Estudio de poxvirus de mamíferos marinos

Anastasia Pickford

Grado en Veterinaria. Universidad Complutense de Madridanapickf@ucm.es

Mar Melero Asensio, José Manuel Sánchez-Vizcaíno

Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madridmar.melero@ucm.es, jmvizcaino@visavet.ucm.es

Resumen: Existen muchos casos descritos de lesiones cutáneas en mamíferos marinos producidas por poxvirus, tanto en cetáceos en forma de lesiones anulares o “tattoo lesions”, como en pinnípedos en forma de lesiones nodulares. Sin embargo, existe muy poca información molecular sobre los poxvirus que causan estas lesiones. Por razones epidemiológicas, ecológicas y de sanidad marina interesa conocer más a fondo las características de los poxvirus que afectan a los mamíferos marinos, comenzando por su clasificación filogenética. Para ello en este trabajo se analizaron 184 muestras de lesiones de piel mamíferos marinos mediante PCR, obteniendo 6 positivos y 57 dudosos, que sugieren que la PCR utilizada es demasiado específica. Con los resultados obtenidos se pretende diseñar nuevas PCRs para la detección de este virus y facilitar así su estudio.

Palabras clave: Poxvirus, mamíferos marinos, pinnípedos, PCR, lesión cutánea

INTRODUCCIÓN

La familia Poxviridae contiene el mayor número de virus de mamíferos terrestres y marinos descritos. Está formada por virus con ADN de doble cadena, un genoma de 130-380kpb y que se replican casi exclusivamente en el citoplasma celular, sobre todo en piel y mucosas. Dicha familia se divide en dos subfamilias: Entomopoxvirinae que incluye los poxvirus de insectos; y Chordopoxvirinae a la que pertenecen los poxvirus de vertebrados y que a su vez se divide en 8 géneros (1, 2, 3).

A pesar de haberse documentado numerosos casos de poxvirus en mamíferos marinos, existe muy poca información molecular sobre las especies/cepas que afectan a estos animales. Su presencia en lesiones cutáneas se ha detectado hasta el momento gracias a la visualización de partículas víricas típicas de poxvirus por microscopia electrónica junto a la de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos mediante microscopia óptica (1). Se han descrito lesiones en animales tanto en libertad como en cautividad en las siguientes especies de cetáceos: delfín de flancos blancos o delfín del Atlántico (Lagenorynchus acutus), orca (Orcina orca), delfín oscuro (Lagenorynchus

obscurus), delfín común costero o de rostro largo (Delphinus capensis), delfín de Héctor o de cabeza blanca (Cephalorynchus hectori) y marsopa negra o espinosa (Phocoena spinipinnis); y en diferentes especies de pinnípedos: león marino californiano (Zalophus californianus), lobo marino sudamericano (Otaria byronia), foca común o de puerto (Phoca vitulina) y oso marino ártico (Callorhinus ursinus) (1, 4). Las pocas cepas víricas que se han analizado molecularmente hasta el momento se han clasificado dentro de los géneros Orthopoxvirus y Parapoxvirus y en base a investigaciones recientes se está planteando la posibilidad de establecer un nuevo grupo de poxvirus de cetáceos (Cetaceanpoxvirus) (1, 2, 3).

Con respecto a los signos clínicos que se manifiestan en mamíferos marinos como consecuencia de la infección por este virus, en cetáceos se han descrito dos tipos de lesiones: anulares y “tattoo lesions”. Suelen ser focales, de 0.5-3.0cm de diámetro, con forma circular a elíptica, planas, de color gris claro con borde más oscuro y que tienden a coalescer. Aparecen sobre todo en la cabeza, aletas pectorales, aleta dorsal y en la cola (1, 4). En pinnípedos las lesiones tienen una distribución similar en cabeza, cuello, pecho, aletas, región ventral y mucosa oral; tratándose de lesiones nodulares que aumentan de tamaño con el paso del tiempo (1.5-3.0cm de diámetro) y que pueden llegar a ulcerarse dando lugar con su resolución a zonas alopécicas y cicatrizadas (1, 4).

Se ha documentado que los parapoxvirus de pinípedos pueden transmitirse a humanos que entran en contacto con ellos, afectando a la piel (sobre todo de las manos), por lo que se aconseja el uso de guantes a la hora de manejar individuos infectados con el virus (4).

La clasificación filogenética de los poxvirus de mamíferos marinos tiene importancia a la hora de desarrollar ensayos diagnósticos moleculares y serológicos, además de su utilidad en estudios epidemiológicos y ecológicos, ya que pueden ser utilizados como indicadores de la salud de estos animales (2, 5). El objetivo de este trabajo es obtener más información molecular sobre los poxvirus que afectan mamíferos marinos mediante la identificación de lesiones y el diagnóstico molecular, realizando PCR y secuenciación.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales y muestras

Para obtener secuencias de ADN de posibles poxvirus de mamíferos marinos lo primero que se hizo fue analizar un total de 184 muestras de lesiones de piel recogidas hasta la fecha por el equipo de investigación de Sanidad Marina del grupo SUAT del Centro VISAVET de la Facultad de Veterinaria de la UCM. De dichas muestras 40 pertenecían a pinnípedos y las 144 restantes a cetáceos; e incluían tanto tejidos recogidos de animales varados en la costa mediterránea de la Comunidad Valenciana,

como hisopos obtenidos a partir de animales en cautividad en distintos centros marinos de España. Cada muestra se acompañaba de una fotografía de la lesión en cuestión.

En el laboratorio los tejidos fueron procesados con un holmogeneizador automático (Bullet Blender) en una dilución 1:10 con una solución salina (PBS). Tras esta preparación se realizó la extracción de ADN de las mismas mediante el High Pure PCR Template Preparation Kit de Roche siguiendo las instrucciones del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Una vez obtenido el ADN de las muestras, para determinar la presencia de ADN de poxvirus se utilizó una PCR convencional que amplificaba una región de 543 pb del gen de la ADN polimerasa de poxvirus y que fue diseñada por A.J. Bracht y col. para identificar Ceteceanpoxvirus y que fue diseñada a partir de las secuencias de exantema nodular bovino (Lumpy skin disease LSDV), poxvirus porcino (Swinepoxvirus SPV) y de poxvirus de ciervo mulo (mule deer poxvirus MDPV) registradas en GenBank (1).

Para la preparación de la PCR se añadió 1,25μl de cada primer a 10μM junto a 12,5μl de Buffer Kappa (con los nucleótidos para la amplificación, el Cl2Mg cofactor de la polimerasa y la polimerasa), 7,0 μl de agua (libre de ARNasa y ADNasa) y 3μl de muestra para tener un volumen final de 25 μl. También se preparó un control negativo de PCR (agua libre de ARNasa y ADN asa) y un control positivo de PCR (8739 – muestra de cetacean poxvirus obtenida previamente).

La PCR presentaba las siguientes condiciones de temperatura: una desnaturalización inicial a 95ºC durante 3minutos; seguido de 40 ciclos de amplificación a 95ºC para 30 segundos, 45ºC para 30 segundos y 72ªC para 30 segundos; y por último una elongación final a 72ºC durante 7 minutos.

Electroforesis y purificación de las muestras de ADN obtenidas de la PCR

Para analizar los fragmentos de ADN amplificados en la PCR, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2% (120V, 400mA, 40 minutos). Durante la lectura del gel de agarosa, mediante luz ultravioleta en el lector de geles, se pudo observar los resultados de la PCR. Posteriormente, se cortaron las bandas de interés con el fin de purificar los amplicones y mandar los fragmentos a secuenciar.

A continuación, se purificaron los amplicones, tanto a partir del producto de PCR (cuando sólo se observó una banda), como a partir del gel de agarosa (tras cortar las bandas de interés). Para ello, se utilizó respectivamente el PCR Purification Kit y el Gel Extraction Kit, ambos de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez purificados los amplicones, se mandaron a secuenciar un total de 10 μl del producto purificado junto a 1μl de los dos cebadores a 5μM por separado, empleados en la PCR (FPPOL y RPPOL).

RESULTADOS

De las 184 muestras analizadas, además del control positivo, 5 muestras fueron claramente positivas obteniéndose una banda a la altura esperada y 57 fueron dudosas con bandas inespecíficas algunas a la altura. Las 5 muestras positivas se secuenciaron y se procedió posteriormente a su análisis genético, en primer lugar con el alineamiento múltiple de todas las secuencias limpias obtenidas, utilizando el programa informático Mega 4.0, alineándolas con ClustalW. Y, en segundo lugar, las secuencias fueron comparadas con todas las secuencias existentes a través de la base de datos del Genbank (con el BLASTn) con el fin de ver a qué otras secuencias se parecían y confirmar que se trataba de un poxvirus. Todas las muestras positivas – tres de delfín listado (Stenella coeruleoalba), dos de león marino californiano (Zalophus californianus) y uno de delfín mular (Tursiops truncatus) – correspondían con Cetaceanpoxvirus tipo 1 con una cobertura (Q) del 100% y una semejanza (I) de entre 97 y 99%. Los resultados moleculares obtenidos se compararon con las fotografías de las lesiones correspondientes y se pudo comprobar que se ajustaban a las lesiones típicas descritas de poxvirus.

Figura 1. Fotos de lesión cutánea en dos delfines listados (Stenella coeruleoalba), la imagen de la izquierda corresponde al control positivo utilizado. Son lesiones circulares en el flanco izquierdo,

ligeramente deprimidas, de color marrón grisáceo con punto en la zona central

Figura 3. Foto de piel de león marino californiano (Zalophus californianus) con múltiples lesiones nodulares circulares rojizas junto a zonas alopécicas y cicatrizadas

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

A partir del estudio realizado se puede concluir que se han encontrado muestras de lesiones cutáneas de mamíferos marinos producidas por poxvirus, tratándose de un cetaceanpoxvirus. Pero cabe destacar tres características importantes de los resultados: en primer lugar el hecho de que todas las muestras positivas fueran idénticas; en segundo lugar, el gran número de muestras dudosas; y, en tercer lugar la secuenciación de un fragmento de un poxvirus distinto a cetaceanpoxvirus 1 a partir de una banda a una altura de 250pb. Estos hallazgos sugieren que el diseño de la PCR utilizada pueda ser demasiado específico detectando correctamente únicamente las secuencias de cetaceanpoxvirus 1 y no siendo capaz de amplificar correctamente las secuencias diferentes, produciendo bandas inespecíficas.

Por tanto, a partir de los resultados obtenidos hasta el momento, el próximo paso en esta línea de investigación será el diseño de una PCR menos específica que permita detectar más tipos de poxvirus para poder seguir con el estudio molecular de los mismos.

BIBLIOGRAFÍA

1. Bracht AJ, Brudek RL, Ewing RY, Manire CA, Burek KA, Rosa C, Beckmen KB, Maruniak JE, Romero CH. Genetic identification of novel poxviruses of cetaceans and pinnipeds. Archives of Virology. 2006. 151: 423-438

2. Nollens HH, Gulland FMD, Jacobson ER, Hernandez JA, Klein PA, Walsh MT, Condit RC. Parapoxviruses of seals and sea lions make up a distinct subclade within the genus Parapoxvirus. Virology. 2006. 349: 316-324

3. Ropp SL, Jin Q, Knight JC, Massung RF, Esposito JJ. PCR strategy for identification and differentiation of Smallpox and other Orthopoxviruses. Journal of Clinical Microbiology. 1995. 33: 2069-2076

4. Dierauf LA, Gulland FMD. CRC Handbook of Marine Mammal Medicine. 2ª ed. EEUU: CRC Press; 2001

5. Blacklaws BA, Gajda AM, Tippelt S, Jepson PD, Deaville R, Van Bressem MF, Pearce GP. Molecular characterization of poxviruses associates with tattoo skin lesions in UK cetaceans. PLOS one. 2013. 8.