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Análisis de la posición filogenética, niveles de diferenciación y análisis preliminar de
la estructura genética de las poblaciones de Hyla meridionalis de Donostia-San
Sebastián
Museo Nacional de Ciencias Naturales.
Consejo Superior de Investigaciones Científicas.
José Gutiérrez Abascal, 2. 28006 Madrid. España.
Autores/ Autoreak: Ainhoa Iraola
Ernesto Recuero
Xabier Rubio
Annie Machordom
Mario García-París
Análisis de la posición filogenética, niveles de
diferenciación y análisis preliminar de la estructura
genética de las poblaciones de Hyla meridionalis de
Donostia-San Sebastián
Dirección del proyecto: Mario García París (MNCN, CSIC)
Annie Machordom (MNCN, CSIC)
Coordinación del proyecto: Xabier Rubio Pilarte (Aranzadi Z.E.)
Becarios: Ainhoa Iraola Apaolaza (Aranzadi Z.E.)
Ernesto Recuero (MNCN, CSIC)
Índice de la memoria
1.- Antecedentes
2.- Motivación del estudio e hipótesis de trabajo
3.- Introducción general
3.1.- Distribución geográfica y niveles de amenaza de Hyla meridionalis
3.2.- Definición del problema
3.3.- Aplicación de técnicas moleculares
4.- Filogeografía en el ámbito europeo y singularidad de la población de Donostia
4.1.- Introducción
4.2.- Material y método
4.3.- Resultados
4.4.- Discusión
4.5.- Conclusiones
5.- Filogeografía global y posisión filogenética de la población de Donostia
5.1.- Introducción
5.2.- Material y método
5.3.- Resultados
5.4.- Discusión
5.6.- Conclusiones
6.- Implicaciones de los resultados para conservación
6.1.- Análisis de la estructura genética de la población
6.2.- Implicaciones para la conservación de la población de Donostia
Agradecimientos
Bibliografía citada
1.- ANTECEDENTES
Ante la grave situación de amenaza de la población de ranita meridional (Hyla
meridionalis) de Donostia-San Sebastián, el Gobierno Vasco y la Diputación de Gipuzkoa
toman una serie de medidas encaminadas a la recuperación de la especie bajo el
asesoramiento de Aranzadi, que incluye entre otros aspectos la diversificación de los
lugares de reproducción y la gestión de dichos puntos. Dada la inversión y esfuerzo
efectuados para la conservación de esta población resultaba llamativo que no existiera
información fiable sobre la singularidad evolutiva de esta población, ni tampoco sobre el
posible origen filético de la misma. Esta información resulta imprescindible a la hora de
determinar aspectos relevantes de conservación, como la posibilidad de efectuar
reintroducciones y el conocimiento de la estructura genética básica de la población.
Con objeto de paliar esta deficiencia en el conocimiento de aspectos relevantes de
la historia evolutiva de la población de Donostia y de sus implicaciones se planteó la
realización de este trabajo, ejecutado en el Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC)
en el marco del Convenio de Colaboración firmado entre la Sociedad de Ciencias Aranzadi
Zientzi Elkartea y el Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid (MNCN),
perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC). Aquí se presenta
la memoria final de este proyecto que ha sido financiado por la Dirección de
Biodiversidad perteneciente al Departamento de Ordenación del Territorio y Medio
Ambiente del Gobierno Vasco.
2.- MOTIVACIÓN DEL ESTUDIO E HIPÓTESIS DE TRABAJO
La población de Hyla meridionalis de Donostia-San Sebastián es la única conocida
de la especie en el País Vasco y en toda la vertiente atlántica de la Península Ibérica. Se
trata de una población aislada geográficamente, cuyas poblaciones coespecíficas más
cercanas se encuentran en el suroeste de Francia y en Cataluña.
Hasta la realización de este trabajo no se disponía de ningún dato para explicar la
distribución actual de este especie y las posibles razones que explicasen el actual
aislamiento de la población de Guipúzcoa. El Proyecto planteaba 3 posibles hipótesis:
1. El aislamiento actual de estas poblaciones es consecuencia de un fenómeno de
reducción reciente y progresiva del ámbito de la especie en toda la región atlántica
hispano-francesa, en cuyo caso se espera que sean genéticamente similares a las
poblaciones más cercanas conocidas.
2. Se trata de un aislamiento antiguo, consecuencia de cambios climatológicos
pretéritos, que tuvieron como resultado el mantenimiento con carácter relicto de
esta población, en cuyo caso se encontraría una diferenciación genética elevada con
respecto a las poblaciones cercanas.
3. Estas ranitas provienen de una introducción accidental, o deliberada, desde
poblaciones en mayor o menor medida alejadas geográficamente. Esta hipótesis es
plausible dado el atractivo de estas ranas como mascotas y la existencia de casos
previos (García-París et al., 1989). En este caso, contando con que la introducción
fuese reciente (en términos evolutivos), las poblaciones serían muy similares o
idénticas a las existentes en las zonas de procedencia de los ejemplares
introducidos.
La motivación específica del trabajo es determinar cuál de estas hipótesis es
aplicable a las poblaciones de Hyla meridionalis del País Vasco. En caso de tratarse de
poblaciones diferenciadas genéticamente y como ya se indicó en la memoria inicial sería
necesario abordar un estudio de las características genéticas de la población incluyendo un
estudio preliminar de su estructura genética.
3.- INTRODUCCIÓN GENERAL
3.1.- Distribución geográfica y niveles de amenaza de Hyla meridionalis
La ranita meridional Hyla meridionalis (Boettger, 1874), es una de las dos especies
de la familia Hylidae presentes en la Península Ibérica. La otra especie Hyla arborea
(ranita de San Antonio) tiene una amplia distribución en el País Vasco.
Hyla meridionalis se distribuye en Europa por el sur de Francia, el noroeste de
Italia (Liguria), la Península Ibérica y Menorca, mientras que en Africa ocupa el norte de
Marruecos, Argelia y noroeste de Túnez. Además se encuentra en las Islas Canarias y hay
menciones en Madeira.
En la Península Ibérica su distribución se concentra en dos núcleos. El primero se
sitúa en el cuadrante suroccidental, que incluye gran parte del centro y sur de Portugal y
casi toda Extremadura, Andalucía occidental y Castilla-La Mancha hasta Toledo y Ciudad
Real. Su presencia en Albacete no es segura y se adentra hacia el norte por el sur de las
provincias de Salamanca y Ávila en Castilla-León. Hay citas en Murcia y al parecer fue
introducida en Valencia. El segundo núcleo, que se extiende hacia Francia e Italia, se
concentra en la zona norte e incluye Cataluña y una población aislada en el País Vasco
(Pleguezuelos J. M et al., 2002) (fig.1). La población del País Vasco se encuentra situada
en torno al monte Mendizorrotz cuyo cordal se extiende 10 km, discurriendo en paralelo a
la costa Cantábrica (Etxezarreta & Rubio 2003).
La situación crítica en la que se encontraba la población y su aislamiento, propició
la incorporación de esta especie en el Catálogo Vasco de Especies Amenazadas de la
Fauna y Flora Silvestre y Marina", Decreto 167/1996, de 9 de julio (BOPV Núm. 140, de
22.07.96, pp 11613-11617). De hecho la ranita meridional esta considerada como el único
anfibio en peligro de extinción de la Comunidad Autónoma Vasca (Etxezarreta & Rubio,
1998) y la población de Gipuzkoa podría ser considerada como la más amenazada de
España (García-París, 1997).
Figura1. Distribución de la especie Hyla meridionalis.
En 1998 Rubio y Etxezarreta hicieron un estudio preliminar sobre las causas de la
regresión en el período 1978-1998 y la situación de la ranita meridional (Hyla
meridionalis) en ese año en Mendizorrotz (Gipuzkoa, País Vasco). Este informe sirvió para
la elaboración del Plan de Gestión de la Ranita Meridional (Hyla meridionalis) aprobado el
10 de noviembre de 1999 por la Diputación Foral de Guipúzcoa (BOG Num.221, 18
noviembre 1999, pp.16797-16802). En este estudio preliminar se recopilaron citas de la
especie y se identificaron las áreas de reproducción existentes en 1978 y su posterior
regresión en el periodo 1978-1998. En 1998 la presencia de Hyla meridionalis se limitaba
a dos zonas: el núcleo de Berio y el núcleo de Igara que estaba compuesta por un embalse
de tamaño considerable y algunas piscinas.
Quedaba patente que la especie vivía en piscinas en sustitución a las charcas
naturales debido a su escasez. No se pudo constatar de que la especie lograse culminar su
ciclo reproductor en las piscinas y los dos núcleos mencionados presentaban un grave
peligro de urbanización. El tamaño estimado de la población reproductora en los dos
núcleos era de 1000-1200 individuos adultos y la mayoría (885/1040 individuos) se
encontraban en el embalse de Gurelesa (Igara).
Las principales amenazas identificadas en Hyla meridionalis fueron:
a) La destrucción del hábitat. En consecuencia, la dinámica de la población se ve
afectada por la disminución espacial de la población con una consiguiente
reducción en el flujo de genes que la mantienen.
b) La introducción de especies alóctonas. La introducción de las especies
Procambarus clarkii (Cangrejo rojo) y Carassius auratus (Pez rojo o carpín)
tienen una gran repercusión en la viabilidad de la especie Hyla meridionalis y
en la de los anfibios en general. Estás especies, y en especial el cangejo, son
potentes depredadores (se alimentan de larvas, huevos, metamórficos…) y
difíciles de eliminar pudiendo llevar a cabo la eliminación de poblaciones
enteras.
Con la puesta en marcha del Plan de Gestión para la Ranita meridional se llevó
adelante un programa para su reintroducción.
En una primera fase se aseguró la presencia y continuidad de la población existente,
regenerando charcas ya existentes y creando otras nuevas. A continuación se ejecutó el
plan de reintroducción. El Departamento de Agricultura y Medio Ambiente de la
Diputación Foral de Gipuzkoa encargó a la Sociedad de Ciencias Aranzadi la realización
de la primera fase del Plan de Reintroducción de la Ranita meridional (Hyla meridionalis)
en Mendizorrotz en el año 2000 (Rubio & Etxezarreta, 2003). En la primavera de 2001
dicho organismo, con la asistencia de la empresa Ekos Estudios Ambientales S.L,
desarrolló el plan de revegetación de las charcas existentes, iniciado en 1999 (EKOS,
2001), y puso en marcha la Segunda Fase del Plan de Gestión. El 28 de mayo de 2001, se
publica la Orden Foral por la que se incluye un nuevo apartado en la anterior O.F. de 10 de
noviembre de 1999, por la que se aprueba el Plan de Gestión de la Ranita Meridional (Hyla
meridionalis) y se dictan normas complementarias para su protección (BOG Núm. 120, 22
junio 2001, pp 11790). Estas normas protegen las áreas de reproducción del anfibio, que
incluyen los propios humedales y su orla de vegetación.
Desde 1998 se está implantando el Plan de Gestión en la que el paso más
importante es la construcción de una red de charcas a lo largo del área de distribución
histórica de la especie y la reintroducción de la especie en ellas.
Se conoce la capacidad colonizadora de esta especie (Salvador & García París,
2001) y por tanto sería factible la creación de una estructura metapoblacional, permitiendo
el trasiego de los individuos, con el propósito de mantener la viablilidad de la especie.
La población de Hyla meridionalis de Mendizorrotz presenta indicios de haberse
estabilizado e incluso de estar recuperándose (Rubio & Etxezarreta, 2003). Pero, los
nuevos biotopos aún no se han estabilizado y la introducción incontrolada de especies
alóctonas en las charcas persiste como una amenaza importante. En consecuencia, hay que
controlar la evolución del hábitat de la especie, su población y erradicar las amenazas
existentes.
3.2.- Definición del problema objeto de estudio
La población de Hyla meridionalis de Donostia es la única conocida de la especie
en el País Vasco y en toda la cornisa cantábrica ibérica. Las poblaciones más cercanas se
ubican en áreas del suroeste de Francia. Dada la fragilidad de la población, la especie se
incluyó en el listado de especies amenazadas del País Vasco. La destrucción y alteración
de los puntos de reproducción principales de la especie con motivo de obras de interés
industrial provocaron la toma de medidas para la protección de la especie. Sin embargo y
de nuevo como consecuencia del pequeño tamaño de la población, se consideró necesario
efectuar un estudio sobre la singularidad de la población, tanto para evaluar el interés de la
conservación de esta población en particular como para evaluar la posibilidad de
reintroducciones en caso necesario.
Desde un punto de vista evolutivo la singularidad de una población o de un
conjunto de poblaciones viene definida por el número y relevancia de los caracteres
independientes que presenta. Estos caracteres pueden ser de cualquier tipo: morfológicos,
de comportamiento, genéticos... En anfibios los cambios morfológicos y de
comportamiento en una población suelen aparecer tras mucho tiempo de aislamiento
(generalmente millones de años), por lo que su ausencia, es decir la falta de rasgos
diferenciales, no es indicativa del tiempo ni del grado de diferenciación alcanzado por una
población. De hecho, los anfibios son uno de los grupos en los que se conocen un mayor
número de especies crípticas, es decir externamente indistinguibles, y este hecho ocurre
con frecuencia en la Península Ibérica (es el caso de las dos especies de sapillos pintojos,
Discoglossus galganoi y Discoglossus jeanneae, o el de los sapillos moteados Pelodytes
punctatus y Pelodytes ibericus, o el de los sapos parteros común y bético, Alytes
obstetricans y Alytes dickhilleni). Por lo tanto, tratar de establecer el grado de singularidad
de la población donostiarra de Hyla meridionalis basándose en este tipo de caracteres no
sería fiable.
Una alternativa es identificar el grado de diferenciación genética alcanzado entre
esta población y el resto de las poblaciones de la especie mediante la utilización de
marcadores moleculares. Cada marcador proporciona un carácter o una serie de caracteres
que cambian con el tiempo, y en el caso de corresponder a cambios de tipo neutral
(selectivamente neutros), estos cambios teóricamente se producirían a una tasa de cambio
relativamente constante. Existe una gran diversidad de marcadores moleculares que
difieren en la tasa de cambio (es decir cambian más o menos deprisa) y también en los
métodos necesarios para su estudio. En las últimas décadas se ha generalizado el uso del
ADN mitocondrial como marcador, en particular algunos de sus genes codificantes para
proteínas, ya que permiten establecer tasas de divergencia variables entre decenas de miles
de años y unos pocos millones de años, y su obtención no requiere el sacrificio de los
ejemplares de estudio, si no que basta con la obtención de una pequeña muestra.
En nuestro caso decidimos utilizar estos marcadores ya que nos permitirían
averiguar tanto el grado de diferenciación genética alcanzado por la población de San
Sebastián como el tiempo aproximado que lleva en aislamiento. De esta forma se puede
documentar la singularidad de la población y evaluar los riesgos que supondría tanto su
posible pérdida como la posibilidad de realizar reintroducciones desde poblaciones
próximas.
Para evaluar esta singularidad es necesario comparar la muestra del País Vasco con
una representación adecuada de muestras del resto de la distribución conocida de la
especie. Para efectuar estas comparaciones utilizamos muestras del suroeste de Francia, de
Portugal, de Cataluña, de Castilla-León, de Castilla-La Mancha, de Andalucía, de las Islas
Canarias y una nutrida representación de Marruecos. Como ya se verá en los resultados
estas últimas muestras han sido fundamentales para la correcta interpretación de los datos,
y su ausencia nos hubiera llevado a conclusiones erróneas, poniendo de relieve una vez
más que no se pueden realizar estudios de singularidad genética a nivel local sin analizar
poblaciones de todo el ámbito de distribución de la especie.
La metodología utilizada para determinar la singularidad de la población se basa en
los principios básicos de la filogeografía y de filogenia. En la práctica filogenética dos
grupos provienen de un antepasado común más reciente que con cualquier otro grupo,
cuando comparten entre sí mayor número de caracteres derivados. De esta forma podemos
saber de qué antepasado provienen los grupos actuales, y en muchos casos, cuando lo
combinamos con datos de divergencia genética, podemos saber cúanto tiempo hace que
esos grupos se separaron entre sí. Los análisis filogeográficos permiten aplicar de una
forma laxa estos criterios de manera que son utilizables a nivel de poblaciones, con la
ventaja adicional de que permiten discutir los posibles mecanismos que han llevado al
aislamiento y diferenciación de una población concreta. Es decir estos métodos permiten
no sólo averiguar qué grado de diferenciación existe entre dos poblaciones, si no también
conocer su origen y los mecanismos que han provocado su diferenciación.
Por lo tanto en este estudio abordaremos el problema del aislamiento de la
población de Hyla meridionalis de Donostia con esta perspectiva. Los resultados obtenidos
son totalmente inesperados y ponen de relieve que el estudio tendría que haberse efectuado
mucho antes de iniciar los programas de conservación de la especie.
3.3.- Aplicación de técnicas moleculares
Para conseguir una efectiva gestión de conservación de poblaciones, es necesaria la
información sobre la diversidad genética de la población. Con esta información se puede
definir una apropiada escala geográfica para la gestión, identificar el origen de los
individuos (determinar el papel de la migración) y comprobar los efectos de la gestión en
la práctica. En estas investigaciones, los marcadores de ADN, pueden contribuir
considerablemente (Gresshoff, 1997). Hay dos tipos fundamentales de marcadores de
ADN: Los marcadores del ADN mitocondrial y los marcadores del ADN nuclear. Algunos
marcadores nucleares como los microsatélites (regiones no codificantes altamente
repetidas), presentan una tasa de evolución superior a la de ciertos marcadores
mitocondriales, por tanto, los marcadores nucleares se utilizan para identificar variaciones
genéticas fijadas recientemente.
Para establecer la posición filogenética de las poblaciones de Hyla meridionalis del
País Vasco dentro del conjunto de la especie, se ha utilizado un marcador molecular de
evolución relativamente lenta, pero lo suficientemente rápida como para identificar el
origen de las poblaciones. El gen seleccionado ha sido el codificante de la citocromo
oxidasa 1 (COI) mitocondrial.
El ADN mitocondrial (fig.2) es una poderosa herramienta (Wilson et al. 1985;
Avise et al. 1987; Moritz et al. 1987; Harrison 1989) debido a que posee una serie de
características que lo hacen idóneo para trabajos de variabilidad específica y poblacional:
a) El ADN mitocondrial es una molécula circular con 15 y 20 kilobases (kb). Está
compuesto por 37 genes que codifican para 22tRNAs, 2rRNAs, 13mRNAs, para
proteínas de la cadena de transporte electrónico y fosforilación oxidativa. El ADN
mitocondrial no recombina, se hereda como una sola unidad. Desde la perspectiva
funcional el ADN mitocondrial está compuesto por 37 genes, pero desde el punto de
vista filogenético se hereda como una única molécula, lo cual representa una unidad
genealógica no recombinante con múltiples alelos y por tanto resulta muy útil para
estudios filogenéticos intra e interespecíficos. Las diferencias que se encuentren
entre individuos se deberán exclusivamente a fenómenos de mutación y no de
recombinación (Avise, 1994).
b) Herencia maternal y haploide. En comparación con la herencia diploide biparental
el número efectivo de genes mitocondriales será cuatro veces menor. Este efecto
incrementará la deriva genética (Birky et. al.,1989), aumentando la posibilidad de
fijación de alelos a nivel intrapoblacional, lo que hará que haya más variabilidad
interpoblacional. El ADN mitocondrial actuaría como una “marca” para
caracterizar linajes o pedigrees.
c) Tiene una tasa de sustitución nucleotídica muy alta comparada con genes nucleares
de copia única. Esto posibilita la utilización del ADN mitocondrial como marcador
filogenético en estudios microevolutivos (Avise, 2000), ya que permite observar
cambios nucleotídicos en tiempo geológico corto. Aunque, hay que tener en cuenta
que dentro del genoma mitocondrial hay diferentes tasas de evolución,
permitiéndonos utilizar diferentes genes según el problema que tengamos que
resolver.
Figura 2. Mapa del ADNmt. El círculo externo muestra los genes que se transcriben de la hebra pesada (H strand) y el círculo interno muestra los genes de la hebra liviana (L strand).
Para la evaluación preliminar de la estructura genética de la población de San
Sebastián también se utilizan marcadores moleculares nucleares de evolución muy rápida:
microsatélites. Los microsatélites son secuencias repetidas en tándem. Esta secuencias son
cortas, constan de 1 a 6 nucleótidos. Los microsatélites son regiones altamente variables
del ADN nuclear que resultan muy eficaces para la evaluación de la estructura genética
intrapoblacional (Avise, 1994).
Debido al avance que se ha producido en los últimos años en las técnicas genéticas,
el ADN mitocondrial y nuclear son moléculas fáciles de aislar y manipular. Uno de los
principales avances tecnológicos y metodológicos para la biología molecular en los últimos
tiempos ha sido el desarrollo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
Polymerase Chain Reaction) cuya utilidad se basa en la amplificación de fragmentos de
ADN tanto mitocondrial como nuclear, utilizados como marcadores moleculares. El
descubrimiento de la técnica de la PCR ha contribuido en gran medida al desarrollo de la
sistemática molecular y a otros importantes campos de la biología (Palumbi, 1996).
La técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) consta de tres etapas (fig.3):
a) Desnaturalización: las dos cadenas de la doble hélice se separan mediante
calor.
b) Hibridación: los cebadores se unen a las zonas específicas de las cadenas.
c) Extensión: el enzima Taq polimerasa (obtenido de bacterias termales) se
une a los cebadores y empieza a crear una nueva cadena de ADN mediante
los dinucleótidos (dNTP).
Los cebadores empleados para iniciar la PCR son secuencias cortas (cerca de 20-30
nucleótidos) y presentan una gran similitud con la secuencia a amplificar (especialmente en
la parte 3').
5’
3’5’
3’
5’ 3’
3’3’5’
5’
5’
3’5’
3’
5’ 3’
3’ 5’
PCR : Polymerase Chain Reaction
30 - 40 ciclos de 3 pasos:
Paso1: Desnaturalizaci�n
1 minuto 94 ¡C
Paso 2 : Hibridaci�n
45 segundos 54 ¡C
Paso 3 : Extensi�n
2 minutos 72 ¡C
cebadores
s�lo dNTP’s
Figura 3. Esquema de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Mediante técnicas de electroforesis, los fragmentos de ADN amplificados se colocan
en un gel compuesto de agarosa, acrilamida o de otro tipo, y aplicando una corriente
eléctrica los fragmentos se diferencian por su peso molecular. Al gel se le añade un
marcador para poder comprobar que el ADN amplificado es el esperado (fig.4).
Figura 4. Fotografía de un gel de agarosa con ADN amplificado de 6 individuos y 2 blancos (para comprobar que no ha habido contaminación) y el marcador (en el margen izquierdo).
Marcador 1 2 3 Blanco1
Marcador 4 5 Blanco2 6
Las muestras de ADN se secuencian en secuenciadores automáticos (fig.5) y
posteriormente se alinean y analizan mediante programas informáticos: Sequencher,
Sequence Navigator, PAUP, MacClade, Nested Clade...
Figura 5. Secuencia de ADN de un individuo de Hyla meridionalis secuenciado y posteriormente
alineado mediante el programa Sequencher.
Mediante estos programas informáticos, se obtienen árboles filogenéticos y datos
estadísticos fiables para el estudio de la especie. En las últimas décadas, la secuenciación
de ADN se ha convertido en el método más utilizado en la reconstrucción filogenética
(Miyamoto and Cracaft, 1991). Y a su vez una adecuada interpretación de los árboles
filogenéticos permite conocer las relaciones entre las poblaciones analizadas.
4.- FILOGEOGRAFÍA EN EL ÁMBITO EUROPEO Y SINGULARIDAD DE LA POBLACIÓN DE DONOSTIA
4.1.- Introducción
Las poblaciones europeas de Hyla meridionalis se distribuyen en dos núcleos
disjuntos. Un núcleo situado en la región septentrional ibérica con poblaciones en Cataluña
que se extiende por el suroeste y sur de Francia hasta el noreste de Italia; y otro grupo
acantonado en el suroeste ibérico con poblaciones en Portugal, Andalucía, Castilla-La
Mancha, Castilla-León y Madrid. Además de estos núcleos existe una población
introducida en la isla de Menorca y la población aislada de Donostia objeto de este estudio.
El análisis filogeográfico en este nivel permite determinar si la población europea de
la especie corresponde a dos entidades diferenciadas (suroeste frente a noreste) o si
realmente es todo parte de una única población. Además, y refiriéndose al caso concreto de
Donostia, permitirá averiguar si dicha población constituye un grupo diferenciado o si su
aislamiento es reciente y forma en realidad parte de alguno de los otros dos grupos.
Además la utilización de un gen mitocondrial de evolución relativamente rápida permitirá
establecer los posibles tiempos de aislameinto entre las unidades.
4.2.- Material y método
4.2.1.- Recogida muestras
Se han analizado 89 individuos de Hyla meridionalis muestreados en 21
localidades (Tabla 1). La toma de tejidos se realizó sin sacrificio de los ejemplares. La
localización de los ejemplares en el campo se realizó, bien mediante escuchas y muestreos
nocturnos, bien mediante la búsqueda de larvas en las charcas de reproducción. Los
muestreos se realizaron en la mayor parte de la distribución ibérica de la especie, aunque
en numerosas ocasiones fue necesario repetir las visitas debido, por una parte, a la
reducción y desaparición de poblaciones de la especie en muchos puntos de su distribución
y, por otra, a las condiciones metereológicas cambiantes que trastocan los ciclos
reproductivos de la especie.
El ADN fue extraído de tejido muscular procedente de metamórficos, dedos de
individuos adultos o trozos de cola de larvas y almacenados en etanol al 80-95%. Además
se utilizaron muestras de tejido muscular y estómago previamente congeladas a -80ºC,
procedentes de las colecciones de tejidos del Museo Nacional de Ciencias Naturales
(CSIC) y del Museum of Vertebrate Zoology de la University of California at Berkeley
(EEUU).
Tabla1. Localidades de las muestras analizadas de Hyla meridionalis. Muestras Localidades
01 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 02 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 03 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 04 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 05 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 06 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 07 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 08 FRANCIA: Biaritz: Lago Mouriscaut 07 FRANCIA: Tarnos: Lago Le Metro 08 FRANCIA: Tarnos: Lago Le Metro 09 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 10 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 11 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 12 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 13 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 14 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 15 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 16 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 17 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 18 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 19 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 20 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 21 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 22 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 23 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 24 GIPUZKOA: Donostia: Piscinas de Berio 25 BARCELONA:Rubí 26 BARCELONA:Garraf 27 GIRONA: Santa Coloma de Farnés (Comarca de la Selva) 28 FUERTEVENTURA: Vega del Río Palmas: Emb.Las Peñitas 29 FUERTEVENTURA: Vega del Río Palmas: Emb.Las Peñitas 30 TENERIFE: Puerto de la Cruz 31 TENERIFE: 32 TENERIFE: 33 TENERIFE: 34 TENERIFE: 35 BADAJOZ: Alconchel (N 38º31´02.9´´/W 7º04´00.1´´) 36 BADAJOZ: Pallares (4km S) 37 BADAJOZ: Pallares (4km S) 38 BADAJOZ: Pallares (4km S) 39 BADAJOZ: Pallares (4km S) 40 CACERES: Logrosán 41 CACERES: Cañamero (4km SW) 42 CACERES: Cañamero (4km SW)
43 CACERES: Garrovillas 44 CACERES: Garrovillas 45 CACERES: Garrovillas 46 CIUDAD REAL: Valdoro: Río Montoro 47 CIUDAD REAL: Chillón 48 HUELVA:Calañas 49 HUELVA:Calañas 50 HUELVA:Calañas 51 HUELVA:Calañas 52 HUELVA:Calañas 53 HUELVA:Calañas 54 JAEN: Aldeaquemada 55 TOLEDO: Real de San Vicente 56 PORTUGAL: Monteclaro 57 CÁDIZ: Facinas 58 CÁDIZ: Facinas 59 CÁDIZ: Facinas 60 CÁDIZ: Facinas 61 CÁDIZ: Facinas 62 CÁDIZ: Facinas 63 CÁDIZ: Tarifa 64 SEVILLA: Doñana 65 SEVILLA: Doñana 66 SEVILLA: Doñana 67 SEVILLA: Doñana 68 SEVILLA: Villanueva del Río 69 SEVILLA: Villanueva del Río 70 ÁVILA :Candeleda 71 ÁVILA :Candeleda 72 ÁVILA: Valle del Tíetar 73 ÁVILA: Valle del Tíetar 74 ÁVILA: Valle del Tíetar 75 CÓRDOBA: Carretera Villaviciosa 76 CÓRDOBA: Carretera Villaviciosa 77 CÓRDOBA: Cercanías Córdoba capital 78 CÓRDOBA: Cercanías Córdoba capital 79 MARRUECOS: Ksar-el-Kivir 80 MARRUECOS: Ksar-el-Kivir 81 MARRUECOS: Ksar-el-Kivir 82 MARRUECOS:Oukaimeden 83 MARRUECOS:Oukaimeden 84 MARRUECOS:Tingis Campground, E of Tanger 85 MARRUECOS:Tingis Campground, E of Tanger 86 MARRUECOS:7,2Km S Chefchaouene 87 MARRUECOS:7,2Km S Chefchaouene 88 MARRUECOS:14.7Km S Asilah 89 MARRUECOS:14.7Km S Asilah
4.2.2.- Extracción de ADN
La extracción de ADN de los tejidos se realizó con el kit Qiagen DNeasy Tissue
handbook (Qiagen). Se usaron 20µL de proteinasa K (20mg/ml) por cada muestra a una
temperatura de 55ºC durante unas 8 horas de incubación y posteriormente se utilizaron 4
tipos de tampones: AL (200µL), AW1 (500µL), AW2 (500µL) y AE (200µL) según las
instrucciones del kit.
4.2.3.- Amplificación y secuenciación de ADN
La amplificación de ADN fue realizada mediante la técnica de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR; Polymerase Chain Reaction) amplificando un fragmento de
841 bp del gen mitocondrial citocromo oxidasa 1 mediante el primer P3 F
(5´CAATACCAAACCCCCTTRTTYGTWTGATC-3´) y P3 R (San Mauro et al., 2004).
Las amplificaciones fueron realizadas en un volumen total de 25µl con 2.5µl de
solución tampón, 0,5µl de cada cebador (10mM), 1µl de dNTPs, 0.2µl de la polimerasa
Taq (Biotools), 2µl de ADN procedente de la muestra y agua esterilizada para completar
el volumen total. Los ciclos de PCR empezaron con 5 minutos de desnaturalización a 94ºC,
seguidos de 40 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, continuando con 45
segundos de hibridación a 42ºC y finalmente 45 segundos de elongación a 72ºC. Después
de 40 ciclos se sumaron 7 minutos de elongación a 72ºC. Los productos de PCR fueron
verificados en geles de agarosa al 0.8% mediante electroforesis.
Las muestras fueron secuenciadas mediante un secuenciador capilar modelo ABI
3700, en el Servicio de Secuenciación del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC).
4.2.4.- Análisis filogenético
Para establecer una hipótesis filogenética que refleje las relaciones evolutivas entre
los marcadores analizados se emplearon los siguientes métodos de reconstrucción:
• En primer lugar, se utilizó un método de distancia. Los métodos de
distancia se basan en el reagrupamiento de las poblaciones a partir de sus
distancias genéticas. Para este tipo de análisis se ha utilizado el método del
"Vecino más Próximo" (Neighbor-Joining) (Saitou & Nei, 1987). Para
llevar a cabo este análisis se utilizó el programa PAUP* 4.0b10
("Phylogenetic Analysis Using Parsimony") (Swofford, 2000).
• El segundo método de análisis que se llevó a cabo, fue un análisis
cualitativo, que se incluye dentro de la búsqueda algorítmica un armazón
filosófico y metodológico (Cladismo) a la vez que un criterio de
optimización (Parsimonia) (Swofford et al.,1996). También se realizó este
tratamiento con el programa PAUP* 4.0b10.
• El tercer método de análisis empleado fue el de ‘Máxima
Verosimilitud’(Maximum Likelihood). Éste es un método probabilístico:
evalúa una hipótesis filogenética en términos de la probabilidad de que un
determinado modelo evolutivo propuesto haya dado lugar o explique los
datos observados (en este caso las secuencias) (Huelsenbeck & Crandall,
1997; Swofford et al., 1996). El modelo empleado describe cómo se han
sustituido las bases en las secuencias observadas.
El método de Máxima Verosimilitud evalúa la probabilidad total de
que el modelo evolutivo propuesto pueda generar las secuencias observadas;
las filogenias que se infieren a partir de este método son las que tienen unos
valores de probabilidad más altos. A la hora de evaluar un árbol generado,
la estimación de la longitud de las ramas es uno de los pasos claves de este
método, considera que es más probable que ocurran más cambios en las
ramas largas que en las cortas. Esta diferencia explica por qué en algunos
casos el método de Máxima Verosimilitud es más eficaz que el de
parsimonia. De nuevo, se empleó el programa PAUP* 4.0b10 para llevar a
cabo este análisis.
4.2.5.- Análisis filogeográfico
La filogeografía es un campo de estudio relativamente reciente (Avise et al., 1987)
que se ocupa de los principios y procesos relacionados con la distribución geográfica de
los linajes, trabajando siempre bajo una perspectiva filogenética y por lo general a un nivel
intraespecífico (Avise, 1998; 2000). La incorporación de las técnicas moleculares a la
sistemática ha sido decisiva para esta disciplina, que en la actualidad se basa casi
exclusivamente en el análisis de la distribución geográfica de marcadores moleculares, por
lo general de haplotipos mitocondriales. El estudio filogeográfico de un grupo pretende
fundamentalmente interpretar de una forma cualitativa y cuantitativa los procesos
demográficos poblacionales que se han ido sucediendo a lo largo de su historia. Para ello
analizamos la distribución geográfica actual de marcadores moleculares, revelando e
interpretando los posibles rastros o huellas evolutivas que dichos procesos han ido dejando
en estos marcadores (Avise, 2000).
El método utilizado, el análisis de “clados encajados” (Nested Clade Análisis o
NCA, Templeton, 1995), se define como un método “cladístico” ya que reconstruye las
relaciones entre los haplotipos a partir de las diferencias en los estados de sus caracteres y
utilizando la parsimonia como método de optimación.
En un primer paso, se establecen en primer lugar las relaciones genealógicas entre
todas las secuencias de ADN. Para ello, se genera una red de haplotipos con el programa
TCS 1.13 (Clement et al., 2000). El programa calcula y dibuja la red, conectando
sucesivamente los haplotipos que difieren en una base. Una vez establecida la red de
haplotipos, el segundo paso consiste en realizar el análisis encajado. Empezando por los
extremos de la red, los haplotipos (clados de “0 pasos”) que difieren en una base se
agrupan en los llamados “clados de 1 paso”. Luego los “clados de 1 paso” que difieren en
una mutación se agrupan en “clados de 2 pasos” y así sucesivamente hasta que toda la red
de haplotipos haya sido encajada en algún nivel de análisis. El análisis de Clados
Encajados también fue realizado con el programa TCS 1.13.
4.3.- Resultados
Las secuencias de ADN mitocondrial de las poblaciones europeas estudiadas forman
dos grupos bien diferenciados, aunque con diferencias de escasa magnitud, que
correponden con los dos grupos geográficos de la especie. El núcleo suroccidental que
incluye todas las poblaciones de esa región y el grupo nororiental que incluye a todas las
demás, y en las que se integran las secuencias de los ejemplares de Donostia. La población
del país Vasco es por lo tanto parte del núcleo más próximo geográficamente. El único
haplotipo presente en el núcleo nororiental europeo difiere de los haplotipos del núcleo
suroccidental en un 0.9-1.1%. La divergencia entre los cuatro haplotipos del núcleo
suroccidental es mínima y corresponden a sustituciones en una única base (0.1-02%). Estas
divergencias son mucho menores de lo habitual en especies de anfibios con una
distribución ibérica tan amplia.
En las Figuras 6 y 7 se muestran los resultados de los análisis filogeográficos y
corresponden respectivamente a la red de haplotipos y al análisis de clados encajados. En
la tabla 2 se muestra la distribución de los diferentes haplotipos según poblaciones. La
Figura 8 muestra un mapa con la distribución de los diferentes haplotipos y su
encajamiento para facilitar su visualización.
Los niveles de divergencia entre los grupos son pequeños, y la diferenciación
intragrupal inexistente para el caso septentrional y muy limitada en el sudoccidental, con
sólo unos pocos haplotipos divergentes en una base localizados en el área de Doñana y
Cádiz.
Figura 6.Red de haplotipos con muestras europeas generada con el programa TCS 1.13.
Figura 7. Análisis de Clados Encajados (Nested Clade Analysis) con muestras europeas.
Tabla 2. Relación de los individuos de cada población incluidos en cada haplotipo en el análisis de Clados Encajados. Haplotipos como 0 y I incluyen individuos de distintas poblaciones. Los haplotipos V,VI,VII,VIII, IX, X y XI son supuestos haplotipos intermediados.
Haplotipos Localidad
Individuos
0 Donostia 16 Biarritz 8 Francia 2 Barcelona 2 Girona 1
I Ciudad Real
2
Cáceres 6 Sevilla 4 Badajoz 5 Huelva 6 Jaén 1 Toledo 1 Portugal 1 Cadiz 6 Cordoba 4 Ávila 5
II Tarifa 1 III Doñana 1 IV Doñana 1
Figura 8. Mapa con la distribución de los diferentes haplotipos analizados
en las muestras europeas y su encajamiento.
4.4.- Discusión
Los datos obtenidos en este estudio permiten discutir aspectos diversos sobre el
origen y aislamiento de los grupos, y así por ejemplo la escasa divergencia entre grupos
permitiría inferir que el aislamiento entre ambos es muy reciente. Pero a tenor de los
resultados obtenidos en el estudio global, que se discute en el siguiente epígrafe, tanto la
discusión como las interpretaciones hubieran sido totalmente erróneas.
Sin embargo, este estudio sí nos permite discutir los niveles de diferenciación de la
población de Donostia. De acuerdo con los datos obtenidos todos los ejemplares de la
población de San Sebastián estudiados presentan la misma secuencia de ADN mitocondrial
para el gen COI, es decir poseen el mismo haplotipo. Además este haplotipo es
exactamente el mismo que presentan todos los ejemplares franceses y catalanes estudiados.
Por lo tanto, la población del País Vasco es parte del núcleo nororiental de la especie. El
hecho de que todos los ejemplares presenten el mismo haplotipo indica que el aislamiento
actual de las poblaciones es un fenómeno muy reciente (menor de 8000 años si utilizamos
una estima de reloj molecular habitual para COI) y no permite distinguir entre dos posibles
hipótesis:
(1) La población del País Vasco es parte de la población nororiental de Hyla
meridionalis y su aislamiento en Donostia es consecuencia de la extinción
de poblaciones de conexión debido al deterioro ambiental sufrido en los
últimos años
(2) La población del País Vasco es parte de la población nororiental de Hyla
meridionalis y su presencia en Donostia es consecuencia de una
colonización muy reciente desde otras áreas septentrionales.
El hecho de que en el suroeste francés las poblaciones también se encuentren
fragmentadas sugeriría que podría tratarse del punto 1, pero puesto que las poblaciones de
Hyla poseen una estructura típica de metapoblaciones, en las que la tasa de extinción local
es la misma que la de recolonización, no podemos tomar una decisión al respecto. En este
sentido es muy posible que el uso de marcadores más rápidos de tipo nuclear (actualmente
en análisis) no aporte información nueva, ya que en estructuras metapoblacionales de
origen reciente, los fenómenos de colonización-extinción son parte de un proceso continuo
en el que no existe direcionalidad.
En cualquiera de los dos casos, sabemos que bien el aislamiento o la colonización
han ocurrido hace muy poco tiempo y, como se apunta, las implicaciones para
conservación utilizando teoría de metapoblaciones son las mismas.
4.5.- Conclusiones del estudio filogeográfico en Europa
La población de Donostia es parte de la población nororiental de Hyla meridionalis y
por tratarse de una especie que como su congénere Hyla arborea se ajustan a modelos
poblacionales de tipo metapoblación, no es posible identificar si el aislamiento actual es
consecuencia de una extinción de las poblaciones circundantes consecuencia del deterioro
ambiental sufrido en los últimos años o bien producto de un evento de colonización
reciente. Las consecuencias para la conservación de la población pueden reflejarse en dos
vertientes:
(1) El manteniminto de la población de Donostia ha de realizarse siguiendo la
teoría de metapoblaciones y por lo tanto la población tiene que incluir
puntos de reproducción en localizaciones dispersas e idealmente
conectados entre sí. Es necesaria la existencia de un núcleo central con una
población relativamente grande de individuos, ya que las subpoblaciones
periféricas pueden extinguirse por procesos estocásticos sin que ello pueda
prevenirse.
(2) En caso de extinción total de la población no se plantearía ningún
inconveniente para reintroducir la especie, una vez proporcionadas las
condiciones necesarias, a partir de ejemplares de las poblaciones francesas
próximas, o menos convenientemente de otras poblaciones del núcleo
nororiental.
5.- FILOGEOGRAFÍA GLOBAL Y POSICIÓN FILOGENÉTICA
DE LA POBLACIÓN DE DONOSTIA
5.1.- Introducción
La ranita meridional, Hyla meridionalis, tiene una distribución global que abarca
gran parte del noroeste africano, incluidas las Islas Canarias, y la fracción europea
analizada en el capítulo anterior. La población de las Islas Canarias se ha venido
considerando como una introducción efectuada a partir de ejemplares europeos, aunque
este punto nunca ha sido documentado.
En este estudio, tras obtener una amplia representación de muestras de Marruecos y
de las Islas Canarias elaboramos sendos estudios filogeográfico y filogenético que nos
permitieran:
a) Conocer el nivel de diferenciación y grado de aislamiento de los núcleos
europeos y por lo tanto de la población de Donostia, con respecto al resto de
las poblaciones de la especie.
b) Averiguar qué poblaciones comparten un antepasado común más cercano
con los núcleos europeos y estimar tiempos de divergencia. En particular
nuestro interés se centra en determinar ¿cúanto tiempo llevan separados los
núcleos europeos entre sí? y ¿cúal es su origen?
c) Puesto que la ranita meridional (Hyla meridionalis) y la ranita de San
Antonio (Hyla arborea) compiten en algunos lugares a la hora de la
reproducción (produciéndose incluso hibridación), tratamos de evaluar la
posibilidad de que el aislamiento actual de Hyla meridionalis en el País
Vasco fuera producto de la competencia directa con Hyla arborea. Para ello
es necesario conocer los patrones temporales y geográficos de dispersión de
la ranita meridional.
Como ya indicamos en el epígrafe anterior los resultados de este estudio son muy
diferentes de lo que esperábamos y tienen un gran interés desde diversos enfoques, no sólo
evolutivos, sino también en el ámbito de la genética de la conservación.
5.2.- Material y método
El material y métodos utilizados son los mismos que se han mencionado para abordar
la filogeografía en el ámbito europeo completándolo con muestras procedentes de las islas
Canarias y la zona noroeste de África.
5.3.- Resultados
Los 89 ejemplares estudiados presentan un total de 10 haplotipos diferentes, un
número muy bajo comparado con lo que suelen presentar otras especies de anfibios en
muestreos de la amplitud geográfica para este gen mitocondrial. La divergencia máxima
entre haplotipos es del 1.2%, una divergencia extraordinariamente baja cuando se compara
con otras poblaciones de otras especies de anfibios. El único haplotipo presente en el
núcleo nororiental europeo difiere de los haplotipos del núcleo suroccidental en un 0.9-
1.1%. La divergencia entre los cuatro haplotipos del núcleo suroccidental es mínima y
corresponden a susbtituciones en una única base (0.1-0.2%). A su vez el haplotipo
nororiental está también presente en Canarias y Marruecos. En este clado se incluyen
además otros haplotipos marroquíes también poco divergentes, pero que como se ve en el
árbol filogenético de la figura 9 ocupan una posición basal. La divergencia entre estos
haplotipos de Marruecos oscila entre el 0.1 y 0.2 %, es decir también corresponden a
niveles bajos de diferenciación.
En cuanto al clado suroccidental incluye a un haplotipo marroquí poco diferenciado,
es decir, existen haplotipos distribuidos en los dos clados (ramas principales del árbol).
La diversidad de haplotipos de las poblaciones africanas supera con mucho a la de
las europeas. Una misma población de Marruecos presenta individuos tan diferentes
genéticamente entre sí, como los individuos de cada uno de los dos grupos europeos. Este
dato es extraordinariamente llamativo, ya que la superficie geográfica ocupada por la
especie en Europa es prácticamente igual a la ocupada en África y sin embargo las
diferencias en diversidad son marcadísismas.
Un segundo aspecto fundamental es que en Marruecos existen ejemplares que
presentan exactamente el mismo haplotipo que el que se encuentra en núcleo nororiental
europeo y prácticamente idénticos a los del núcleo suroccidental. Es decir que a nivel
mitocondrial las poblaciones europeas no difieren cualitativamente de las africanas. O
dicho de otra forma, no hay evidencia de aislamiento entre las poblaciones africanas y las
europeas.
Finalmente las dos poblaciones canarias estudiadas tienen el mismo haplotipo
mitocondrial que los ejemplares del núcleo nororiental europeo.
En las Figuras 10 y 11 se muestran los resultados de los análisis filogeográficos y
corresponden respectivamente a la red de haplotipos y al análisis de clados encajados.
Únicamente se incluye la representación de un árbol ya que los diferentes métodos
coindiden en la topología general. Sin embargo, existen pequeñas diferencias entre
métodos, así mientras los métodos del vecino más próximo y máxima verosimilitud poseen
una mejor definición en las ramas terminales, el método de máxima parsimonía no resuelve
estos nodos y se limita a definir los dos clados principales (en el árbol de consenso
estricto). El método de máxima parsimonia produce 4 árboles igualmente parsimoniosos,
con una longitud de 15 pasos, con un alto índice de consistencia (0.93). Para éste ánalisis
únicamente resultaron informativos 8 caracteres, ya que los otros 6 de tipo variable no eran
informativos. El árbol de máxima verosimilitud también presentaba nodos sin resolver, una
clara indicación de que en los datos se incluían haplotipos ancestrales cuya resolución no
es posible con métodos filogenéticos para los que por lo tanto habría que recurrir a los
análisis filogeográficos. El árbol de máxima verosimilitud posee un valor de -Ln=1224.7.
De nuevo es necesario destacar que el número total de posiciones variables es muy bajo
(tan sólo 14) y que por lo tanto no es esperable mayor resolución.
En cuanto al análisis filogeográfico, la red de haplotipos muestra claramente dos
grupos separados por una serie de haplotipos ficticios (que posiblemente existieron, pero
que ya no se encuentran en la muestra) y que es indicativo de un cierto aislamiento
temporal (que si existieron fue suficiente para concluir con su extinción). Dentro de cada
uno de los dos grupos se aprecia la existencia de un haplotipo ancestral, al que
corresponden la mayoría de las muestras estudiadas y del que divergen los haplotipos
restantes. La existencia de estos haplotipos muy poco divergentes en Marruecos (para el
clado nororiental) y en el sur de la Península y Marruecos (para el sudoccidental) indica
que la diversificación dentro de cada clado es muy reciente. En la tabla 3 se muestra la
distribución de los diferentes haplotipos según poblaciones.
Una vez obtenida la red de haplotipos se procede a su encajamiento en diversos
clados jerarquizados. De nuevo se obtienen dos clados de mayor nivel correspondientes
uno al grupo nororiental europeo con Canarias y Marruecos y el otro al grupo suroccidental
europeo también con Marruecos. La Figura 12 muestra un mapa con la distribución de la
especie en la que se han delineado los diferentes haplotipos y su encajamiento para facilitar
su visualización.
Figura 9. Árbol filogenético de la especie Hyla meridionalis.
Figura 10. Red de haplotipos generada con el programa TCS 1.13 con muestras de
la distribución global de la especie. .
Figura 11. Análisis de Clados Encajados (Nested Clade Analysis) con muestras de
la distribución global de la especie.
Tabla 3. Relación de los individuos de cada población incluidos en cada haplotipo en el análisis de Clados Encajados. Haplotipos como 0 y I incluyen individuos de distintas poblaciones. Los haplotipos X, XI, XII, XIII, XIV y XV son supuestos haplotipos intermedios.
Haplotipos Localidad Individuos0 Donostia 16
Biarritz 8 Francia 2 Barcelona 2 Girona 1
I Ciudad Real
2
Cáceres 6 Sevilla 4 Badajoz 5 Huelva 6 Jaén 1 Toledo 1 Portugal 1 Cadiz 6 Cordoba 4 Ávila 5
II Tarifa 1 III Doñana 1 IV Doñana 1 V Marruecos 1 VI Marruecos 1 VII Marruecos 1 VIII Marruecos 1 IX Marruecos 1
Figura 12. Mapa con la distribución de la especie en la que se han delineado los
diferentes haplotipos y su encajamiento
5.4.- Discusión
Los análisis filogeográficos y filogenéticos coinciden totalmente al incluir dentro de
la población africana a los dos núcleos poblacionales europeos. Este hecho junto con los
bajísimos niveles de variabilidad mitocondrial de las poblaciones europeas, que como en el
caso del núcleo nororiental presentan en todo su ámbito geográfico un único haplotipo,
sólo puede ser explicado con una hipótesis: el conjuto de las poblaciones europeas de Hyla
meridionalis son producto de colonizaciones recientes desde el norte de África.
Puesto que los dos núcleos europeos no comparten haplotipos entre sí y además se
encuentran en distintas poblaciones africanas es altamente probable que la colonización de
Europa se haya producido en dos oleadas diferentes, ambas muy recientes, coetáneas o
posteriores al último máximo glaciar (8.000 años). La colonización tuvo que realizarse a
partir de un número muy limitado de ejemplares dada la homogeneidad haplotípica actual
y el escaso número de generaciones transcurridos desde la misma.
En el estudio anterior pretendíamos establecer tiempos de aislamiento y divergencia
entre los dos núcleos europeos, ya que se asumía que los núcleos, disjuntos en la
actualidad, habían estado presumiblemente unidos con anterioridad y su aislamiento sería
consecuencia de procesos externos a la especie en sí. Con los datos de este nuevo estudio
sabemos que estos dos núcleos nunca han estado en contacto ya que proceden de
colonizaciones independientes y por lo tanto era un ejercicio erróneo y fútil tratar de
calcular cuánto tiempo llevaban separados, puesto que nunca habían estado juntos.
En cuanto al poblamiento de Canarias, existen dos posibilidades, bien una
colonización directa desde el norte de África o bien desde el núcleo nororiental europeo.
Nosotros nos inclinamos por la segunda hipótesis pero es destacable que de ser así la
colonización tuvo que producirse bien desde San Sebastián o algún puerto del suroeste
francés, o bien desde las costas mediterráneas de Cataluña o del Sur de Francia. Una
situación relativamente complicada teniendo en cuenta que el grueso del tráfico marítimo
antiguo entre Canarias y la península se realizó desde Sevilla y Lisboa, puntos ambos con
presencia de Hyla meridionalis, correspondiente a un núcleo mitocondrial diferente al
presente actualmente en Canarias. Quizá el hecho de la presencia habitual de marineros
Vascos en las diferentes expediciones marítimas realizadas en la época podría explicar la
posible colonización de las Canarias desde nuestras costas.
5.5- Conclusiones
El origen de la población de Donostia, como el resto de las europeas, es por tanto
africano, y su llegada a Europa relativamente reciente. Esta situación apoya la discusión
del estudio anterior. Y por lo tanto carece de relevancia plantearse si la situación actual es
consecuencia de extinciones muy recientes o colonizaciones muy recientes. En ambos
casos el conjunto de la población ibérica es muy reciente y tanto si el aislamiento de la
población es consecuencia de extinciones o colonizaciones se trata de un proceso tan
reciente que a nivel de análisis es prácticamente indistinguible y que por lo tanto ha de
tratarse desde un punto de vista metapoblacional.
En un marco teórico este estudio pone de manifiesto que las relaciones entre las
faunas de Europa Occidental y el Norte de África han sido mucho más estrechas de lo que
se suele suponer, y puesto que la colonización parece haberse efectuado con un número
muy bajo de efectivos en dos momentos diferentes, no cabe excluir la posibilidad de que
poblaciones humanas pretéritas hayan sido las responsables de las introducciones.
Desde el punto de vista de la genética de la conservación nos encontramos ante una
situación extrema, que puede constituir un modelo de estudio fundamental a la hora de
evaluar la importancia del mantenimeinto de los niveles de variabilidad genética
poblacional en especies amenazadas. Ya que en este caso la expansión es producto de una
variabilidad genética inicial muy limitada.
Por otra parte las teorías sobre competencia entre Hyla arborea e Hyla meridionalis
han de revisarse en este nuevo marco conceptual, ya que desde un punto de vista
geográfico Hyla meridionalis es una especie invasora que está ocupando el territorio de
Hyla arborea. Lo mismo ha de plantearse con respecto a los estudios de selección sexual
entre ambas especies, ya que obviamente la evolución de los cantos se produjo en alopatría
total (H. arborea en Europa, H. meridionalis en África) y por lo tanto no pudo influir el
canto de una de ellas en la evolución del de la otra. Esta nueva hipótesis permite por tanto
rechazar la de que la selección sexual vía canto haya jugado absolutamente ningún papel
en la especiación y evolución de estas dos especies de Hyla.
6.- IMPLICACIONES PARA LA CONSERVACIÓN
6.1.- Análisis de la estructura genética de la población
A efectos de conservación local el análisis de la estructura genética de la población
de Donostia resulta irrelevante, ya que tenga el origen que tenga la variabilidad genética
intrapoblacional será en cualquier caso bajísima y por lo tanto los costes de ejecución de
microsatélites para un análisis poblacional detallado no son justificables. Pero, sí es
justificable desde un punto de vista de conservación en general, testar la hipótesis de que
las poblaciones de anfibios pueden mantenerse viables con niveles bajísimos de
variabilidad genética, incluso aunque las poblaciones puedan considerarse totalmente
depauperadas. Y este caso representa una magnífica oportunidad para realizar este tipo de
estudio que sería aplicable a muchas poblaciones de otras especies de anfibios.
En este sentido, ya hemos confirmado la posibilidad de utilización de algunos
microsatélites, desarrollados originalmente para Hyla arborea, en la población donostiarra.
Nuestro objetivo es efectuar comparaciones de los niveles de variabilidad (en particular
número de alelos y frecuencia de los mismos) entre las poblaciones de Donostia, País
Vasco francés y Marruecos. De estos resultados no contemplados inicialmente se dará
cuenta a su finalización en el correspondiente informe.
6.2- Implicaciones de los resultados para la conservación de la población de Donostia
Como ya hemos indicado el origen de la población de Donostia, como el resto de las
europeas, es por tanto africano, y su llegada a europa relativamente reciente y por lo tanto
ha de tratarse desde un punto de vista metapoblacional.
Por lo tanto nuestras conclusiones son:
El mantenimiento de la población de Donostia ha de realizarse siguiendo la teoría
de metapoblaciones y por lo tanto la población tiene que incluir puntos de
reproducción en localizaciones dispersas e idealmente conectados entre sí. Es
necesaria la existencia de un núcleo central con una población relativamente grande
de individuos, ya que las subpoblaciones periféricas pueden extinguirse por
procesos estocásticos sin que ello pueda prevenirse. Es necesario por lo tanto hacer
un seguimiento continuado de las mismas.
En caso de extinción de la población no se plantearía ningún inconveniente para
reintroducir la especie, una vez proporcionadas las condiciones necesarias, a partir
de ejemplares de las poblaciones francesas próximas, o menos convenientemente
de otras poblaciones del núcleo nororiental.
No es necesario hacer un seguimiento de la estructura genética de la población a
través del tiempo, ya que los valores actuales son lo suficientemente bajos como
para que pueda preocupar una posible reducción, a no ser que los resultados de los
análisis de los microsatélites proporcionen resultados inesperados.
Se remarca la necesidad de la conservación de la población de Gipuzkoa dado su
interés desde el punto de vista filogeográfico, ya que es el último reducto de lo que
parece ha constituido el límite suroccidental del núcleo nororiental de la especie
durante milenios.
LABURPENA
Hego Euskal Herria eta Iberiar Penintsulako isurialde atlantiko osoan, hegoaldeko
zuhaitz-igelaren (Hyla meridionalis) espeziearen populazio bakarra Donostian ezagutzen
da. 1999. urtean, Gipuzkoako Foru Aldundiak, espeziearen mehatsu arrisku handiaren
aurrean, hegoaldeko zuhaitz-igelaren Kudeaketa Plana abian jarri zuen.
Ikerketa honen helburua, populazioaren gaur egungo isolamendu egoera azaltzen
duten honako 3 hipotesi hauetatik zein den aplikagarria zehaztea izan da: 1) Populazioaren
isolamendua, eskualde hispaniar-frantsez osoan duela gutxi eta etengabe gertatu da. Egoera
honetan, ezagunak diren gertueneko populazioen ezaugarri genetiko antzekoak aurkeztuko
dituzte. 2) Iraganeko aldaketa klimatologikoek eragindako aintzinako isolamendu baten
ondorio dira. Gertueneko populazioekiko aldaketa genetiko handiak aurkeztuko lituzkete.
3) Geografikoki urrun edo gertu dauden populazioetatik, istripuz edo nahita burututako
sarrerak dira. Genetikoki, populazioan sartutako aleak jatorrizko populazioen antzekoak
edo berdinak izango dira (sarrera duela gutxi gertatu dela kontuan hartuta).
Hiru hipotesietatik zein den egokiena zehazteko, markatzaile molekularrak erabiliz,
Euskal Herriko Hyla meridionalis populazioak espezieko beste populazioekin alderatuz
lortu duen desberdintasun genetiko maila aztertu da. Ikerketan, markatzaile funtzioan
DNA mitokondriala (zitokromo oxidasa 1 genea) erabili da.
Espeziearen banaketa orokorra adierazten duen 21 herritik jasotako 89 ale aztertu
dira: Iberiar Penintsulako iparekialdeko (Donostiko populazioa gune honetan aurkitzen da)
eta hegomendebaldeko guneak, Frantzia hegoaldea, ipar Afrika eta Kanariar irlak.
Emaitz filogenetiko eta filogeografikoek, Donostiako eta europako populazioak
ipar Afrikako kolonizaziotik etorri direla adierazten dute. Europako bi guneek (iberiar
penintsulako iparekialdea eta Frantzia hegoaldea alde batetik eta iberiar penintsulako
hegomendebaldea bestetik) haplotipo desberdinak dituzte baina haplotipo desberdin horiek
afrikako populazio desberdinetan agertzen dira. Litekeena da, azken muturreko Izotz-
aroan edo ondoren (8000 urte) ipar Afrikatik bi kolonizazio indepententeen ondorio izatea.
Europako bi guneak ez dira inoiz elkarrekin egon, beraz, Donostiako hegoaldeko zuhaitz-
igelaren (Hyla meridionalis) populazioak Europako iparekialdeko hego muturrean 8000
urte iraun ahal izan ditu.
Laburbilduz, espeziearen kolonizazioetatik iragandako denbora kontuan hartuta,
Hego Euskal Herriko populazioa autoktonoa eta balio historiko-ekologiko handikoa da.
Populazioa babestu eta kudeatu egin behar da, Populazioaren etorkizuneko
bideragarritasuna ziurtatuko badugu.
RESUMEN
La población de ranita meridional (Hyla meridionalis) de San Sebastián es la única
conocida de la especie en el País Vasco y en toda la vertiente atlántica de la Península
Ibérica. Ante la grave situación de amenaza de la población, en 1999 la Diputación Foral
de Gipuzkoa puso en marcha el Plan de Gestión para la especie.
El objetivo de este estudio ha sido determinar cual de estas 3 hipótesis es aplicable
para el aislamiento actual de esta población: 1) El aislamiento de la población ha sido
reciente y progresiva en toda la región atlántica hispano-francesa, en cuyo caso se espera
que sean genéticamente similares a las poblaciones más cercanas conocidas. 2) Ha
ocurrido mediante un aislamiento antiguo, consecuencia de cambios climatológicos
pretéritos, en cuyo caso se encontraría una diferenciación genética elevada con respecto a
las poblaciones cercanas 3) Mediante la introducción accidental o deliberada, desde
poblaciones en mayor o menor medida alejadas geográficamente, en este caso, las
poblaciones serían muy similares o idénticas a las existentes en las zonas de procedencia
de los ejemplares introducidos ( contando con que la introducción fuese reciente).
Para determinar cual de estas hipótesis es aplicable a las poblaciones de Hyla
meridionalis del País Vasco se ha estudiado el grado de diferenciación genético alcanzado
entre esta población y el resto de las poblaciones de la especie mediante la utilización de
marcadores moleculares. Se ha utilizado un marcador de ADN mitocondrial (el gen
citocromo oxidasa 1).
Se han analizado 89 individuos procedentes de 21 localidades en las que se incluye
la zona nororiental (con la población de San Sebastián) y el cuadrante suroccidental de la
Península Ibérica, sur de Francia, norte de Africa e islas Canarias, representando así gran
parte de la distribución global de la especie.
Los resultados filogenéticos y filogeográficos demuestran que la población de
Donostia-San Sebastián, como el resto de las europeas, provienen de colonizaciones
producidas desde el norte de África. Los dos núcleos europeos no comparten haplotipos
entre sí y estos haplotipos se encuentran en distintas poblaciones africanas. Es muy
probable que se hayan producido dos colonizaciones independientes relativamente
recientes desde el norte de África, coetaneas o posteriores al último máximo glaciar (8000
años). Los dos núcleos europeos (zona nororiental y suroccidental) nunca han estado en
contacto, por lo que la población relicta de San Sebastián habría podido subsistir 8000 años
y ha representado la zona extrema sur del núcleo nororiental europeo.
En conclusión, la población de Hyla meridionalis del País Vasco es una población
autóctona con gran valor histórico y ecológico que debe ser gestionada y conservada para
asegurar su futura viabilidad.
Eskeronak:
Eusko Jaurlaritzari proiektu hau aurrera ateratzeko eman duen dirulaguntzagatik,
Aranzadi Zientzia Elkarteari beka hau eskeini duelako. Museo Nacional de Ciencias
Naturales-eko kide eta laguntzaile izan diren David Buckley, Marina Alcobendas, Eva
Maria Albert eta Iñigo Martinez-Solano. Berkeley-ko (EEUU) Museum of Vertebrate
Zoology de la University of California laginak eskeintzeagatik. Jon Etxezarreta urteetako
lana eta laginak hartzen lagundu duelako, Jaen Claude Vignes, Alberto Gosa eskeinitako
aholku eta Iparraldeko zein Landeetako laginak hartzen laguntzeagatik eta Xabier Rubio
proiektua aurrera atera duelako .
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apartado en O.F. de 10-11-99 por la que se aprueba el Plan de Gestión de la Ranita
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