análisis calorimétrico como alternativa en el diagnóstico...
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Análisis calorimétrico como alternativa en el diagnóstico de fibrosis hepática
Dr. Galileo EscobedoInvestigador en Ciencias Médicas “D”
Unidad de Medicina ExperimentalHospital General de México
Septiembre de 2011
1 Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers. 28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
Sujetos sanos
Hígado1-3
5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME)(colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato)
Plasma4,5
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina.
Hígado normal (10X)
1 Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers. 28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
Sujetos sanos Pacientes con fibrosis hepática
Hígado1-3
5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME)(colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato)
20-40% de PME
(colágeno I, III, IV y VI, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato, entactina, undulina, dermatan sulfato)
Plasma4,5
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina.
ALT, AST, GGT, albúmina, haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF-1, factores de coagulación, bilirrubina, ácido hialurónico, MMP1, MMP9, TIMP1, laminina, colágeno IV and VI, procolágeno III, propéptido procolágeno C-terminal.
Hígado normal (10X) Hígado con fibrosis (10X)
1 Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers. 28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
Sujetos sanos Pacientes con fibrosis hepática
Hígado1-3
5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME)(colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato)
20-40% de PME
(colágeno I, III, IV y VI, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato, entactina, undulina, dermatan sulfato)
Plasma4,5
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina.
ALT, AST, GGT, albúmina, haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF-1, factores de coagulación, bilirrubina, ácido hialurónico, MMP1, MMP9, TIMP1, laminina, colágeno IV and VI, procolágeno III, propéptido procolágeno C-terminal.
Hígado normal (10X) Hígado con fibrosis (10X)
1 Gressner AM, 1991. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 29:293-311. 2 Rojkind M, 1982. Fibrogenesis in The Liver: Biology and Pathobiology. Raven Press. NY. pp 57-90. 3Burgerson and Olsen, 1990. Curr Opinion Cell Biol. 2:830-838. 4Skovgard-Veidal S et al., 2010. Dis Markers. 28:15-28. 5Anderson NL, 2010. Clin Chem. 56:177-185.
Sujetos sanos Pacientes con fibrosis hepática
Hígado1-3
5-7% de proteínas de matriz extracelular (PME)(colágeno I, III y IV, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato)
20-40% de PME
(colágeno I, III, IV y VI, laminina, fibronectina, elastina, ácido hialurónico, condroitin sulfato, heparán sulfato, entactina, undulina, dermatan sulfato)
Plasma4,5
Fosfatasa ácida, ALT, AST, GGT, albúmina, α-fetoproteína, apolipoproteína A1, proteínas del complemento, fibrinógeno, haptoglobina, IGF-1, mioglobina, factores de coagulación, insulina, antitrombina III, pancreastatina.
ALT, AST, GGT, albúmina, haptoglobina, apolipoproteína A1, IGF-1, factores de coagulación, bilirrubina, ácido hialurónico, MMP1, MMP9, TIMP1, laminina, colágeno IV and VI, procolágeno III, propéptido procolágeno C-terminal.
Hígado normal (10X) Hígado con fibrosis (10X)
Conclusión #1:
La fibrosis hepática lleva a cambios composicionales tanto a nivel local (hígado) como a nivel sistémico (plasma).
La calorimetría es una técnica de análisis fisicoquímico capaz de determinar variaciones composicionales en un compuesto particular, con base en sus valores de capacidad calorífica, flujo de calor y temperaturas de transición 3,4.
1Jelesarov and Bosshard, 1999. Journal of molecular recognition. 12:13-18. 2Dean JA, 1995. The analytical chemistry handbook. New York, McGraw Hill, Inc. pp. 15.1-15.5. 3Liang Y et al., 2001. European Journal of Biochemistry. 268:4183-4189. 4Grinberg VY et al., 2000. Journal of biotechnology. 79:269-280.
Capacidadcalorífica
Flujo de calor
Temperatura de transición
La capacidad calorífica es la cantidad de calor requerido para modificar la temperatura de un compuesto en una cantidad determinada. El flujo de calor es la cantidad de energía térmica transferida de los alrededores al compuesto. La temperatura de transición o de transición de fase es la temperatura a la que el compuesto cambia de un estado fisicoquímico a otro1.
Estas propiedades térmicas varían dependiendo de la composición molecular del compuesto.
1Dean JA, 1995. The analytical chemistry handbook. New York, McGraw Hill, Inc. pp. 15.1-15.5.
Conclusión #2:
La calorimetría es capaz de determinar cambios en la composición de un material.
Tomando en cuenta que:
1. Es necesario diseñar métodos de diagnóstico enfocados en determinar los estadios inicial (F1) e intermedio (F2) de la fibrosis hepática.
2. La fibrosis hepática lleva a cambios composicionales en el hígado y en el plasma.
3. La calorimetría es capaz de determinar variaciones en la composición de cualquier material.
Hipótesis
A nivel plasmático y hepático, la capacidad calorífica, el flujo de calor y la temperatura de transición son significativamente distintos entre sujetos sanos y sujetos con distintos grados de fibrosis hepática.
Metodología
F11 mes
20 mg/200 µL
Análisis calorimétrico
Capacidad CaloríficaFlujo de Calor
Temp. de transición
F22.5 meses
F35 meses
Vehículo = aceite de olivo, 2 mL/Kg de pesoCCl4 = 2:5 v/v en aceite de olivo, 2 mL/Kg de peso
F0 F1 F2 F3
Resultados preliminares
****
*
*P<0.05; **P<0.001
Plasma
Resultados preliminares
Resultados preliminares
Tejido hepático
Conclusiones
El plasma de ratas sanas es calorimétricamente distinto al proveniente de ratas F2 (capacidad calorífica 3 veces mayor en F2 que en F0) .
La temperatura de transición en el tejido hepático sano ocurrió a los 90-95°C, mientras que para el tejido F2 este cambio se observó a los 73, 77, 83 y 90°C. Para el tejido F3 se registraron cinco cambios de fase a los 67, 75, 80, 84 y 90°C.
El grado de fibrosis parece ser proporcional al aumento en el número de transiciones de fase del tejido hepático.
En términos de capacidad calorífica, el plasma de ratas con daño hepático moderado (F2) por administración de CCl4 es distinto al proveniente de ratas con un nivel inicial de daño (F1).
El tejido hepático F1 muestra dos transiciones de fase (90 y 95°C) mientras que el F0 muestra una (94°C).
En términos calorimétricos, las muestras plasmáticas de ratas sanas y F1 son iguales.
1Cheung KJ et al., 2009. J Viral Hepatol, 16:418-429. 2Diamond DL et al., 2006. Hepatology, 44:299-308. 3Anderson NL, 2010. Clin Chem, 56:177-185.
La proteómica es una herramienta molecular útil en la separación, cuantificación e identificación de una proteína en particular o de un grupo de estas1,2,3.
Propiedades Fisiopatológicas
No. Proteína Regulación
1 Apolipoproteína A1 Isoforma 1 -
2 Apolipoproteína A1 Isoforma 2 -
3 Apolipoproteína A1 Isoforma 3 -
4 Apolipoproteína A4 +
5 Ag parecido a CD5 +
Gel 1: Sujeto sano
Gel 2: Cirrosis (NAFLD)
Propiedades Fisiopatológicas Propiedades Térmicas
No. Proteína Regulación Capacidad Calorífica
Flujo de
Calor
Temp. de Transición
1 Apolipoproteína A1 Isoforma 1 - ¿? ¿? ¿?
2 Apolipoproteína A1 Isoforma 2 - ¿? ¿? ¿?
3 Apolipoproteína A1 Isoforma 3 - ¿? ¿? ¿?
4 Apolipoproteína A4 + ¿? ¿? ¿?
5 Ag parecido a CD5 + ¿? ¿? ¿?
¿Hay un mapa proteómico-calorimétrico asociado con la fibrosis hepática?
Gel 1: Sujeto sano
Gel 2: Cirrosis (NAFLD)
La proteómica es una herramienta molecular útil en la separación, cuantificación e identificación de una proteína en particular o de un grupo de estas1,2,3.
1Cheung KJ et al., 2009. J Viral Hepatol, 16:418-429. 2Diamond DL et al., 2006. Hepatology, 44:299-308. 3Anderson NL, 2010. Clin Chem, 56:177-185.
Perspectivas
Analizar las propiedades calorimétricas de muestras séricas provenientes de sujetos sanos y pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis por distintos agentes etiológicos.
Analizar las propiedades proteómico-calorimétricas de muestras séricas provenientes de sujetos sanos y pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis por distintos agentes etiológicos.
¿Qué se ha obtenido?
Resultados preliminares (go on!)
Financiamiento por parte de la Fundación Mexicana para la Salud (Proyecto F-583 Antonio Ariza Cañadilla para Jóvenes Investigadores) y el CONACYT (Proyecto CB-2009-01-129316 Apoyo a Iniciativas de Jóvenes Investigadores).
¿Qué falta?
Sueros de pacientes con distintos grados de fibrosis/cirrosis asociada a HCV, ALD, NAFLD, PBC (n=45).
Cámara de Isoelectroenfoque.
Agradecimientos
Dr. David Kershenobich
Dr. Guillermo Robles
Dra. Gabriela Gutiérrez
Dra. Carolina Guzmán
Dr. Joselín Hernández
Dr. Jesús Aguirre
QFB. Karina Suárez Álvarez
pQFB. Giuliana López Navarrete
Dr. José Luis Arjona
Dra. Adela Rodríguez
Dra. Yolanda López Vidal
Dr. Gonzalo Castillo Rojas
Dr. Antonmaría Minzoni