trucos y consejos en el desarrollo de métodos en lc y … · el volumen muerto de los sistemas...
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Trucos y consejos en el desarrollo
de métodos en LC y LCMS
1
Jaume C. Morales
Especialista de producto LC y LCMS
Agilent Technologies, Spain
7 de marzo de 2013
Indice
En esta sesión se abordará :
Introducción
Fundamentos de la técnica LC
Requisitos para el desarrollo de un método
Parámetros de optimización y variables
Especificidad del método LCMS.
Indice
En esta sesión se abordará :
Introducción
Fundamentos de la técnica LC
Requisitos para el desarrollo de un método
Parámetros de optimización y variables
Especificidad del método LCMS.
El desarrollo de un método LC depende principalmente de:
El objetivo del método
• Cuantitativo o Específico, Cualitativo o Genérico, Alto rendimiento, número de muestras…
El sistema de detección (selectividad)
• UV,FLD, ELSD, IR, MS FullSCan, MS Target
El origen de la muestra y su extracción (carga de matriz)
• Biológica, extracto de alimento, suelo, aguas, etc….
Las características del equipo/columna
disponible
Page 5
o Diferentes tipos de método
o Diferentes criterios de desarrollo
o Diferentes objetivos de optimización
o Diferente instrumentación
Base Fundamentos LC
Definición
Objetivo
Instrumento
Pruebas de desarrollo
Indice
En esta sesión se abordará :
Introducción
Fundamentos de la técnica LC
Requisitos para el desarrollo de un método
Parámetros de optimización y variables
Especificidad del método LCMS.
El desarrollo y la optimización del método requiere el conocimiento de :
o El sistema completo (diagrama del sistema)
o Las reglas del juego – Conceptos Teóricos
o Los fenómenos asociados
o Detalles del proceso de separación
o Principio de detección
Page 9
Tipo de compuestos Modo Fase
Estacionaria
Fase Móvil
Neutros
Acidos Débiles
Bases Débiles
Compuestos Muy polares
Fase Reversa
“HILIC”
C18, C8, C4
ciano, amino
Silica acuosa
Agua/Orgánicos
Modificadores
Agua/Orgánicos
Iones , Bases, Acidos Par Iónico C-18, C-8 Agua/Orgánicos
Sal Par Iónico
Compuestos hidrofobos
Fase Normal
Silica, Amino,
Cyano, Diol
“Silica HILIC”
Organics
Agua / ACN
Iones Inorgánicos Intercambio
Iónico
Anion or Cation
Exchange
Resin
Agua Tampones
Contra Ión
Compuestos de Alto
peso molecular
Polimeros
Size
Exclusion
Polystyrene
Silica
Gel Filtration-
Aqueous
Gel Permeation-
Organic
Page 10
• Ecuación fundamental de Resolución
• La curva de Van Deemter
• Los procesos de difusión
• Particulas superficialmnete porosas
• Calentamiento por fricción
)(2/1 2,1, tt
Rs
ww
tR
Time t
Separation Δt Peak width w
¿Qué pasa dentro de la columna? Importancia de la resolución
Δt Δt
Buena separación Separación pobre
w w w w
Buena separación Separación pobre
Resolución - selectividad - retención
k
kNRs
1
1
41
R = Resolución
N = Numero de platos Long. Columna y tamaño de partícula
α = Selectividad Fase móvil y estacionaria, Temperatura
k = Ret. relativa Fase móvil y estacionaria
O
t - t O R
t = k' = k’B
k’A
p
cS
d
LNR ~
N y R aumentan con :
La columna más larga
Un tamaño de partícula menor
)(2/1 2,1, tt
Rs
ww
tR
p
cs
dh
LR
41~
)(wfh
La combinación de ambas fórmulas resulta la Ecuación de VanDeemter que considera las propiedades físicas, termodinámicas y cinéticas de una
separación.
h = f ( weddy + wax + wC )
La eficacia de la columna dependerá de tres tipos diferentes de difusión
weddy ~ Calidad empaquetamiento y dp 1. Diferencias en el trayecto recorrido:
Diferentes camino Mal empaquet. Distrib. Tamaño
Diferentes difusiones en el sistema
wC ~ dp2
Partícula porosa
Capa de fase móvil
3. Difusión por resistencia a la transferencia de masa:
2. Difusión lineal en el seno de un fluido :
A bajo flujo, el analito permanece más tiempo en la fase móvil. Mayor anchura de pico.
wax Flujo
Longitudinal diffusion
Página
16
Optimización del Flujo de Fase Móvil. Ecuación
Van Deemter: Inverso Eficacia “ vs“ Flujo
Pla
te H
eig
ht
H:
H
EP
T
1/N
Linear Velocity u
Eddy Diffusion *
H Sum Curve: Van Deemter
Resistance to Mass Transfer *
u opt
H min
C
H = + + u
u
A B C
A
B
Static Mobile Phase
Diffusion Path Deviations
into pores of particle
Porous Particles
Las partículas más pequeñas otorgan una mayor eficacia de separación.
Además la influencia del incremento del flujo en la eficacia de la separación es mucho menor.
< 2 µm
Totalmente porosas < 2 µm , sub-two-micron (STM)
SOLID CORE < 3 µm
Superficialmente porosas
~ 0.5µm
• Distancia de difusión es menor.
• Luego también la resistencia a la transferencia de masa.
• Eficacia similar (80%) a las totalmente porosas STM.
• Aproximadamente 40-50% presión de las STM.
C
Tipos de partículas
Definición : Calor generado por la fricción entre fase móvil y estacionaria
Cuantitativamente podría calcularse como ::
Potencia = ΔP x F
ΔP = Caída de presión a lo largo de la colmuna [N/m2]
Depende de : • Longitud de la columna
• Diametro de la columna
• Tamaño de la partícula
• Viscosidad de la fase móvil
• Flujo
F = Flujo [m3/s]
Las columnas con mayor diámetro trabajan a mayor flujo y por lo tanto son capaces de disipar mayor potencia.
Calentamiento por fricción
Gradiente longitudinal
Flow
Gradiente radial
Flow
Situación adiabática Tipo horno de ventilador
Optimas condiciones Tipo columna en baño
• Gradiente de temperatura dentro de la columna
Calentamiento por fricción – consecuencias
Indice
En esta sesión se abordará :
Introducción
Fundamentos de la técnica LC
Requisitos para el desarrollo de un método
Parámetros de optimización y variables
Especificidad del método LCMS.
El desarrollo del método generalmente no parte de cero.
Un desarrollo desde cero implica disponer de muchos más recursos y un sistema más complejo para poder experimentar con muchas fases móviles, estacionarias, modificadores, Temp. , etc…
La propia experiencia y la búsqueda en bibliografía nos debe permitir encontrar un punto de partida :
Columna, Disolventes, Gradiente, …
La fase estacionaria (selectividad , α) es el factor que mayor influencia tiene en la separación pero es difícil de poder predecir.
Hay que tener en cuenta además aquellos factores que van a “penalizar” el rendimiento del método :
Volumen muerto del sistema, de la columna.
Page 24
• “System volume from the point of mobile phase mixing to the column head” (W. Dolan LCGC 2006 Vol. 24, No. 5, 458-466)
• Retrasa la llegada del gradiente a la columna.
• Prolonga el tiempo que la muestra permanece en la columna en condiciones isocráticas.
Totvolumen
Reducción del volumen muerto
Page 25
• La dispersión es la dilución de la muestra que ocurre en tubos, vávulas, celdas y conexiones.
• Conexiones capilares (diam.interno, longitud)
Dispersión Altura de pico : pérdida de sensibilidad
Anchura de pico : pérdida de resolución
Reducción del volumen muerto
2.1 mm 3 mm 4.6 mm
Agilent 1100 / Standard 1200 Agilent 1200 RRLC (standard delay vol.) Agilent 1200 RRLC (low delay vol.)
Agilent 1290 Infinity LC
El volumen muerto de los sistemas está en relación con el diámetro de columna y el flujo.
Reducción del volumen muerto
Indice
En esta sesión se abordará :
Introducción
Fundamentos de la técnica LC
Requisitos para el desarrollo de un método
Parámetros de optimización y variables
Especificidad del método LCMS.
Page 28
Menor tiempo de análisis (misma resolución)
Mayor sensibilidad Aplicación
Mayor resolución (mismo tiempo de análisis)
Mayor resolución Y menor tiempo de análisis
Hacia dónde dirigir la optimización
Page 29
Menor tiempo de análisis (misma resolución)
Aplicación
Optimizando el tiempo de análisis
Tomamos como punto de partida un método definido, con tipo de columna definida. El objetivo es hacer un método más rápido que permita hacer un mayor número de muestras por día p.e.
Page 30
Optimizando el tiempo de análisis
A través del desarrollo teórico visto anteriormente se llega a una de las fórmulas más importantes para la optimización de métodos :
Ft
Vb
G
c
~
F: Flujo
b: Pendiente de gradiente
Vc: Volumen de la columna
Vm ≈ Vc (mínimo vol.muerto)
Lc: Longitud de la columna
Ft
L
G
c
~
Si b permanece constante, el perfil de elución no cambia.
Esto nos permite jugar en varias direcciones.
Page 31
consFt
Lb
G
c
~
p
c
d
LN ~
Acortar la longitud de la
columna pero mantener a
misma eficacia requiere :
=> Partículas más
pequeñas Menor tiempo de análisis (misma resolución)
Aplicación
En éste caso queremos acortar la columna pero mantener la resolución y el Flujo.
Optimizando el tiempo de análisis
Page 32
Optimizando el tiempo de análisis
Regla genérica Longitud / Diam.Part
2
2
1
1~p
c
p
c
d
L
d
LN
Al final obtenemos un método más rápido con la misma resolución cambiando : • Columna más corta (Lc) • Diámetro de partícula más pequeño (dP) • Gradiente más rápido (tG)
2.1mm x 50mm 1.8µm
1.00ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 0.9 min
Analysis Time= 1.1min
UHPLC/RRLC, 40°C
10x faster
PW = 0.5 sec
min 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0
Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLC Agilent 1200-RRLC
HPLC, 40°C
PW = 3.4sec
4.6 x 150mm, 5µm
1.20ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 10.8 min
Analysis Time = 11min
min 0 2 4 6 8 10
0.2 0.6 0 0.4 min
2.1mm x 50mm 1.8µm
2.40ml/min, 95°C
Grad.: 35-95% en 0.38 min
Analysis Time: 0.4min
UHPLC/RRLC, 95°C
27x faster
PW = 197msec
150mm > 50mm: 3x
1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x
Hasta 20x más rápido que un HPLC. Manteniendo la resolución
Página 33
p
c
d
LN ~
Page 35
Hacia dónde dirigir la optimización
Aplicación
Mayor resolución (mismo tiempo de análisis)
consFt
Lb
G
c
~
Incrementar la longitud de
columna
Pero esto obliga a
aumentar el tiempo de
gradiente (b= cte)
Page 36
Hacia dónde dirigir la optimización
p
cS
d
LNR ~
Particulas más
pequeñas
Hacia dónde dirigir la optimización
Aplicación
Mayor resolución (mismo tiempo de análisis)
Otra forma es simplemente disminuir el tamaño de partícula
Como consecuencia, la Presión de trabajo será más alta.
4.6 x 150, 1.8um
490 bar
N = 28669
RS = 1.80 (+ 57%)
S/N = 44
7 Impurezas
Las 7 Separadas
a línea de base
4.6 x 150, 5um
93 bar
N = 7259
RS = 1.15
S/N = 42
Ejemplo de un cliente
Método Impurezas Isocr.
Zoom zona critica
rango tiempo @ 7min
4.6 x 150, 3.5um
165 bar
N = 14862
RS = 1.37
S/N = 50
7 Impurezas
6 No Separadas
a línea de base
Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs
UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µm Ejemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución
4 Impurezas
2 No Separadas
a línea de base
HPLC UHPLC
Página 37
p
c
d
LN ~
Page 38
Hacia dónde dirigir la optimización
Aplicación
Mayor resolución (mismo tiempo de análisis)
consFt
Lb
G
c
~
Incrementar la longitud de
columna
Se aumenta el flujo para
mantener (b= cte)
Otra forma es aumentar Longitud y Flujo
Como consecuencia, la Presión de trabajo será más alta.
1. Las partículas más pequeñas otorgan una mayor eficacia de separación.
2. Además la influencia del incremento del flujo en la eficacia de la separación es mucho menor.
0.0000
0.0005
0.0010
0.0015
0.0020
0.0025
0.0030
0.0035
0.0040
0.0045
0.0 0.5 1.0 1.5
Alt
ura
eq
uiv
alen
te d
el p
lato
teó
rico
HET
P
5.0 m
3.5 m
1.8 m
Flujo
Page 40
En 2 versiones On-line o en su PC
Esta herramienta funciona muy bien para el traslado de métodos sí :
1. Se dispone de la misma fase estacionaria en diferentes tamaños de partícula, manteniendo la selectividad.
2. El volumen del sistema cromatográfico está en línea con el tipo de la columna.
Agilent Method Translator
Page 41
El papel de la Temperatura
La temperatura tiene influencia en varios sentidos :
• Viscosidad de la fase móvil (presión, tiempo de análisis)
• Transferencia de masa (anchura de pico, resolución).
• Selectividad
• Estabilidad de los analitos.
Page 43
Optimizando la sensibilidad
Mayor sensibilidad Aplicación
La sensibilidad, o más en concreto el LOD de un análisis viene determinado por la relación de señal y ruido (S/N). Su optimización pasa por incrementar la señal y disminuir el ruido
El LDI (límite de detección instrumental es un indicador más robusto para medir el limite real de detección de un equipo)
Noise
Signal
hSignal = 3(2) x hNoise
Limit of Detection (LOD):
Page 44
Optimizando la sensibilidad
La capacidad de optimización de sensibilidad de un método depende principalmente del tipo de detector, UV-Vis, FLD, ELSD, MS … Desde el punto de vista del pico, se puede hacer que sea más estrecho y por lo tanto más alto aumentando la señal. Puesto que el detector UV-Vis es probablemente el más usual, observaremos como se puede aumentar la sensibilidad en UV-Vis. Más adelante cubriremos las especificidades del LCMS.
Page 45
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
From: “Enhancing Signal to Noise”, John W. Dolan, LC/GC, March, 2010
Factores dependientes del
analito
Longitud de onda
Modificación del analito (*)
Inyección de más muestra (*)
Factores dependientes del
detector
Mejor detector (*)
Incrementar la frecuencia (*)
Mejorar el filtrado (*)
Factores dependientes del sistema (columna,
bomba,etc..)
Reducir anchura de pico (*)
Control de la Temperatura
Pureza de disolventes (*)
Menor ruido de mezcla
(*) Parámetros válidos para cualquier detector en general
Page 46
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
Optimización del Detector UV-VIS
Ruido de línea de base
• Tipo y Geometría de la celda de flujo
• Diseño de la óptica
• Frecuencia de muestreo
• Rendija óptica
Page 47
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
Tipo y Geometría de la celda de flujo
10 mm path length
13 µL volume
4.6 mm i.d. column
+ =
+ =
Short 2.1 mm i.d. column 10 mm path length
13 µL volume
+ =
Short 2.1 mm i.d. column Long path length (10 mm, 0.5 µL) Low light transmission => high noise
Ventajas:
• Alta sensibilidad con bajo volumen de celda.
• Reducción de efectos de IR (Índice de refracción) y térmicos (temperatura del disolvente).
• Diseño en cartucho para comodidad de manipulación e intercambio .
Non-coated fiber (Fused Silica)
Alta transmisión de luz por la tecnología de Total-Internal Reflection (TIR) principle
Page 48
Optofluidic
Waveguides
Agilent Infinity
Diode Array Detector
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
Tipo y Geometría de la celda de flujo
Lampara de D2
Cartucho “Max-Light” Con celda de 3,7 , 10 o 60 mm
Rendija programable
Diode array con 1024 elementos
Difractor Espejo
Page 49
Optofluidic
Waveguides Agilent 1260/90 Infinity Diode Array Detector
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis Diseño de la óptica
Page 50
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis Rendija óptica
nm 230 240 250 260 270 280
Absorbance
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
(mAU)
1 nm
2 nm
4 nm
8 nm
Noise
Rendija programable para optimizar la sensibilidad y la resolución espectral.
Rendija programable
Page 51
• Sample: Phenone Test Mix
• Column: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um
• Gradient: 50 -100% ACN in 2 min
• Temperature: 50°, Flow Rate: 2.5 mL/min
• Signal: 250nm, Bandwith: 20nm
• Reference: 360nm, Bandwidth: 100nm
Hz Height (% Difference) Resolution (% Difference) Efficiency (% Difference)
40 11.3 4.01 23622
20 10.8 (-4.4%) 3.76 (-6.2) 20889 (-12)
10 9.62 (-15%) 3.29 (-18) 15824 (-33)
2.5 4.6 (-59%) 1.34 (-67) 2680 (-89)
Peak Width 0.10 min. (2.5Hz)
Peak Width 0.025 min. (10Hz)
Peak Width 0.013 min. (20Hz)
Peak Width 0.0063 min. (40Hz)
min 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95
mAU
0
2
4
6
8
10
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
Frecuencia de muestreo
Page 52
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
Frecuencia de muestreo
min 0 0.5 1 1.5
mAU
0
2
4
6
8
min 0 0.5 1 1.5
mAU
0
2
4
6
8
Noise(PtoP, 0.5 – 1.5 min) = 1.48 x 10-2 Noise(PtoP, 0.5 – 1.5 min) = 5.43 x 10-2
File size(DAD1A.ch) = 9 KB File size(DAD1A.ch) = 45 KB
Data rate = 10 Hz Data rate = 160 Hz
Page 53
Optimizando la Sensibilidad UV-Vis
Frecuencia de muestreo
Frecuencia óptima para máxima sensibilidad 40 Hz Para éste método
Indice
En esta sesión se abordará :
Introducción
Fundamentos de la técnica LC
Requisitos para el desarrollo de un método
Parámetros de optimización y variables
Especificidad del método LCMS.
Page 55
En LCMS existe dos principales modos de trabajo
Enfoque dirigido (Target)
• Cuantificación de compuestos conocidos
• Lista cerrada de compuestos
• Técnica de máxima sensibilidad
Enfoque NO dirigido (Untarget)
• Identificación de compuestos desconocidos
• Confirmación de compuestos “desconocidos”
• Lista de compuestos a identificar abierta
Consideraciones generales
Agilent 6000 Series LC/MS Portfolio
6200 series TOF
6100 series Quad
6500 series Q-TOF
6400 series QQQ
Alta resolución – Cuali y Cuantitativo
Baja Resolución - Cuantitativo
MS
MS / M
S
Page 57
El enfoque Dirigido o NO Dirigido conlleva el crear un método específico o genérico respectivamente.
La técnica, basada en la formación de iones moleculares, busca el máximo rendimiento del proceso de ionización, cualquiera que sea éste : ESI, APCI, APPI, MALDI, NanoESI, etc….
Consideraciones generales
Sin embargo ambos enfoques buscarán siempre la menor interferencia posible de la matriz por los efectos de supresión iónica que ésta puede generar.
Page 58
El enfoque Dirigido busca siempre la máxima sensibilidad y requiere una mayor optimización del método : Optim.Cromatográfica Mínima coelución : Por supresión iónica Por interferencia espectral Por máximo tiempo dedicado (dwell time) Parámetros de Ionización Parámetros óptimos para cada compuesto (Fragmentor, CE) EMV
Consideraciones generales
Page 59
Consideraciones generales
El enfoque NO Dirigido se conforma con una mínima separación cromatográfica para evitar la supresión iónica. Adquiere en FullScan siempre MS y/o MS/MS. Método simple y sencillo. NO dependiente del compuesto (¿Cuál?) La potencia del enfoque se centra en el tratamiento de los datos de alta resolución. Algoritmos de deconvolución sofisticados pero de fácil manejo para extraer datos del FullScan.
Page 60
Optimizando un método LCQQQ
Obtener el máximo de información posible de la muestra
• Origen, cantidad solubilidad, estabilidad, condiciones de almacenaje.
• Estructura molecular, MW, pK, pI, polaridad.
• Utilizar la técnica de ionización más adecuada : ESI, APCI,….
• Utilizar la polaridad apropiada.
– Negativa para : ácidos, hydroxilos, fosfatos, sulfatos, etc…
– Positiva para : bases, aminas, amidas, antibióticos, etc…
Consultar literatura de trabajos previos en MS para el compuesto.
• http://www.chem.agilent.com/scripts/Library.asp?OPT=OL
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
Utilizar la introducción de muestra más conveniente : infusión, FIA, Cromatografía, CE, etc..
Información previa
Page 61
Optimizando un método LCQQQ
1. Determinar / confirmar el ión precursor por MS2 scan (Protonados, ¿aductos Na+, AcO-,
NH4+, en muestra?
2. Optimizar los parámetros de la fuente basado en la composición de la fase móvil y el flujo?
3. Optimizar los parámetros propios de cada compuesto por FIA (o importar directamente de
una Database)
a. Determinar el Fragmentor óptimo para una máxima transmisión del precursor
b. Determinar la óptima Energía de Colisión para cada compuesto
4. Crear el método de MRM o DMRM
a. Los parámetros de la fuente no suelen cambiar
b. Utilizar los optimizados de cada compuesto: Fragmentor, Product Ions & Collision Energies
• Pueden también importarse de la Database del OPTIMIZER
c. Ajustar la separación cromatográfica en base a un óptimo ciclo (num.puntos por pico)
d. Determinar los segmentos de tiempo, dwell times, o usar Dynamic MRM
e. Inyectar una recta de calibrado y establecer un método de procesado cuantitativo
Desarrollo del Método
MRM dinámico (DMRM)
Mejora de la sensibilidad basado en la
especificidad de la transición a su tiempo
Page 62
tMRM Confirmación espectral de los target sin barrido
ni perdida de sensibilidad
Optimizer
Si no se dispone de Kits de Agilent permite
buscar los valores de adquisición óptimos
para la cuantificación
Counts vs. Acquisition Time (min)
x105
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Segmento 1 Segmento 2
Segmento 3
Segmento 4
Análisis por segmentos vs. MRM dinámico
MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo
La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés
Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Nº de Transiciones Concurrentes =
Rt
Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.
Tiempo de Ciclo
MRM dinámico
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1
Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.
Nº de Transiciones Concurrentes =
Tiempo de Ciclo
MRM dinámico
Resultados típicos: 10 pg Atrazine on-column usando Dynamic
MRM
6460A QQQ with Jet Stream Technology
Avg. Signal Height: 15,650
Avg. Signal Area: 50,966
RSD: 3.2 %
Estimaciín LOQ: < 100 fg
6-7 puntos por encima de media
altura.
3 seg. de anchura a media altura
(FWHM) 6 seg @10% valle
20 puntos de inicio a fin de pico
•
•
•
•
•
•
• •
• • •
• •
•
• • •
•
• • • •
3 sec FWHM
10% valley
Pesticides LC/MS method
Jet stream conditions
Drying gas temperature 275 ºC
Drying gas flow (nitrogen) 6 L/min
Nebulizer gas pressure (nitrogen) 35 psig
Capillary voltage 4000 V
Sheath gas temperature 325 ºC
Sheath gas flow 12 L/min
Nozzle voltage Off
6460A QQQ
settings
MS1 and MS2 resolution Unit
Time Filtering pk width = 0.03
min
Dynamic MRM transitions up to 4000
Constant cycle time 373 ms
Delta EMV 400 V
1200 LC parameters
Column Eclipse Plus-C18, 2.1 x 100mm, 1.8 µm
Column temperature 35 ºC
Injection volume 5.0 L
Autosampler temp 6 ºC
Needle wash flushport (MeOH:H2O 75:25), 5 secs
Mobile phase A = 0.01% formic acid in water
B =5 mM ammonium formate 0.01% formic acid in 95:5 acetonitrile:water
Flow rate 0.3 mL/min
Gradient 0 min 6% B
15 min 95% B
Stop time 20 min 6% B
Post time 1 min
Fragmentor Voltage Collision Energy
QQQ Analyte Optimizer: Máxima Sensibilidad
Optimización Automática de 2 Settings clave
MassHunter Optimizer – Step 1: Compound Setup
First, click the New Project button.
In Compound Setup tab:
• Right-click in the table, and select Add compound.
• Enter compound name and either formula or nominal mass.
• Enter Vial Number.
• Select compound for optimization.
New
Project
Select
compound
FIA to Optimize Fragmentor Voltage
Voltage: 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
EIC 316.2 (clonazepam precursor ion) Optimum Fragmentor Voltage
FIA to Optimize Collision Energy
CE (V): 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
EIC 270.2 (a clonazepam product ion; -NO2)
Optimum Collision Energy
¿Para qué sirve el triggered MRM? Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting
Enfoque de barrido:
Barrido de la huella del compuesto
Estrategia tMRM:
Foco en las características (fragmentos)
del compuesto
Dos posibles escenarios:
- Confirmación de positivos con información adicional
(confirmación espectral)
- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz
Mayor confianza en la confirmación
“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”
Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM
Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM
1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de
confirmación de cada uno de los compuestos detectados
Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple
Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos …
Página 75
Threshold
Secondary MRM
Transitions are “Triggered”
Primary cycle (below threshold)
Triggered cycle (above threshold)
tMRM Product Ion Spectrum
x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
334.2 171.1
145.0
132.1
117.0
105.1 91.1 76.0
tMRM Product
Ion Spectrum
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80
76.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100
91.1
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120
105.1
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120
117.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 100 140
132.1
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120
119.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 100 140 180
145.0 x103
8
7
6
5
4
3
2
1
0 100 140 180
147.0
x103 8
7
6
5
4
3
2
1
0 80 100 120 140 160 180
171.1
334 > 76 334 > 91 334 > 105 334 > 117 334 > 119
334 > 132 334 > 145 334 > 147 334 > 171
Page 78
En muestras complejas de alta carga de matriz, buscar la separación cromatográfica de ésta.
Evitar la coelución con compuetos polares de la matriz. Típicamente éstos compuestos eluyen :
– Durante los -2 minutos en columnas de fase reversa convencionales. – Durante < 1 minuto en columnas UHPLC. – Consejo: durante ése período enviar el lo que eluye de la columna a desperdicio
para evitar que entre en el espectrómetro.
Las separaciones con gradiente son menos propensas a acumular background de la matriz que las separaciones isocráticas. Aún así limpiar la columna a menudo.
Debe considerarse técnicas como patrones con marcaje isotópico, si hay disponibles, para compensar restos de supresión iónica en matrices de alta dificultad (cereales).
Optimizando un método LCQQQ
Supresión Iónica de la Matriz
Page 79
Patrones en
dilución, Sin
Preparación
Extracto de Blanco
de matriz + Adición
de Patrones
Extracto de Blanco de
matriz dopada con
patrones antes de la
extracción
Comparar la
respuesta de área
para determinar la
supresión iónica
Comparar respuesta de área
para determinar la
recuperación de la
extracción
El estudio debería realizarse con múltiples muestras de diferentes orígenes. e.g.
Blanco de orina de diferentes pacientes, blanco de tomate de diferentes especies,
etc.
Evaluación del impacto de la supresión Iónica
Supresión Iónica de la Matriz
Agilent 1290 Infinity LC
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