analisis del flujo genico en poblaciones de

ANALISIS DEL FLUJO GENICO EN POBLACIONES DE

PALYTHOA CARIBAEORUM EN EL CARIBE COLOMBIANO

MANRIQUE HOYOS NATALIA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

BIOLOGA

Luis Alberto Acosta, Ph.D. Director

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGIA

Bogota, D.C.

Junio 13 de 2007

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

�La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia�.




APROBADO

________________________ Luis Alberto Acosta, Ph.D

Director

__________________________ __________________________ Diana Alvarez, Ph.D. Maria Martinez, Bióloga

Jurado Jurado




APROBADO

________________________ ________________________

Angela Umaña Muñoz, MPhil. Andrea Forero Ruiz

Decana Académica Directora de Carrera

DEDICATORIA

A mi familia, por acompañarme a pesar de la distancia.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la Pontificia Universidad Javeriana y a Colciencias por la financiación del

proyecto y al Laboratorio de Genética de Poblaciones y Biología Evolutiva por el

préstamo de equipos y la asesoría recibida. A mi director Alberto Acosta, por acogerme

como pupila, ser paciente y mostrarme qué significa realmente enamorado de una

profesión. Al Dr. Manuel Ruiz-García por su gran asesoría y colaboración en el

aprendizaje de la genética de poblaciones. A María Eugenia Varela, cuyo trabajo ha sido

invaluable en este proyecto.

TABLA DE CONTENIDOS

1. Introducción 11

2. Marco teórico y revisión de literatura 12

2.1 Estado de arrecifes de coral 12

2.2 Conectividad de arrecifes y genética de poblaciones 13

2.3 Marcadores moleculares en corales 16

2.4 Biología de Palythoa caribaeorum 17

3. Formulación del problema y justificación 19

3.1 Formulación del problema 19

3.2 Justificación de la investigación 19

3.3 Pregunta de investigación 20

4. Objetivos 20

4.1 Objetivo general 20

4.2 Objetivos específicos 20

5. Materiales y métodos 21

5.1 Diseño de la investigación 21

5.1.1 Población de estudio y muestra 21

5.1.2 Variables del estudio 21

5.2 Recolección de la información 22

5.3 Análisis de información 24

6. Resultados 31

6. 1 Polimorfismo y composición del ADN 31

6.2 Desequilibrio de ligamiento 32

6.4 Detección de selección natural 34

6.2 Diversidad genética 34

6.5 Divergencia entre poblaciones 35

6.6 Estructura Poblacional 39

6.7 Flujo génico 41

6.8 Aislamiento por distancia 42

6.9 Distancias genéticas y análisis de agrupamiento 43

6.10 Existencia de cambios en el tamaño poblacional 51

7. Discusión 53

8. Conclusiones 64

9. Recomendaciones 65

10. Referencias 66

11. Anexos 76

Anexo A. Protocolo de extracción de ADN 76

Anexo B. Haplotipos de P. caribaeorum encontrados 77

Resumen

Los resultados sobre diversidad y flujo genético de organismos marinos, según la escala

espacial, resultan contradictorios a nivel mundial y son escasos en Colombia. Debido a

ello, en este trabajo se estimaron los niveles de diversidad y flujo genético en cuatro

poblaciones del zoantharia Palythoa caribaeorum en el Caribe colombiano (dos

poblaciones oceánicas y dos continentales). Se utilizó el marcador ITS2 de ADN

ribosomal nuclear para obtener y comparar la diversidad y flujo génico en dos escalas

geográficas, local (≈100 Km) y regional (≈700 Km), así como para detectar la estructura

poblacional y la existencia de aislamiento por distancia a nivel total. Se obtuvieron altos

niveles de diversidad nucleotídica y haplotípica, y las poblaciones no presentaron

aislamiento por distancia; sin embargo, se detectó una ligera diferenciación entre las

poblaciones a nivel global (FST = 0.06268; p<0,01) a pesar de valores moderados y altos

de flujo génico (Nm=3,74-6,78); lo cual se atribuye a posible exceso de clones por

reproducción asexual en la población de San Andrés, al no encontrarse estructura

poblacional entre las otras poblaciones estudiadas, a nivel regional y local. Los

resultados sugieren alta conectividad genética y ausencia de estructura genética real

tanto a nivel regional como local de P. caribaeorum en el Caribe colombiano; pudiendo

explicarse este patrón por fuertes corrientes durante la época reproductiva de la especie,

que transporta las larvas entre arrecifes de forma bidireccional. La alta diversidad

genética encontrada, sería el producto de moderados o altos niveles de flujo,

reproducción sexual y asexual y tasas mutacionales (en el marcador estudiado). Futuras

estrategias de manejo deberán considerar la alta conectividad y diversidad genética

encontrada para esta especie en Colombia.

Abstract.

Results on diversity and gene flow of marine organisms according to spatial scale are

contradictory throughout the world, and are scarce in Colombia. Due to the little

information available, the levels of diversity and gene flow were determined in four

populations of the Zoantharia Palythoa caribaeorum in the Colombian Caribbean (two

oceanic and two continental populations). Sequences from the ITS2 of nuclear ribosomal

DNA were used to assess and compare the diversity and gene flow at two spatial scales,

local (<100 Km) and regional (<800 Km) as well as to detect the genetic structure and

isolation by distance at a total level. High values of genetic diversity were obtained, and

the populations did not reveal isolation by distance. However, a slight differentiation

among the populations was detected (FST = 0.06268; p<0,01), in spite of moderate to

high values of gene flow (Nm=3,74-6,78). This could be explained by an excess of clones

product of asexual reproduction in the San Andres population, since no population

structure was detected among the other populations studied, at a local and regional

scale. The results suggest an absence of real genetic structure, and a high level of

connectivity between all the populations of P.caribaeorum studied, at a regional and local

scale in the Colombian Caribbean, pattern that could be explained by the strong currents

during the reproductive stage of the species, which could carry the larvae between the

reefs in a bidirectional manner. The high genetic diversity found would be the product of

moderate o high levels of gene flow, sexual and asexual reproduction rates and

mutational rates in the molecular marker. Future management strategies should consider

the high connectivity and genetic diversity found for this species in Colombia.

1. Introducción

Los arrecifes de coral son formaciones recurrentes en el paisaje marino y de las cuales

dependen un gran número de especies no coralinas que encuentran en los arrecifes un

albergue y una fuente de alimento (INVEMAR 2005), sin embargo, en las últimas

décadas se ha registrado un creciente declive de la cantidad y calidad de arrecifes a

nivel mundial (Wilkinson 2002; Gardner et al. 2003), por lo que se han creado iniciativas

de investigación y planes de manejo para poder conservar y restaurar estos

ecosistemas. Para esto, es necesario conocer previamente la organización espacial y

definir la conexión que existe entre las poblaciones arrecifales (Pandolfi 2002).

Ya que cada arrecife de coral contiene especies que realmente se encuentran divididas

en poblaciones, es frecuente encontrar un intercambio genético poblacional entre

arrecifes (Le Goff & Rogers 2002). Para estimar la cantidad y dirección de este

intercambio poblacional, es conveniente realizar estudios indirectos no invasivos, debido

a la gran dificultad que representa el seguir y cuantificar directamente los gametos y

larvas que se mueven de un lugar a otro.

La genética de poblaciones, además de ser un método indirecto, usualmente no

invasivo, es matemáticamente riguroso, y permite, además de calcular de una manera

aproximada el flujo génico, conocer el estado genético de las poblaciones, su historia

evolutiva y calcular la viabilidad de las mismas (Hastings & Harrison 1994). De la misma

manera, se debe complementar los resultados genético-poblacionales con información

sobre corrientes marinas, contaminación, disturbios, sedimentación y demás factores

que puedan afectar la dispersión, asentamiento y reclutamiento de los organismos.

Ya que la mayoría de especies de coral utilizadas para estudios genético-poblacionales

pertenecen al orden Scleractinia, en este trabajo se buscó explorar la utilidad de una

especie conspicua del orden Zoantharia, Palythoa caribaeorum, ampliamente distribuido

en el Caribe, en estudios poblacionales utilizando marcadores moleculares. El género

Palythoa ha sido estudiado al nivel de morfo fisiología, ecología y reproducción (Ryland

1997; Acosta et al. 2001) encontrándose características que le hacen atractivo para ser

estudiado a nivel genético-poblacional, como el ser liberador de gametos (Fadlallah et al.

1984) y poseer estrategias de reproducción asexual (Acosta et al. 2001); sin embargo,

son pocos los estudios realizados sobre la estructura genética de las poblaciones

colombianas (Camacho 2004).

Diferentes estudios de migración han utilizado marcadores moleculares para inferir los

procesos de colonización, expansión y flujo genético en poblaciones de diferentes

plantas y animales, y también han mostrado que puede existir una relación directamente

proporcional entre la distancia geográfica y genética (Le Goff-Vitry et al. 2004; van

Oppen & Gates 2006). De la misma manera, el flujo génico puede verse afectado por

disturbios que pueden disminuir la viabilidad y asentamiento de larvas, y funcionar como

una barrera para el mismo, como la descarga de ríos a la que se ven sometidas las

poblaciones continentales aquí estudiadas, que disminuyen la salinidad y aumentan la

sedimentación en el área (Díaz et al. 1996; von Prahl & Erhardt 1985).

Al tratarse de un estudio a nivel intraespecífico se debe seleccionar un marcador

variable y de gran resolución (Le Goff & Rogers 2002), por lo que se trabajó con el

espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del ADN ribosomal nuclear. Este trabajo buscó

estimar el flujo génico e inferir la estructura genética de poblaciones de P. caribaeorum

a escala regional y local, en el mar Caribe colombiano, así como comparar la diversidad

genética de la regiones ITS2 de poblaciones de P. caribaeorum de los arrecifes de San

Andrés, Providencia, Isla Grande e Isla Fuerte. Se propuso aportar información valiosa

para contribuir con la definición de áreas marinas protegidas y su demarcación basada

en parámetros biológicos.

2. Marco teórico

2.1 Estado de arrecifes de coral

Los arrecifes de coral son el hogar y la fuente de alimento del cual depende una gran

cantidad de especies marinas (INVEMAR 2005). Son ecosistemas marinos complejos,

que han presentado un progresivo deterioro en las últimas tres décadas a una velocidad

alarmante, y se ha predicho que esta degradación dista de detenerse (Wilkinson 2002;

Gardner et al. 2003). Por esta razón, se han llevado a cabo múltiples estudios buscando

comprender el funcionamiento de estos ecosistemas a diferentes escalas espaciales y

temporales (Pandolfi 2002), para crear estrategias que permitan su conservación y su

recuperación.

Se ha reportado que en el Caribe el 85% de las especies coralinas presenta algún nivel

de deterioro (Rogers 1985). Es difícil conocer a ciencia cierta la causa real de la

degradación de un arrecife de coral ya que lo más probable es que sea debida a una

combinación de factores y disturbios y no se pueda asociar a un único agente (Gardner

et al. 2003; Rodríguez-Ramírez et al. 2005; Acosta & Martínez 2005). Uno de los

principales procesos que degradan un arrecife es el blanqueamiento coralino, que a su

vez puede ser causado por varios factores, como un aumento en la temperatura del agua

(como ocurre actualmente con el calentamiento global), alta irradiación, sedimentación,

contaminación o enfermedades causadas por otros organismos (Douglas 2003; Gil-

Agudelo et al. 2005).

Uno de los procesos más importantes en la recuperación de un arrecife de coral es el

reclutamiento de juveniles, que recolonizan áreas de coral muerto. La tasa de

reclutamiento influye sobre la demografía y variabilidad genética de las poblaciones

coralinas. Se ha encontrado que en las islas continentales Isla Fuerte e Isla Grande

existe una menor diversidad y riqueza coralina de juveniles que en las islas oceánicas

San Andrés y Providencia (Dueñas 2005), relacionando este resultado con el efecto que

tiene la descarga de ríos cerca a las islas continentales, provocando la disminución de la

salinidad y un aumento en la sedimentación (Diaz et al. 1996; Garzon-Ferreira & Diaz

2003). También se ha propuesto que los ríos Sinú, Atrato y Magdalena podrían actuar

como una barrera para el flujo génico entre Isla Fuerte e Isla Grande (Acosta et al.

2005a).

2.2 Conectividad de arrecifes y genética de poblaciones

La conservación de especies marinas depende en parte de determinar si las regiones

están genéticamente conectadas de la manera en que lo predicen los patrones de

corrientes (Roberts 1997). La conexión genética depende en gran medida de la manera

en que se dispersan las especies; y se puede llegar a inferir cuáles poblaciones

funcionan como fuente o sumidero en áreas afectadas por impacto antrópico (Le Goff &

Rogers 2002). Diferentes estudios de dispersión han utilizado marcadores moleculares

para inferir los procesos de colonización, expansión y flujo genético ocurridos en

poblaciones de diversos modelos biológicos (Hastings & Harrison 1994), abarcando una

gran cantidad de taxones, desde plantas (Broyles & Wyatt 1993) hasta insectos (Levins

1969; Preziosi & Farbaim 1992), gasterópodos (Johnson & Black 1991), equinodermos

(Hunt 1993), anuros (Berven & Grudzien 1990), aves (Stangel et al. 1992) y corales

(Hellberg 1994; Le Goff & Rogers 2002; Nishikawa et al. 2003).

En Colombia, los trabajos de conectividad y estructura genética de poblaciones se han

realizado principalmente con dípteros (Vargas et al. 2006, Ruiz-García et al. 2006a,

Munstermann et al. 1998, Scarpassa et al. 1999) y, en menor proporción, con protozoos

(Márquez et al. 1998, Ruiz-García et al. 2001), mariposas (Gómez et al. 2006), delfines

(Banguera-Hinestroza et al. 2002), jaguares (Ruiz-García et al. 2006b), osos de anteojos

(Ruiz-García 2003) y humanos (Jaramillo-Correa et al. 2001).

Los seres vivos habitan en ambientes no homogéneos (Sousa 1984) y una especie

generalmente se encuentra dividida en parches discretos de hábitat separados entre sí,

inmersos en una matriz no habitable por la misma (Gavrilets et al. 2000; Hanski &

Ovaskainen 2003). Usualmente cada población presenta una dinámica local

independiente (Hanski 1996, Hanski & Simberloff 1997) y esta puede estar relacionada

con la calidad y cantidad de recursos que tienen un efecto directo sobre la eficacia

biológica o fitness promedio, la densidad de las poblaciones, y el crecimiento o

decrecimiento de estas (Leibold 1995). Un conjunto de poblaciones demográficamente

independientes, pero conectadas entre sí por un bajo o moderado flujo génico se

denomina metapoblación, y la �capacidad metapoblacional� es la capacidad del paisaje

de sostener a largo plazo una especie, donde ésta incrementa con el número y tamaño

de los parches, y disminuye con la distancia entre ellos (Hanski 1996; Hanski &

Ovaskainen 2003).

El flujo génico entre poblaciones y el efecto de la deriva génica tienen una gran

repercusión en la evolución de una especie y en un modelo donde el nivel de dispersión

es dependiente de la distancia entre parches se pueden observar patrones de

correlación de distancias genéticas y geográficas (Hastings & Harrison 1994, Hanski

1996, Ovaskainen & Hanski 2003, Ovaskainen et al. 2002). En algunas poblaciones, se

ha demostrado la existencia de una relación entre éstas variables (Salvato et al. 2002;

Sokal 1979). Estudios realizados con microsatélites por Harper et al. (2003), analizando

la variación intraespecífica de 26 poblaciones de Polymmatus bellargus (Lepidóptera),

permitieron determinar que distancias geográficas superiores a 13 Km son una barrera

importante al flujo genético entre las poblaciones, presentándose un fenómeno de

aislamiento por distancia. Salvato et al. (2002) estudiaron el grado de diferenciación de

dos especies del genero Thaumetopoea; T. pityocampa y T. wilkinsoni (Lepidóptera),

calculando un flujo génico de solo un individuo cada dos generaciones, probablemente

debido a su baja capacidad de dispersión, barreras geográficas y fragmentación del

hábitat.

La interacción entre el flujo génico y la correlación geográfica y genética de las

poblaciones son de especial interés para determinar su efecto sobre la variabilidad

genética dentro y entre poblaciones y viabilidad de las metapoblaciones (Hanski 1996,

Gavrilets et al. 2000). Este tipo de estudios ha permitido determinar el nivel de

conectividad entre poblaciones de muchas especies, así como realizar la distinción entre

especies simpátricas y morfológicamente similares y estimar el tiempo de divergencia

entre las mismas, aportando información valiosa a los campos de la biología de la

conservación, la taxonomía y la sistemática.

Al incrementar la distancia entre las poblaciones se aumentan los costos energéticos y

riesgos durante la dispersión, se disminuye la probabilidad de recolonización y se puede

incrementar la diferenciación genética, entendida como la cantidad de diferencias entre

genes de diferentes poblaciones, medidas por el número de sustituciones de nucleótidos

por sitio (Nei 1987). Este último proceso puede ser retardado si existe un flujo génico

constante, aunque se dé en una cantidad reducida (Hanski 1996). Por el contrario, un

aislamiento puede generar y determinar una diferencia en la estructura genética de las

poblaciones, que refleja el número de alelos que se intercambian entre las poblaciones,

mientras que al existir un gran intercambio genético las frecuencias alélicas tienden a

homogeneizarse y es más difícil detectar una estructura genética (Balloux & Lugon-

Moulin 2002).

La estructura genética de una población es un conjunto de parámetros que describen el

estado genético de una población, entre ellos el equilibrio Hardy-Weinberg, la

heterogeneidad genética y el flujo génico (Slatkin 1994). A partir de estos parámetros se

puede inferir cómo se encuentran agrupados realmente los individuos de las

poblaciones. La conectividad entre poblaciones se encuentra muy relacionada con la

estructura genética de las mismas, pero se enfoca principalmente a describir la magnitud

y dirección de la dispersión de material reproductivo, organismos o partes de ellos. Ésta

se determina tanto por medio del valor del flujo génico entre las poblaciones como de la

autocorrelación espacial, que es la dependencia del valor de las frecuencias alélicas en

una ubicación geográfica adyacente, es decir, el patrón de variación de los datos de

acuerdo a su ubicación espacial (Sokal 1979).

Las especies que son buenas dispersoras o que viven en hábitats efímeros usualmente

presentan una baja diferenciación genética promedio, medida con un FST u otro índice

de diferenciación entre poblaciones, y poca correlación entre distancias genética y

geográfica (Palumbi 2003; Hellberg 1996). Cuando los valores FST se grafican contra la

distancia entre sitios, las distancias en que el valor de FST se encuentra por encima de

cero, pero debajo de su asíntota corresponde a la escala en que las poblaciones son

independientes, pero aun se encuentran unidas por flujo génico y un fenómeno de

aislamiento o especiación no es inminente (Hastings & Harrison 1994). Se considera que

las poblaciones están localmente diferenciadas si Nem (el producto del número efectivo

y la tasa de la migración por generación, ocasionalmente denominada M) es mucho

menor que uno (Hastings & Harrison 1994).

Varios estudios en genética de poblaciones han demostrado que las larvas de varias

especies de corales presentan una gran capacidad de dispersión, impidiendo la

detección de un aislamiento genético poblacional aun en escalas geográficas de hasta

2000 Km (Burnett et al. 1994; Magalon et al. 2005). Rodriguez-Lanetty & Hoegh-

Guldberg (2002) en un estudio realizado utilizando los marcadores ribosomales ITS-1 e

ITS-2, no encontraron una estructura genética en las poblaciones del coral Plesiastrea

versipora en el archipiélago Ryuku en Japón, en una escala de aproximadamente 700

km. Se ha encontrado un alto nivel de flujo génico entre poblaciones de Pocillopora

damicornis, Seriatopora histrix, Stylophora pistillata, Acropora cuneata y Acropora valida

a lo largo de 1200 km en la Gran Barrera de Coral (Ayre & Hughes 2000). Sin embargo,

también se han encontrado que para algunas poblaciones el rango de conectividad entre

arrecifes de coral se puede limitar a decenas de kilómetros (Ayre & Dufty 1994). Esta

diferencia en la capacidad de dispersión de las larvas de corales puede depender de

muchos factores, incluyendo la historia de vida y estrategia de reproducción de la

especie (Nishikawa & Sakai 2003; Nishikawa et al. 2003), así como de los patrones de

corrientes de la zona (Ayre & Dufty 1994, Gutiérrez-Rodríguez & Lasker 2004; Magalon

et al. 2005).

2.3 Marcadores moleculares en corales

En estudios de genética de poblaciones se pueden utilizar una gran variedad de

marcadores moleculares como alozimas, microsatélites, secuencias codificantes o no

codificantes de ADN nuclear y mitocondrial, o se pueden realizar estudios que exploran

el genoma de una manera más general. Para realizar estudios genéticos a nivel

poblacional o de especies de un mismo género se deben usar marcadores genéticos de

alta resolución y gran variabilidad para calcular índices de diferenciación genética entre

poblaciones (Le Goff & Rogers 2002).

Dependiendo de parámetros del estudio, como la escala taxonómica y análisis a realizar,

unos marcadores pueden ser más apropiados que otros. Los microsatélites consisten de

repeticiones de una secuencia simple de ADN, éstos se encuentran distribuidos

ampliamente en el genoma eucariótico y usualmente son muy polimórficos (varían en el

número de repeticiones). Sin embargo, una desventaja de los microsatélites en estudios

de filogenia o diferenciación entre poblaciones es que si el rango de alelos posibles es

muy pequeño las mutaciones pueden tener un efecto homogenizador sobre las

poblaciones, creando una falsa igualdad (Gaggiotti et al. 1999). Aunque los

microsatélites son ampliamente utilizados en estudios de flujo génico y diferenciación

entre poblaciones de vertebrados e invertebrados, Balloux et al. (2000) afirman que

estos marcadores pueden arrojar resultados que subestiman la diferenciación entre

poblaciones y en consecuencia sobreestiman los niveles de flujo génico.

Ciertos marcadores ampliamente utilizados en algunos grupos taxonómicos pueden ser

inapropiados para la especie a estudiar. El ADN mitocondrial es frecuentemente utilizado

en vertebrados porque presenta tasas de evolución hasta 10 veces mayores que los

genes nucleares de una sola copia. Sin embargo, contrario a la mayoría de phyla

animales, en la clase Anthozoa (Cnidaria) las secuencias mitocondriales tienen una tasa

de evolución menor en comparación al genoma nuclear y en general de 10 a 20 veces

menor que la tasa de evolución de secuencias mitocondriales de vertebrados (Shearer et

al. 2002). En consecuencia los marcadores mitocondriales no se consideran apropiados

para realizar análisis a nivel de poblaciones de Anthozoa (Sinniger et al. 2005), razón por

la cual no serán utilizados en este estudio de conectividad.

En su lugar, se ha recomendado que se utilicen las secuencias de ADN ribosomal

nuclear no conservadas (de gran variabilidad) exclusivamente en estudios a nivel

poblacional o de especie (Chen et al. 2004). El ADN ribosomal (rDNA) nuclear

eucariótico consta de unidades de transcripción que contienen las regiones codificantes

para las subunidades 18S, 5.8S y 28S de ARN ribosomal, separados entre si por dos

espaciadores transcritos internos, ITS1 e ITS2 (Internal Transcribed Spacer 1 y 2). Las

diferentes regiones del ADN ribosomal presentan diferentes tasas de evolución. Las

subunidades 18S y 28S, altamente conservadas, han sido utilizadas para realizar

estudios filogenéticos de niveles taxonómicos mayores dentro de un phylum aunque se

ha propuesto que la subunidad 28S ADN ribosomal es un mejor marcador para estudiar

las relaciones que cobijen organismos de un mayor rango taxonómico (Chen et al.

2000a)

Las secuencias de ADN nuclear ribosomal de la región ITS de muchos corales presentan

una gran variabilidad intraespecífica (Takabayashi et al. 1998; Shearer et al. 2002), lo

cual provee una buena resolución al nivel específico e intraespecífico (van Oppen et al.

2002). Las secuencias de ITS1 y 2 del ADN ribosomal se caracterizan por presentar una

rápida tasa de evolución y gran variabilidad, y han sido frecuentemente utilizados en

estudios de genética de poblaciones y filogenia, por su alta diversidad dentro y entre

grupos taxonómicos de varios phyla (Chen et al. 2004). Reimer et al. (2007) reportan una

variabilidad intraespecífica moderada en Palythoa para los marcadores ITS1 e ITS2, lo

cual permite considerarlos apropiados en estudios poblacionales.

2.4 Biología de Palythoa caribaeorum

Clasificación taxonómica de Palythoa caribaeorum (tomado de Acosta et al. 2005b y de

la base de datos taxonómica de NCBI 2006):

Reino: Metazoa

Phylum: Cnidaria

Clase: Anthozoa

Subclase: Hexacorallia

Orden: Zoantharia

Familia: Sphenopidae

Género: Palythoa

Especie: Palythoa caribaeorum

El orden Zoantharia se encuentra ampliamente distribuido en las aguas someras de

arrecifes tropicales y subtropicales del Caribe y el mundo (Ryland 1997, Reimer 2007),

donde el género Palythoa, ha sido estudiado al nivel de ecología y reproducción, y se ha

encontrado que presenta varias características que lo hacen interesante a nivel

poblacional, como gran capacidad de dispersión a través de reproducción asexual

(Acosta et al. 2001) y reproducción sexual por liberación de gametos (Fadlallah et

al.1984; Boscolo & Silveira 2005). La fisión de las colonias puede afectar la demografía

y el tamaño de las poblaciones (Acosta et al. 2005a), y cuando las poblaciones locales

se reproducen exclusivamente de forma asexual por fisión o por fragmentación, se

genera un autoabastecimiento de individuos o self-seeding que reduce la variabilidad

genética, pero mantiene localmente a la población (Chen et al. 2000b).

Sin embargo, P. caribaeorum también se reproduce sexualmente por medio de la

liberación masiva de gametos y fertilización externa. Estudios realizados por Fadlallah et

al. (1984) en Panamá reportaron poca fertilidad de colonias y de pólipos en época

reproductiva. Sin embargo, Acosta & Asbahr (2000) en Santa Marta (Caribe colombiano),

y Boscolo & Silveira (2005) en Brasil, han registrado una gran frecuencia de pólipos

fértiles en esta especie, y un alto esfuerzo reproductivo. Los pólipos pueden ser

hermafroditas, con una producción desfasada inicial de oocitos y producción posterior

de esperma. Fadlallah et al. (1984) reporta una maduración de gametos (presencia de

pólipos fértiles) de P. caribaeorum en Panamá durante el periodo comprendido entre

enero y junio, presentando un esfuerzo reproductivo mayor que el de las otras especies

simpátricas de zoantídeos consideradas, Zoanthus sociatus y Zoanthus solanderi.

Acosta (datos sin publicar) sugiere que la época de liberación de gametos se da entre

mayo y junio, Fadlallah et al. (1984) plantea que una combinación de factores abióticos,

como la exposición aérea repetida de las colonias, y un aumento de la temperatura a

finales de la estación seca (marzo y abril) servirían como señales para la sincronización

entre las colonias para realizar la liberación masiva de gametos en el comienzo de la

estación húmeda.

Se ha encontrado que P. caribaeorum es abundante en las poblaciones estudiadas,

formando tapetes densos generalmente expuestos al oleaje (Márquez 1987). Además,

presenta la capacidad de entrar en un estado de diapausa (Acosta 2001) como

respuesta a altos niveles de estrés, formando una capa de mucus sobre las colonias y

realizando una retracción de las mismas (Gutiérrez 2005). Sin embargo, aunque se han

estudiado varios aspectos de la morfología, historia de vida y ecología poblacional del

esta especie, descrita por Duchassaing & Michelotti (1860), son pocos los estudios

realizados sobre la estructura genética de sus poblaciones en el Caribe colombiano.

Camacho (2004) evaluó la amplificación del marcador microsatélite Sput diseñado para

el coral escleractíneo Montastraea annularis (Lopez et al. 1999), que aunque presentó

una baja eficiencia en la amplificación, se obtuvieron resultados que indican que el

marcador presenta un gran polimorfismo y que las poblaciones del Caribe Colombiano

tienen altos niveles de diversidad haplotípica y flujo génico.

3. Formulación del problema y justificación

3.1 Formulación del problema

Existe evidencia de que los arrecifes de coral han venido presentando un proceso

progresivo de pérdida de cobertura y biodiversidad a nivel mundial, que se ha

intensificado en las últimas décadas debido a causas naturales y antrópicas. Una de las

prioridades en la biología de la conservación es crear planes de manejo y restauración

de estos ecosistemas, para lo cual es muy importante conocer el estado de diversidad

genética de las poblaciones y determinar a qué escala espacial las poblaciones de los

arrecifes están conectadas genéticamente.

Es difícil dilucidar la magnitud de conexión entre poblaciones, ya que existen múltiples

factores que afectan este proceso, tal como barreras geográficas, corrientes marinas, la

historia de vida de la especie, estrategias de reproducción y capacidad de dispersión,

entre otros. Sin embargo, por medio de análisis de genética de poblaciones es posible

medir, a partir de frecuencias alélicas o secuencias de regiones determinadas del

genoma, la diversidad y el flujo génico entre poblaciones y determinar patrones de

conectividad y estructura genética, pudiéndose aplicar a diferentes escalas geográficas.

En Colombia, sin embargo, existen muy pocos trabajos que estudien el flujo génico de

arrecifes de coral en el Caribe, por lo cual es necesario realizar investigaciones que

permitan conocer los patrones de conexión entre los mismos y la escala espacial a la

cual esta conectividad se presenta, así como la estructura genética de sus poblaciones.

3.2 Justificación de la investigación

Colombia, como la mayoría de países tropicales, ha perdido en las últimas décadas

grandes áreas de arrecifes y número de especies. Por ello, actualmente el manejo y

conservación del ecosistema arrecifal es prioridad mundial. Sin embargo, para que las

acciones de manejo sean efectivas a nivel poblacional, se debe conocer la escala

espacial en la que las poblaciones están conectadas y el grado de diversidad genética

de las mismas. Este proyecto, además de informar si las poblaciones de P. caribaeorum

de cuatro islas, continentales y oceánicas, se encuentran conectadas entre sí y

proporcionar información acerca de la magnitud de esta conexión entre poblaciones,

permitirá inferir si las corrientes marinas, el efecto de ríos (Magdalena, Atrato y Sinú),

que desembocan entre las islas continentales Isla Grande e Isla Fuerte, al igual que la

distancia han influido en la estructura genética y conexión real de las mismas.

El determinar la estructura genética de las poblaciones, el nivel y patrón de flujo génico a

diferentes escalas entre arrecifes de coral utilizando especies con una amplia

distribución como P. caribaeorum, permitirá obtener información útil para la toma de

decisiones de demarcación y diseño de áreas de conservación, así como avanzar hacia

el uso de métodos no invasivos en el estudio a gran escala de poblaciones marinas en

Colombia.

A corto plazo, la información obtenida podrá tener algún impacto en políticas nacionales,

particularmente en lo relacionado con la definición de áreas marinas protegidas (2007),

ya que los resultados obtenidos se podrán incorporar en los modelos de simulación para

ayudar, con criterios biológicos, a definir las nuevas áreas marinas que deberán incluirse

en el 2007.

A mediano plazo, el conocer datos genético poblacionales, como diversidad y flujo

genético, complementa los estudio ecológicos de Palythoa caribaeorum para poder

postularla como modelo biológico de especies con estrategia de liberación de gametos al

agua; con el beneficio de proporcionar información más precisa a bajo costo y en menor

tiempo. La estimación de la diversidad genética y flujo génico de las poblaciones de P.

caribaeorum responde a las necesidades planteadas por el Convenio sobre diversidad

Biológica (CDB) y el mandato de Yakarta adoptado por el país en 1994 (Ley 165) y

desarrollado por el Programa Nacional de Investigaciones Básicas en Biodiversidad

Marina (PNIBM) en Colombia, de realizar la identificación y seguimiento de los

componentes de diversidad biológica en ecosistemas con especies en peligro, y que

tengan importancia social, económica, cultural o científica; para así poder establecer

sistemas de áreas protegidas con medidas especiales para conservar la diversidad

biológica.

3.3 Pregunta de investigación

¿Cómo es la estructura genética y el flujo génico a escala local y regional entre

poblaciones de Palythoa caribaeorum de San Andrés, Providencia, Isla Fuerte e Isla

Grande, en el Caribe colombiano?

4. Objetivos

4.1 Objetivo General

Estimar el flujo génico entre cuatro poblaciones de Palythoa caribaeorum a escala

regional y local en el mar Caribe colombiano, e inferir su estructura y diversidad genética.

4.2 Objetivos específicos

� Estimar la diversidad genética de la región ITS2 de poblaciones de Palythoa

caribaeorum de los arrecifes de Isla de San Andrés, Isla de Providencia, Isla Grande e

Isla Fuerte.

� Estimar la magnitud del flujo génico y la heterogeneidad genética entre

poblaciones de Isla de San Andrés, Isla de Providencia, Isla Grande e Isla Fuerte.

5. Materiales y métodos

5.1 Diseño de la investigación

� Factor de diseño: Escala espacial. Niveles: regional (703-714 Km, arrecife

oceánico vs. continental) y local 93-98 Km.

� Variable respuesta: Secuencias nucleotídicas obtenidas a partir de las muestras.

� Unidad de respuesta: Dependiendo del análisis y nivel de comparación, se

obtendrán índices a nivel poblacional que serán comparados, en los que la unidad de

respuesta será cada población de cada isla (San Andrés, Providencia, Isla Fuerte e Isla

Grande), así como índices de comparación por pares de islas, donde la unidad de

respuesta es cada par de poblaciones, e índices a nivel total, donde la unidad de

respuesta es el conjunto de las cuatro poblaciones.

� Unidad de muestreo: Cada colonia de Palythoa caribaeorum.

5.1.1 Población de estudio y muestra

Se trabajó con 60 muestras (15 muestras por población) de Palythoa caribaeorum

colectadas por Acosta y colaboradores en el año 2003 (comunicación personal) en las

islas oceánicas de San Andrés (en 81º41�-12º35� latitud Norte, longitud Oeste) y

Providencia (81º19�-13º23�), y en las islas continentales Isla Fuerte (76º10�08��-9º24�02��)

e Isla Grande (10º11�-75º44�) en el Caribe Colombiano.

5.1.2 Variables del estudio

� Variables independientes

La variable independiente es la distancia entre las poblaciones, medida en kilómetros y

clasificada en dos escalas: Regional (≈ 700 Km. � arrecife oceánico vs. continental) y

local (≈100 Km., entre arrecifes oceánicos, o entre continentales). La distancia existente

entre los pares de islas son: Isla de San Andrés � Isla Providencia: 93.4 km; Isla San

Andrés � Isla Fuerte: 703 km; Isla San Andrés � Isla Grande: 708 km; Isla Providencia �

Isla Fuerte: 718 km; Isla Providencia � Isla Grande: 710 km; Isla Fuerte � Isla Grande:

100 km (Acosta et al. 2005a).

Número de sitios segregantes y número de mutaciones

� Variables dependientes:

Diversidad genética, calculada por los parámetros genético-poblacionales de diversidad

nucleotídica y diversidad haplotípica. Distancia genética entre poblaciones, calculada por

medio del método de dos parámetros de Kimura y el método de Tajima-Nei.

Diferenciación genética entre poblaciones calculada a partir de los estadísticos FST, γST,

GST y NST. Flujo génico (Nm, número de migrantes por generación), calculado a partir del

estadístico FST a partir del método de Wright (1969).

5.2 Recolección de la información

Fase de campo

En el Caribe colombiano se escogieron cuatro arrecifes con presencia de Palythoa

caribaeorum. La elección de las islas siguió un diseño basado en la distancia

equidistante entre ellas, tanto para las poblaciones presentes en islas de tipo oceánico,

como para las de tipo continental. Se escogieron islas siguiendo dos niveles espaciales;

el primero, islas separadas por cerca de 700 Km, que corresponde a comparar las

poblaciones de esta especie a nivel regional, en este caso, oceánicas vs continentales; y

el segundo nivel, diseñado para comparar islas separadas aproximadamente por 100

Km, escala local, que corresponde a comparar entre las dos islas oceánicas, o entre las

dos islas continentales seleccionadas (Fig. 1). La elección de las dos islas continentales

también contempló que estuvieran equidistantes a grandes ríos que desembocan en el

Caribe, como por ejemplo el Río Magdalena (Isla Grande) y los ríos Atrato-Sinú (Isla

Fuerte), posibles fuentes de disturbio. El muestreo de cuatro arrecifes, dos oceánicos

(San Andrés y Providencia) y dos continentales (Isla Grande e Isla Fuerte), fue realizado

en el 2003, siguiendo el protocolo de Camacho (2004). En cada arrecife se colectaron

muestras en dos sitios separados entre sí por 500 m2. Un total de 35 a 40 colonias de P.

caribaeorum fueron muestreadas por sitio (cresta arrecifal, arrecife franjeante o terraza

prearrecifal), para un total de 70 a 80 colonias por arrecife.

Los fragmentos de tejido (2x2cm2 por colonia) se extrajeron con ayuda de navaja y

tanques de buceo y fueron colocados en tubos Eppendorf (Camacho 2004). Las colonias

se escogieron bajo los siguientes criterios: 1. encontrarse entre 0 y 3m de profundidad; 2.

estar separadas físicamente por mínimo dos metros para minimizar el muestreo de

clones (producto de fisión y fragmentación); 3. Ser colonias sanas (sin mortalidad parcial,

blanqueo, enfermedades, ni diapausa); y 4. Evitar colectar colonias pequeñas, ovoides,

de pólipos grandes en ramillete, no del todo conectados por cenénquima basal; para

impedir el muestreo sobre el congénere P. mammillosa (presente en simpatría en hábitat

similar). Los fragmentos fueron fijados en alcohol 70%, codificados, transportados al

laboratorio y almacenados en neveras a -20ûC (Laboratorio de Genética de Poblaciones

de la Pontificia Universidad Javeriana; permiso de investigación No. 04 31 Julio 2006;

resolución de acceso a recurso genético No. 0457; permiso de acceso a recurso

genético aún en trámite). Las muestras se numeraron de la siguiente manera: para las

muestras de San Andrés, de 1 a 76; para Providencia, de 77 a 153, para Isla Fuerte, de

154 a 224 y para Isla Grande, de 225 a 304.

Figura 1. Ubicación espacial de las cuatro poblaciones muestreadas (Isla de San Andrés, Providencia, Isla Grande e Isla Fuerte). La distancia entre San Andrés e Isla Grande es de 708 Km, entre San Andrés e Isla Fuerte: 703 Km, Providencia a Isla Grande: 710 Km y Providencia a Isla Fuerte: 718 Km. Mapa tomado del Instituto Geográfico Agustín Codazzi (2004).

Fase de Laboratorio

Extracción de DNA. Para la extracción de ADN se siguió el protocolo estandarizado por

Camacho (2004; Anexo A), modificado a partir de los protocolos de extracción de

Coffroth et al. (1992) y de Berntson et al. (1999). Los productos de esta extracción se

conservan en el Laboratorio de Genética de Poblaciones y Biología Evolutiva de la

Pontificia Universidad Javeriana. Se realizó una evaluación cualitativa del ADN por

110000 KKmm

9933,,44 KKmm

electroforesis en gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio para seleccionar

las muestras con mejor calidad de ADN para realizar amplificación por PCR.

Amplificación por PCR. Se realizó la estandarización del protocolo de PCR para definir

las concentraciones y ciclos óptimos para la amplificación de la región ITS2 del ADN

ribosomal nuclear en un termociclador BioRad iCycler utilizando el par de cebadores

ZoanF (5�- CTTGATCATTTAGAGGGAGT-3�; Reimer et al. en prensa) e ITS4 (5�

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3�; White et al. 1990); así como utilizando el par de

cebadores 5.8S-436 (5�-AGCATGTCTGTCTGAGTGTTGG-3�) y 28S-663 (5�-

GGGTAATCTTGCCTGATCTGAG-3�; Aguilar 2006). Las condiciones óptimas obtenidas

para amplificación por PCR fueron las siguientes: para el par de cebadores 5.8S-

436/28S-663 se utilizó 0.3 µM de cada cebador, 5 mM de MgCl2, 1 U (unidades) de Taq

polimerasa para 30 µL de reacción final, 30 ciclos con una temperatura de anillamiento

de 53°C y extensión final a 72°C por 7 min. Para los cebadores ZoanF/ITS4 se utilizó

0.7 µM de cada cebador, 5mM de MgCl2 y 1,5 U de Taq, para un volumen final de 50

µL; con 30 ciclos con temperatura de anillamiento de 52°C. Se realizó la amplificación

por PCR de muestras seleccionadas aleatoriamente con una buena calidad de ADN,

hasta obtener 15 muestras con amplificación positiva en chequeo de agarosa para cada

población (60 muestras en total).

Chequeo en Agarosa. Se sembraron en una cámara de electroforesis horizontal 5 µl del

producto de PCR con 3 µl de buffer de carga, en un gel de agarosa al 2% y se

adicionaron 8 µl de Bromuro de etidio (1mg/ml) para la tinción de la banda. Los

productos de PCR se corrieron durante 50 minutos a 100 voltios para constatar la

amplificación de DNA. Los 60 productos de amplificación positiva se enviaron al

laboratorio de Macrogen Corp., Korea, donde se realizó una purificación con

precipitación de etanol y posteriormente se generaron las secuencias de forma

automática (Sequencer 3730xl). Un total de 40 muestras se enviaron a secuenciar para

el marcador ribosomal 5.8S-436/ 28S-663 y 60 muestras (colonias) para el par de

marcadores ZoanFA18S/ITS4. Los individuos se secuenciaron en los dos sentidos de la

cadena (5´y 3´).

5.3 Análisis de la información

La búsqueda de la similitud de las secuencias obtenidas con otras secuencias

reportadas en GenBank se llevó a cabo utilizando el programa BLAST. El alineamiento

de las secuencias se hizo manualmente, tomando como modelo la secuencia mas

emparentada a Palythoa caribaeorum (Palythoa cf. caribaeorum; Reimer et al. 2007)

presente en la base de datos �The National Center for Biotechnology Information� (NCBI;

Schuler et al. 1996). Se utilizó el programa BioEdit v.7.0.5.3 (Hall 1999) con el paquete

Clustal W (Thompson et al. 1994) y ajuste manual para alinear todas las secuencias

utilizadas.

Las estimas genético moleculares de las diferentes variables se realizaron a diferentes

niveles: 1. Para la especie como un todo (independiente del lugar de procedencia de la

muestra); 2. Comparando las poblaciones a nivel regional, tomando el conjunto de

poblaciones oceánicas (I. San Andrés + I. Providencia) y el de las poblaciones

continentales (I. Grande + I. Fuerte); así como realizando las comparaciones por pares

de poblaciones San Andrés-Isla Fuerte, San Andrés-Isla Grande, Providencia-Isla Fuerte

y Providencia-Isla Grande; 3. Comparando las poblaciones a nivel local (≈100 Km): San

Andrés-Providencia e Isla Fuerte-Isla Grande.

Se utilizaron cinco paquetes estadísticos para el análisis de resultados. El primero, DNA

Sequence Polymorphism (DnaSP v. 4.10; Rozas & Rozas 1999), con el cual se estimó el

polimorfismo total de las secuencias (sitios polimórficos de DNA, número de mutaciones,

número de alelos y número promedio de diferencias nucleotídicas), así como la

distribución haplotípica por población. Se estimaron dos estadísticos para medir la

variabilidad genética de las secuencias obtenidas. El primer índice fue la diversidad

haplotípica (Hd; Nei 1978); o la probabilidad de que al tomar dos alelos al azar, éstos

sean diferente, y se calculó por:

Hd= n(1-∑xi-2)/(n-1) El segundo índice fue la diversidad nucleotídica (π), o número promedio de diferencias

nucleotídicas por sitio entre dos secuencias, calculada por:

Π= ∑Πij/nc

donde nc es el numero total comparaciones realizadas y Πij es la proporción de

nucleótidos diferentes entre las secuencias i y j (Nei 1987, ecuación 10.6). También se

estimó la diversidad nucleotídica con la modificación de Jukes & Cantor (Π JC; 1969),

descrita por Lynch & Crease (1990).

El desequilibrio de ligamiento, o asociación no aleatoria entre sitios polimórficos dentro

de la secuencia se estimó el coeficiente de correlación, r, del estado alélico entre pares

de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs, single nucleotide polymorphisms) y el

cuadrado del coeficiente de correlación, r2 (Hill & Robertson 1968). Se realizó una

regresión lineal de la distribución de las frecuencias del determinante del desequilibrio

gamético, D y del parámetro D� (Lewontin & Kojima 1960, Lewontin 1964):

D=x0x3 � x1x2

D�= D/Dmax

donde x0, x1, x2 y x3 representan las frecuencias haplotípicas y Dmax es el valor máximo

de D para un conjunto de alelos definido. A partir de los índices también se definieron

ecuaciones de regresión para el r y r2. Se ejecutó el test de x2 y el test de Fisher de dos

colas para determinar si las asociaciones entre sitios polimórficos son estadísticamente

significativas. La existencia de desequilibrio de ligamiento también se evaluó por medio

de la estima de ZnS (Kelly 1997) que mide las asociaciones dentro de un gen asumiendo

un modelo mutacional neutral, computando el promedio del índice de correlación r2 (Hill

& Robertson 1968) para pares de comparaciones en sitios polimórficos,

ZnS=(2/(S(S-1))∑S-1i=1∑Sj=i+1 r2ij ,

donde S es el numero de sitios polimórficos rij es el estimador r (Hill & Robertson 1968)

entre los sitios i y j. Este es una prueba estadística de una cola, donde valores mayores

al esperado indican la existencia de un desequilibrio de ligamiento y una señal de

selección natural.

El estimador ZZ (Rozas et al. 2001), que mide el efecto de la recombinación intragénica

sobre la variabilidad nucleotídica, teniendo en cuenta el desequilibrio de ligamiento entre

sitios polimórficos en relación a la distancia física en la secuencia, es definido por

ZZ=Za - ZnS

Za=(1/(S-1)) ∑S-1i=1r2i, i+1 , donde Za es el promedio del estimador r2 entre sitios polimórficos adyacentes. Se

determinó el intervalo de confianza al 95% para ZnS y ZZ por medio de simulaciones de

coalescencia.

El nivel de heterogeneidad genética entre las poblaciones se realizó por pares de

poblaciones a nivel regional y local, así como agrupando a San Andrés y Providencia

(Islas Oceánicas) y a Isla Fuerte e Isla Grande (Islas Continentales). Para ambos tipos

de análisis se calculó HS, la diferenciación asociada a la diversidad haplotípica en

subpoblaciones (Hudson et al. 1992), dado por

Hs=∑Li=1 wiHi ,

Hi=(ni/(ni-1)(1-∑Kj=1p2ij) ,

p2ij es la frecuencia del alelo j en la población i y wi = (n1 -2)/( n1 + n2-4). El estimador Ks

es el promedio de las diferencias entre las secuencias de dos poblaciones (Hudson et al.

1992, ec. 7, 10). Se estimó el número promedio de sustituciones nucleotídicas entre

haplotipos de un par poblaciones, Dxy (Nei 1987) y el número total de sustituciones por

sitio entre poblaciones, Da (Nei 1987), dadas por

DXY= ∑ij xiyjdij

Da= DXY - (dx +dy)/2 ,

donde dx y dy son el número promedio de sustituciones nucleotídicas para un par de

haplotipos escogidos al azar en la población X y en la población Y respectivamente; y dij

es el número de sustituciones entre el haplotipo i de la población X y el haplotipo j de la

población Y.

Se llevó a cabo el test HBK diseñado por Hudson et al. (1992), que es una prueba

estadística no paramétrica, que utiliza permutaciones para evaluar la subdivisión entre

localidades geográficas basada en variación molecular de las muestras de ADN. Este

test evalúa la hipótesis nula de una asociación al azar entre un haplotipo y una

población, es decir una ausencia de subdivisión poblacional. Para muestras pequeñas

Hudson et al. (1992) comprobaron el estadístico X2 cuyos valores son estimados por

1000 permutaciones tiene un mayor poder para tamaños pequeños de muestreo

X2=∑Li=1 ∑Kj=1 (nij � nipj)2/nipj ,

Donde L es el número de poblaciones, K es el número de haplotipos en la muestra total,

ni es el tamaño muestral de la población i, nij es el número de copias del haplotipo j en la

población i y pj es la frecuencia del haplotipo j en la muestra total.

Este paquete estadístico también se utilizó para calcular los índices de subdivisión

poblacional FST (Wright 1951, Hudson et al. 1992), GST (Nei 1973), γST (Nei 1982) y NST

(Lynch & Crease 1990). Se estimaron los valores de flujo génico (Nm, número efectivo

de la población multiplicado por la fracción de migrantes por generación) entre

poblaciones y a nivel total a partir de FST, por medio del cálculo propuesto por Wright

(1969)

Nm= (1/FST)-1)/4

Con el paquete estadístico Arlequín v 3.11 (Excoffier et al. 2005) se calculó el porcentaje

de composición nucleotídica por población. Se llevó a cabo un test exacto de

diferenciación poblacional (Goudet et al. 1996, Raymond & Rousset 1995) y una

computación de distancias entre poblaciones a partir del índice FST por pares de

poblaciones (Reynolds et al. 1983, Slatkin 1995, Gaggioti & Excoffier 2000), ambos para

detectar una subdivisión poblacional y su significancia. El test exacto de diferenciación

poblacional y la computación de la distancia entre poblaciones a partir de FST se realizó

excluyendo una población a la vez, para evaluar si alguna afectaba la significancia de

éstos análisis. También se realizaron dos análisis de variabilidad poblacional por medio

del análisis de varianza molecular (AMOVA; Weir & Cockerham 1984, Excoffier et al.

1992, Excoffier 2003) para determinar la estructuración poblacional y el porcentaje de

variación debido a cada nivel poblacional, estimando la significancia por medio de 1023

permutaciones. Un análisis se realizó agrupando a San Andrés y Providencia (Islas

Oceánicas) y comparándolas con Isla Fuerte e Isla Grande (Islas Continentales), y el

segundo análisis se llevó a cabo considerando a las cuatro poblaciones por separado y

comparándolas entre sí.

El paquete estadístico, IBDWS v. 3.07 (Jensen et al. 2005), se utilizó para realizar un

análisis de aislamiento por distancia. Este programa incluye el test de Mantel (Manly

1994) y la regresión reducida del eje mayor, usando la medición de similaridad M de

Slatkin (1993), a partir del índice de diferenciación el FST estimado por el método de Weir

(1990),

M = ((1/FST) � 1)/4

Este índice es análogo al flujo génico Nm, y se calcula para cada par de poblaciones con

el propósito de determinar si las muestras físicamente cercanas presentan una mayor

similitud genética que aquellas que se encuentran a una mayor distancia. A partir de esta

información se graficó la relación entre el logaritmo de similitud genética y la distancia

física entre las poblaciones. Ésta prueba permite identificar tanto la existencia de una

relación estadísticamente significativa entre la similitud genética y la distancia geográfica

como la magnitud de esta relación, por medio del test de Mantel. Éste consiste en tomar

la matriz de similaridad genética A y la matriz de distancia genética B, calculando el valor

y la significancia del estadístico Z,

Z= ∑i,j AijBij

También se obtuvo el valor y la significancia del coeficiente de correlación r, que varía de

-1 a 1 y r2, que varia de 0 a 1 y calcula la proporción en que la distancia geográfica

explica las diferencias de similitud genética entre los pares de poblaciones.

El cuarto paquete estadístico empleado fue MEGA v.3.1 (Kumar et al. 2004), para

estimar los niveles de heterogeneidad entre pares de secuencias dentro de la población

muestreada, mediante el análisis de substituciones nucleotídicas, usando diferentes tipos

de distancias. La distancia de las secuencias dentro y entre las poblaciones fue estimada

a partir del modelo de dos parámetros de Kimura (1980) y el modelo de Tajima-Nei

(Tajima & Nei 1984). El modelo de Tajima-Nei provee una estima de sustituciones

nucleotídicas asumiendo una misma tasa de sustitución entre sitios y entre transiciones y

transversiones. El modelo de Kimura tiene en cuenta las tasas de transversiones y

transiciones, asumiendo una misma tasa de sustitución entre sitios y una misma

frecuencia de nucleótidos.

Se construyeron árboles de distancias con MEGA v.3.1 a partir de distancias genéticas

con el método de dos parámetros de Kimura (1980) y de Tajima-Nei (Tajima & Nei

1984); usando los algoritmos de Minimum Evolution, Neighbor-Joining, UPGMA y

Máxima Parsimonia. También se construyeron arboles de filogenia con el paquete

estadístico PAUP* v.4.0 (Swofford 2003) por medio del método de parsimonia, que

busca construir arboles con el número mínimo de cambios o pasos evolutivos,

minimizando el numero de homoplasias. Aplicando el método heurístico se

construyeron árboles de consenso estricto y semiestricto siguiendo los algoritmos

simple stepwise addition, y nearest neighbor interchange branch-swapping.

Se utilizó el programa DnaSP, para conocer si ocurrió un cambio en el tamaño, como

una expansión o un evento de cuello de botella, en la historia de las poblaciones. Se

realizó un análisis de la distribución de diferencias por pares de nucleótidos (pairwise

mismatch distribution) y un análisis de la distribución de la frecuencia de sitios

segregantes, bajo la hipótesis nula de tamaño constante (Slatkin & Hudson 1991,

Rogers & Harpending 1992, Tajima 1989a), generando la representación gráfica de los

valores esperados y observados para cada análisis. En el análisis de la distribución de

diferencias por pares de nucleótidos (mismatch distribution) se calculó el estadístico r

(Raggedness statistic; Harpending et al. 1993; Harpending 1994), que estima la

rugosidad de la curva observada, donde se asume que poblaciones de un tamaño

estable presentan distribuciones rugosas, mientras que poblaciones que han sufrido

una expansión poblacional presentan distribuciones llanas, con valores de r muy bajos.

También se estimó el estadístico R2 (uno de los estadísticos para detectar expansión

poblacional con mayor poder, Ramos-Onsins & Rozas 2002), que se basa en las

diferencias entre el número de sustituciones presentes en una sola secuencia

(singleton mutations) y el número promedio de diferencias nucleotídicas entre las

secuencias dentro de una población, y que es una prueba más apropiada que otras

para tamaños de muestra pequeños. Se determinó el intervalo de confianza al 95%

para r y R2 por medio de simulaciones de coalescencia.

Se evaluó la existencia de selección natural sobre la secuencia estudiada por medio del

test de Tajima (1989b), probando la correlación del número de sitios segregantes y el

promedio de diferencias nucleotídicas, y realizando una prueba de significancia de dos

colas estimando el intervalo de confianza al 95% siguiendo una distribución β. También

se llevo a cabo el test de Fu y Li (1993), donde se estimaron los estadísticos D* y F*,

para probar las predicciones de acuerdo a la teoría neutral de evolución molecular

(Kimura 1983), comparando el número esperado de mutaciones en las ramas internas y

externas de una genealogía bajo una selección neutral. El estadístico D* es calculado a

partir de datos intraespecíficos, utilizando los valores críticos obtenidos por Fu & Li

(1993) para determinar su significancia.

El test de Fu y Li (1993) ofrece una corrección al test de neutralidad de Tajima (1989b),

al separar el número de mutaciones total de una genealogía en el numero de mutaciones

de las ramas internas y externas, y realizar una comparación del número de mutaciones

de las ramas externas (mutaciones nuevas) con el número promedio de diferencias

nucleotídicas entre dos secuencias (π).

D* toma en cuenta el numero del numero total de singletons (sustituciones presentes en

una sola secuencia), y el numero total de mutaciones η,

D*= (n/(n-1)) η - anηs

√uD* η+ vD* η2

F* toma en cuenta el número de singletons, el número promedio de diferencias

nucleotídicas entre dos secuencias y el número total de mutaciones. Asumiendo que la

selección natural negativa genera una acumulación de alelos raros en las ramas

externas de una genealogía

F*= πn � ((n-1)/n) ηs

√uF* η+ vF* η2

Donde ηs es igual al numero de singletons, η es el numero total de mutaciones, π es el

numero promedio de diferencias nucleotídicas entre dos secuencias, y n es el numero de

secuencias estudiadas. Estos tests para detectar posible selección natural, son útiles

también para detectar posibles cambios en el tamaño poblacional.

6. Resultados

6.1 Polimorfismo y composición del ADN

Se utilizaron 34 secuencias, cada una de 138 pares de bases pertenecientes a la región

ITS2 del ADN ribosomal nuclear (cuatro secuencias eran de 134 bases debido a un gap

de cuatro nucleótidos presente, y tres de 137 por un gap de un nucleótido; estos vacíos

fueros ignorados en algunos análisis). En las secuencias de ITS2 analizadas se

encontraron 21 haplotipos diferentes (Anexo B), 24 sitios polimórficos y 27 mutaciones.

Isla Fuerte presentó el mayor número de sitios polimórficos (16), seguido por Isla Grande

(13), Providencia (9) y San Andrés (9). La composición nucleotídica promedio fue de

32.8% de C, 18.3% de T, 15% de A y 33.9% de G (Tabla 1A). Cinco haplotipos se

encontraron en más de una isla (Tabla 1B).

Tabla 1. A. Numero de haplotipos, porcentaje relativo de haplotipos y promedio de la composición nucleotídica por población de la región ITS2 de Palythoa caribaeorum. N=número de secuencias; C=Citosina; T=Timina; A=Adenina; G=Guanina. B. Distribución haplotípica por población. N= número de muestras; SAI=San Andrés; PROV= Providencia; IF=Isla Fuerte; IG=Isla Grande. Los valores presentados corresponden al código de la muestra.

Población N #Haplotipos C (%) T (%) A (%) G (%)

San Andrés 10 4 (40%) 33.12 18.26 15.29 33.33

Providencia 5 5 (100%) 32.22 18.37 14.58 34.84

Isla Fuerte 11 9 (81%) 32.74 18.16 14.98 34.13

Isla Grande 8 8 (100%) 32.88 18.57 14.86 33.70

Todos 34 21 (62%) 32.8 18.3 15.0 33.9

B.

Haplotipo N SAI PROV IF IG

1 3 4, 53 214

2 6 5, 10, 16, 25, 27 256

3 2 41, 52

4 1 54

5 1 85

6 3 105 164, 204

7 1 129

8 1 141

9 1 147

10 3 156, 158 233

11 2 157 244

12 1 161

13 1 198

14 1 201

15 1 211

16 1 215

17 1 236

18 1 255

19 1 260

20 1 266

21 1 303

6.2 Desequilibrio de ligamiento

De los 21 sitios polimórficos encontrados en la secuencia de ITS2, se realizaron 210

comparaciones entre pares de sitios polimórficos, de los cuales sólo diez (4,76%)

presentaron desequilibrio de ligamiento significativo (Bonferroni; P<0,001). Se encontró

que el valor de ZZ (0,0445, P>0,05; Rozas et al. 2001) no fue estadísticamente

significativo, lo cual sugiere que no existe un efecto de la recombinación intragénica

sobre la variabilidad en la secuencia nucleotídica estudiada. El valor de ZnS (Kelly 1997)

tampoco fue significativo (P>0.05). Las ecuaciones de regresión lineal de D

(determinante del desequilibrio gamético exacto; Lewontin 1964), D� (determinante del

desequilibrio gamético relativo), y los estadísticos r y r2 respecto a la distancia

nucleotídica mostraron una baja correlación entre las variables. Tampoco se encontró un

desequilibrio de ligamiento estadísticamente significativo entre sitios polimórficos

relacionado con la distancia (en pb) dentro de la secuencia en las muestras estudiadas,

como se evidencia en las ecuaciones de regresión lineal de los estadísticos nombrados

(Fig. 2, Fig. 3).

Figura 2. Gráfica de regresión entre el desequilibrio de ligamiento absoluto (IDI) y la

distancia nucleotídica. Ecuación de regresión Y = 0,0123 - 0,0178X

Figura 3. Gráfica de regresión entre el coeficiente de correlación R2 y la distancia

nucleotídica. Ecuación de regresión Y = 0,0998 - 0,7194X

6.3 Detección de selección natural

El test de neutralidad de Tajima (1989b) no arrojó un resultado estadísticamente

significativo (P>0.10) para el marcador ITS2, al igual que los tests de Fu y Li (P>0.5;

1993), lo cual indica que la región estudiada sigue un modelo mutacional neutral. Los

estadísticos siempre fueron negativos y menores que -1 (D (Tajima)= -1.14042; D*(Fu &

Li)=-2.08234, F*(Fu & Li 1993)=-2.09159), lo cual puede indicar la existencia de una

expansión poblacional, que genera una acumulación de mutaciones y alelos raros en las

ramas externas de la genealogía, al igual que cuando existe selección natural negativa.

Esto corrobora los resultados encontrados en los análisis de diferencias por pares de

comparaciones y de sitios segregantes asumiendo un cambio poblacional.

6.4 Diversidad genética

La diversidad nucleotídica (π; número promedio de diferencias nucleotídicas entre dos

secuencias; Nei 1987) calculada con el marcador ITS2 para las cuatro poblaciones

muestreadas fue moderadamente alta (π = 0,03349, var.= 0,0000109, SD= 0,00331).

Este valor de diversidad se mantuvo al realizar la corrección de Jukes & Cantor (πJC;

1969) = 0,03453). La alta diversidad genética se corroboró con la estima de la diversidad

haplotípica de Nei (1978; Hd=0,954, var.=0,00044).

La diversidad nucleotídica (π) calculada por separado para poblaciones oceánicas y para

las continentales (asumiendo San Andrés y Providencia como un mismo grupo, y lo

mismo para Isla Fuerte � Isla Grande) arrojó mayores valores para el conjunto de islas

continentales. Esta diferencia aumentó ligeramente al realizar la corrección de Jukes &

Cantor descrita por Lynch & Crease (0,031 y 0,036 respectivamente; 1990). La alta

diversidad se ratificó con la estima de la diversidad haplotípica de Nei (1978), donde el

valor de poblaciones continentales superó a las oceánicas (Tabla 2A).

Las poblaciones con mayores valores de diversidad haplotípica fueron en su orden: Isla

Grande y Providencia en el primer lugar, seguidas por Isla Fuerte y finalmente San

Andrés. Por su parte, Isla Grande presentó el mayor valor de diversidad nucleotídica,

seguida por Isla Fuerte, Providencia y San Andrés en el último lugar (Tabla 2B)

Tabla 2. Índices de diversidad genética calculados a partir de diferentes estadísticos. A. Comparaciones realizadas a nivel regional (800 Km) B. Comparaciones realizadas para cada población. S= Número de sitios segregantes; Eta= Número de mutaciones; K= número promedio de diferencias nucleotídicas; π = diversidad nucleotídica; Hd = diversidad haplotípica.

A.

B.

Población Número de secuencias S Eta K Π Hd

San Andrés 10 9 9 3.20000 0.02406 0.73333

Providencia 5 9 9 4.40000 0.03308 1

Isla Fuerte 9 16 17 4.72727 0.03554 0.96364

Isla Grande 8 13 16 5.14286 0.03867 1

Total 34 24 27 4.45455 0.03349 0.95365

6.5 Divergencia entre poblaciones

Se realizaron estimas de diferenciación genética por medio del test HBK (1000

permutaciones; Hudson et al. 1992) para detectar subdivisión poblacional. Esto se llevó a

cabo agrupando las poblaciones oceánicas San Andrés-Providencia y continentales Isla

Fuerte-Isla Grande, asumiendo que cada grupo es una población, y también se llevó a

cabo comparando todas las poblaciones por separado. Los estadísticos X2 no arrojaron

resultados estadísticamente significativos para ninguna de las comparaciones (P>0.07).

Por lo tanto, es claro que no existe una diferenciación estadísticamente significativa entre

los pares de poblaciones San Andrés-Providencia e Isla Fuerte-Isla Grande ni para los

pares de poblaciones comparadas a escala regional, a pesar de la gran distancia que los

separa (aproximadamente 700 km). Tampoco se encontró una diferenciación significativa

entre las poblaciones al compararse por pares a escala local (San Andrés contra

Providencia e Isla Fuerte contra Isla Grande). Éstos resultados concuerdan con los

índices de diferenciación genética, Ks, Dxy y Da, que presentan valores bajos entre

pares de poblaciones, y que a su vez son muy homogéneos, independiente de la

comparación realizada (Tabla 3).

Región Número de secuencias S Eta K Π Hd

Oceánica 15 13 13 4.03810 0.03036 0.88571

Continental 19 15 23 4.71930 0.03548 0.97076

Total 34 24 27 4.45455 0.03349 0.95365

Tabla 3. Índices de diversidad y diferenciación genética entre pares de poblaciones a

escala regional y local. Hs: Diversidad haplotípica por pares de poblaciones. Ks:

promedio de las diferencias entre las secuencias por par de poblaciones. Dxy: número

promedio de sustituciones nucleotídicas entre dos haplotipos para un par de

poblaciones. Da: número neto de sustituciones nucleotídicas por sitio entre poblaciones.

Población 1

Población 2 Hs Ks Dxy Da

SAI-PROV IF-IG 0.93391 4.41877 0.03345 0.00053

SAI IF 0.85526 4.00000 0.03322 0.00342

SAI IG 0.84762 4.06349 0.03318 0.00181

PROV IF 0.97273 4.62500 0.03377 -0.00055

PROV IG 1.00000 4.85714 0.03421 -0.00166

SAI PROV 0.80606 3.60000 0.03549 0.00692

IF IG 0.97818 4.90226 0.03443 -0.00267

Al calcular la heterogeneidad genética total a partir del índice de fijación FST, se

obtuvieron valores bajos (0.036; donde 1 es la máxima diferenciación). El coeficiente de

diferenciación genética a escala regional agrupando a las poblaciones oceánicas y

continentales generó valores bajos (FST= 0.016) sugiriendo que no existe heterogeneidad

genética entre el conjunto de poblaciones oceánicas y continentales (Tabla 4). Sin

embargo, al comparar las poblaciones por pares a nivel regional, se obtuvieron mayores

valores de FST en las comparaciones de San Andrés con Isla Fuerte e Isla Grande (0.103

y 0.055, respectivamente), respecto los valores, cercanos a cero, obtenidos al comparar

a la población de Providencia con las islas continentales. A escala local, las poblaciones

continentales presentaron valores cercanos a cero, mientras que la comparación

realizada con las poblaciones oceánicas de San Andrés y Providencia, arrojaron los

mayores valores para los índices de heterogeneidad de todas las comparaciones

realizadas.

Tabla 4. Índices de heterogeneidad genética entre pares de poblaciones a escala regional y local, calculados para el marcador ITS2. GST: Índice de subdivisión poblacional. FST: Diferenciación genética entre las subpoblaciones respecto a la población total basada en las frecuencias alélicas. Todos los valores van de 0 a 1 (donde 1 es la máxima diferenciación) ≈ 0: Valores estimados cercanos a cero.

Población 1 Población 2 Gst γSt Nst Fst

POBLACION TOTAL 0.047 0.118 0.034 0.036

SAI-PROV IF-IG 0.021 0.038 0.015 0.016

SAI IF 0.072 0.103 0.101 0.103

SAI IG 0.040 0.090 0.051 0.055

PROV IF 0.002 0.058 ≈ 0 ≈ 0

PROV IG 0.004 0.058 ≈ 0 ≈ 0

IF IG ≈ 0 0.020 ≈ 0 ≈ 0

SAI PROV 0.074 0.179 0.194 0.195

El test exacto de diferenciación basado en frecuencias haplotípicas (cadena de Markov

de 10 000 pasos; Raymond & Rousset 1995, Goudet et al. 1996), arrojó un valor

estadísticamente significativo para la población total (P= 0.01375, 20 000 pasos de

Markov). Sin embargo, los valores significativos entre los pares de poblaciones, a nivel

tanto regional como local, sólo se presentan en comparaciones en las que se involucra a

San Andrés (ver Tabla 5A).

No obstante, al eliminar a San Andrés del test exacto de diferenciación global, se obtuvo

una probabilidad carente de significancia (P = 0.74985), así como al realizar la

comparación por pares de poblaciones (Tabla 6). Las demás comparaciones no

resultaron ser estadísticamente significativas. Es decir, no existe una diferenciación

genética entre Providencia, Isla Fuerte e Isla Grande. En los análisis donde se excluyó

alguna de estas tres poblaciones, pero se incluía a San Andrés, el valor de diferenciación

poblacional global siguió siendo significativo (P<0.05).

Tabla 5. Análisis de diferenciación poblacional. A. Niveles de significancia de los análisis

exactos de diferenciación genética entre pares de poblaciones. SAI= San Andrés,

PROV= Providencia, IF= Isla Fuerte, IG=Isla Grande. * P<0.05 **P<0.01 ***P<0.05 al

tener en cuenta la desviación estándar. B. Niveles de significancia por pares de

poblaciones del índice de diferenciación genotípica FST a partir de frecuencias

haplotípicas. Número de permutaciones: 110 SAI= San Andrés, PROV= Providencia, IF=

Isla Fuerte, IG=Isla Grande. * P<0.05 **P<0.01.

A.

SAI PROV IF

PROV 0.03604+-0.0148*

IF 0.00000+-0.0000** 0.74775+-0.0334

IG 0.05405+-0.0201 0.99099+-0.0030 0.74775+-0.0430

B.

SAI PROV IF

PROV 0.01770+-0.0034*

IF 0.00645+-0.0023** 0.69040+-0.0217

IG 0.05070+-0.0082*** 1.00000+-0.0000 0.80190+-0.0143

Al realizar la comparación por pares de poblaciones a escala regional y local del índice

de heterogeneidad genética (FST), se encontró una diferenciación genética significativa

entre San Andrés y Providencia y entre San Andrés e Isla Fuerte (P<0.05, Tabla 5B).

Aunque la probabilidad para San Andrés- Isla Grande se acercó al umbral de

significancia, 0.05, al considerar la desviación estándar continuó siendo no significativo.

En general, a partir de los análisis estadísticos de heterogeneidad y el test exacto de

diferenciación se observa una subdivisión poblacional (Tabla 4, Tabla 5), sugiriendo dos

grupos de poblaciones. El primero, está compuesto por las poblaciones de Providencia,

Isla Grande e Isla Fuerte, y el segundo por la población de San Andrés.

Tabla 6. Análisis de diferenciación poblacional excluyendo a la población de San Andrés.

A. Niveles de significancia de los análisis exactos de diferenciación genética entre pares

de poblaciones. PROV= Providencia, IF= Isla Fuerte, IG=Isla Grande. B. Niveles de

significancia por pares de poblaciones del índice de diferenciación genotípica FST a partir

de frecuencias haplotípicas. Número de permutaciones: 110. PROV= Providencia, IF=

Isla Fuerte, IG=Isla Grande.

A. B.

PROV IF

IF 0.68080+-0.019

IG 1.00000+-0.000 0.78030+-0.012

6.7 Estructura Poblacional

El análisis molecular de la varianza (AMOVA, Excoffier et al. 1992) reveló que solo una

pequeña parte de la variación genética se debe a la diferenciación entre el conjunto de

islas oceánicas y el de islas continentales (1,39%, tomando a San Andrés y Providencia

como una sola población y a Isla Fuerte e Isla Grande como otra) y 5,30% a la

diferenciación a escala local (entre San Andrés y Providencia y entre Isla Fuerte e Isla

Grande; Tabla 7). Al realizar este mismo análisis, comparando a todas las poblaciones

entre sí, independientemente de la distancia, se encontró que sólo el 6,27% de la

variación se debe a diferencias entre las poblaciones (Tabla 8).

Tabla 7. Análisis molecular de la varianza. A. Análisis molecular de la varianza computando los estadísticos F a partir de frecuencias haplotípicas. Se agrupó las poblaciones San Andrés-Providencia (Continentales) y comparándolas con la agrupación Isla Fuerte-Isla Grande (Oceánicas) B. Significancia de los componentes de varianza del AMOVA agrupando las poblaciones San Andrés-Providencia (Continentales) y comparándolas con la agrupación Isla Fuerte-Isla Grande (Oceánicas) A.

Fuente de variación g.l. Suma de cuadrados

Componentes de varianza

Porcentaje de variación

Entre grupos 1 0.798 0.00678 Va 1.39 Entre poblaciones dentro

de grupos 2 1.319 0.02579 Vb 5.30

Dentro de poblaciones 30 13.618 0.45394 Vc 93.31 Total 33 15.735 0.48651

PROV IF

IF 0.79279+-0.035

IG 0.99099+-0.003 0.76577+-0.043

B. Componente de varianza F P-value Entre grupos 0.01393 0.64516 Entre poblaciones dentro de grupos 0.05375 0.06158 Dentro de poblaciones 0.06694 0.00782

Por su parte, el 93% de la variación genética es explicado por la variabilidad dentro de

las poblaciones, congruente en los dos análisis, lo cual confirma que la alta diversidad no

se atribuye a las diferencias que existen entre las islas, sino dentro de las mismas. Se

calculó el nivel de significancia (P-value) a partir de 1023 permutaciones (FST = 0.06268,

P<0.01).

Tabla 8. Análisis molecular de la varianza. A. Análisis molecular de la varianza computando los estadísticos F a partir de frecuencias haplotípicas considerando las cuatro poblaciones por separado. B. Significancia de los componentes de varianza del AMOVA considerando las cuatro poblaciones por separado A.

Fuente de variación g.l. Suma de cuadrados

Componentes de varianza

Porcentaje de variación

Entre poblaciones 3 2.117 0.03035 Va 6.27 Dentro de poblaciones 30 13.618 0.45394 Vb 93.73

Total 33 15.735 0.48429 B. Componente de varianza F P-value Entre poblaciones(FST) 0.06268 0.00978

6.7 Flujo génico

El flujo génico se calculó a partir de los valores FST obtenidos para los pares de

poblaciones, para el conjunto San Andrés-Providencia con Isla Fuerte-Isla Grande y para

el conjunto total de las poblaciones (Nm= (1/FST)-1)/4; Nei 1987). Se asume que este

número de individuos migran y se reproducen en cada generación en cualquier sentido

dentro de las cuatro poblaciones. El número de migrantes por generación entre todas las

poblaciones fue alto, de 6,78 individuos por generación .

A nivel regional, entre el conjunto de arrecifes oceánicos y el de continentales, se obtuvo

un nivel alto de conectividad, de más de 15 individuos por generación (Tabla 9). El flujo

estimado entre las poblaciones de Isla Fuerte, Isla Grande y Providencia, al compararlas

por pares, tiende a infinito; mientras que disminuye cuando se compara el flujo por pares

de poblaciones que incluyen a San Andrés (particularmente entre San Andrés y

Providencia). Sin embargo, aún para San Andrés se obtuvo un nivel moderado (entre

uno y cuatro) o alto (mayor a cuatro) de flujo génico en las comparaciones tanto a nivel

local como regional.

Tabla 9. Niveles de flujo génico calculado a partir de índices de diferenciación genética FST entre pares de poblaciones a escala regional y local. Nm: Flujo genético medido como número de individuos que migran a otra población y se reproducen. ≈ 0: Valores estimados cercanos a cero (cálculo de Nm tiende a infinito).

Población 1 Población 2 FST Nm

POBLACION TOTAL 0.036 6.782

SAI-PROV IF-IG 0.016 15.543

SAI IF 0.103 2.180

SAI IG 0.055 4.326

PROV IF ≈ 0 ∞

PROV IG ≈ 0 ∞

IF IG ≈ 0 ∞

SAI PROV 0.195 1.033

Por su parte, al calcular el flujo génico entre todas las poblaciones utilizando el

estadístico FST (0.06268) obtenido en el análisis molecular de la varianza (AMOVA) por el

método de Weir y Cockerham (1984), se obtuvo un valor moderado de flujo génico

(Nm=3,74).

6.8 Aislamiento por distancia

Al realizar el análisis de correlación entre la similaridad genética M (análogo al Nm) y la

distancia geográfica, no se encontró una correlación estadísticamente significativa

(Mantel test, Z = 94286.8552, r = 0.3216, P> 0.7898, r2= 0.103). La distribución espacial

de la variación genética no corresponde a un modelo de aislamiento por distancia, ya

que la diferenciación entre arrecifes (FST) no incrementa al aumentar la separación

geográfica, por lo tanto, se infiere que existe similitud genética en la escala geográfica

analizada (Fig. 4).

Figura 4. Aislamiento por distancia analizado con el test de Mantel para evaluar la correlación matricial entre la similitud genética M y la distancia geográfica.

6.9 Distancias genéticas y análisis de agrupamiento

Las distancias genéticas, siguiendo el modelo de Kimura de 2 parámetros (Kimura 1980),

fueron mínimas entre los individuos colectados en San Andrés (Tabla 10A, Fig. 5

muestras SAI 5, 10, 16, 25 y 27). La distancia entre pares de poblaciones calculadas por

el modelo de dos parámetros de Kimura (1980) y por el modelo de Tajima-Nei (Tajima &

Nei 1984) presentaron valores muy similares entre pares de poblaciones y entre

modelos, siendo el mayor valor el de la distancia de San Andrés y Providencia

(distancias=0.037, Tabla 10B, Tabla 10C).

Tabla 10. Matriz de distancias genéticas A. Basada en las distancias de Tajima-Nei y de Kimura 2 parámetros dentro de las poblaciones estudiadas. B. Basada en las distancias de Kimura 2 parámetros entre las poblaciones estudiadas. C. Basada en la distancia de Tajima-Nei entre las poblaciones estudiadas. SAI= San Andrés PROV= Providencia IF= Isla Fuerte IG= Isla Grande.

A.

Tajima Nei Kimura 2-p

SAI 0.025 0.025

PROV 0.035 0.034

IF 0.037 0.037

IG 0.041 0.040

B.

SAI PROV IF

SAI

PROV 0.037

IF 0.034 0.035

IG 0.034 0.035 0.036

C.

SAI PROV IF

SAI

PROV 0.037

IF 0.035 0.035

IG 0.035 0.036 0.036

Al utilizar el modelo de Tajima-Nei se obtuvieron árboles y relaciones similares a los

construidos con el modelo Kimura de dos parámetros. Sin embargo, los arboles

obtenidos por medio de los diferentes algoritmos (Minimum Evolution, Neighbor-Joining,

UPGMA y Máxima Parsimonia), no presentaron coherencia entre si, por los bajos valores

de bootstrap obtenidos, y la mayoría de las agrupaciones no se sostienen al pasar de un

método a otro. Se debe resaltar que algunos árboles, como el árbol consenso obtenido

por el modelo de 2 parámetros de Kimura y con el algoritmo Neighbor-Joining, solo

presentaron una agrupación (muestras con código de colección número 41 y 52 de San

Andrés) con un valor de bootstrap mayor al 50%, valor a partir del cual se considera que

un clado se encuentra soportado (Fig. 6, Kumar et al. 2004).

En ninguno de los árboles obtenidos se observó una clara diferenciación entre las

poblaciones estudiadas, ni una agrupación de las islas continentales o de las islas

oceánicas, que permitiera reconocer una diferenciación entre ellas.

Figura 5. Dendrograma de similitud entre individuos aplicando el modelo de distancias de Kimura 2 parámetros. Los números en los nódulos de cada árbol indican el valor de �bootstrap� cuando éste fue mayor a 50%, utilizando el algoritmo de UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetic means). SAI= San Andres; PROV=Providencia; IF=Isla Fuerte; IG=Isla Grande.

SSAAII 55 SSAAII 1100 SSAAII 2277 IIGG 225566 SSAAII 1166 SSAAII 2255 IIFF 220011 SSAAII 4411 SSAAII 5522 IIFF 119988 PPRROOVV 114411 PPRROOVV 114477 IIFF 221155 IIGG 225555 IIFF 115577 IIGG 224444 IIFF 115588 IIFF 115566 IIGG 223333 SSAAII 5544 IIFF 221111 IIGG 223366 IIFF 116644 IIFF 220044 PPRROOVV 110055 PPRROOVV 112299 PPRROOVV 8855 IIFF 116611 IIGG 226600 IIGG 330033IIFF 221144 SSAAII 44 SSAAII 5533 IIGG 226666

5588

5577

5511

00..00000000..00005500..00110000..00115500..00220000..00225500..003300

Figura 6. Dendrograma de similitud entre individuos (código de colección siguiendo al nombre de la isla) aplicando el modelo de distancias de Kimura 2 parámetros. Los números en los nódulos de cada árbol indican el valor de �bootstrap� cuando éste fue mayor a 50%, utilizando el algoritmo de Neighbor-joining. SAI= San Andres; PROV=Providencia; IF=Isla Fuerte; IG=Isla Grande.

SSAAII 55 SSAAII 2277 SSAAII 1100SSAAII 2255 SSAAII 1166 IIGG 225566 IIFF 119988 IIFF 220011 IIGG 226666 SSAAII 4411 SSAAII 5522 IIFF 115577 IIGG 224444 IIFF 221155 IIGG 225555 PPRROOVV 114411 PPRROOVV114477 IIFF 115588 IIFF 115566 IIGG 223333 PPRROOVV 112299 PPRROOVV 110055 IIFF 116644 SSAAII 5544 IIFF 220044 IIFF 221111 IIGG 223366 IIGG 226600 SSAAII 44 IIFF 221144 SSAAII 5533 PPRROOVV 8855 IIFF 116611 IIGG 330033

5599

Figura 7. Dendrograma de similitud entre individuos aplicando el modelo de distancias de máxima parsimonia. Los números en los nódulos de cada árbol indican el valor de �bootstrap� cuando éste fue mayor a 50%. SAI= San Andres; PROV=Providencia; IF=Isla Fuerte; IG=Isla Grande.

IIGG 330033 SSAAII 44 PPRROOVV 8855 SSAAII 5533 IIFF 116611 IIFF 221144 SSAAII 55 SSAAII 2277 SSAAII 1166 SSAAII 4411 SSAAII 5522 IIGG 225566 SSAAII 1100IIFF 119988

SSAAII 2255 IIFF 220011 IIGG 226666 IIFF 115577 IIGG 224444 IIFF 221155 IIGG 225555 PPRROOVV 114411 PPRROOVV 114477 IIFF 115566 IIFF 115588 IIGG 223333 SSAAII 5544 PPRROOVV 110055 IIFF 116644 IIFF 220044 IIFF 221111 IIGG 223366 PPRROOVV 112299 IIGG 226600

110000

110000

110000

110000

110000

9999

9955

8822

110000

Figura 8. Dendrograma de similitud entre individuos aplicando el modelo de Kimura 2 parámetros. Los números en los nódulos de cada árbol indican el valor de �bootstrap� cuando éste fue mayor a 50%, utilizando el algoritmo de mínimum evolution. SAI= San Andres; PROV=Providencia; IF=Isla Fuerte; IG=Isla Grande.

SSAAII 55 SSAAII 1166 SSAAII 1100 SSAAII 2255 SSAAII 2277 IIGG 225566 IIFF 119988 IIFF 220011 IIGG 226666 SSAAII 4411 SSAAII 5522 IIFF 115577 IIGG 224444 PPRROOVV 114411 PPRROOVV 114477 IIFF 115566 IIFF 115588 IIGG 223333 IIFF 221155 IIGG 225555 IIFF 221111 IIGG 223366 IIGG 226600 IIFF 220044 PPRROOVV 110055 SSAAII 5544 IIFF 116644 PPRROOVV 112299 SSAAII 5533IIFF 221144 SSAAII 44PPRROOVV 8855 IIFF 116611 IIGG 330033

5577

El análisis realizado por el método de máxima parsimonia (Swofford 2003) arrojó

resultados diversos y no consistentes al cambiar el método de análisis. Se encontraron

arboles de consenso estricto (Fig. 9A, 9C) y semiestricto (Fig. 9B) con un número mínimo

de 38 pasos. La filogenia obtenida es de tipo estrella (Lavery et al. 1996), siendo poco

definida y presentando escasa formación de clusters o agrupaciones. Las ramas

formadas en general incluyen individuos provenientes de diferentes poblaciones, a

excepción de la agrupación constante formada entre los individuos 141 y 147 de

Providencia (Fig. 9).

Los arboles consenso construidos a partir de los diferentes métodos no son congruentes,

a excepción de un cluster formado por la mayoría de las muestras de San Andrés (5, 10,

16, 25, 27, 41, 52), las muestras 198 y 201 de Isla Fuerte y las muestras 256 y 266 de

Isla Grande, pero a nivel general no se encuentra ningún patrón que asocie a las

muestras de una población, o de pares de poblaciones entre sí, ya que se forman

agregaciones entre las diferentes poblaciones y se encontraron una gran cantidad de

politomías dentro de la gran mayoría de clusters.

El método que genera el árbol con más definición es el de consenso semiestricto con

adición pairwise (Fig 9B). Sin embargo, los nuevos clados incluidos también presentaron

politomías e incluyen muestras de poblaciones como San Andrés, Providencia e Isla

Grande dentro de un mismo grupo.

A. B.

C.

Figura 9. A. Árbol consenso estricto con método heurístico y análisis de adición step-wise simple. El árbol consenso de formo a partir de los 100 primeros arboles con el menor número de pasos (38) de 1 400 732 arboles. B. Árbol consenso semiestricto con métodos heurístico y adición step-wise. C. Arbol consenso estricto con métodos heurístico y nearest neighbor interchange branch-swapping. El árbol consenso se realizó a partir de los 100 primeros arboles con el menor número de pasos (38) de 6200 árboles. SAI= San Andres; PROV=Providencia; IF=Isla Fuerte; IG=Isla Grande.

6.10 Existencia de cambios en el tamaño poblacional

Para detectar un cambio en el tamaño de las poblaciones estudiadas, se llevaron a cabo

análisis de la distribución de la frecuencia de diferencias por pares de nucleótidos

(Pairwise differences) y de frecuencias de sitios segregantes, bajo la hipótesis nula de

tamaño constante. Se encontró un mayor ajuste de la distribución de los valores

observados a las gráficas esperadas bajo la hipótesis alternativa de la existencia de un

cambio poblacional (Fig. 10, 11). En el análisis de diferencias por pares de nucleótidos

se obtuvo un estadístico de Rugosidad (Raggedness statistic, (Harpending 1994)

estadísticamente significativo (r= 0,0125, P<0.05), lo cual permite rechazar la hipótesis

nula de tamaño poblacional constante en el pasado. De la misma manera, se encontró

un valor de R2 (Ramos-Onsins & Rozas 2002) estadísticamente significativo (R2=

0.0848, P<0.05) cuyo bajo valor es lo esperado en la existencia de una expansión

poblacional, corroborando el rechazo de la hipótesis nula de tamaño poblacional

constante realizado previamente por el estadístico de rugosidad r.

En el análisis de la distribución de las frecuencias de sitios segregantes (Tajima 1989a),

de naturaleza gráfica y descriptiva, los datos se ajustaron a lo esperado bajo la hipótesis

de expansión poblacional. La curva observada se encuentra ligeramente por encima de

la curva esperada (Figura 11), lo cual indica la existencia de un fenómeno de expansión

poblacional al inicio de la historia de las poblaciones. Debido a que no se observan

descensos en esta curva, no hay evidencia de la existencia de un cuello de botella en el

pasado. Los datos no se ajustaron a ninguno de los análisis bajo la hipótesis nula de

tamaño poblacional constante.

Figura 10. Distribución de las frecuencias esperadas y observadas del número de

diferencias por pares de nucleótidos para el total de las muestras. Análisis bajo la

hipótesis de cambio en el tamaño poblacional.

Figura 11. Distribución del numero esperado de sitios segregantes esperados entre las

secuencias (Snt/a1) observado (n=34) y esperado (n=2) en el tiempo. Análisis bajo la

hipótesis de cambio en el tamaño poblacional. N= numero de generaciones.

7. Discusión

Los resultados obtenidos con el marcador ITS2 presentan poblaciones con una alta

diversidad nucleotídica y haplotípica, demostrando que la reproducción sexual y

posiblemente la mutación juegan un papel importante en el mantenimiento de la

variabilidad genética de la población de P. caribaeorum en el Caribe colombiano. La

diversidad nucleotídica es mucho mayor que la encontrada para Pavona cactus y

Pavona decussata para el marcador ITS2 (0.0069-0.0079 y 0.0093-0.0107,

respectivamente; Moothien-Pillay et al. 2006), y la variación genética observada se debe,

casi en su totalidad, a la variabilidad intrapoblacional, y no a una diferencia entre las

islas. El nivel de flujo génico encontrado en P. caribaeorum no sólo permitiría que alelos

nuevos generados en una población pasen a otra, aumentando la diversidad de la

población receptora, sino que además actuaría como fuerza que homogeneíza el acervo

genético del marcador.

La baja diferenciación genética encontrada también puede ser atribuida a una reciente

(entre 5 000 y 10 000 años; Pfaff 1969) y masiva colonización (Palumbi & Wilson 1990)

por parte de P. caribaeorum al final de la última glaciación tras los cambios del

nivel del mar y a la subsecuente expansión poblacional en el Caribe colombiano que,

bajo las estrategias de historia de vida de la especie (reproducción sexual y asexual, alta

resistencia y diapausa), le han permitido lograr altos niveles de diversidad genética.

Varios estudios geológicos revelan la formación de arrecifes modernos de San Andrés

(Díaz et al. 1995, Zea et al. 1998, Geister & Díaz 1997) y Providencia (Geister 1992,

Geister 1973), Isla Fuerte (von Prahl & Erhardt 1985, INVEMAR 2003) e Isla Grande

(INVEMAR 2003) entre el Pleistoceno tardío y el Holoceno (entre 10 000 y 30 000 años),

pero es probable que se haya llevado a cabo un proceso de recolonización y expansión

poblacional tras el aumento y posterior estabilización del nivel del mar tras la finalización

de la última glaciación, aproximadamente hace 7 000 años (Milliman & Emery 1968).

Ahora bien, los tests de neutralidad, además de detectar la existencia de selección

natural también pueden dar información sobre la ocurrencia de cambios en el tamaño de

las poblaciones estudiadas. Cuando una población se está expandiendo, se espera un

resultado negativo y no significativo en el test D de Tajima (1989b), así como para los

tests D* y F* de Fu & Li (1993), como los encontrados en este estudio. El ajuste de los

resultados a una distribución de Poisson de la frecuencia de las diferencias por pares de

nucleótidos y una filogenia alélica de tipo estrella (sin una estructura definida) detectada

en P. caribaeorum, se ajusta a lo esperado por Lavery et al. (1996) para poblaciones en

expansión poblacional. No se ha reportado en la literatura una disminución en la

cobertura de esta especie o un evento de cuello de botella; tal vez por ello es una

especie dominante en la mayor parte de los arrecifes, y ha llegado a ser planteada como

una plaga (Acosta comunicación personal). Adicionalmente, la existencia de una alta

diversidad haplotípica, sumada a los resultados anteriores, puede ser un indicativo más

de la expansión poblacional sufrida por las poblaciones de P. caribaeorum estudiadas.

El test HBK de subdivisión poblacional realizado en este estudio indica que no existe una

diferenciación entre las poblaciones a nivel total. Esto, sumado al bajo soporte y

estructuración de las ramas de los arboles construidos (tipo estrella), y los resultados

reportados por Camacho (2004) con el marcador heterólogo microsatélite Sput, indican

que no existe una estructuración genética notable entre las poblaciones. Sin embargo, al

realizar el test exacto de subdivisión poblacional, se detecta una leve diferenciación de la

población de San Andrés respecto a las demás poblaciones. Esto significa que

Providencia, Isla Fuerte e Isla Grande se comportan como una misma población,

independientemente de la distancia que las separa, e independientemente de la barrera

que los ríos Sinú, Atrato y Magdalena podrían representar para las larvas de las islas

continentales para comunicarse entre sí.

Respecto a la diferenciación de San Andrés, es recomendable utilizar un mayor número

de muestras en este tipo de estudios poblacionales, ya que la heterogeneidad genética

detectada en la población de San Andrés, con el marcador ribosomal ITS2, podría

también deberse a un efecto de tamaño muestral o efecto por azar de muestreo de

clones. Esta hipótesis se ve soportada por el hecho que no se encuentra una

diferenciación a nivel regional (>700 Km.) y que los índices de diferenciación genética

presentan valores bajos, y su significancia estadística puede no estar representando una

diferenciación biológica real. Adicionalmente, la poca definición de los árboles obtenidos

por los métodos de distancia y de máxima parsimonia son consecuencia de la alta

diversidad de las secuencias y la ausencia de una demarcación clara de las poblaciones,

y además son congruentes con los procesos de expansión poblacional y alto flujo génico

encontrados en este estudio, indicando que no existe una diferenciación real entre las

poblaciones.

Sin embargo, debe considerarse la posibilidad que esta diferenciación de la población de

San Andrés corresponda a una realidad biológica y no a un artificio por esfuerzo de

muestreo. Existen varios procesos locales que podrían explicar la diferenciación de esta

población y que se van a explorar a continuación, como una tasa de fragmentación y

fisión mayor respecto a las demás poblaciones debida a factores exógenos, que

aumentan la probabilidad del muestreo de clones.

Los procesos de fisión o de fragmentación de la colonia pueden deberse a varios

factores de estrés, en fisión a una baja disponibilidad de nutrientes (oligotrofía), y

restricciones del crecimiento por falta de sustrato; mientras que la fragmentación (ramets

generados por procesos externos) puede generarse por enfermedades o disturbios

físicos como tormentas, fuerte oleaje y huracanes (Acosta et al. 2001). Cada uno de

estos factores se han reportado en la isla de San Andrés, y pueden estar afectando la

reproducción (particularmente asexual) y demás procesos demográficos en la población.

Aunque P. caribaeorum tiene una alimentación autótrofa por simbiosis con zooxantelas,

se ha reportado que las especies de su género son fuertes depredadoras, obteniendo

gran parte de su energía por medio de alimentación heterótrofa mediante predación y

filtración (Sorokin 1993). Los arrecifes de San Andrés han sido reportados como zonas

oligotróficas, de baja productividad y disponibilidad de nutrientes (Márquez 1987), lo cual

puede significar una alta competencia intra e interespecífica por el alimento. La isla de

San Andrés presenta, en su barrera arrecifal, una alta cobertura y densidad de Palythoa

(Geister 1973), que sumada a la escasez de nutrientes de la zona, puede generar

procesos de fisión por denso-dependencia (Acosta & Asbahr 2000), tal y como lo

reportado por Tanner (2002) para Palythoa caesia en la Gran Barrera Arrecifal de

Australia. Por otro lado, pueden presentarse efectos negativos sobre los zoantharia por

causa de fuertes corrientes, como el que experimentan los organismos que se

encuentran en la zona de alto oleaje en la cresta arrecifal de San Andrés (Geister & Diaz

1997; Geister 1973). Los efectos incluyen la dispersión de ramets por fragmentación

(Ayre & Hughes 2000; Sebens et al. 1998). A esto se suman los efectos de disturbios

como huracanes, que en Colombia han sido reportados de manera esporádica,

únicamente en el archipiélago de San Andrés (Garzon-Ferreira & Díaz 2003).

Aunque los fenómenos naturales, como el fuerte oleaje y los huracanes se presentan

tanto en San Andrés como en Providencia (Elhuyar 1988) Geister & Diaz (1997)

reportaron diferencias entre los arrecifes de las dos islas, con más de un 50% de pérdida

de cobertura de coral vivo en San Andrés a profundidades someras (0.5-20 metros),

frente a una mejor condición de los arrecifes expuestos a olas en Providencia y demás

complejos arrecifales del archipiélago. Esto evidencia que pese a su cercanía, los

arrecifes de ambas islas han sido expuestos a diferentes intensidades de disturbios, lo

cual puede influir sobre la composición genética de las poblaciones y favorecer su

diferenciación al promover la clonación de P. caribaeorum en la isla de San Andrés. En

comparación a la fuerte exposición a la que se ve sometida la población de San Andrés,

los arrecifes continentales se encuentran expuestos a una menor corriente y oleaje (Pfaff

1969, Acosta observación personal), lo que no favorecería de manera relativa la

formación de ramets.

A nivel mundial, los estudios en diferentes escalas espaciales que relacionan los niveles

de flujo génico y la estructura genético poblacional han dado resultados contradictorios,

lo cual ha sido atribuido a la historia de vida de las especies estudiadas (Anthozoa:

Scleractinia) y al patrón local de corrientes. Por ejemplo, para Pseudopterogorgia

elisabethae Gutierrez-Rodriguez y Lasker (2004) encontraron bajos niveles de flujo

génico y estructura poblacional, al estudiar poblaciones (Bahamas) separadas entre 12 y

443 Km.; mientras que Burnett et al. (1994) encontró alto flujo genético entre poblaciones

del Zoantharia Palythoa caesia a lo largo de 1765 Km, pero insuficiente para prevenir la

estructuración genética entre las poblaciones de la Gran Barrera de Coral en Australia.

Burnett et al. (1994) atribuyen la ligera diferenciación genética entre estas poblaciones a

una selección al azar que actúa sobre las larvas y no a un aislamiento reproductivo entre

las poblaciones, ya que no encuentran un aislamiento por distancia, al igual que este

estudio.

Según los resultados, existe flujo genético considerable (Nm = 1 - 6,78 individuos por

generación) entre las poblaciones de Palythoa caribaeorum en las dos escalas

espaciales analizadas (≈100 y ≈700 Km) y se mantiene aún entre poblaciones separadas

por 718 Km, sin evidenciar aislamiento por distancia. Para P. caribaeorum no existen

otros estudios a nivel mundial o en Colombia que permitan comparar los niveles de flujo

génico. Adicionalmente, las diferentes escalas espaciales, lugares y especies (con

diversas estrategias de vida) hacen difícil su comparación con otros trabajos sobre

conectividad de Cnidaria. Sin embargo, en la literatura se encontraron valores de flujo

similares para otras especies de corales pétreos, que han detectado la presencia de flujo

génico en corales a diferentes escalas espaciales, desde unos pocos kilómetros hasta

más de 2 000 Km (Tabla 11).

Por ejemplo, Burnett et al. (1994) encontraron flujo génico en poblaciones del zoantharia

P. caesia en la Gran Barrera arrecifal aún en distancias superiores a las de este estudio,

1765 Km. La ausencia de aislamiento por distancia también ha sido documentada por

Goffredo et al. (2004) en una escala espacial de 36 a 1951 Km para especies del coral

escleractíneo Balanophyllia europaea en el Mediterráneo; pero ésta aún no ha sido

totalmente explicada por la ausencia de información biológica (capacidad de dispersión

de las larvas en el estadio planctónico) y oceanográfica en los sitios de estudio.

Nishikawa et al. (2003), argumenta que lo esperado es encontrar una relación inversa

entre la intensidad de flujo y la distancia (Tabla 11), lo cual no ocurrió en este estudio,

posiblemente por la complejidad de las corrientes en el Caribe colombiano.

La diferencia encontrada en la intensidad de flujo entre las subpoblaciones estudiadas

podría ser explicada principalmente por la dirección y fuerza diferencial de las corrientes

que conectan las islas en el tiempo (Williams et al. 1984; Ayre & Dufty 1994; Gutierrez-

Rodriguez & Lasker 2004; Whitaker 2004), al igual que por procesos biológicos, que

pueden ocurrir de forma distinta al interior de cada población (p.e. diferente tasa de

reproducción o reclutamiento) (Yu et al. 1999).

Yu et al. (1999), Gutierrez-Rodriguez y Lasker (2004) y Magalon et al. (2005) han

planteado que las corrientes oceánicas juegan un rol importante en la conectividad al

funcionar como transporte larval entre poblaciones de algunas especies coralinas, como

Mycedium elephantotus, Pocillopora meandrina y Pseudopterogorgia elisabethae, ya que

se han encontrado poblaciones geográficamente distantes, pero genéticamente más

parecidas entre sí que poblaciones que se encuentran más cercanas, y el patrón de

división genética es coherente con los patrones de corrientes oceánicas del lugar.

Adicionalmente, la existencia del flujo de larvas, gametos o ramets entre poblaciones

separadas físicamente y relativamente distantes, depende de otros factores y procesos

como el éxito reproductivo, la viabilidad de las larvas en la columna de agua y su

capacidad de asentamiento (Atoda 1951; Ayre & Dufty 1994; Maier et al. 2005), así como

el comportamiento larval (Scheltema 1975), entre otras variables. Pese a los reportes de

alta infertilidad de P. caribaeorum en el Caribe (Fadlallah et al. 1984) y a su bajo

reclutamiento larval (Acosta et al. 2005a), los resultados obtenidos permiten inferir que

algunos o el total de estos procesos deben estar contribuyendo de manera favorable en

el tiempo a los niveles de flujo génico de la especie en el área de estudio.

En el Caribe colombiano el flujo génico entre poblaciones de P. caribaeorum es

favorecido por las fuertes corrientes oceánicas (Fig. 12A). La dirección de flujo genético,

inferida a partir de simulaciones del patrón de corrientes

(http://oceancurrents.rsmas.miami.edu y descrita por Diaz et al. (1995), permitiría la

conexión bidireccional entre los cuatro arrecifes muestreados, particularmente durante la

época de reproducción de la especie (Mayo y Junio; Acosta A. datos sin publicar). Entre

Mayo y Junio se puede observar, en el área de estudio, la presencia de tres corrientes

anticiclónicas y la corriente Caribe (Fig. 12B).

La corriente Caribe, al chocar con las costas de Nicaragua (Archipiélago de San Andrés

y Providencia) se bifurca; por un lado, generando una contracorriente que podría llevar

larvas originadas en Providencia hacia San Andrés, y posteriormente mover estas larvas

hasta los arrecifes continentales. Por otro lado, la corriente Caribe podría seguir su

rumbo hacia el Golfo de México. No obstante, también es posible que las larvas

provenientes de los arrecifes oceánicos retornen a San Andrés o a Providencia a través

de la contracorriente y de un anticiclón que se origina a la altura de Panamá (Vergara

1990), que se dirige hacia el Norte hasta encontrarse nuevamente con la corriente

Caribe. Adicionalmente, en estos meses los satélites detectan una corriente superficial

ciclónica, que se desplaza rápidamente de este a oeste y que se estaciona (antes de

desaparecer) sobre el Archipiélago de San Andrés y Providencia, generando un posible

flujo bidireccional de gametos y larvas entre San Andrés y Providencia.

A.

B.

Figura 12. A. Trayectoria de las corrientes superficiales desde Mayo hasta Julio. B. Sentido de corrientes y anticiclones entre Mayo y Junio. Fuente: National Oceanographic Partnership Program (NOPP), University of Miami Rosenstiel School of Marine and Atmoshperic Science (RSMAS), y NOAA's Cooperative Institute for Marine and Atmospheric Sciences (CIMAS) <http://oceancurrents.rsmas.miami.edu/>

Sin embargo, dada la alta complejidad del patrón de corrientes en el Caribe colombiano,

se sugiere realizar estudios que intenten relacionar la dirección y velocidad de las

corrientes con la intensidad de flujo génico obtenida en esta y en otras poblaciones que

se reproducen en diferente época del año.

Lo que resulta como un supuesto válido, que deberá ser verificado en un futuro, es la

posible dirección en ambos sentidos que se presentaría en el flujo larval entre todas las

poblaciones continentales y oceánicas estudiadas; al igual que la posibilidad de que

larvas originadas en Venezuela y Colombia (fuentes) viajen por estas fuertes corrientes a

través de las Antillas y logren llegar hasta arrecifes de los Estados Unidos (sumideros).

De ser corroborada esta hipótesis se podría plantear que la mayor parte de las

poblaciones de P. caribaeorum en el Gran Caribe están conectadas, por lo menos

teóricamente, y que existiría también una dirección de flujo importante en sentido Sur a

Norte.

Otro factor de gran importancia en la conectividad poblacional es el tiempo de duración

de las larvas (Johnson & Threlfall 1987, Coscinasterias calamaria; Benzie & Stoddart

1992, Acanthaster planci; Williams & Benzie 1993, Linckia laevigata; Foltz et al. 1996,

Leptasteria sepichrola; Benzie & Williams 1997, Tridacna maxima). Zaslow y Benayahu

(1998) encontraron que las larvas de diferentes especies del orden Alcyonacea

(Anthozoa) pueden sobrevivir entre 7 y 22 semanas, perdiendo la capacidad de realizar

metamorfosis a las 11 semanas. En este sentido el género Palythoa, libera gametos al

agua y genera larvas de tipo tele-planctónica, que según Jackson (1986) tienen la

capacidad de sobrevivir en la columna de agua de 3 semanas hasta 7 meses, lo cual

favorece la dispersión a gran escala (730 Km a 10 000 Km; Babcock & Ryland 1990;

Ryland 1997.

Las larvas de Palythoa transportadas por fuertes corrientes (> a 0.5 m/s, como en el

Caribe), podrían potencialmente, cruzar el océano Atlántico (Scheltema 1968).

Asumiendo la mínima velocidad superficial de la Corriente del Caribe (0.5 � 1 m/s;

Hallock & Elrod 1988) se estimó que el tiempo requerido por las larvas de P.

caribaeorum para ser transportadas entre San Andrés y Providencia sería de 3 días

aproximadamente (93 Km), entre Isla Fuerte y Providencia (714 Km) de 24 días, y

atravesando el Caribe un poco más de dos meses; lo cual es tiempo suficiente para

garantizar la sobrevivencia larval en la columna de agua y su potencial asentamiento en

los arrecifes.

Varios autores han concluido que para mantener la conectividad genética entre arrecifes

se requiere que las especies presenten amplia capacidad de dispersión larval y que las

características oceanográficas locales permitan el asentamiento larval y consecuente

reclutamiento de juveniles (Done 1982, Sammarco & Andrews 1988, Willis & Oliver 1988,

Black & Moran 1991, Black et al. 1991, Whitaker 2004). La teoría indica que a mayor

velocidad de corriente, mayor viabilidad larval (por menor tiempo a la deriva) y por lo

tanto mayores tasas de dispersión y valores de flujo génico (Johnson & Threlfall 1987,

Benzie & Stoddart 1992, Williams & Benzie 1993, Foltz et al. 1996, Benzie & Williams

1997), lo cual parece ser lo que ocurre en el área de estudio. Luego se esperaría que

poblaciones de arrecifes más cercanos y con fuerte corriente conectora presentaran

mayores valores de flujo entre sí, que otras más distantes y conectadas por corrientes

más débiles, lo cual no se evidenció en nuestro caso de estudio, donde los niveles de

flujo génico no presentan relación alguna con la distancia entre las poblaciones. Esto

indica que, la explicación de las diferencias en la intensidad de flujo depende de otras

variables (procesos biológicos) que determinan cuántas larvas se fijan, cuántas sufren

metamorfosis a juvenil y cuántos de estos se reproducen, en diferentes generaciones.

Para complementar este estudio, deberían realizarse investigaciones para determinar el

esfuerzo reproductivo de P. caribaeorum, la tasa de sobrevivencia de las larvas en la

columna de agua (Harrison & Wallace 1990, Isomura & Nishihira 2001) y el potencial de

reclutamiento de esta y de otras especies; ya que como lo argumentan Nishikawa et al.

(2003), la diferente intensidad de flujo génico también se puede deber a las diversas

estrategias en la historia de vida (liberadores de gametos vs. incubadores de plánulas)

empleadas por las especies (Tabla 11), lo cual en últimas determina su vulnerabilidad.

Los resultados sugieren que los niveles de flujo génico encontrados son suficientes para

homogeneizar las poblaciones de P. caribaeorum e impedir el efecto de estructura

genético-poblacional en el Caribe colombiano a escala regional (el conjunto de islas

oceánicas no se diferencia del conjunto islas continentales, y Providencia no se

diferencia de Isla Grande e Isla Fuerte), siendo corroborado por los resultados no

significativos del análisis de aislamiento por distancia y por los análisis de filogenia, tanto

bajo los supuestos de parsimonia como de distancia genética. Según Slatkin (1987) el

flujo génico es una fuerza cohesiva poderosa, y requiere de niveles moderados o altos

(Nm > 1) para mantener la homogeneidad entre las poblaciones, previniendo la

acumulación de diferencias fijadas entre y dentro de las poblaciones, como se encontró

en este estudio (Nm=3,74-6,78, Tabla 11). Este resultado concuerda con lo esperado

para especies bénticas marinas con larvas tele-planctónicas (Willis & Oliver 1988, Hunt

1993, Ayre et al. 1997), que con alto potencial de dispersión, generarían poca

diferenciación genética en grandes escalas geográficas (Benzie & Williams 1997, Burnett

et al. 1994, Hellberg 1996, Yu et al. 1999).

Tabla 11. Estructura genética (FST) y niveles de flujo genético (Nm) para diferentes escalas espaciales y especies de escleractíneos liberadores de gametos, incubadores de larvas, y que usan ambas estrategias de reproducción. Se indica los valores de significancia para los valores de FST. En negrilla las poblaciones comparadas que presentaron estructura genética. GBC: Gran Barrera de Coral, Australia.

Especie Escala (Km) Ubicación Fst P Nm(Fst) Fuente

Liberador de gametos

Platygyra sinensis 45 Hong Kong 0.004 >0,05 (NS) >60 Ng & Morton (2003)

Pocillopora verrucosa 70 África del Sur 0 - (NS) >40 Ridgway et al. (2001)

Acropora aspera 155 Ningaloo reef, Australia 0.067 <0,001 n/a Whitaker (2004)

Acropora digitifera 155 Ningaloo reef, Australia 0.01 <0,001 n/a Whitaker (2004)

Mycedium elephantotus 250 Taiwán 0.032- 0.218 <0,001 0,90 - 7,56 Yu et al. (1999)

Zoanthus coppingeri 340 GBC 0.039 < 0,001 6.2 Burnett et al. (1995)

Acropora tenuis 500 Japón 0.066 - 0.015 <0.01; >0.05 (NS) 3,5 - 16,4 Nishikawa et al. (2003)

Paracyathus stearnsii 1000 California 0.0039 <0,05 >60 Hellberg (1996)

Acropora cytherea 1200 GBC 0.03 <0.05 8.1 Ayre & Hughes (2000)

Acropora hyacinthus 1200 GBC 0.05 <0.05 4.8 Ayre & Hughes (2000)

Acropora millepora 1200 GBC 0.01 >0.05(NS) 24.8 Ayre & Hughes (2000)

Acropora valida 1200 GBC 0.02 >0,05 (NS) 12.3 Ayre & Hughes (2000)

Palythoa caesia 1765 GBC 0.010 <0,05 25 Burnett et al. (1994) Pocillopora meandrina

200, 2000 Polinesia 0.02-0.16 <0,01 1,3-12 Magalon et al. (2005)

Lophelia pertusa 2800 Nordeste Atlántico Europeo

0.264 < 0,05 n/a Le Goff et al. (2004)

Incubador de plánulas

Seriatopora hystrix 90 GBC 0.43 <0,0001 0.59 Ayre & Dufty (1994) Pseudopterogorgia elisabethae 444 Bahamas 0.371 < 0,001 0,424 Gutierrez-Rodriguez &

Lasker (2004) Stylophora pistillata 500 Japón 0.142-0.215 <0,05 0,9 - 1,5 Nishikawa et al. (2003)

Seriatopora hystrix 610 Mar Rojo 0.089 <0,001 2,6 Maier et al. (2005)

Balanophyllia elegans 1000 California 0.2 <0,05 1 Hellberg (1996)

Acropora cuneata 1200 GBC 0.05 >0,05 (NS) 4,8 Ayre & Hughes (2000)

Acropora palifera 1200 GBC 0.02 >0,05 (NS) 12,3 Ayre & Hughes (2000) Pocillopora damicornis 1200 GBC 0.01 >0,05 (NS) 31 Ayre & Hughes (2000)

Seriatopora hystrix 1200 GBC 0.15 <0,05 1,4 Ayre & Hughes (2000)

Stylophora pistillata 1200 GBC 0.09 <0,05 2,5 Ayre & Hughes (2000) Balanophyllia europea 1941 Cuenca del

Mediterráneo 0.202 <0,01 0,988 Goffredo et al. (2004)

Balanophyllia elegans 3000 Costa oeste de EEUU 0.28 <0,05 0,633

Hellberg (1994)

Liberador o incubador

Goniastrea aspera 100 Japón 0.026 0,098 (NS) 9,36 Nishikawa & Sakai (2005)

Goniastrea aspera 500 Japón 0.039 - 0.087 <0,01 2,6 - 6,2 Nishikawa & Sakai (2003)

Pocillopora damicornis 650 Japón 0.056 < 0,01 2,4 - 8,9 Adjeroud & Tsuchiya

(1999)

En la literatura, existe un amplio rango de posibilidades a nivel de diferenciación

genético-poblacional, desde poblaciones que están altamente subdivididas

genéticamente, aunque tengan el potencial larval para una dispersión a gran distancia

(Ayre & Dufty 1994), hasta poblaciones con gran potencial de dispersión y poca

diferenciación genética, distanciadas por cientos de kilómetros (Tabla 11). La mayor

parte de los estudios realizados en escleractíneos indican que las poblaciones

comparadas presentan estructura poblacional; no obstante, la estructura es

independiente de la escala, pero dependiente del área geográfica estudiada y de la

historia de vida de las especies (Yu et al. 1999; Tabla 11).

Los arrecifes analizados en el Caribe colombiano están expuestos a diferentes disturbios

(descarga de ríos, huracanes, marea fuerte, etc.; Geister 1973, Díaz et al. 1995, Geister

& Díaz 1997, Acosta & Martinez 2005). La literatura indica que el crecimiento y el

desarrollo de corales se pueden ver afectados por el aumento de la sedimentación y la

influencia negativa de diversos contaminantes transportados por los ríos al mar (Díaz et

al. 1996, Garzón-Ferreira & Diaz 2003); en consecuencia se esperaría que estos factores

disminuyeran la intensidad del flujo existente entre las islas afectadas o peor aún, fueran

una barrera para el flujo larval (entre Isla Grande e Isla Fuerte). No obstante, se encontró

que la cantidad de migrantes no se reduce bajo estas condiciones. Si las diversas

presiones de selección actúan en las subpoblaciones de P. caribaeorum incrementando

la resistencia larval o afectando la diversidad genética es aún desconocido en el país y

debe ser motivo de futuras investigaciones. Lo que sí se sabe es que la intensidad

moderada de un disturbio puede llegar a potenciar la diversidad genotípica en

poblaciones de corales (Hunt 1993, Yu et al. 1999), lo cual podría en parte explicar altos

valores de diversidad génica en poblaciones afectadas por grandes ríos. Así mismo,

según Yu et al. (1999) los disturbios pueden actuar en conjunto para permitir la

coexistencia de muchos genets y mantener así la alta diversidad genotípica de las

especies clonales.

Dueñas (2005) plantea que el estado de conservación de los arrecifes continentales está

relacionado con el grado de estrés por sedimentación generado por ríos, encontrando

que la bahía del Chengue (Caribe colombiano) presenta mayor riqueza y densidad de

juveniles que los registrados para Isla Grande e Isla Fuerte, donde se presenta una

mayor descarga de ríos. Sin embargo, de acuerdo con los resultados de este estudio, el

flujo génico y la diversidad no parecen verse afectadas por las barreras que podrían

representar los ríos Atrato, Sinú y Magdalena, entre Isla Fuerte e Isla Grande, ya que se

encontró que la cantidad de migrantes tiende a infinito y no se observa una distancia

genética entre éstas poblaciones mayor que la encontrada entre los demás pares de

islas comparadas en cualquier escala. El efecto de muchos parámetros ambientales no

ha sido medido en nuestras costas, ni se ha comprendido si estas diversas presiones de

selección actúan en las subpoblaciones de Palythoa caribaeorum incrementando la

resistencia larval o afectando la diversidad genética.

Se ha encontrado que la desembocadura de ríos como el Sinú, al este de Isla Fuerte,

puede afectar diferencialmente a las especies de corales adultos y juveniles de los

arrecifes continentales, afectando a poblaciones sensibles a la sedimentación y que

requieren aguas altamente iluminadas como Acropora spp. y Agaricia tenuifolia,

permitiendo la colonización y dominancia de especies más resistentes a estas

condiciones, como Montastraea cavernosa, Siderastraea sidérea (Diaz et al. 1996). Es

posible que Palythoa caribaeorum no se esté viendo afectada por la descarga de los ríos

y se esté comportando como una especie resistente y de gran capacidad colonizadora,

reportada para la especie por Acosta et al. (2001). Adicionalmente es posible que entre

en estados de diapausa para resistir en periodos de estrés intensivo, como un aumento

excesivo de sedimentación, que usualmente ocurre en periodos lluviosos (Acosta 2001),

lo cual corrobora la alta resistencia de esta especie, como fue reportada por Díaz et al.

(1995).

En resumen, los resultados indican que las poblaciones de P. caribaeorum presentan

una conectividad importante entre ellas, con un flujo génico moderado o alto y de manera

bidireccional, en concordancia con los patrones de corrientes en el Caribe colombiano y

facilitado por atributos propios de las larvas tele-planctónicas de la especie. El alto nivel

de variabilidad genética en la región analizada se atribuye casi en su totalidad a la

variabilidad dentro de las poblaciones y no a diferencias entre ellas. No existe una

estructura genética conspicua y los índices de diferenciación poblacional tienden a

indicar que las poblaciones estudiadas se comportan con una sola, a pesar de encontrar

por medio de algunos de los análisis una diferenciación estadísticamente significativa

entre las poblaciones a un nivel global. Esta leve diferenciación, al realizar la

comparación por pares de poblaciones del índice de heterogeneidad genética (FST),

permite comprender que es completamente atribuible a un efecto introducido por San

Andrés, posiblemente debido a un número insuficiente de muestras.

Si en realidad la diferenciación de la población de San Andrés se debe a un efecto del

esfuerzo de muestreo en este estudio y no a una heterogeneidad genética real, los

resultados estarían revelando que existe solamente una gran población de P.

caribaeorum en el Caribe colombiano y no cuatro como se pensaba inicialmente; luego

las cuatro subpoblaciones harían parte de una gran metapoblación, la cual, siguiendo el

patrón de corrientes, podría extenderse a todo el Caribe. Sin embargo, en el caso que se

compruebe que existe realmente una estructura poblacional, sigue siendo evidente que

las larvas de esta especie tienen una gran capacidad de dispersión y resistencia incluso

a los efecto producidos por los ríos, lo cual permite un alto grado de flujo génico entre

sus poblaciones a gran escala, y no se deben considerar como poblaciones aisladas o

completamente independientes.

8. Conclusiones

Las poblaciones P. caribaeorum estudiadas se encuentran conectadas aun en escala

regional (700 Km.), sugiriendo gran dispersión y resistencia de las larvas al efecto de ríos

y distancia. El alto flujo génico no solo evita la presencia de diferentes acervos genéticos,

sino que posiblemente ha favorecido la homogenización y la alta diversidad genética

encontrada. La no correlación entre flujo y distancia geográfica es posiblemente

explicado por el patrón de corrientes (velocidad) y la capacidad de dispersión larval. La

evidencia indica el buen estado genético poblacional, incluyendo un proceso de

expansión poblacional que se dió después de su reciente colonización en el Caribe

colombiano y que posiblemente continúa en la actualidad.

9. Recomendaciones

• Realizar estudios aumentando el número de muestras de las poblaciones para

garantizar un adecuado esfuerzo de muestreo y poder confirmar si la

diferenciación detectada en la población de San Andrés corresponde a la

realidad biológica o si es un artificio generado por un número insuficiente de

muestras.

• Ampliar la escala de estudio e incluir otras poblaciones de P. caribaeorum en el

Caribe, para realizar un mayor número de comparaciones que le confieran mayor

robustez a los análisis, y conocer hasta donde se extiende la conectividad entre

las poblaciones.

• Diseñar cebadores específicos para Palythoa sp., para aumentar la eficiencia y

especificidad de la amplificación de secuencias por PCR. Así mismo, se

considera apropiado utilizar otros marcadores para corroborar los resultados

aquí presentados, seleccionándolos de acuerdo a su utilidad para realizar

estudios a nivel poblacional, es decir que presenten una gran variabilidad a nivel

intraespecífico.

• Se recomienda a las Corporaciones Regionales, municipios e instituciones de

investigación hacer un esfuerzo a corto y mediano plazo para profundizar en la

importancia de la conectividad y la diversidad genética como una herramienta útil

para definir los límites geográficos de las áreas marinas protegidas. Por lo tanto,

se debe realizar estudios similares con otras especies de coral, tanto

dominantes, raras y de abundancia intermedia, así como especies con diferentes

historias de vida (incubadores de larvas y liberadores de gametos), para poder

integrar la información obtenida e inferir a nivel general la conexión genética

entre arrecifes coralinos. Como se discutió durante el 2006 y 2007 en reuniones

del INVEMAR, la conectividad y la diversidad genética han sido incorporadas

textualmente en los documentos para definir áreas marinas protegidas en

Colombia (2007). Esta información adicionalmente facilitará diseñar planes de

manejo y conservación con una visión más holística (interdisciplinaria).

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11. Anexos

Anexo A. Protocolo de extracción de ADN de Camacho (2004) a partir de los protocolos

de extracción de Coffroth et al. (1992) y de Berntson et al. (1999).

1. Extracción fenólica

a. Sumergir la muestra en un buffer de extracción con las siguientes

concentraciones: NaCl 0.1 M, EDTA pH 8 5mM, Tris-HCl pH 8 0.01M,

SDS 0.5% y proteinasa K 0.25 mg/ml.

b. Centrifugar a 13 000 rpm a 4ûC por diez minutos.

c. Realizar una separación fenólica utilizando de una a tres veces una

mezcla de proporciones de volumen 25:24:1 de fenol, cloroformo y

alcohol respectivamente.

d. Utilizar una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico de proporciones

24:1.

2. Alternativamente: Extracción rápida con resina sintética Chelex100

a. Extraer dos o tres pólipos de cada muestra.

b. En un tubo de 1.5 ml agregar 200 µl de Chelex al 10% y 7 µl de DTT.

c. Incubar en baño María a 56ûC por 24 horas.

d. Mezclar por diez segundos

e. Centrifugar a 13 000 rpm

3. Conservar las muestras a -20ûC.

Anex

o B

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lotip

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10 20 30 40 50 60 70 80

* * * * * * * *

Hap 1 GTCGAACCGA ACCGGCTGCT TGCTGCGGAT CGCGGGGAAC CGTTTCGTTT TAGGCCTCCG AGGATCTCGC TAGGCGGCGG

Hap 2 .......... .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..CA......

Hap 3 .......... .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..CA......

Hap 4 .......... .......... .......... ....A..... .......... ......A..A .......... ..........

Hap 5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Hap 6 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Hap 7 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Hap 8 .......... .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..........

Hap 9 .......... .........- ---....... .......... .AA....... .........A .......... ..........

Hap 10 .......... .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..........

Hap 11 .......... .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..........

Hap 12 .......... .......... .......... .......... .......... .......A.. .......... ..........

Hap 13 .......... ......C..- ---..A.... .......... .AA....... .......... .......G.. ..CA......

Hap 14 .......... .........- ---....... .......... .AA....... .......... .......... ..CA......

Hap 15 C......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......A...

Hap 16 .G........ .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..........

Hap 17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Hap 18 .......... .......... .......... .......... .AA....... .......... .......... ..........

Hap 19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Hap 20 T.......A. .......... ...G...... .......... .AA....... .........A .......... ..CC......

Hap 21 C......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

90 100 110 120 130

* * * * *

Hap 1 TTCTCCTGCA TTTCGAGGGA CGCGGGCCTG GACGCCGCGA CGCCTCAACG CCGCGCGG

Hap 2 .......... .......... .......... .......... .......... ....A...

Hap 3 .......... .......... .......... .......... .......... ........

Hap 4 .......... .......... .......... .......... .......... ....A..A

Hap 5 A..A...... .......... .......... .......... .......... ........

Hap 6 .......... .......... .......... .......... .......... ....A..A

Hap 7 .......... .......... .......... .......... .......... ....A...

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Hap 9 .......... .......... G.....T... .......... .......... ........

Hap 10 .......... .......... .......... .......... .......... ........

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Hap 18 .......... ....T..... .......... .......... .......... ....A..A

Hap 19 .......... .......... .......... .......... .......... .......A

Hap 20 .......... .......... G......... .......... .......... ....A...

Hap 21 .......... .......... .......... .......... .......... ........

analisis del flujo genico en poblaciones de

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