8.2 Método de determinación por cromatografía en fase gaseosa

Reactivos

1.Éter etílico (C2H5)O2 destilado en el momento de su utilización.2.Solución del patrón interno y solución del ácido undecanoico C11H22O2 en etanol al 95% vol g/l.3.Solución acuosa de ácido sulfúrico H2SO4 en una cantidad de 1.84g/l.

Material

- Cromatografía de gases equipado mediante un detector de ionización de llama con columna de acero inoxidable.- Microjeringa.Para el tratamiento con dimetil cloro (DMDCS), se hace pasar por la columna una solución de tolueno, lavándose de inmediato la columna con metanol y secándola con una corriente de nitrógeno. Posteriormente se rellena la columna.

Proceso

Se añaden 20 ml en un tubo de vidrio provisto de un tapón. Se añaden 2 ml de solución de patrón interno y 1 ml de solución diluida de ácido sulfúrico.(1) Se agita el tubo y se añade una cantidad de 10 ml de éter etílico . El ácido sórbico se extrae en la fase orgánica agitando el tubo durante 5 minutos.Se selecciona el vino cuyo cromatograma de extracto etéreo no presente ningún pico de ácido sórbico. Se añade al vino ácido sórbico hasta alcanzar una concentración de 100 mg/l.Se inyecta sucesivamente en el cromatógrafo (2) de la fase etérea obtenida en (1) y se realiza la cromatografía.Hay que comprobar la presencia de ácido sórbico y patrón interno. Se mide la altura de cada uno de los picos registrados.

Método de cálculo

La concentración de ácido sórbico, viene expresada en mmg/l.H= altura del pico del ácido sórbico en la solución de referencia.h= altura del pico del ácido sórbico en la muestra para análisis.I= altura del pico del patrón interno en la solución de referencia.i= altura del pico del patrón interno para muestra de análisis.

18.3 Método de detección de trazas de ácido sórbico mediante cromatografía de capa fina

Reactivos

1.Éter etílico (C2H5)O2.2.Solución acuosa de ácido sulfúrico H2SO4.3.Solución de referencia de ácido sórbico en una mezcla hidroetanica a 10% de etanol (vol).aproximadamente unos 20 mg de etanol.4.Fase móvil hexano-pentano-ácido acético C6H14-C5H2-CH3COOH.

Material

- Placas para cromatografía de capa fina de 20x20 recubiertas donde se les añadirá un indicador de fluorescencia.- Cubeta para cromatografía.- Micropipeta o microjeringa.- Lámpara de ultravioleta.

Proceso

Se introducen 10 ml de vino en un tubo de vidrio, se añade 1 ml de solución de ácido sulfúrico diluido y 5 ml de éter etílico. Se agita y se deja decantar. Por último se prepara las soluciones diluidas de 2, 4, 4, 8 y 10 mg/l de ácido sórbico.Cromatografía: Con una jeringa o micropipeta se deposita una cantidad de 2 cm de fase etérea obtenida en una de las dos placas y también una cantidad de 5 l. de cada una de las soluciones diluidas. La distancia entre los puntos será 2 cm.Se introduce la fase móvil en la cubeta de cromatografía y se coloca la placa en la cubeta. Se deja desarrollar el cromatograma entre 12 a 15 cm un tiempo aproximado de 30 minutos. Posteriormente las

placas se secan bajo una corriente de aire frió. El cromatograma se examina bajo una lámpara ultravioleta a 250nm.Las manchas de ácido sórbico, de color oscuro, destacan sobre el fondo amarillo de la placa La comparación entre la intensidad de la mancha de la muestra para analizar y las manchas de las soluciones de referencia permiten evaluar la concentración de ácido sórbico entre 2-10 mg/l.

19. ÁCIDO L-ASCÓRBICO

Fundamento del método.

El método aquí empleado determina el ácido L-ascórbico dehidroascórbico presentes en el vino.Este ácido se oxida por acción del carbón activo a ácido dehidroascórbico. El ácido dehidroascórbico forma un compuesto fluorescente por su reacción con la ortofenilendiamina (OPDA) mediante la realización de una prueba testigo con ácido bórico se determina la fluorescencia.

Reactivo

1.Solución de hidrocloruro de ortofenilendiamina a 0.02g/100ml (C6H10Cl2N2).2.Solución compuesta de ácido bórico y cromato de sodio.3.Solución de ácido acético cristalizado al 56% con pH  =1.2.4.Solución de ácido L-ascórbico de 1g/l (C6H8O6)5.Carbón activo puro.

Material

- Fluorímetro.- Filtro de vidrio poroso.- Tubos de ensayo.- Agitador para tubos.

Proceso de preparación de la muestra

Se ponen en un matraz de 100ml de vino y se enrasa con ácido acético. Se homogeneiza el contenido del matraz agitando y se añaden 2g de carbón activo, dejándolo reaccionar un tiempo de 15 minutos. Por último se pasa por papel de filtro.Se introducen en dos matraces aforados de capacidad 100ml, 5ml de filtrado y 5 ml de solución mixta de ácido bórico y malato de sodio. Se dejan 15 minutos en contacto y se enrasan con agua.Se extraen 2ml de cada uno de los matraces y se le añaden una cantidad de 5 ml de ortofenilendiamina y se agita. Debe de permanecer en reposo media hora y en oscuridad. Posteriormente se mide con el espectrofotómetro.Se introducen 2, 4 y 6 ml en tres matraces de solución de ácido L-ascórbico y se emplea con ácido acético hasta 100ml y se agita hasta homogeneizar la solución.Se añaden 2g de carbón activo en cada uno de los matraces y se dejan 15 minutos agitando de vez en cuando , se filtra y se añade 5 ml de cada filtrado en matraces añadiendo posteriormente una solución de 5ml de ácido bórico y de acetato de sodio y a los matraces de segunda serie se le añaden 5ml de acetato de sodio.Se dejan 15 minutos en contacto y se enrasan con agua hasta 100ml. Se extraen 2 ml de cada matraz y se le añaden 5 ml de ortofenilendiamina , se agita y se deja 30 minutos en oscuridad y se mide con el espectrofluorímetro.La curva patrón que se obtiene de las medidas del espectrofluorímetro, debe ser una curva de regresión lineal y que pase por el punto origen.La concentración de ácido L-ascórbico más ácido dehidroascórbico en el vino se expresa en mmg/l.

INTRODUCCION: 

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w w w . i n f o a g r o . c o m

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza frecuentemente para separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, metabolitos, y ocacionalmente para separar cadenas cortas de polipéptidos y ácidos nucleicos. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o una mezcla de ambos. El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centímetro del borde en uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña cantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria. Si la mezcla de muestras que se está analizando presenta color, se verán los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora (developer) para poder determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador dependerá del tipo de moléculas que se analizan.   OBJETIVOS: 

1.      Familiarizarse con otra técnica de separación de moléculas pequeñas, en este caso, aminoácidos.

2.      Determinar la composición de una mezcla de aminoácidos.3.      Determinar el grado de afinidad de los aminoácidos, por medio del cálculo

de Rf.  MATERIALES: Placas de silicato de 5 x 20 cmTanque desarrollador con tapaGuía para marcar la placaSolvente (n-butanol: ácido acético: agua) (4:1:5)Muestras de aminoácidos estándares (individuales)Mezcla de aminoácidos experimentalHornoNinhidrina en atomizador (developer)Pipeteador de 2 μl, con puntas

LápizRegla (cm)  PROCEDIMIENTO: 1.      Teniendo mucho cuidado de no tocar la superficie de la placa de silicato con sus

dedos, tome la suya y colóquela sobre la mesa. NO TOQUE LA PARTE DE LA PLACA CON EL POLVO DE SILICATO. SUS DEDOS TIENEN SUSTANCIAS QUE SE ADHIEREN A LA SUPERFICIE DEL SILICATO Y AFECTARA LA VISIBILIDAD DE LAS MUESTRAS.

2.      Haga una marca con lápiz a un centímetro del borde inferior de la placa de silicato, en los bordes laterales. Haga otra marca a 10 cm arriba de la marca inferior. Estas servirán de guía para colocar sus muestras y hasta dónde dejará correr la cromatografía. No use tinta porque esta se correrá con el solvente. No raye la placa de lado a lado: esto interferirá con el movimiento del solvente, al interrumpir la continuidad de la fase estacionaria.

3.      Utilizando la guía plástica para colocar muestras, coloque 2 μl de cada una de las muestras individuales (los estándares y la mezcla desconocida) sobre la placa de silicato. Si no tiene la guía, coloque las muestras a 1cm del borde inferior de la placa, usando de guía la marca que hizo a lapiz. Mantenga una separación de 1.5 cm entre las muestras. Quedarán unas manchitas de humedad sobre el silicato. Identifique cada uno de los puntos: numere el orden de cada mancha. Anote en su libreta los estándares usados según el orden en que colocó en el silicato, y la  posición de su desconocido.

4.      Coloque la placa de silicato, SIN la guía plástica, en el horno por 5 minutos, para secarla.

5.      Saque la placa, deje que se enfríe y repita el procedimiento de muestreo como en el paso 2. Esto le permitirá concentrar sus muestras para que los puntos se vean más claros. Asegúrese de que la segunda muestra que coloca en cada punto es la misma que en el primer muestreo. NO LAS MEZCLE.

6.      Luego se secar al horno y dejar enfriar, coloque las placas en el tanque desarrollador con solvente. El solvente debe tener menos de 1 cm de profundidad para que no entre en contacto directo con las muestras. Tape el tanque porque el solvente es bastante volátil y se evapora con facilidad.

7.      Deje que el solvente suba por capilaridad hasta unos 10 cm del punto donde usted colocó las muestras. (Hasta la marca superior.)

8.      Si por falta de tiempo no se puede esperar hasta que el solvente llegue a 10 cm, marque con lápiz hasta dónde subió el solvente.

9.      Seque en el horno por 5 minutos.10.  Saque, deje enfriar y rocíe con ninhidrina. Esta es una sustancia que se adhiere a los

aminoácidos y los tiñe. Tenga cuidado al rocear la ninhidrina o se mancharán las manos por varios días.

11.  Coloque de nuevo en el horno por varios minutos hasta que note manchas de colores.

12.  Mida la distancia recorrida por cada mancha desde el lugar donde colocó la muestra hasta el centro de la mancha de color.

13.  Como marcó el punto de origen y el punto hasta donde corrió el solvente, mida esta distancia también.

14.  Anote el color de cada una de las manchas.

  RESULTADOS:      1.      Haga un dibujo de su placa, identificando cada uno de los estándares.2.      Calcule en Rf de cada muestra estándar y determine cuál(es) es (son) el (los)

desconocido(s) de su muestra.Rf = Distancia corrida por la muestra               Distancia solvente

 Distancia recorrida por el solvente: ________________  

Número Nombre de la Muestra

Color de la mancha Distancia recorrida

Rf

123456

   DISCUSIÓN: 1.      ¿Cuál fue su desconocido?2.      ¿Cómo determinó que ése es su desconocido?3.      ¿Qué puede inferir de la afinidad de los aminoácidos usados en el ex