analisis de compuestos migrantes-cromatografia

C. Nern de la Puerta

NUEVAS TCNICAS ANALTICAS PARA LA EVALUACIN DE LA MIGRACIN ESPECFICA

IXNuevas tcnicas analticas para la evaluacin de la migracin especficaCristina Nern de la Puerta

RESUMEN El anlisis de migracin especfica de componentes procedentes del envase a los alimentos en contacto es una tarea realmente difcil. Los niveles muy bajos de concentracin (trazas o ultratrazas) en los que se encuentran los migrantes en los alimentos y en los simulantes alimentarios tras los ensayos de migracin, requieren la utilizacin de tcnicas sofisticadas de anlisis y procedimientos laboriosos que permitan la cuantificacin de dichos componentes. La necesidad de disponer de tcnicas de anlisis directo y rpido, fiable y sensible, junto con las exigencias cada vez mayores del empleo de tcnicas limpias, ha llevado a los investigadores en este campo a proponer nuevas tcnicas de aislamiento y preconcentracin que, unidas al anlisis cromatogrfico posterior, permiten el anlisis de migracin especfica. Estas son: a) las tcnicas de Espacio de Cabeza en modo esttico (HS) y en modo dinmico (P%T); b) Extraccin con fluidos supercrticos (SFE); c) Microextraccin en fase slida (SPME). Todas ellas se plantean y discuten en este captulo, ilustrando los logros conseguidos con ejemplos prcticos.

ABSTRACT The specific migration analysis of migrants from packaging materials to the food in contact with them is a very difficult task. The extremely low concentration values (traces or subtraces) in which the migrants are present in both the food and the food simulants after the migration tests, require the use of sophisticated analytical techniques as well as tedious and time consuming 163



analytical procedures to get the quantitative analysis of such migrants. The requirements of techniques for direct, fast, accurate and sensitive enough analysis allow the reseachers to propose the use of several techniques of preconcentration and isolation of analytes which, together with the further chromatographic analysis, facilitate the analysis of specific migration. These techniques are the following: a) Headspace techniques, in both static (HS) and dynamic mode (P&T); b) Supercritical Fluid Extraction (SFE); c) Solid Phase Microextraction (SPME). All of them are reviewed and discussed in this chapter. Several examples of specific migration analysis illustrate the behaviour and findings of these techniques.

INTRODUCCIN Es bien conocido que los materiales que se emplean para la fabricacin de envases alimentarios no son totalmente inertes, sino que pueden transferir sustancias que forman parte de su composicin, hacia el alimento en contacto con ellos, ya sea por contacto directo o a travs de la fase vapor. La salud del consumidor junto con la seguridad y calidad del producto son de importancia extraordinaria y requieren un control exhaustivo para evitar la alteracin de cualquiera de estos aspectos. Para cumplir estos requisitos se han establecido lmites en la legislacin vigente, tanto a nivel europeo (Directivas 92/32/CE, 93/9/CE, 95/3/CE, 96/11/CE, 99/91/CE) como en Amrica del Sur (Mercosur) que fijan la naturaleza y concentracin mxima de las sustancias que pueden utilizarse para la fabricacin de envases alimentarios. Aunque esta limitacin afecta a todos los materiales en contacto con alimentos, ya sea vidrio, papel, cartn, metales y plsticos, por su complejidad y mayor novedad nos centraremos en los materiales polimricos sintticos, que llamaremos en lo sucesivo plsticos. La primera limitacin establecida a nivel europeo para controlar la migracin de sustancias procedentes de los plsticos data de 1990 y es comnmente conocida como la lista positiva, ya que en ella se establece un listado de sustancias que pueden utilizarse para la fabricacin de envases en contacto con alimentos as como dos tipos de concentraciones lmite; QM o concentracin mxima de migrante que puede contener el material plstico final, y SML o lmite de migracin especfica, es decir, la concentracin mxima que puede haber de dicho migrante en el alimento. Esta situacin exige, por tanto, que se controle la concentracin de dichas sustancias, tanto en el envase como en el alimento, para lo cual se requieren tcnicas y mtodos analticos apropiados. En consecuencia, a travs de los ensayos de migracin normalizados, es imprescindible analizar un gran nmero de componentes a niveles de concentracin muy bajos, trazas

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en la mayora de los casos. Esto lleva consigo un enorme esfuerzo en el desarrollo de metodologa analtica capaz de abordar este reto, que es absolutamente necesario para garantizar la salud del consumidor y la garanta de calidad del producto (Nern, 2000a). El anlisis de trazas en alimentos es siempre una tarea difcil por la gran cantidad de componentes que conllevan, que actan como interferencias directas y aaden efectos matriz. Puesto que en la mayora de los casos las sustancias migrantes implicadas en los envases plsticos son de naturaleza orgnica, los problemas analticos se multiplican y requieren para su solucin la utilizacin de tcnicas sofisticadas. En este campo se estn desarrollando metodologas novedosas y tcnicas de anlisis directo, que se conocen como tcnicas limpias, es decir, que no requieren laboriosos tratamientos de muestra para su aplicacin. El anlisis de migracin especfica propiamente dicho, es decir la identificacin de los compuestos, denominada anlisis cualitativo, y su cuantificacin o anlisis cuantitativo, se llevan a cabo por tcnicas analticas bien conocidas, fundamentalmente por Cromatografa. As, el anlisis de compuestos voltiles se realizar preferentemente por Cromatografa de Gases , con detectores adecuados a cada caso y siempre que sea posible, se confirmar la identidad de los compuestos con un detector de Espectrometra de Masas. Por otra parte, el anlisis de migrantes no voltiles se llevar a cabo en la mayora de los casos por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), con los detectores ms apropiados (UV, fluorescencia, electroqumico). No obstante, en ambos casos esto constituye la ltima etapa del procedimiento analtico, ya que previamente es necesario extraer los compuestos migrantes de la matriz en la que se encuentran, ya sea un material de envase, un simulante o un alimento, eliminar el resto de los componentes de la matriz que le acompaan y que actan como interferencias en el anlisis posterior y, adems, concentrar los analitos una vez aislados, ya que con frecuencia la concentracin de los migrantes objeto del anlisis es muy baja. Todas estas etapas son las que dificultan extraordinariamente el anlisis de migracin especfica, siendo el principal motivo para que no se hayan desarrollado todava los procedimientos analticos necesarios para poder evaluar la migracin especfica de todos y cada uno de los posibles migrantes, que aparecen listados en la Directiva Europea. El desarrollo de tcnicas de preconcentracin y aislamiento de compuestos es fundamental para los estudios de migracin especfica y es precisamente este aspecto el que est marcando las nuevas tendencias y mtodos de anlisis de migracin especfica. Por su novedad y aportacin en el anlisis de la migracin especfica, nos centraremos en este captulo en tres grupos de tcnicas: 1.Tcnicas de espacio de cabeza 2.Extraccin con fluidos supercrticos 3.Microextraccin en fase slida 165



En todos los casos existe adems un denominador comn, que es la inexistencia de etapas previas, normalmente laboriosas, de tratamiento de la muestra as como la ausencia de disolventes orgnicos. Otras tcnicas con la misma filosofa estn actualmente en desarrollo y se augura un auge en los prximos aos que muy probablemente desplazar a muchos de los mtodos clsicos bien conocidos como son: la extraccin Soxhlet, la extraccin con ultrasonidos, la extraccin con microondas, la preconcentracin sobre lechos slidos o extraccin en fase slida, etc.

TCNICAS DE ESPACIO DE CABEZA (HS) Se llama espacio de cabeza al espacio libre que existe sobre una muestra, ya sea sta slida o lquida y que por tanto contiene el vapor en equilibrio con ella. El anlisis por espacio de cabeza implica, por tanto, la toma de muestra de la fase vapor que est en contacto con la muestra y su anlisis posterior. Dependiendo de cmo se realiza dicho muestreo tendremos tcnicas diferentes, que se pueden agrupar a su vez en dos tipos: Espacio de cabeza esttico Espacio de cabeza dinmico

Desde el punto de vista de los estudios de migracin, estas tcnicas han cobrado mucho inters por varios motivos. En primer lugar porque muchos de los monmeros y sustancias capaces de migrar son bastante voltiles, por lo que alcanzan el equilibrio slido-vapor o lquido-vapor con relativa velocidad y facilidad a temperaturas no excesivamente elevadas. Esto hace que para el anlisis de estas sustancias no sea necesario proceder a la disolucin de la muestra o su destruccin, sino que puede llevarse a cabo de forma directa, con el consiguiente ahorro de tiempo y coste. En segundo lugar, porque se ha demostrado la existencia de una migracin en fase vapor, es decir, sin que exista contacto directo entre el envase y el alimento (Nern et al., 1998 a). En este caso, la opcin ms fiable para su estudio es el anlisis por espacio de cabeza. Veamos con ms detalle las caractersticas de estas tcnicas y algunos ejemplos. a) Espacio de cabeza esttico Se trata del anlisis del vapor en equilibrio con la muestra a una temperatura dada. El hecho de que est basada en la existencia de un equilibrio fsico-qumico es de suma importancia, ya que posibilita la cuantificacin fiable de las sustancias. Siendo 166



un equilibrio, se asume que se cumplen todas las leyes del mismo y en consecuencia, se trata de una tcnica totalmente reproducible, siempre que se mantengan constantes la temperatura y el resto de condiciones externas. Por el contrario, tiene la limitacin de la sensibilidad. Sustancias voltiles o muy voltiles se enriquecen en la fase vapor y por tanto, su concentracin en esta fase es relativamente alta. Esto permite superar con facilidad los lmites de deteccin de la cromatografa de gases. Por esta razn, se reconoce en general como una tcnica sensible para el anlisis de sustancias voltiles. La tcnica puede realizarse de forma manual o automtica. El procedimiento manual consiste en recoger con una jeringa cromatogrfica la fase vapor en equilibrio con la muestra e inyectarla de inmediato en un cromatgrafo de gases. Para evitar prdidas por condensacin en la jeringa fra, es conveniente termostatizar la jeringa. Este sistema es aplicable en cualquier laboratorio, ya que no requiere instrumentacin adicional, pero se necesita cierta prctica para obtener resultados fiables y reproducibles. Se han introducido algunas mejoras prcticas que facilitan este anlisis. Por ejemplo, la coevaporacin del analito con un disolvente voltil (200 microlitros de hexano) y la condensacin posterior del vapor sobre las paredes internas de la jeringa que se mantiene a 20C. De esta forma, el condensado resultante, en fase lquida, se coloca en un microvial y se inyecta en el cromatgrafo de gases como muestra lquida. El anlisis de nanogramos por gramo (partes por billn) de estireno en aceite de oliva por este procedimiento (Nern et al., 1993) es sencillo y preciso y tiene la ventaja adicional de que la muestra de vapor recogida se puede inyectar varias veces. Permite adems el anlisis de sustancias semivoltiles, ya que estas son arrastradas por el disolvente voltil aadido para conseguir la coevaporacin, actuando como gas portador. Por el contrario, el procedimiento automtico de anlisis de espacio de cabeza (HS) requiere el uso de instrumentacin especfica, que bsicamente incluye un horno, para la termostatizacin de la muestra durante el equilibrio, una lnea de transferencia desde el vial hasta el inyector y un sistema adecuado de inyeccin automtica del vapor. Los distintos equipos comerciales varan en el modo de introduccin del vapor en el inyector del cromatgrafo de gases. En este caso, aunque se pueden analizar varias rplicas, stas no tienen la misma composicin, ya que una vez extrado el vapor, deber esperarse a que se alcance el equilibrio de nuevo y dependiendo de la masa total de analito inicialmente presente, la concentracin del vapor no es igual en las rplicas sucesivas (Nern et al., 1992). Uno de los inconvenientes de esta tcnica es la obtencin de patrones para cuantificacin. Si se trata de una muestra lquida o semislida, el problema se reduce a la adicin a la muestra de una disolucin de concentracin perfectamente conocida de los patrones (Nern et al., 1994). Pero cuando se trata de productos slidos, como por ejemplo, materiales plsticos, la adicin de una disolucin no refleja fielmente el proceso de volatilizacin que tiene lugar en la muestra. Se han propuesto distintas 167



alternativas, pero en todos los casos es necesario asumir que se cumplen las leyes de Raoult y que, por tanto, el equilibrio se alcanza de forma similar en los slidos y en los lquidos. De esta forma, se pueden validar los resultados cuantitativos. Cloruro de vinilo, estireno, acrilonitrilo, butadieno, y muchos otros monmeros se han analizado por este procedimiento (Joint Research Center, http://cpf.jrc.it/smt/) con buenos resultados. Plastificantes, monmeros, disolventes y contaminantes voltiles en papel y cartn se han determinado por este procedimiento (Nern et al., 2001a, Nern et al., 2001b,). Sin embargo, los estudios de migracin especfica en simulantes o en alimentos requieren alta sensibilidad y no siempre se alcanzan los lmites de deteccin necesarios mediante el anlisis por espacio de cabeza esttico. Esto ha dado lugar al desarrollo de la tcnica de espacio de cabeza dinmico. b) Espacio de cabeza dinmico o Purga y Trampa Si la masa de los compuestos voltiles desprendidos de la muestra y que pasan al espacio de cabeza se retira del recipiente en que sta se encuentra, stos se desprendern nuevamente con objeto de tratar de alcanzar el equilibrio. Si esta operacin se repite de forma continua, se habr volatilizado la masa total de compuestos voltiles que contena la muestra. Dichos compuestos se arrastran fuera del recipiente que contiene la muestra mediante un gas inerte, que se llama gas de purga, y se retienen en una trampa de adsorbente. Posteriormente la trampa slida se somete a una desorcin trmica que elimina todos los compuestos retenidos, introducindolos directamente en la columna de un cromatgrafo de gases al que normalmente est conectado el equipo de Purga y Trampa. Para evitar el ensanchamiento de los picos cromatogrficos, es conveniente colocar una trampa criognica adicional a la entrada de la columna cromatogrfica. De esta forma, los compuestos condensan conjuntamente en la cabeza de la columna cromatogrfica. Posteriormente, un calentamiento rpido consigue la inyecin flash necesaria para un buen comportamiento de los compuestos en el cromatografo de gases. El procedimiento completo por tanto, consta de tres etapas: Purga, Trampa y Desorcin. La caracterstica ms importante de esta tcnica es que no se trata de un sistema en equilibrio, ya que ste se rompe continuamente. Podemos decir que es una tcnica de anlisis absoluto, porque en este caso, no se inyectar en el cromatgrafo de gases una fraccin de los componentes voltiles sino la masa total de stos que exista en la muestra, siempre que el tiempo de purga haya sido suficiente para conseguir desprender la totalidad de los compuestos voltiles de la muestra. Esto hace que la sensibilidad que se alcanza en el anlisis sea muy superior a cualquiera de las tcnicas convencionales de aislamiento y preconcentracin de analitos. La tcnica se denomina indistintamente espacio de cabeza dinmico o purga y 168



trampa, ya que para favorecer el desprendimiento de los compuestos voltiles de la muestra, sta se purga continuamente con una corriente de gas inerte, que arrastra los compuestos desde la muestra termostatizada a un lecho de adsorbente slido mantenido a temperatura ambiente o preferentemente enfriado. Es decir, los analitos se extraen de la muestra con ayuda de un gas inerte (purga) y se concentran en la trampa slida antes de la inyeccin en el cromatgrafo, por lo que pueden analizarse nanogramos por Kg, es decir, partes por trilln de compuestos presentes en la muestra original (Nern et al., 1995). Un esquema general de este sistema se presenta en la Figura 1. Este sistema ha permitido la determinacin de estireno en yogur. Un estudio realizado en distintas marcas comerciales de yogur envasado en poliestireno (Nern et al., 1998 b), mostr la presencia de este monmero en niveles de concentracin de 8 microgramos por Kg mientras que el yogurt envasado en vidrio mostr valores de estireno por debajo del lmite de deteccin en todos los casos (6 ng/Kg). La tcnica es aplicable tambin a muestras slidas, lo cual permite el anlisis de componentes voltiles en los materiales de envase (Salafranca et al., 2000, Nern et al., 1995

P&T-GC-MSHe trampa de Tenax

muestra

GC

Manta calefactoraFigura 1.Esquema del sistema Purga y Trampa conectado a un cromatgrafo de gases.

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b). Por ejemplo, se ha aplicado a la determinacin de olefinas alifticas de bajo peso molecular, cuyo grupo ms importante se muestra en la Tabla 1 (Rubio, 1998). Las caractersticas analticas del mtodo desarrollado para el anlisis de estos compuestos en plsticos por P&T-GC-MS se muestran en la Tabla 2. Un cromatograma obtenido a partir de los patrones de calibracin utilizando el mtodo desarrollado, se muestra en la Figura 2. Los valores de recuperacin de la Tabla 2 se calcularon

Tabla 1.Olefinas voltiles utilizadas como monmeros y clasificadas como migrantes potenciales del envase al alimento Compuesto (cis)-1,3-Pentadieno (cis)-2-Penteno (cis)-4-Metil-2-penteno* (trans)-1,3-Pentadieno* (trans)-2-Metil-1,3-pentadieno* (trans)-2-Penteno* (trans)-3-Metil-2-penteno (trans)-4-Metil-2-penteno* 2-Metil-2-penteno 3-Metil-1,4-pentadieno* 3-Metil-1-penteno 4-Metil-1,3-pentadieno 4-Metil-1-penteno Ciclopenteno* Punto de ebullicin, C 44 37 - 38 57 - 58 42 75 - 76 37 69 57 67 55 69 75 53 - 54 44 Masas caractersticas, m/z 67 55 69 67 67 55 41 41 41 67 55 67 43 67 y y y y y y y y y y y y y y 39 70 41 39 39 42 69 69 69 81 41 85 41 68 Restricciones Suprimido Seccin B Suprimido Suprimido Suprimido Seccin B Suprimido Suprimido Suprimido SML = 0,02 mg/kg

Tabla 2.Caractersticas analticas del mtodo desarrollado para el anlisis de olefinas de bajo punto de ebullicin mediante P&T/GC/MS-SIM Analito 2-Penteno 1,3-Pentadieno 3-Metil-1,4-pentadieno 4-Metil-1-penteno Ciclopenteno (trans)-4-Metil-2-penteno (cis)-4-Metil-2-penteno 2-Metil-1,3-pentadieno DL QL (g/g) (g/g) 0,30 0,30 0,29 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,64 0,63 0,63 0,29 0,29 0,29 0,30 0,29 Rango lineal (g/g) 0,64 0,63 0,63 0,29 0,29 0,29 0,30 0,29 3028 3012 3000 3008 3006 2992 3018 2984 Linealidad (r) 0,9997 0,9989 0,9985 0,9992 0,9989 0,9996 0,9992 0,9996 RSD (%) 5,4 4,7 8,0 6,2 4,8 3,7 4,6 4,2 Rec. (%) 48 66 66 59 65 77 53 42

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Abundance

TIC: 1301013.D

140000 130000 120000 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 Time--> 0 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00

Figura 2. Cromatograma obtenido en GC-MS con la columna HP-624 con inyeccin mediante P&T.

por comparacin con la inyeccin directa de una disolucin de los compuestos en el GC-MS en las mismas condiciones que las utilizadas para la inyeccin P&T. Un estudio completo de este tema puede encontrarse en la Tesis Doctoral de Carlos Rubio (1998). La migracin potencial de compuestos voltiles desprendidos de materiales plsticos se ha estudiado tambin en otros polmeros, bien sea de material virgen o reciclado (Salafranca, 2000). Otras aplicaciones realizadas por P&T-GC-MS en el campo de la migracin es el anlisis de compuestos voltiles responsables de olores extraos en aguas (Rubio et al., 2001 a), el anlisis de disolventes residuales en envases plsticos y en alimentos secos en contacto con ellos (R. Lpez et al., 2000) o bien la determinacin de residuos de disolventes en papel y cartn (Nern et al., 2001 c). Tambin se han determinado por este procedimiento los compuestos voltiles desprendidos de envases plsticos utilizados para calentamiento y coccin en hornos microondas (Nern et al., 2001 d). Una posibilidad adicional que ofrece el equipo utilizado para P&T es la desorcin trmica directa de los migrantes retenidos en un adsorbente slido, ya sea como resultado de un ensayo de migracin por contacto directo con el slido (caso de los ensayos de alta temperatura) o bien a travs de un ensayo de migracin en fase vapor (Nern, 1998 a). En este caso, no es necesaria la etapa de purga y el adsorbente slido que contiene los migrantes puede colocarse en el lugar de la trampa slida habitualmente utilizada en el sistema (Rubio et al., 2001 b, Nern et al., 2001 e). De esta forma se ha estudiado la migracin especfica de varios compuestos cuyos valores se muestran en la Tabla 3. 171



Tabla 3.Migracin potencial a fase vapor Material Compuesto Metil benceno 1- octene Etil bencenoXyleno Estireno 1,4 diclorobencenoMetil benceno1- octene Etil bencenoXyleno Estireno 1,4 diclorobencenometil benceno1- octene etil bencenoXyleno Estireno 1,4 diclorobencenometil benceno1- octene etil bencenoXyleno Estireno 1,4 diclorobencenometil benceno1- octene etil bencenoXyleno Estireno 1,4 diclorobencenomg/Kg plastico 2,20E-03 1,73E-04 2,12E-04 1,13E-03 1,53E-03 7,33E-04 1,94E-03 1,08E-04 2,34E-04 7,64E-04 1,01E-03 6,81E-05 4,23E-04 1,61E-04 1,47E-04 7,78E-04 1,12E-03 1,27E-04 8,62E-05 3,11E-04 3,60E-04 1,09E-03 1,78E-03 2,18E-04 6,91E-03 3,95E-04 *** *** *** 8,79E-05 mg/dm2 plastico 4,70E-05 3,72E-06 4,55E-06 2,42E-05 3,29E-05 1,57E-05 3,63E-05 2,03E-06 4,39E-06 1,43E-05 1,90E-05 1,28E-06 7,92E-06 3,01E-06 2,75E-06 1,46E-05 2,09E-05 2,39E-06 1,08E-06 3,89E-06 4,50E-06 1,36E-05 2,22E-05 2,72E-06 9,21E-05 5,26E-06 *** *** *** 1,17E-06 mg/Kg alim. 2,82E-04 2,23E-05 2,73E-05 1,45E-04 1,97E-04 9,42E-05 2,18E-04 1,22E-05 2,63E-05 8,60E-05 1,14E-04 7,66E-06 4,75E-05 1,81E-05 1,65E-05 8,75E-05 1,26E-04 1,43E-05 6,47E-06 2,34E-05 2,70E-05 8,15E-05 1,33E-04 1,63E-05 5,53E-04 3,16E-05 *** *** *** 7,03E-06

PC

PPR

PP%T

PPCo

SAN

PC: Policarbonato; PPR: Polipropileno Random; PPCo: Polipropileno Copolmero; PP%T: Polipropileno 20% talco; SAN: Estireno Acrilonitrilo. Media de tres determinaciones. ***fuera del rango de estudio (100 mg/Kg).

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La versatilidad de estas tcnicas y su elevada sensibilidad hacen de ellas una herramienta potente y atractiva para el anlisis de la migracin especfica de compuestos voltiles. Sin embargo, no hay que olvidar que el elevado nmero de variables a optimizar en cada caso y los problemas inherentes a la tcnica, junto con la facilidad de contaminacin del sistema a los niveles de concentracin en los que se trabaja, obligan a extremar los cuidados, limpiezas, calibracin y tiempo requerido para la optimizacin necesaria. Esta situacin hace aconsejable la utilizacin de las tcnicas de diseo de experimentos, que permiten optimizar simultneamente un conjunto de variables e identificar las variables dependientes y los efectos de interaccin entre ellas. La seleccin apropiada del diseo experimental permite adems realizar la optimizacin con el mnimo nmero de experimentos de laboratorio, lo cual redunda en menor tiempo y menor coste.

EXTRACCIN CON FLUIDOS SUPERCRTICOS (SFE) Como ya se ha indicado, la extraccin de los analitos presentes en el material de envase o en el alimento es una de las etapas ms crticas del anlisis de migracin especfica, ya que junto con las sustancias de inters se encuentran otras muchas que es necesario eliminar. La utilizacin de fluidos supercrticos y en especial de CO2, ha proporcionado una herramienta muy valiosa en este campo, por varias razones. La primera de ellas es la posibilidad de realizar extracciones selectivas de compuestos o grupos de compuestos. En efecto, modificando nicamente las condiciones en las que se efecta dicha extraccin, principalmente la presin y la temperatura aplicadas, se obtiene un fluido supercrtico de distinta densidad. Este parmetro tiene una gran influencia en el poder solubilizante del fluido supercrtico, que se calcula a travs de la conocida ecuacin de Hildebrand. Cuando no se consigue eficiencia suficiente en la extraccin por modificacin de la densidad, se puede recurrir a la adicin, en pequea proporcin, de un disolvente que modifique las caractersticas de polaridad del fluido supercrtico utilizado. A este disolvente se le llama modificador y el modo en el que se aade condiciona a su vez los resultados obtenidos, como luego se explicar. La segunda ventaja inherente a la SFE, y en especial cuando se trabaja con CO2, es el hecho de que este fluido es gas a temperatura ambiente, por lo que una vez realizada la extraccin, el fluido recupera las condiciones atmosfricas y queda automticamente eliminado del extracto, dejando los compuestos extrados en estado puro y aislados de la muestra. En consecuencia, no es necesario recurrir a etapas adicionales de concentracin del extracto ni tampoco de eliminacin de disolventes.

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Adems, la SFE es bastante verstil, ya que puede realizarse en modo esttico y en modo dinmico. El primero implica el contacto entre la muestra y el fluido supercrtico durante un tiempo, en la celda de extraccin cerrada, mientras que el modo de extraccin dinmico tiene lugar cuando la muestra est continuamente en contacto con nuevo fluido supercrtico. Dicho fluido va depositando los compuestos extrados sobre una trampa enfriada desde la cual posteriormente se desorbern. Ambos modos de extraccin tienen ventajas e inconvenientes. El modo esttico implica un consumo muy reducido de fluido supercrtico, que es siempre caro, pero es en general menos eficaz, ya que una vez alcanzado el equilibrio de reparto de los compuestos entre la muestra y el CO2, ya no se extrae mayor masa de compuestos, con lo que el rendimiento en la extraccin no suele ser del 100%. El modo dinmico renueva continuamente el CO2 y por tanto no est limitado a la situacin de equilibrio, por lo que puede extraer globalmente mayor masa de compuestos. No obstante, el consumo de fluido supercrtico es mucho mayor. Es habitual combinar en un mismo procedimiento ambos modos de extraccin. Adems de la extraccin propiamente dicha, una etapa crtica en los procedimientos de SFE es la coleccin del extracto, que puede realizarse de diversas formas: en trampa slida inerte y enfriada criognicamente, en lecho slido activo, o por borboteo en un disolvente. En el caso de retener los compuestos en un lecho slido, que es ms comn en los procedimientos de SFE, los analitos deben eluirse posteriormente con un disolvente adecuado. La utilizacin del sistema de borboteo directo en un disolvente presenta varios inconvenientes: evaporacin del disolvente durante la coleccin del extracto, excesiva dilucin del extracto, prdida de los componentes ms voltiles, etc. Por estas razones, no es el mtodo ms utilizado. Como fcilmente se deduce de lo anteriormente expuesto, hay un amplio nmero de variables que afectan a la SFE y cuya optimizacin requiere un procedimiento sistemtico eficiente. Las variables pueden dividirse adems en dos grupos: i) Aquellas que afectan al proceso de extraccin propiamente dicho, que son: presin, temperatura, tiempo, flujo de CO2, modo de extraccin (esttico o dinmico) y presencia, naturaleza y cantidad del modificador. El flujo de SF usado en la etapa dinmica, junto con el tiempo de extraccin, determina la cantidad total de CO2 en contacto con la muestra. Valores muy altos de CO2 suponen un coste elevado y pueden producir una elevada dilucin de los analitos, que podran escapar del sistema de coleccin. ii) Las que afectan a la recogida del extracto, es decir: tipo de trampa slida para la sorcin de los analitos, temperatura de sorcin y de desorcin en la trampa slida, naturaleza del disolvente de elucin de los analitos, volumen total de disolvente y flujo del mismo. 174



Las dos etapas estn estrechamente relacionadas, pero estn controladas por factores independientes. Por ello, se pueden optimizar por separado. La figura 3 muestra un esquema de la extraccin con fluidos supercrticos. Con el fin de tener en cuenta los efectos de interaccin entre variables de cada grupo, es conveniente recurrir a diseos matemticos de experimentos, entre los que destacan los diseos factoriales. Por ejemplo, empleando un diseo factorial completo se ha optimizado la extraccin de antioxidantes primarios y secundarios (Irganox 1076, Irgafos 168) y un estabilizante UV (Chimassorb 81), tanto en plsticos vrgenes como en reciclados (muestras de polietileno) (Salafranca et al., 1999), aditivos y contaminantes en PET (Nern et al., 2000 b) o bien la extraccin de pesticidas en fresas (Nern et al., 1998 c). Si bien la SFE podra aplicarse a muestras slidas y lquidas cuando estas ltimas estn impregnadas en un lecho slido, la realidad es que la inmensa mayora de las aplicaciones se centran en la extraccin de muestras slidas. La extraccin de un analito dado depende, entre otros factores, de la capacidad del fluido supercrtico para difundir a travs de la matriz, y, en consecuencia, depende de las caractersticas fsicas de la matriz. Esto significa

ESQUEMA SFErestrictor eluyent

horno

lana de vidrio

muestra

bomba

trampa criognica

modificador CO2 P, T caudal CO2 modificador

CO2 sonda

extracto

Figura 3.Esquema de un equipo de SFE.

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que la extraccin de matrices diferentes puede ser muy distinta, pero tambin puede diferir cuando se trata de una misma matriz en condiciones fsicas diferentes. Por ejemplo, los valores de extraccin de pesticidas absorbidos en plstico son mucho menores cuando se extrae la granza que cuando la muestra est en forma de pelcula (Nern et al., 1997). Otro ejemplo ilustrativo de estas diferencias es el estudio sistemtico realizado con muestras de PET por Nern (Nern et al., 2000 b). A varias muestras de PET virgen y reciclado se les aplicaron tres tratamientos diferentes con el fin de extraer los aditivos presentes en las mismas. En el primer caso, las muestras en copos, se pesaron y se extrajeron directamente por SFE. En el segundo caso, las muestras se prensaron a 250 atm para obtener lminas ms finas y facilitar la extraccin. Finalmente, el tercer mtodo consisti en congelar las muestras con nitrgeno lquido y molerlas inmediatamente hasta obtener una muestra en polvo, que se someti a la extraccin SFE. Este ltimo procedimiento junto con la obtencin de lminas finas bajo presin, se mostraron ms eficientes, ya que la reduccin del espesor y la mayor superficie facilitan el contacto entre el CO2 y los analitos. Conviene resaltar que en el caso de los polmeros el estado fsico de la matriz es un factor esencial, que condiciona la difusin de los analitos en su seno as como la capacidad de penetracin del fluido supercrtico, ambos aspectos de suma importancia en el proceso de extraccin. En el campo del envase alimentario se han publicado varios trabajos sobre la extraccin por SFE de componentes de envases plsticos y de envases de papel y cartn, as como aditivos y contaminantes (Ashraf-Khorassani et al., 1990, Ashraf-Khorassani et al., 1991; Kppers, 1992; Cotton et al., 1993; Cotton et al., 1993 b; Marn et al., 1996; Vandenburg et al., 1997; Clifford et al.,1998; Pinto et al.,1998; Garde et al.,1998; Marn et al.,1998; Ashraf-Khorassan et al., 1999; Martial et al., 1999; Nern et al., 2000 c; Nern et al., 2000 d), que ponen de manifiesto el enorme potencial de esta tcnica para los estudios de migracin. Por otra parte, el comportamiento de una serie de muestras de papel y cartn extradas por SFE parece sugerir que esta puede ser una buena tcnica de screening para evaluar la migracin potencial de un material. Como ya se ha mencionado, las caractersticas del fluido supercrtico se pueden cambiar con la adicin de un modificador. Esta es una sustancia que se aade a la celda de extraccin directamente (modo esttico) o a la corriente de CO2 antes de que ste alcance la celda de extraccin (modo dinmico). En ambos casos el resultado es un fluido con polaridad y poder solubilizante diferente. Con ello se amplan enormemente las posibilidades de aplicacin de esta tcnica. Una amplia discusin del papel del modificador se puede encontrar en Nern et al. (2000e). Respecto a los anlisis de migracin especfica en simulantes, la tcnica SFE es una herramienta poderosa para la extraccin de los migrantes retenidos en adsorbentes slidos, como Tenax, Porapack, Amberlitas, mezclas de zeolitas o cualquier otro adsorbente slido que se utilice. Este es el caso por ejemplo de los estudios de migracin en fase vapor, en el que los analitos son retenidos en un adsorbente slido, 176



o bien los estudios de migracin a alta temperatura, por ejemplo, en recipientes utilizados para calentamiento en microondas. En estos casos, los migrantes se retienen en lechos slidos que posteriormente deben analizarse. Detalles de estos casos pueden encontrarse respectivamente en los trabajos de Nern et al., (1998a) sobre el diseo de los ensayos de migracin en fase vapor, realizado con plsticos de origen agrcola contaminados con pesticidas y tambin en Nern et al., (2001e), en el que se estudia la migracin en fase vapor de los compuestos desprendidos de una serie de recipientes de plstico utilizados para calentamiento en hornos microondas. En general, la limpieza del proceso de extraccin y recogida del extracto, en especial cuando ambas etapas estn conectadas de forma automtica en lnea, junto con las ventajas apuntadas anteriormente, hacen que la SFE pueda considerarse como una tcnica limpia muy atractiva para el anlisis de migraciones especficas.

MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME) La microextraccin en fase slida es una tcnica relativamente nueva cuyo fundamento es la retencin de los compuestos objeto de anlisis sobre una fase estacionaria polimrica, cromatogrfica, que se encuentra ligada o depositada en una microfibra capilar de slice fundida. Dicha microfibra se encuentra sujeta al extremo de una jeringa cromatogrfica, de forma que todo el proceso, retencin de los analitos y posterior desorcin, se realiza sobre la jeringa. La figura 4 muestra un esquema del sistema.

SORCION SORCIONTipo de fibra Tipo de fibra Espesor de la fibra Espesor de la fibra Tiempo de sorcin Tiempo de sorcin Temperatura Temperatura Agitacin Agitacin pH de la muestra pH de la muestra Contenido en sales Contenido en sales Naturaleza de sales Naturaleza de sales

DES DETiem Tie Tem Te Lim Lim

GC-MS

(Optimizacin: Diseo Factoria (Optimizacin: Diseo FactoriFigura 4.Esquema de SPME.

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La tcnica es muy verstil, ya que puede realizarse la retencin de los analitos en fase vapor, es decir, en el espacio de cabeza en equilibrio sobre una muestra slida o lquida, o bien por inmersin total de la microfibra en una muestra lquida. La primera modalidad se conoce como SPME en modo Espacio de Cabeza, o abreviadamente HS-SPME, y la segunda modalidad se denomina directamente SPME. El proceso de desorcin tambin es verstil. Si se trata de analitos voltiles, la desorcin tiene lugar directamente en el portal de inyeccin de un cromatgrafo de gases, mientras que si se trata de analitos no voltiles, la desorcin debe hacerse por redisolucin en un medio lquido apropiado. En este caso, el sistema es algo ms complejo, razn por la que se han desarrollado todava muy pocas aplicaciones en este campo. De forma similar a las tcnicas anteriormente descritas, el proceso global puede subdividirse en dos grandes etapas: la retencin de los compuestos y la desorcin posterior. Respecto a la retencin (o sorcin), las variables ms importantes son: el tipo de fibra (polar, no polar, entrecruzada, etc.) y su espesor (puede ser desde 7 hasta 100 micras); el tiempo de sorcin, la temperatura, el pH de la muestra y la presencia o ausencia de sal as como su naturaleza. Estas ltimas variables parecen afectar a los puntos activos de la fibra y en definitiva a su capacidad de sorcin. Resulta sorprendente que dichas variables influyan tambin cuando se trata de procedimientos en modo Espacio de CabezaSPME, ya que en estos casos no hay contacto entre la muestra y la fibra, pero los hechos experimentales as lo demuestran. Una optimizacin sistemtica de la tcnica SPME puede encontrarse en el trabajo de Batlle et al., (1999). Cuando se trata de compuestos voltiles ya se ha citado que la desorcin tiene lugar directamente en el portal de inyeccin de un cromatgrafo de gases. Las variables que afectan son: la temperatura de desorcin y el tiempo. Este ltimo debe estar de acuerdo con el modo de inyeccin del cromatgrafo de gases, por ejemplo, si se trata de modo splitless el tiempo de desorcin deber coordinarse con el tiempo de splitless, para conseguir que la totalidad de los compuestos desprendidos de la fibra entren en la columna cromatogrfica. Un factor que, en general, influye negativamente en la efectividad de la SPME es la presencia de disolventes orgnicos en la muestra. Esto dificulta el anlisis cuantitativo de migantes en los simulantes C y D, es decir, en etanol al 10% y en isoctano por inmersin total de la fibra. De hecho, la presencia de cantidades crecientes de etanol en agua provoca una fuerte disminucin de la sensibilidad en la determinacin de pesticidas procedentes de lminas de plstico tras el ensayo de migracin (Nern et al., 1999). Si se tiene en cuenta la pequea dimensin de la microfibra en esta tcnica de SPME y el hecho de que posteriormente no se diluyen los analitos con disolvente durante la etapa de desorcin, el procedimiento de SPME supone un factor de preconcentra 178



cin de los analitos muy importante, con lo que la sensibilidad que se alcanza en los procedimientos de SPME es muy elevada. Esta es la razn, junto a su economa, facilidad de manejo y universalidad en sus aplicaciones, por la que las tcnicas de SPME se revelan entre las ms prometedoras para el anlisis de la migracin especfica de multitud de migrantes potenciales. Ya se ha mencionado la posibilidad de aplicar esta tcnica en modo Espacio de Cabeza. Esto es especialmente adecuado cuando se trata de determinar migrantes voltiles en muestras slidas o en aceite de oliva, resultante de un ensayo de migracin. O bien en aquellos casos en los que el vapor de agua interfiere en la determinacin, como es el caso de compuestos voltiles presentes en el agua mineral como consecuencia de una migracin de componentes desde el envase (Rubio et al., 2001a). La exposicin de la microfibra en el vapor en equilibrio a una temperatura dada y la desorcin posterior en el GC proporcionan un procedimiento de anlisis muy sensible y prcticamente exento de interferencias. Algunos ejemplos en esta rea lo constituyen los trabajos de Rubio et al., (2001b) y Lpez et al., (2000). As, por ejemplo, se han estudiado los disolventes residuales identificados en unas muestras de t envasado en bolsitas de plstico. Los procedimientos normales de extraccin, o de espacio de cabeza no permitieron su cuantificacin, pero s se consigui mediante la tcnica SPME en modo Espacio de Cabeza. Otro caso interesante es el estudio de migracin especfica de olefinas voltiles (monmeros y sustancias de partida) en aceite de oliva utilizado como simulante graso, realizado por HS-SPME-GC-MS. Los lmites de cuantificacin alcanzados en este caso son mucho mejores que los obtenidos por otras tcnicas alternativas (HS-GC-MS). Si las sustancias objeto de anlisis son muy voltiles, el procedimiento de SPME se comporta mejor que la tcnica P&T antes descrita, ya que en esta ltima los compuestos ms voltiles se pueden perder en la trampa slida durante la etapa de purga. Algunos aspectos crticos de la SPME son la reproducibilidad, el efecto memoria, tambin llamado carryover y los rangos lineales. Respecto al primero de los mencionados, es necesario realizar antes del anlisis un buen acondicionamiento de la fibra, ya que de otra forma las desviaciones estndar pueden superar el 30% y a pesar de que se trata de concentraciones muy bajas, y por tanto son aceptables valores de RSD mayores, se pueden conseguir reproducibilidades sensiblemente mejores (5-10% o menos), dependiendo de la muestra y de los analitos. El efecto memoria se reduce e incluso elimina realizando una buena limpieza trmica despus de la desorcin. Su magnitud depende tambin de la naturaleza de la fibra y de los compuestos objeto de anlisis. Las fibras que se comercalizan hoy presentan menores efectos memoria que las fabricadas en los primeros lotes y tambin son ms estables, por lo que estn ms protegidas frente a la prdida de fase durante la limpieza trmica y, en general, se comportan mejor. 179



Finalmente, el rango lineal es en general muy corto, lo cual es lgico pues implica una cierta saturacin de los puntos activos de la fibra. Este comportamiento se debe a que las fibras son poco selectivas para los compuestos. La sorcin est basada en la afinidad de los compuestos por la fibra, la cual depende de la polaridad, de la interaccin de grupos funcionales, etc. pero este comportamiento no puede clasificarse como selectivo, por lo que durante el proceso de sorcin en una matriz compleja, se ligarn a la fibra todos los compuestos que tengan cierta afinidad. Esto hace que el rango lineal se reduzca. Son normales rangos de slo un orden de magnitud, al contrario de lo que ocurre en otras tcnicas analticas. Esto no es un inconveniente, en general, aunque si se sospecha la existencia de concentraciones elevadas, conviene diluir la muestra y repetir la determinacin completa (sorcin + desorcin). En realidad, en la tcnica de SPME se alcanza el equilibrio de particin de los analitos entre dos fases: la fase estacionaria soportada o ligada a la fibra y la fase lquida o vapor en la que se encuentran los analitos. Para que la tcnica SPME sea eficaz, es necesario que el coeficiente de particin de los analitos entre la fibra y el medio (lquido o vapor) sea muy elevado y, por tanto, los compuestos quedarn preferentemente retenidos sobre la fibra. Por otro lado, dicha retencin no debe ser irreversible y a ser posible debera permanecer en la superficie de la fibra. De esta forma, el proceso de desorcin ser ms rpido y eficaz, consiguiendo mejor eficiencia desde el punto de vista global. Esto no siempre se consigue, por lo que es frecuente que la optimizacin de cada procedimiento exija una amplia serie de medidas experimentales. En este proceso, y al igual que se ha citado anteriormente para otras tcnicas analticas, es aconsejable la utilizacin de procedimientos matemticos de diseo de experimentos que minimicen las medidas experimentales durante la optimizacin (Batlle et al., 1999). Si se trata de analitos no voltiles, el proceso de sorcin debe realizarse obligatoriamente por inmersin total de la fibra en la disolucin que contiene la muestra a analizar. En este caso, la tcnica queda restringida a disoluciones acuosas, ya que no es posible introducir la fibra en aceite y tampoco es estable, en principio, en disolventes orgnicos. El problema aparente es la desorcin, ya que no puede realizarse la desorcin trmica como en el caso anterior, ante la falta de volatilidad de los compuestos objeto de anlisis en este caso. Se ha diseado y comercializado una interfase especial para la desorcin directa de la fibra en la fase mvil de un cromatgrafo lquido de alta resolucin (HPLC). La interfase consta de una vlvula de tres vas con un loop y un inyector tipo Reodyne. La microfibra se introduce en una microcmara, conectada a la vlvula, donde se realiza la desorcin con la fase mvil del HPLC en modo dinmico. Puede realizarse tambin la desorcin en modo esttico, con ayuda de un modificador o disolucin inyectada a tal efecto en la microcmara de dicha vlvula. La disolucin resultante se inyecta en el HPLC accionando la vlvula. A pesar de ser en apariencia sencilla y eficaz, la interfase comercial posee bastantes problemas, principalmente de falta de estanqueidad y consiguientes fugas. A pesar 180



de todo, con el sistema descrito se ha optimizado la determinacin cuantitativa de acetato de vinilo y de cido tereftlico en simulantes acuosos (Batlle et al., 2001). Las caractersticas analticas del mtodo se muestran en la Tabla 4. Como puede verse, la sensibilidad alcanzada por el procedimiento de SPME-HPLC es muy superior a la que se obtiene por inyeccin directa del simulante acuoso resultante del ensayo de migracin. Esto permite el control de estas sustancias a niveles de concentracin sensiblemente inferiores. Una alternativa muy atractiva al empleo de la interfase comercial, es desorber los compuestos retenidos en la fibra en un microvial en el que se aaden 150 microlitros de un disolvente apropiado. En realidad el volumen de disolvente puede ser incluso menor, aunque por razones prcticas no debe ser inferior a 50 microlitros. La fibra se sumerje en el microvial y una vez trasncurrido el tiempo necesario para la desorcin cuantitativa, el microvial se sella y se coloca en el muestreador automtico de un HPLC: De esta forma, se consigue el efecto de preconcentracin requerido, pero el mtodo resulta ms rpido, ms verstil, ya que se puede utilizar cualquier disolvente como medio de desorcin, ms barato, porque es compatible con cualquier HPLC y no requiere inversin en la interfase, y adems es ms eficaz porque no hay prdidas por falta de estanqueidad. Ejemplos de migracin especfica utilizando este sistema de desorcin directa en microvial, lo constituyen los estudios de migracin especfica de Bisfenol A, Bisfenol F, BADGE, BADGE-HCl y BFDGE en simulantes y en alimentos acuosos (Nern et al., 2001f). Este sistema ha mostrado ser adems un buen mtodo para el screening rpido de la migracin especfica en esta serie de compuestos, ya que la fibra se introduce directamente en el lquido contenido en la lata y a continuacin se desorbe en 150 microlitros de fase mvil colocada en un microvial. A pesar de los efectos matriz observados, cuando se analizan directamente los jugos de esprragos, guisantes, palmito, atn al natural o alcachofas en lata, el procedimiento permite la determinacin de 1 ng/g de alimento.

Tabla 4.Caractersticas analticas del mtodo SPME-HPLC Analito Acido tereftlico Acetato de vinilo Rango lineal (r2) (g/g) 5-150 (0,9896) 7,5-100 (0,9975) % CV (intra) 13,6 3,1 % CV (HPLC) 8,9 2,2 % CV (inter) 25,3 11,2 D.L. (g/g) 0,59 1,56 Q.L. (g/g) 1,99 5,20

CV: Coeficiente de variacin; DL: Lmite de deteccin; QL: Lmite de cuantificacin; HPLC: Cromatografa lquida de alta resolucin.

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Se han publicado en los ltimos aos un buen nmero de aplicaciones de SPME, aunque son muy pocas todava las dedicadas al estudio de migraciones especficas. No cabe duda de que la mejora de las fibras y la mayor versatilidad de stas, junto con el mejor conocimiento de los procesos que tienen lugar, harn que en un futuro prximo muchos de los anlisis de migracin especfica se realicen mediante la aplicacin de las tcnicas de SPME en sus distintas modalidades.

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analisis de compuestos migrantes-cromatografia

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