidos para esta especie, la cual en general, presentó un corto tiempo de germinación comparada con otras especies botánicas de interés silvícola. Al respecto, Vargas, Werden y Powers (2015), demuestran que las especies arbóreas leguminosas tienen mayores porcentajes y tasas de germinación final (pero no sincronía) en comparación con las no leguminosas. Estos autores también argumentan que esta rápida germinación de semillas después del inicio de la temporada de lluvias, junto con las altas tasas de crecimiento de las plántulas, es una estrategia exitosa para cualquier especie de árbol en este bosque tropical seco estacional.

Por otra parte, las especies o lotes de semillas que presentan los mayores PG, IVG, VP, GDM, en condiciones óptimas de germinación son más deseables y de mejor calidad fisiológica, ya que permiten obtener el mayor número de plántulas, más vigorosas y en el menor tiempo posible, por su mayor energía y vigor germinativo. Lo anterior es más valioso si se tiene en cuenta que en teoría, probablemente, sólo las semillas que germinan con rapidez y vigor en condiciones favorables de laboratorio, casa-malla o invernadero, serán capaces de producir plántulas vigorosas en condiciones de vivero o mayor sobrevivencia inicial en campo (Gokturk et al. 2012; Rivera-Martin, Peñuela-Mora, Jiménez-Rojas y Vargas-Jaramillo, 2013).

En la figura 4.3 se observan los valores medios y niveles de significancia estadísticas de las diferentes variables estudiadas en las condiciones de laboratorio y casa malla. Se indican con distintas letras los grupos estadísticamente diferentes de acuerdo a la prueba de Tukey (α=0,05). Las variables de DIG, DFG y DDG (Figura 4.3a), muestran gráficamente el proceso germinativo en términos de tiempo (días), influenciado por las condiciones de siembra y establecimiento de las semillas. Incluso la diferencia de un (1) día en el inicio de la germinación, permitió deducir y esclarecer diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos.

El incremento en el porcentaje de germinación, así como en el valor germinativo fue gráficamente pronunciado (Figura 4.3b), entre los ambientes. Ambas variables favorecidas por las condiciones presuntamente óptimas de humedad relativa y temperatura reinantes en la cámara de germinación, aunque el VG pareció no estar influenciado por el ambiente utilizado.

Cuando se observó gráficamente la tasa de producción de plántulas por unidad de tiempo (Figura 4.3c), también se determinó que este parámetro está seriamente

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influenciado por la uniformidad de las variables ambientales, que a su vez es lograda por la CAGER, apoyando la conclusión de que para C. ebano conviene realizar la estimación de su germinación así como la generación de procedencias bajo condiciones óptimas siempre que la logística lo permita.

Figura 4.3. Valores medios de DIG, DFG, DDG, PG, VG, IVG, GDM y VP para la germinación de semillas de C. ebano en condiciones de casa malla y laboratorio. Letras distintas indican diferencias significativas con la prueba de Tukey, a un nivel α = 0,05.

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4.4 CONCLUSIONES

La respuesta de los parámetros fisiológicos de la germinación en ébano, fue diferente en los dos ambientes germinativos para los días al inicio de la germinación, días al final de la germinación, días durante la germinación después de la siembra, porcentaje acumulado de germinación, índice de velocidad de la germinación y valor pico de la germinación.

Cuando las condiciones lo permitan se recomienda mejor utilizar cámaras germinativas en laboratorio frente a casa-malla, para estimar los parámetros fisiológicos de la germinación de ébano debido al mayor control que se ejerce sobre los factores ambientales esenciales para la misma.

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DISCUSIÓN GENERAL

Las semillas de C. ebano tiene forma ovoide y lisa, en la estructura externa está cubierta por una testa seminal dura, seca e impermeable, similares a las reportadas por Moreno et al. (2018) en semilla de Caesalpinia gilliesii, de color pardo oscuro a negro. En su estructura interna, el embrión es axial y lineal, de color verde claro, envuelto en una membrana traslúdecida gruesa. Tiene dos cotiledones de color verde claro y presenta una germinación epigea.

Un factor determinante según Rao et al. (2007) es el pre-acondicionamiento que se realiza en la semilla, ya que permite el contacto directo entre la sal de tetrazolio y el embrión. El pre-acondicionamiento dependerá de las características morfológicas de la semilla y tamaño (Mancipe-Murillo, Calderón-Hernández y Pérez-Martínez, 2018). En el desarrollo de la prueba de tetrazolio e identificación anatómica de la semilla de C. ebano, fue necesario realizar una escarificación mecánica con lima que facilitara la homogenización de hidratación de la testa. Este método en estudios realizados en semillas de Caesalpinia spinosa (Neri-Chavez et ál. 2018) demostraron que no presenta alteraciones internas en la estructura y composición de las semillas.

Al evaluar la tinción con diferentes concentraciones y tiempos de inmersión, presentaron en semillas de C. ebano diferencias altamente significas en la categoría viable (V), diferencias significativas en la categoría dudosas (D) y viabilidad total (VIATO), sin embargo, no se presentaron diferencias significativas para la categoría inviable (I), evidenciando con esto que las concentraciones de tetrazolio y los tiempos de tinción, afectaron la estimación del efecto en términos de coloración de los tejidos esenciales de la semilla, dado a que al menos una de las categorías mostraron diferencias significativas y/o altamente significativas. Estos resultados concordaron con los reportados por Auday-Costa et al. (2018) en semillas de Parkia multijuga, Costa-Carvalho et al. (2017) en semillas de Libidibia férrea, Espitia et al. (2017a; 2017b) en semillas de Bombacopsis quinata, Anacardium excelsum, Cedrela odorata y Cariniana pyriformi, y Macedo-Sousa et al. (2017) en semillas Poincianella pyramidalis, al evaluar diferentes concentraciones y tiempos de inmersión.

La tinción con diferentes concentraciones y tiempos de inmersión en semillas de C. ebano en la sal de tetrazolio, reflejaron que influyen en los análisis para determinar la viabilidad. Se apreció una tendencia al aumento de la intensidad del color rojo a medida que aumentan las concentraciones y los tiempos de exposición, como lo reportado por Espitia-Camacho et ál. (2017b) en semillas de Bombacopsis quinata y Anacardium excelsum.

La prueba de germinación es necesaria para la validez de la prueba del tetrazolio, ya que permiten evaluar el valor potencial para la siembra en campo (Rodríguez y

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Redman, 2008; Salazar-Mercado et al. 2018). Al comparar los tratamientos de la categoría viabilidad total (VIATO) de tetrazolio con el porcentaje de germinación, el tratamiento al 1,0% de tetrazolio con dos horas de inmersión, presentó el menor margen de diferencia y uniformidad en la tinción. Por lo tanto, para determinar la viabilidad de las semillas de C. ebano es necesario dos horas de inmersión en la solución de tetrazolio a concentración del 1,0 %. Según Mancipe-Murillo et al. (2018) y Caravita-Abbade y Takaki (2014) para que la prueba de tetrazolio sea exitosa, es fundamental el conocimiento de la concentración, el tiempo de tinción y la adecuada identificación de la tinción en las semillas.

Los promedios del porcentaje de germinación para cámara germinativa (CAGER) y casa-malla (CAMA) presentaron diferencias significativas, los cuales estuvieron en 91,0% y 55,5%, respectivamente. Según Pereira-Reis et al. (2020), los factores esenciales para la germinación como la temperatura y humedad en condiciones controladas contribuye en los procesos germinativos. Resultados similares en la variación del porcentaje de germinación ante distintos ambientes fueron reportados por Espitia-Camacho et al. (2017c), Reino-Causil (2017) y Pereira-Reis et al. (2020). En casa-malla, cuenta con condiciones heterogéneas, ya que depende de las variaciones climáticas, como lo reporta Espitia-Camacho et al. (2017c).

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CONCLUSIÓN GENERAL

En las semillas de C. ebano, fueron identificadas su anatomía interna y externa, como la textura y color, tipo de embrión, tipo de germinación, cubiertas seminales, generador de dormancia.

En la prueba de viabilidad con tetrazolio se distinguieron 4 patrones de tinción, los cuales permitieron clasificar a las semillas como viables (V), inviables (I) y dudosas (D). Las semillas alcanzaron un alto porcentaje de viabilidad y se determinó que para la realización de esta prueba es necesario el tratamiento con 1,0% de tetrazolio y dos horas de inmersión, traduciéndose esto en reducción de costos para realizar la mencionada.

Las variables fisiológicas de germinación como día de inicio de la germinación, índice de velocidad de germinación, porcentaje de germinación acumulado, día final de germinación y días durante la germinación y valor pico, son significativamente dependientes de las condiciones de germinación, casa malla o cámara germinativa (laboratorio), sin embargo, otras variables como valor germinativo y germinación diaria media, no difieren estadísticamente hablando de dichas condiciones, si bien, para la mayor parte de la variables estudiadas las condiciones de cámara germinativa resultan ser mucho más favorables en comparación con las condiciones de casa malla.

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anatomÍa, viabilidad y germinaciÓn de la semilla de …

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