Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica

Laboratorio Inmunologa General Cervantes Mendoza Antonio ArtemioRamrez Rodrguez AbrahamSchmolka Cmara AnaGrupo: 1 Equipo: 9

PRCTICA 9: Anlisis de inmunoabsorcin enzimtica (ELISA).INTRODUCCINLa tcnica inmunoenzimtica ELISA (Enzyme-Llinked Immunosorbent Assay) forma parte de aquellas reacciones serolgicas que utilizan conjugados para poder visualizar la reaccin antgeno-anticuerpo. El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.En la actualidad el ELISA es uno de los mtodos ms utilizados para el diagnstico serolgico de distintas enfermedades infecciosas, y es la tcnica ms recomendada para el estudio de poblaciones. Se han adaptado diferentes tipos de ELISA tanto para la deteccin de antgenos como de anticuerpos. Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin:

Anticuerpos marcados:

ELISA Directo

ELISA Indirecto

ELISA sndwich:

- Doble (DAS)

- Heterlogo (HADAS)

Antgeno marcado

ELISA competitivo

ELISA Indirecto.Consiste en la adsorcin pasiva de un Ag sobre la placa y luego la adicin del suero donde se buscan los Acs especficos, posteriormente aadir un segundo Ac anti-IgG que lleva conjugada la enzima.Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.

Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

[[[][]OBJETIVO Identificar el tipo de anticuerpo presente en el suero problema obtenido previamente del conejo inmunizado.MATERIAL Y EQUIPOMaterial:

Gradilla

7 tubos de ensaye 12 75 Micropipetas de 100 y 1000 LPuntas para micropipetas de 100 y 1000 LPlaca de ELISAEquipo:

Espectrofotmetro Reactivos:

Suero problema Bloqueador (leche entera)Agua tween 20 0.01% Sustrato ortofenilendiamina (ODP)Enzima peroxidasa

PROCEDIMIENTO1.- Fijar los antgenos especficos (humano-5, caballo-6, bovino-7) en los pozos de la placa de ELISA.

2.- Realizar diluciones del suero rpoblema (1:10 tubo A, 1:20 tubo B, 1:40 tubo C, 1:80 tubo D, 1:60 tubo E, 1:320 tubo F, 1:640 tubo G): Primera dilucin (tubo A) 70 L de suero ms 630 L de bloqueo.

En tubo B poner 350 L de tubo A ms 350 de bloqueo.

En tubo C poner 350 L de tubo B ms 350 de bloqueo. Y as sucesivamente hasta tubo G.4.- Etiquetar placa de acuerdo al antgeno adherido (antgeno de humano, antgeno de caballo y de bovino) y al tubo de dilucin.

6.- Agregar a cada pozo 100 L de bloqueador y esperar 45 minutos.7.- Lavar con agua Tween 3 veces.

5.- Llenar pozos con 100 L de cada dilucin (A, B, C, D, F, G). Al pozo H solo se agrega bloqueador e incubar 30 minutos.10.- Lavar 3 veces con agua Tween.11.- Agregar anticuerpo secundario e incubar 30 minutos.12.- Lavar 3 veces con agua Tween.13.- Agregar sustrato (OPD) ms cido sulfrico e incubar 10 minutos.14.- Determinar absorbancia. RESULTADOSTabla 1. Absorbancias SUERO HUMANOSUERO CABALLO SUERO BOVINO

DILUCIONES 567

A0.1230.1930.097

B0.1010.1710.075

C0.0580.1240.046

D0.0090.0860.026

E0.0180.0840.052

F0.0450.0670.046

G0.0620.0750.049

H (bloqueo)0.0460.0780.047

En las diluciones A, B C, D y E se obtuvieron valores de absorbancia mayores que el control (pozo H), pues el color es ms intenso debido a que se lograron fijar los complejos con la enzima, la cual pudo reaccionar con el sustrato. Por otro lado se observaron absorbancias menores al control en los pozos F y G pues aqu la cantidad de anticuerpo al ser menor, no logr adherirse al antgeno del pozo, y al no agregarse el anticuerpo tampoco la enzima, por lo que no reaccion con el sustrato.

CONCLUSIONESSe logr confirmar lo que en teora se saba del suero obtenido a partir de nuestro conejo inmunizado, al cual se le administr suero de caballo generando as anticuerpos anti-caballo. En la columna nmero 6, donde se fij el antgeno especfico para el anticuerpo anti-caballo se observ un color ms intenso respecto a las columnas donde contenan el antgeno especfico para anticuerpos anti- humano y anti-bovino. Por lo tanto, el suero contiene en mayor proporcin anticuerpos anti-caballo.

El anlisis revela que el suero obtenido tiene anticuerpos anti-caballo, ya que en el pozo 6, el cual contiene antgenos especficos para el anticuerpo anteriormente mencionado, se observ color amarillo, debido a que el complejo anticuerpo secundario (IgG) enzima (peroxidasa) qued adherido al anticuerpo primario (anti-caballo) y este a su vez al antgeno. Al reaccionar el sustrato (ortofenilendiamina) se obtuvo un producto que emite color amarillo.

Bibliografa: Rojas Espinosa Oscar. Inmunologa (de memoria). 2006. 3 edicin. Mxico. Pginas consultadas: 228 230. -Kindt J. T., Goldsby R. A. Osborne B. A. Inmunologa de Kuby. Mc GrawHill, 6 edicin. 2007. Espaa. Pgs. consultadas: 230 245.

-Rodak F.B. Hematologa: fundamentos y aplicaciones clnicas. Mdica Panamericana, 2 edicin. Buenos aires, 2005. Pgs. Consultadas: 155 160, 163 167.

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