ud1 estudios microscópicos

UD1 Estudios microscópicos

UD 1 Estudios microscópicos

1. Introducción2. Partes de un microscopio óptico3. Propiedades del microscopio óptico4. Otros tipos de microscopios ópticos5. Reglas generales para el uso del

microscopio6. Artefactos que impiden o dificultan el

diagnóstico7. Limpieza y conservación del microscopio

• Lentes• Rayos de luz

M. óptico,

fotónico o de luz

• Haces electrones

• Campo magnético

M. electróni

co

1.INTRODUCCIÓNDependiendo del principio en que se basa su poder de aumento:

M. electrónico

• M. óptico: 2000 aumentos

• M. electrónico: 2000000 aumentos– De transmisión: Se obtiene una imagen

plana.– De barrido: Se obtiene una imagen

tridimensional.

M. Electrónico barrido

M. Electrónico

2. PARTES DE UN M. ÓPTICO

M. óptico

A)Parte mecánic

aB)Parte óptica

Microscopio óptico.

A)OcularB)ObjetivoC) portador del

objeto,D)lentes de la

iluminación, E)sujeción del objeto, F)espejo de la

iluminación

A) Parte mecánicaA1 Pie: estabilidadA2 Columna: perpendicular al pie y en su parte superior

está el tuboA3 Platina:

Orificio circular central (coloca preparación) paralela al pie y perpendicular a la columna Se deslice a lo largo de la columna por los tornillos

macrométrico (avance rápido) y micrométrico (avance lento)

Dos pinzas para retener el portaobjetosA4 Tubo: cámara oscura unida a la columna (en sus

extremos están los oculares y objetivos)A5 Revolver: atornillados los objetivos de diferentes

aumentos. Al girar el revolver los objetivos se ubican en el eje óptico.

REVOLVER

B) Parte óptica

B1 Objetivos: lentes + tubo metálico /Imagen real, aumentada e invertida O. seco: aire entre objetivo y preparación O. de inmersión: en grandes aumentos,

liquido transparente entre objetivo y preparación, impide desviación de los rayos + oblicuos más luminosos

O. de corrección: corrige defectos de o. seco cuando se usan cubreobjetos de diferentes espesores

Los aumentos mas utilizados son: 5X,10X,20X,40X y 100X.

Si examinamos un objetivo observamos que hay cifras grabadas por ejemplo: 40X / 0,70:160/ 0,17 en donde: 40X es el aumento del objetivo

0,70 es la abertura numérica (AN), es decir la medida del tamaño del cono de luz que el objetivo puede admitir

160 es la longitud en mm del tubo ocular que debe ser utilizado con ese objetivo

0,17 es el espesor del cubre objeto(en mm) que debe utilizarse con ese objetivo.

OBJETIVOS

OBJETIVOS

B2 Ocular: 2 lentes en pequeño tubo introducida en el extremo superior del tubo del microscopio. Recoge la imagen del objetivo transformándola en una virtual, derecha y aumentada.Superior o lente ocular Inferior o lente de campo o colectora

OCULARES

Las distintas lentes oculares se insertan en la parte superior del tubo del microscopio.

El aumento tope de un microscopio es de 2000 que corresponden a 20x ocular y 100x objetivo. Esta se compone de dos lentes. La lente inferior recoge la imagen del objetivo, la reduce y la reforma dentro del ocular a nivel del limitador del campo visual. La lente superior forma una imagen virtual aumentada para ser vista.

OCULARES

B3 Sistema de iluminación: luz por lámpara halógena (base)+ espejo que la refleja al eje óptico . La luz se recoge y enfoca mediante el condensador: combinación de lentes debajo

de platina y encima del diafragma (limita el haz de rayos)

DIAFRAGMA Y CONDENSADOR

Sistema de iluminación

3. PROPIEDADES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO A) Amplificación

1º aumentoObjetivo

2º aumentoOcular

+ lentes en objetivo mayor

aumento

B) Poder de resolución“Capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy

próximos”

Límite de resolución (R): distancia mínima entre dos puntos para su perfecta discriminación.

R es directamente proporcional a la longitud de onda ( λ ) R es inversamente proporcional a la apertura numérica

(AN) de la lente (depende del diámetro de la lente) AN = n.sen a (siendo n el índice de refracción del

medio circundante y a el ángulo de semiapertura) El ángulo de apertura es el ángulo limitado por los rayos

más periféricos que penetran en el sistema óptico

> PODER resolución > Definición objeto

> PODER resolución < sea R

> PODER resolución

> PODER resoluciónDisminuyen

do λaumentando

AN

Resolución es función de AN

Si λ viene fijada

Lentes con mayores aumentos =mayores AN

¿Longitud de onda?

• La parte superior de la onda se denomina cresta y la inferior valle. La distancia entre dos crestas o dos valles, es lo que se conoce como longitud de onda ().

¿Refracción?• Cuando los rayos luminosos inciden

oblicuamente sobre un medio transparente, o pasan de un medio a otro de distinta densidad, experimentan un cambio de dirección.

• Este fenómeno tiene mucha importancia en fotografía, ya que la luz antes de formar la imagen fotográfica ha de cambiar frecuentemente de medio: aire - filtros - vidrios de los objetivos - soporte de la película.

Refracción

Objeto (1) que es atravesado por un haz de rayos luminosos (2) los cuales son captados por el objetivo (3).

Al formarse el cono de luz proveniente del objeto se determina un ángulo, también llamado de apertura, donde α representa la mitad del mismo.

A partir de las observaciones precedentes, nace la definición de apertura numérica (AN), cifra a considerar para determinar el rendimiento de una lente objetivo:

AN = n x sen a

a = la mitad del ángulo de apertura del objetivo. n = el índice de refracción del medio que se encuentra entre el objeto y el objetivo.(Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite n = 1.51)

Otra manera de incrementar la resolución es creando, del lado de la fuente luminosa, un cono amplio con un ángulo mayor. Para ello se emplea otro juego de lentes denominado condensador el cual posee la misma apertura numérica que el objetivo

El objeto (1) es iluminado con un rayo de luz (2) que formará un cono luminoso frente al objetivo. Se colocó otra lente (4) que recoge y condensa la luz antes que ilumine al objeto

Para aumentar aún más la resolución, además de agregar un condensador, otra posibilidad es colocar algún líquido entre la lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexión de los rayos luminosos

Apréciese que el cono de luz y el ángulo a son mayores con inmersión

Cuanto más pequeña sea la lente objetivo más aumentos tiene pero la muestra requiere más iluminación externa (ya que deben llegar más fotones a la pequeña zona ampliada para que nos den información de sus partes) y la lente debe colocarse más cerca del objeto. Cuantos menos aumentos tenga menos luz necesita, cuantos más aumentos más luz.

La calidad de un objetivo es tanto mayor cuanto más elevada es su apertura numérica.El aumento total más idóneo debe estar comprendido entre 500 y 1000 veces la apertura numérica del objetivo. Oculares de gran potencia favorecen el aumento pero disminuyen la luminosidad, nitidez y las dimensiones del campo visual. Por eso es aconsejable situar el aumento total entre 500 y 1000 veces el valor de A.N.Esta regla está basada en las relaciones entre los poderes separadores del ojo y del microscopio.EjemploSegún la regla anterior, para un objetivo de aumento x40 y A.N. 0,65 debemos usar un ocular que logre valores comprendidos entre los siguientes aumentos 500· 0,65=325 aumentos1000·0,65=650 aumentosPara lograr valores comprendidos entre 325 y 650 aumentos con un objetivo de x40 debemos emplear oculares de x10 y x15Así empleando del de x10 el aumento total será 10x40=400 aumentosEmpleando el de x15 el aumento será de 600.Un ocular x20 producirá imágenes de mayor aumento (800) pero serán poco nítidas.

C) Profundidad de campoEspesor de la preparación enfocada en cualquier momento. Se

consigue mayor profundidad con menor aumento.

D) Área de campoParte de la preparación que se está viendo. Se consigue

mayor área con menor aumento (para rastrear)

E)IluminaciónBuena iluminación es imprescindible para aprovechar los

aumentos y resolución de un microscopio.

La profundidad de campo es el espacio que aparece nítido en la imagen.

4. OTROS MICROSCOPIOS ÓPTICOS

M. de campo oscuroM. de fluorescenciaM. de contraste de fase

Se han diseñado técnicas microscópicas más complejas que incrementan el contraste sin afectar la resolución. Los principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en:

• La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: Empleo de condensadores y filtros:

- Microscopio de campo oscuro.- Microscopio de contraste de fase.

• La modificación de la fuente emisora de luz: Cambiando la luz blanca por luz ultravioleta:

- Microscopio de fluorescencia.

Campo oscuro y objeto brillantemente iluminado Condensador especial que dirige los rayos fuera del

campo microscópico Gran valor para la observación de microorganismos en

fresco, elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.

Si el medio transparente contiene objetos que difieren de él en el índice de refracción se produce una desviación de la luz, la cual penetrará en el objetivo y aparecerá el objeto brillante.

Utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco( consiste en bloquear los rayos centrales que viene del condensador con un disco) concentrado sobre el espécimen. Sólo los rayos desviados por la muestra son captados por el objetivo).El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás

M. de campo oscuro

¿Qué se puede observar con este tipo de microscopios?

- Partículas dispersas en un medio homogéneo. - La observación del movimiento Browniano de las partículas. - Se puede utilizar para la observación de preparaciones vivas, sin colorear. - Visualiza los bordes destacados de las muestras.

Es como si en una habitación oscura entra un pequeño haz de luz por una rendija de una ventana y en el fondo oscuro de la habitación se iluminan las partículas de polvo que flotan en el aire. Lo que en un principio era invisible se vuelve visible.

Ammonia tepida, un foraminífero, en microscopía de fondo oscuro. Los tenues seudópodos se ven claros, por la luz que dispersan, contra el fondo oscuro

Glóbulos rojos en M. campo oscuro

Condensador y objetivos especiales que permiten la distinción entre sustancias que difieren ligeramente en sus índices de refracción

Luz que pasa de un material a otro de ≠ densidad, será refractada, desviada de su dirección original.

Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

El microscopio de contraste de fases permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido.

M. de contraste de fase

Espermatozoide de perro

Sustancias fluorescentes son las que absorben la luz ultravioleta y la emiten como ondas visibles de mayor longitud de onda.

Poseen fuente de luz ultravioleta y filtros para impedir que dicha luz lesione el ojo del observador.

Las estructuras que contienen la sustancia fluorescente aparecerán brillantes y el resto invisible.

M. De fluorescencia

M. De fluorescencia

Filamentos de actina de un bacilo

¿Qué puede ser?

CÉLULA EN MITOSIS

5. REGLAS GENERALES PARA EL USO DEL

MICROSCOPIO1)M. colocado sobre mesa sólida, encima de grueso fieltro que evite vibraciones y movimientos. Observador sentado cómodamente frente a él, con la espalda recta y la cabeza inclinada sobre el ocular.

2) La preparación se coloca sobre la platina de modo que el objeto quede en el centro de la abertura y se fija con las pinzas.

3) Se elige el objetivo que se considere adecuado para la observación a realizar. Generalmente se comienza con un objetivo de bajo aumento.

5) Si trabaja objetivos a seco y con preparaciones sin teñir, el condensador no es necesario, por ello se coloca abajo, lejos de la platina, para que no haya un exceso de luz sobre la preparación.Si se trabaja con objetivos de inmersión si se necesita el condensador, por lo tanto este se coloca arriba cerca de la platina.

6) En ambos casos con el diafragma se gradúa la luz necesaria, generalmente esto se hace una vez enfocada la preparación y en ese momento, se puede modificar ligeramente la altura del condensador, si con el diafragma no se consiguiera la luz adecuada.

7) Se regula la distancia de los oculares a la distancia que existe entre los ojos del observador.

8) Enfocar la preparación:a) Para ello se sube la platina hasta que esté cerca del

objetivo. Esta operación se hace mirando la platina desde fuera. Se mira por los oculares y se hace descender la platina lentamente, sin dejar de mirar, con el tornillo macrométrico hasta que se percibe la imagen difuminada y borrosa. Se termina de enfocar con el micrométrico hasta que en la imagen se aprecien todos los detalles.

b) En el caso de los objetivos de inmersión, se coloca una gota de aceite de cedro sobre la preparación, se hace subir la platina hasta que el objetivo se sumerge en el aceite. Mirando por los oculares se hace descender la platina muy lentamente con el macrométrico y se continua operando como en el caso anterior.

CAUSAS DE ERROR EN EL ENFOQUE Revolver mal centrado Preparación al revés Portaobjetos demasiado grueso o bien

hay dos cubreobjetos colocados

9) Observación. Una vez enfocada la preparación, se desplaza la platina con una mano en los cursores y con la otra mano se rectifica constantemente la posición del tornillo micrométrico. Se hace porque al mover la platina se desenfoca ligeramente y para apreciar detalles situados en diferentes planos de la preparación.

Para una observación completa y

correcta se efectúa un “barrido”.

Cuando se encuentra algo que se desea ver

con más aumento, se mueve la platina hasta

que el objeto queda en el centro del campo

y entonces se cambia el objetivo enfocando

con el tornillo micrométrico hasta que la

preparación se observe perfectamente.

6. Artefactos que impiden o dificultan el

diagnósticoo Artefactos de técnica: durante el procesado, dan imágenes no habituales (gotas líquidas, inclusión de aire, manchas)

o Contaminantes: partículas y organismos ajenas a la región orgánica del estudio.o Intratintoriales: precipitados de colorantes

(maculas del color del reactivo precipitado)o Extratintoriales: de diversa naturaleza y difícil

identificación: granos de polen, talco, pelusas,etc.

Pueden verse partículas extrañas en: Ocular: una vez enfocada la preparación

se gira el ocular y la partícula cambia de posición.

Objetivo: al cambiar de objetivo, desaparecerá.

7. LIMPIEZA Y CONSERVACIÓN DEL

MICROSCOPIO1. Los oculares y el condensador se limpian con un paño fino y seco que no suelte pelusa, o con papel de fumar.

2. Para limpiar el objetivo de inmersión del aceite, se frota suavemente la lente con un paño fino impregnado en una mezcla de alcohol etílico mas éter(50%). Secar con el mismo paño.

3. Si el condensador o la lente frontal del objetivo se manchan con algún reactivo, lavar con agua destilada y secar.

4. La platina se limpia de polvo con un trapo seco, o con agua destilada. Si se mancha de aceite, usar mezcla de alcohol etílico mas éter(50%).

5. Guardar el microscopio cubierto con una funda y no moverlo, sin someterlo a movimientos bruscos, mientras la lámpara del microscopio esté caliente, ya que es muy sensible y se funde con facilidad.

http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/inicio.htm

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