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TTTTéééécnicas de cnicas de cnicas de cnicas de

InmunoprecipitaciInmunoprecipitaciInmunoprecipitaciInmunoprecipitacióóóónnnn

En las reacciones de

inmunoprecipitación hay una

Interacción entre Ac y Ag soluble

en solución o gel con formación de

complejos multimoleculares que

dan precipitados visibles.

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� Se basa en el hecho de que la mayoría de las proteínas difunden libremente a través de poros de un gel.

� Hay ausencia de reacción física o química entre los inmunoreactantes y el gel.

� Al contactarse antígenos y anticuerpos específicos se forma una banda de precipitación en el punto en que ambos alcanzan equivalencia.

� Sirven para determinar la conc de Ags o Acs (cuantitativos) o para comparar Ags y evaluar su pureza (cualitativos).

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Pruebas de precipitación

VENTAJAS

• Existen varias pruebas.

• Se observan fácilmente.

• Muy útiles.

• No se requiere equipo

costoso.

• Pueden ser cuali o cuantitativas

DESVENTAJAS• Poseen baja sensibilidad.

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La reacciLa reaccióón de precipitacion puede realizarsen de precipitacion puede realizarseen distintos mediosen distintos medios

Medios lMedios l ííquidosquidos Medios gelosadosMedios gelosados

Fundamentos

generales

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1 - Factores físico-químicos

2 - Características inmunoreactantes

3 - Proporción relativa de Ag y Ac.

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Interacción Ag-Ac generan una malla → precipitadoAc → divalente y Ag → di-polivalente

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� 1- Difusión simple monodimensional � 2 -Difusión simple o doble

bidimensional� 3 -Doble difusión o técnica de

Ouchterlony� 4 -Contrainmunoelectroforesis (CIEF)

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� En tubos de hemólisis mezclar partes iguales de agar al 1% y suero fundido 50ºC .Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reacción, enfriando rápidamente para que solidifique. Inmediatamente después añadir 0,5 ml de agar 0,5% fundido y enfriado a 50ºC y luego de la solidificación agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antígeno.

� Después de la solidificación, los tubos tapados para evitar evaporaciones, se dejan a temperatura ambiente 24-48hs para su observación.

�

�

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3) Inmunodifusi3) Inmunodifusi3) Inmunodifusi3) Inmunodifusióóóón Radial Doble n Radial Doble n Radial Doble n Radial Doble o to to to téééécnica de Ouchterlonycnica de Ouchterlonycnica de Ouchterlonycnica de Ouchterlony

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K F6.6

Reacciones de precipitación en geles

Usos: pureza preparación antigénica , comparación Ags

� En caja de Petri estéril se depositarán 15ml de agar fundido y enfriado a 50°C. Se dejará solidificar y se confeccionarán pares de orificios de 5mm de diámetro, que distarán 1cm entre sí. Se colocarán 4 pares por placa, la ubicación de los mismos se distribuirá a conveniencia.

� En los distintos orificios enfrentados se sembrarán 10 �l de Ag y 10 �l del suero a testear. Se detectarán las correspondientes bandas de precipitación en el espacio que separa los orificios. Las placas se mantendrán en cámaras húmedas.

� Las lecturas de los resultados se efectuarán a las 24-72hs observándose distintos patrones.

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Antisuero anti-A

Ag epítopo A

AA

AA

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Contra-electroforesis• Método

– Ag y Ac migran en sentido contrario por electroforesis.

– Se usa solo cuando Ag y Ac tienen cargas opuestas.

• Cualitativo–Rápido

Ag Ab- +

� Inmunoelectroforesis (IEF)

� Inmunofijación

�Electroforesis cruzada.

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Inmunoelectrodifusión

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La inmunoelectrodifusión combina dos métodos de separación de proteínas:

1-Separación de una mezcla de antígenos por electroforesis.

2-Las proteínas separadas reaccionan por doble difusión radial con el antisuero adecuado.

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Inmunoelectroforesis.

• Electroforesis del antígeno.

• Migración de antígenos por carga (Separación).

• Formación de un canal. Colocar el Ac.

• Difusión radial doble.• Formación de bandas.• Interpretar las bandas

de acuerdo con los patrones reportados en la literatura.

Suero problem

a

Suero control

Antisuero especifico

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� Procedimiento en gel de agarosa:

� a) Mezclar 1g de agarosa con 100 ml de tampón veronal

� b) Luego de fundir a Baño María colocar 7 ml sobre el portaobjetos. Dejar solidificar.

� c) Practicar los pocillos para el antígeno y marcar en el canal de 2 mm de ancho (para el suero que estará paralelo a las proteínas separadas).

� d) Llenar ambos compartimientos de la cuba con 70 ml del buffer

� e) Colocar 15 µl del antígeno en su pocillo y llevar el portaobjetos sobre el aparato de electroforesis.

� f) Colocar una tira de papel del filtro a modo de puente para que la solución buffer de la cuba haga contacto con el gel de agar sobre el portaobjetos.

� g) Tapar la cuba y conectar la fuente de poder aplicando una corriente de 10 mA y realizar la corrida electroforética hasta que la albúmina marcada esté a 2 cm del punto de siembra.

� h) Retirar el portaobjetos de la cuba, extraer el agar del canal con espátula y coloca al ras el antisuero correspondiente (ej: 100 a 200 µl)

� i) Incubar a temperatura ambiente durante 24-48 hs. Dejar difundir y leer los resultados.

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� Técnica similar a la Inmunoelectroforesis� La inmunofijación consiste en la separación

electroforética de las proteínas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. La unión Ag-Ac da lugar a la formación de bandas de precipitación visualizadas tras lavar y teñir.

� La presencia del antígeno complementario forma inmunocomplejos que precipitan.

� Es una técnica muy rápida que se utiliza especialmente en le detección de identificación de cadena pesada y liviana de bandas monoclonales ,también sirve para identificar bandas oligoclonales en líquido cefalorraquídeo.

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� Inmunodifusión radial simple (IDRS)

� Electroinmunodifusión o “rocket”electroforesis.

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� a) Fundir el agar al 3% en un baño de agua a ebullición, mezclar con igual volumen de solución de cloruro de sodio 0.15 M

� b) Colocar en un baño de agua a 56°C un tubo de Kahn conteniendo 3ml de agar al 1.5%. Luego de estandarizada la temperatura (2 a 3’), agregar la cantidad necesaria de antisuero para conseguir la dilución óptima, que debe ser determinada previamente. En general oscila entre 1/10 y 1/80.

� c) Homogeneizar la mezcla por inversión suave, volcar sobre un portaobjeto y dejar solidificar. Debe obtenerse una placa uniforme.

� d) Cortar los reservorios para el antígeno y retirar el agar. La distancia entre los reservorios debe ser de 1cm aproximadamente para evitar la interferencia entre los halos.

� e) Colocar en 3 reservorios de la placa, volúmenes de 2.5µl de diluciones de la solución estándar cubriendo un rango adecuado (para IgG el rango adecuado es de 10 a 70 mg%)

� f) En los reservorios remanentes colocar 2,5µl de la muestra a ser ensayada, diluida convenientemente (en general para la determinación de la concentración de IgG ene l suero de un paciente se utilizan diluciones que oscilan entre 1/20 y 1/50, dependiendo de la dilución de antisuero y de los caracteres clínicos del paciente en estudio)

� g) Dejar difundir en cámara húmeda a temperatura ambiente hasta que el diámetro de los halos no varíe (24-48hs)

� h) Medir con regla milimetrada el diámetro de los halos, elevarla al cuadrado y graficar la curva colocando en las abscisas mg% del antígeno standard y en las ordenadas el valor de los diámetros obtenidos. Determinar en base al diámetro obtenido con los sueros en estudio, la concentración de la inmunoglobulina teniendo en cuenta la dilución de suero empleada.

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� La inmunoelectroforesis en cohete es una técnica cuantitativa.

� Al igual que en la inmunodifusión radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera que el Ac no pueda migrar. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el cátodo) que se rellenarán con la muestra o con diluciones patrón. Una vez depositadas éstas se activa el campo eléctrico. El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con el Ac.

� La precipitación va produciéndose a medida que el Ag avanza hacia el ánodo de manera que al ir disminuyendo la concentración de Ag los bordes laterales se van acercando hasta unirse. Así, se produce una precipitación triangular (en estela de cohete).

� La concentración de Ag de la muestra es directamente proporcional al área y altura del triángulo. Comparando los resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones patrón obtendremos un resultado cuantitativo.

� Aplicación clínica: determinación de la concentración de albúmina en orina de pacientes con enfermedades renales.

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Turbidimetría

• Reacción Ag-Ac en baja concentración

• Cuantifica la turbidez de la solución en la que

ocurre la formación de inmunocomplejos

• El sistema de medición posee un fotodetector que

cuantifica la reducción en la intensidad de la luz,

lo que ocurre como resultado de la combinación de

la reflexión, absorción y dispersión de la luz

incidente.

• El fotodetector se ubica “en linea” en relación a la

luz incidente

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• Permite la detección de antígenos o de anticuerpos en soluciones a muy baja concentración

• Cuantifica la turbidez producida por los inmunocomplejos utilizando un fotodetector que mide la luz que se dispersa (scattered light).

• El fotodetector está ubicado en un ángulo distinto a la luz incidente.

• Se puede utilizar Polietilenglicol para aumentar el tamaño de los inmunocomplejos.

• Rápido, altamente automatizado, simple de operar, requiere pequeñas cantidades de reactivo, alta sensibilidad y excelente precisión.

Nefelometría

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NefelometríaSe basa en la detección de los complejos Ag-Ab, por la

refracción que dichos complejos producen sobre rayos de

luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el

anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan

rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de

luz que llega y la cantidad de complejos formados.

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�ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

(CELLOGEL)

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� La albalbalbalbúúúúmina es una protemina es una protemina es una protemina es una proteíííína sintetizada en el na sintetizada en el na sintetizada en el na sintetizada en el hhhhíííígado, permanece en gado, permanece en gado, permanece en gado, permanece en circulación unos 19 días

� Constituye el 50-60% del total de las proteínas plasmáticas.

� Sus funciones más importantes:contribuye a transportar moléculas de pequeño tamaño

� (ácidos grasos, bilirrubina, calcio, progesterona, drogas, etc.). También es de vital importancia para el mantenimiento de la presión oncótica de la sangre

� La molécula de albúmina ofrece una superficie total importante para la absorción de tóxicos lo que les otorga la capacidad de unirse a muchos iones (cobre, zinc y cadmio por ejemplo).

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Separa por CARGA Y TAMAÑO

El material soporte interacciona con las proteínas actuando como matriz retardando a las proteínas más grandes

Geles poliacrilamidas.

Condicion nativa(PAGE) o desnaturalizante(SDS-PAGE)

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Las proteinas se separan sólopor su PM

El SDSinteracciona con las proteinas por interacciones hidrofobicas cumple 2 funciones criticas:

� Recubre las proteinas con carga negativa proporcional a su PM

� Desnaturaliza la estructura nativa de la proteína

β -mercaptoetanol rompe los puentes disulfuros

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� Soluciones necesarias:� a) Acrilamida-bisacrilamida (30:0,8).� Acrilamida ........................ 30 g� Bísacrílamida .................... 0,8 g� Agua destilada csp . :......... 100 ml� Disolver, filtrar y conservar en frasco oscuro a 4o C.� b) TEMED ( Acelerador)TEMED ( Acelerador)TEMED ( Acelerador)TEMED ( Acelerador). Conservar a 4o C.� c) Persulfato de amonio (Iniciador)Persulfato de amonio (Iniciador)Persulfato de amonio (Iniciador)Persulfato de amonio (Iniciador)al 1,5%. Conviene preparar

pequeños volúmenes (10 ml) en el momento de usar.� d) SDS al 10%. SDS al 10%. SDS al 10%. SDS al 10%. Se prepara una solución al 10% en agua (P/V).

Conservada a 4o C es estable varias semanas. No conviene preparar grandes volúmenes. Como a bajas temperaturas cristaliza, es necesario calentar a 37° C antes de su uso.

� f) Buffer para gel de resoluciBuffer para gel de resoluciBuffer para gel de resoluciBuffer para gel de resolucióóóónnnn. Tris-HCl 3 M, pH 8,8.� g) SoluciSoluciSoluciSolucióóóón fijadoran fijadoran fijadoran fijadora: etanol al 10% y ácido acético al 0,5% en

agua destilada (200 ml)� h) SoluciSoluciSoluciSolucióóóón coloranten coloranten coloranten colorante: Nitrato de plata 0,185% en agua

destilada.� i) SoluciSoluciSoluciSolucióóóón decoloranten decoloranten decoloranten decolorante: 30 g Hidróxido de sodio, 7,6 ml

formol 40% y llevar a 1000 ml con agua destilada.

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� PreparaciPreparaciPreparaciPreparacióóóón de la muestran de la muestran de la muestran de la muestra

� La muestra debe ser procesada previamente a su análisis, para lo cual será mezclada con un volumen igual de Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, conteniendo 4% de SDS, 10% de 2-mercaptoetanol, 20% de sacarosa y 0,002% de azul de bromofenol.

� Inmediatamente después se la calienta en baño de agua hirviente por 3 minutos para desnaturalizar los componentes proteicos de la muestra y se la deja enfriar a temperatura ambiente antes de usar.

� Si la corrida en SDS-PAGE va a ser desarrollada junto con patrones de comparación de pesos moleculares conocidos con el objeto de determinar los PM relativos de las muestras en análisis, aquéllos deben ser previamente procesados de la

misma manera que lo fueron éstas.

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� Se procede a “sembrar” las muestras en cada espacio o “calle” del gel, el cual se somete a 100 v (45mA) hasta que el colorante marcador del frente de corrida

llegue a la posición deseada.

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� TinciTinciTinciTincióóóón argn argn argn argéééénticanticanticantica. Si se desea aumentar la sensibilidad para la detección de proteínas, se puede realizar una tinción con nitrato de plata, de acuerdo con el siguiente método:

� 1. 1. 1. 1. Finalizada la electroforesis colocar el gel de poliacrilamida en un recipiente con 200 ml de solucisolucisolucisolucióóóón fijadora n fijadora n fijadora n fijadora etanol al 10% y ácido acético al 0,5% en agua destilada,durante 30 minutos.

� 2.2.2.2. Colocar el gel de poliacrilamida en 200 ml de solucisolucisolucisolucióóóón de n de n de n de tincitincitincitincióóóónnnn, durante 1 hora.

� 3. 3. 3. 3. Lavar rápidamente con agua destilada, repitiendo la operación.

� 4. 4. 4. 4. Agregar 200 ml de solucisolucisolucisolucióóóón reveladora n reveladora n reveladora n reveladora y agitar suavemente hasta aparición de bandas.

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� Ello puede hacerse determinando la movilidad relativa de la proteína que interesa midiéndola con referencia a una proteína estándar o a un colorante trazador.

� Generalmente se hace respecto del colorante marcador que normalmente se incorpora al gel.

� Movilidad Distancia migrada por la proteína

� relativa (Rf) = ---------------------------------------

� Distancia migrada por el colorante

� Si se determina el Rf de diferentes péptidos de PM conocido, con los datos obtenidos es posible graficar log PM versus Rf. Conociendo el Rf de una sustancia en análisis, puede calcularse su PM relativo o Mr por interpolación en una curva.

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FIN

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