traducción: síntesis y procesamiento de proteínas traducción
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Enrique Castro, 2003
1© 2011 Enrique Castro
Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas
➢Código genéticoEl proceso general: adaptadoresCaracterísticas del código
➢tRNA y aa-tRNA-sintetasasEstructura de tRNAsaa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos
Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo
➢Estructura de los ribosomasPapel del rRNATipos y mecanismos generales
➢Síntesis ribosomal de proteínasiniciaciónelongación
terminación
regulación
➢Procesamiento post-traduccionalPlegamiento
Modificaciones covalentesDistribución de proteínas a orgánulos.
➢Recambio y degradaciónUbiquitinación y proteasomaLisosomas
Para © Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original
Enrique Castro, 2003
2© 2011 Enrique Castro
Descodificación: adaptador tRNADescodificación: adaptador tRNA
Papeles del RNA• mRNA• rRNA• tRNA
Características del código • tripletes• no solapado• no puntuado• degenerado• universal
Enrique Castro, 2003
3© 2011 Enrique Castro
El código genéticoEl código genético Degeneración
• origen evolutivo• no aleatoria
Señales de control• Codones inicio• Codones stop
ventajas de la degeneración• resistencia a mutaciones• independencia secuencia/composición
•2 primeras bases significativas•tercera posición hipervariable
Enrique Castro, 2003
4© 2011 Enrique Castro
Marcos de lecturaMarcos de lectura
Mutaciones de cambio del marco de lectura
Enrique Castro, 2003
5© 2011 Enrique Castro
Mutaciones: cambios de basesMutaciones: cambios de bases
Enrique Castro, 2003
6© 2011 Enrique Castro
Variaciones del código mitocondrialVariaciones del código mitocondrial
Enrique Castro, 2003
7© 2011 Enrique Castro
Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas
➢Código genético
El proceso general: adaptadores
Características del código
➢tRNA y aa-tRNA-sintetasasEstructura de tRNAs
aa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos
Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo
➢Estructura de los ribosomas
Papel del rRNA
Tipos y mecanismos generales
➢Síntesis ribosomal de proteínas
iniciación
elongación
terminación
regulación
➢Procesamiento post-traduccional
Plegamiento
Modificaciones covalentes
Distribución de proteínas a orgánulos.
➢Recambio y degradación
Ubiquitinación y proteasoma
Lisosomas
Enrique Castro, 2003
8© 2011 Enrique Castro
La traducción es una descodificación bifásicaLa traducción es una descodificación bifásica Reconocimiento del tRNA
• Formación del aminoacil-tRNA• Aminoacil-tRNA sintetasas
Reconocimiento del codón• Apareamiento codón-anticodón
Enrique Castro, 2003
9© 2011 Enrique Castro
Estructura del tRNAEstructura del tRNA
Enrique Castro, 2003
10© 2011 Enrique Castro
Balanceo: apareamientos exóticos en 3ª baseBalanceo: apareamientos exóticos en 3ª base
Lodish, Figure 4-27
Enrique Castro, 2003
11© 2011 Enrique Castro
Funciones de la aminoaciltRNA sintetasasFunciones de la aminoaciltRNA sintetasas
Reconocimiento del tRNA• brazo aceptor• brazo anticodón/microhélice/brazo DHU
Correción• hidrólisis mal-esterificado
activación aa• Enlace anhídrido
TodosVariosUno
Enrique Castro, 2003
12© 2011 Enrique Castro
AminoaciltRNA sintetasas: activación y uniónAminoaciltRNA sintetasas: activación y unión
Figure 429
Each tRNA molecule is recognized by a specific aminoacyltRNA synthetase
Enrique Castro, 2003
13© 2011 Enrique Castro
Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas
➢Código genético
El proceso general: adaptadores
Características del código
➢tRNA y aa-tRNA-sintetasas
Estructura de tRNAs
aa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos
Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo
➢Estructura de los ribosomasPapel del rRNA
Tipos y mecanismos generales
➢Síntesis ribosomal de proteínas
iniciación
elongación
terminación
regulación
➢Procesamiento post-traduccional
Plegamiento
Modificaciones covalentes
Distribución de proteínas a orgánulos.
➢Recambio y degradación
Ubiquitinación y proteasoma
Lisosomas
Enrique Castro, 2003
14© 2011 Enrique Castro
Ribosome structure in prokaryotes & eukaryotesRibosome structure in prokaryotes & eukaryotes
Figure 432
Enrique Castro, 2003
15© 2011 Enrique Castro
Estructura de ribosomas: RNA vs. proteínaEstructura de ribosomas: RNA vs. proteína
rRNA• bases exóticas• alta estructura secundaria• catalítico
Proteina• pequeña• estructurales
L19 (50S)
rRNA 16S (30S)
Enrique Castro, 2003
16© 2011 Enrique Castro
Image reconstruction of an E. coli ribosomeImage reconstruction of an E. coli ribosome
Figure 434
Enrique Castro, 2003
17© 2011 Enrique Castro
Sitios de unión de tRNA en el ribosomaSitios de unión de tRNA en el ribosoma
Enrique Castro, 2003
18© 2011 Enrique Castro
Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas
➢Código genético
El proceso general: adaptadores
Características del código
➢tRNA y aa-tRNA-sintetasas
Estructura de tRNAs
aa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos
Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo
➢Estructura de los ribosomas
Papel del rRNA
Tipos y mecanismos generales
➢Síntesis ribosomal de proteínasiniciaciónelongación
terminaciónregulación
➢Procesamiento post-traduccional
Plegamiento
Modificaciones covalentes
Distribución de proteínas a orgánulos.
➢Recambio y degradación
Ubiquitinación y proteasoma
Lisosomas
Enrique Castro, 2003
19© 2011 Enrique Castro
Iniciación en procariotasIniciación en procariotas
GDP + Pi
Selección codón inicio (procariotas)• AUG internos (múltiples, policistrónico)• AUG precedido Shine-Dalgarno
Shine-Dalgarno
Enrique Castro, 2003
20© 2011 Enrique Castro
Factores de iniciaciónFactores de iniciación
Enrique Castro, 2003
21© 2011 Enrique Castro
Etapas de la elongación de la cadena polipeptídicaEtapas de la elongación de la cadena polipeptídica
Enrique Castro, 2003
22© 2011 Enrique Castro
Entrada del aatRNA: función de EFTu/EFTsEntrada del aatRNA: función de EFTu/EFTs
Enrique Castro, 2003
23© 2011 Enrique Castro
Formación del enlace peptídicoFormación del enlace peptídico
rRNA=peptidil-transferasa• Alta conservación rRNA• Actividad PT tras inactivar proteínas• Mutaciones de resistencia a antibióticos ocurren
en rRNA, no proteínas
• Reacción espontánea (éster -> peptídico)• ΔG invertido en especificar secuencia
Enrique Castro, 2003
24© 2011 Enrique Castro
Translocación: papel de EFGTranslocación: papel de EFG
Enrique Castro, 2003
25© 2011 Enrique Castro
Terminación de la traducciónTerminación de la traducción
Enrique Castro, 2003
26© 2011 Enrique Castro
Antibioticos (1)Antibioticos (1)
Bloquea unión del aa-tRNA al sitio A
[baja]: impide comprobación bases 1-2 del codón
[alta]: bloquea C. iniciación
Bloquea translocación
Enrique Castro, 2003
27© 2011 Enrique Castro
Antibioticos (2)Antibioticos (2)
Inhibe peptidil-transferasa Terminación prematura: reemplaza a aa-tRNA
OH
OHH3C N
CH3H3C
OH
OH
CONH2OH
CH2OH
HH
HO
H
H3CN
OH H
O
H
H2N C
H2+N
NH
OH
NH
OHO
OH
H
N
NN
N
N
HH
OHNH
OCH2
HH
OH
C O
C HH2N
CH2
O
CH3
Puromicina
CH3H3C
HCHO
OHO
OH
HH3C
Estreptomicina
C NH2
N+H2
CH CH
NH C CHCl2
O
OH CH2
OH
O2N
Cloranfenicol
O O
Tetraciclina
CH3
CH3H3C
HO
H3C
HO
OH
O
CH3
CH3
O
H2C
H3C
O
O
O
HO
NCH3
H3C
CH3O
CH3O
O
CH3
CH3
OH
Eritromicina
CH2
C HHO
O
CH3H3C
NH
OO
Cicloheximida
Procariotas, 50S
Eucariotas, 60S
Enrique Castro, 2003
28© 2011 Enrique Castro
Factores de iniciaciónFactores de iniciación
Enrique Castro, 2003
29© 2011 Enrique Castro
Procesos esenciales en iniciación de eucariotasProcesos esenciales en iniciación de eucariotas
Formación del PIC 43S:unión subunidad pequeña y complejo ternario
“Activación” del mRNA:unión de caperuza / poliA
Reconocimienro del inicio:unión AUG-tRNAiGTPasa de eIF2
Reclutamiento de 60S:GTPasa eIF5B
Formación de PIC 48S:reclutamienro del mRNA “activado”escaneo 5'UTR
Enrique Castro, 2003
30© 2011 Enrique Castro
Formación del PIC 43SFormación del PIC 43S
Ayuno/hambreEstrésVirus
recycled
Enrique Castro, 2003
31© 2011 Enrique Castro
Reconocimiento del mRNAReconocimiento del mRNANutrientesInsulina
eIF4F =• eIF4E (unión 5'Cap)• eIF4A (helicasa)• eIF4G (andamio)
mRNA circularizado(iF4E-5' / PAB-3')
Regulación• eIF4-BP inactivado por fosforilación (mTOR)• eIF4E activado por fosforilación (MNK1)
Actividad helicasa eIF4A/eIF4Belimina Est. secundaria 5'UTRavance 50-100 nt
Enrique Castro, 2003
32© 2011 Enrique Castro
Del PIC 48S al complejo de elongación 80SDel PIC 48S al complejo de elongación 80S
Actividad helicasa eIF4A/eIF4B
elimina Est. secundaria 5'UTRavance 50-100 nt Reconocimiento AUG (Kozack)
Primer AUG desde 5'CAP, KozackIRES internos
eIF5 estimula GTPasa eIF2alivia inhibición eIF1 liberación Pi
doble comprobación de apareamiento
GCCA/GCCAUGGsecuencia de Kozack
-3 +1
eiF5B recluta 60SeIF5B reclutado tras eiF2·GDPeIF5B es GTPasa (60S=GAP)
Enrique Castro, 2003
33© 2011 Enrique Castro
Elongación y terminación en eucariotasElongación y terminación en eucariotas
Elongación• EF1(αβγ) = EF-Tu (α) + EF-Ts (βγ)• EF2 = EF-G
Terminación• único eRF1 reconocimiento de codón (=RF1+RF2). GTPasa.
• eRF3: unión a eIF4G (circularización)• eRF3 (disociación)
EF2 inactivado por fosforilación
Traducción múltiple simultánea y reciclado rápido son las claves de sintesis eficiente de proteínas
Enrique Castro, 2003
34© 2011 Enrique Castro
Toxinas inhibidoras de Trad. eucariotaToxinas inhibidoras de Trad. eucariota
T. diftérica• A (catalítico) B (transporte)• ADPribosilación de EF2• Bloqueo de translocación (eucariotas)
Ricina• Despurinación A en 23 S (catalítica)
• Inactivación de 60S
EF2 + NAD+ — nicotinamida + E2F-ADPR
Cicloheximida• Inhibición peptidil- tranferasa
Enrique Castro, 2003
35© 2011 Enrique Castro
Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas
➢Código genético
El proceso general: adaptadores
Características del código
➢tRNA y aa-tRNA-sintetasas
Estructura de tRNAs
aa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos
Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo
➢Estructura de los ribosomas
Papel del rRNA
Tipos y mecanismos generales
➢Síntesis ribosomal de proteínas
iniciación
elongación
terminación
regulación
➢Procesamiento post-traduccionalPlegamientoModificaciones covalentes
Distribución de proteínas a orgánulos.
➢Recambio y degradación
Ubiquitinación y proteasoma
Lisosomas
Enrique Castro, 2003
36© 2011 Enrique Castro
Plegamiento asistidoPlegamiento asistido
Chaperonas• unen zonas hidrofóbicas• evitan agregación/plegamiento prematuro
• HSP70 ubicuo (citosol/RE)• HSP 90 (citosólico)
Chaperoninas• Complejo con cavidad de plegado• Dependiente de ATP
• complejo HSP60 (exclusivo citosol)
Enzimas auxiliares• Proteina-disulfuro-isomerasa (PDI) (exclusivo ER)• Proteina-prolil-isomerasa (PPI)
Enrique Castro, 2003
37© 2011 Enrique Castro
Procesamiento PT: modificaciones covalentesProcesamiento PT: modificaciones covalentes
Generación de extremos• N-terminal: eliminación Met (+hidrólisis)• N-terminal: acetilación (50%)• C-terminal: hidrólisis
Anclaje a membrana (citosol)• miristoilación N-terminal• palmitoilación Cys• prenilación C-terminal (Cys)
Procesamiento ER/Golgi• Eliminación Secuencia señal• Glucosilación (N-, O-)• Inserción en membrana• Puentes disulfuro• Proteolisis/maduración
Unión de cofactores• Enzimas
Modificaciones funcionales• Fosforilación constitutiva (caseína)• Hidroxilación Pro, Lys (colágeno, desmosinas)• Metilación Lys, Glu• γ-carboxilación Glu (F. coagulación)
Enrique Castro, 2003
38© 2011 Enrique Castro
Distribución de proteínas sintetizadasDistribución de proteínas sintetizadas
Ruta citosólica
Ruta secretora
Enrique Castro, 2003
39© 2011 Enrique Castro
Papel del RE/Golgi en la síntesis de proteínasPapel del RE/Golgi en la síntesis de proteínas
Plegamiento• plegamiento inducido por chaperonas• formación de puentes disulfuro
Inserción en membrana• todas las transmembrana
Glucosilación• ER: N-glucosilación estándar• Golgi: O-glucosilación, específica
Maduración proteolítica• Golgi y gránulos de secreción
Ensamblaje de complejos multiproteicos••
Enrique Castro, 2003
40© 2011 Enrique Castro
Secuencia señal: Destino RESecuencia señal: Destino RE
•Longitud: 13-36 aa•1 básico (+) en lado N-terminal•Tramo central hidrofóbico (10-15 aa)•Corte: R pequeña, neutra (opcional)
• Señal N-terminal con corte: proteína N-terminal extracitosólico (secreción)
• Señal interna sin corte: segmentos transmembrana
SRP• RNP• poli-Met en p54
Señal reconocida por partícula de reconocimiento de la señal
Enrique Castro, 2003
41© 2011 Enrique Castro
Importación al RE: SRPImportación al RE: SRP
peptidasade señal
SRP-R• Reconocimiento SRP• GTPasa. GTP hidrolizado
Translocón• Une secuencia señal (N)• Transferencia ATP-dependiente
Enrique Castro, 2003
42© 2011 Enrique Castro
Inserción de proteínas de membranaInserción de proteínas de membrana
Señales topogénicas• secuencia señal N-terminal • secuencia señal interna• secuencia de parada de transferencia
secuencia señal:Básico + 10-15 hidrófobos
parada de transferencia: 20-25 hidrófobos (transmembrana)
Enrique Castro, 2003
43© 2011 Enrique Castro
Plegamiento asistido de proteínas en ERPlegamiento asistido de proteínas en ER
Asistentes de plegado• chaperonas: HSP, calnexina, calreticulina
(retención en ER)• Proteína-disulfuro isomerasa• Prolil-isomerasa (cis/trans)
Control de calidad:Sólo proteínas plegadas correctamente abandonan el ER
(luminal)
(anclada a membrana)
Enrique Castro, 2003
44© 2011 Enrique Castro
Glicosilación estándardGlicosilación estándard•Oligosacárido estereotipado•Construido íntegramente sobre Dolicol-P•Tranferido íntegro sobre N-Asn•Bloqueable por tunicamicina
-N-X-S/T-
Enrique Castro, 2003
45© 2011 Enrique Castro
Maduración por proteolisis Maduración por proteolisis
vía de secreción constitutiva vía de secreción regulada
en el Golgi
en gránulos de secreción
Proalbúmina
Albúmina
Proinsulina
Insulinacirculante
Enrique Castro, 2003
46© 2011 Enrique Castro
Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas
➢Código genético
El proceso general: adaptadores
Características del código
➢tRNA y aa-tRNA-sintetasas
Estructura de tRNAs
aa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos
Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo
➢Estructura de los ribosomas
Papel del rRNA
Tipos y mecanismos generales
➢Síntesis ribosomal de proteínas
iniciación
elongación
terminación
regulación
➢Procesamiento post-traduccional
Plegamiento
Modificaciones covalentes
Distribución de proteínas a orgánulos.
➢Recambio y degradaciónUbiquitinación y proteasoma
Lisosomas
Enrique Castro, 2003
47© 2011 Enrique Castro
Mecanismos de degradación de proteínasMecanismos de degradación de proteínas
Citosólico• Ubiquitina/proteasoma• Dependiente de ATP• Regulado por señales en sustratos
sustratos:•Proteínas T
1/2 corto (señales)
•Proteínas defectuosas
Lisosomal• Hidrolasas lisosomales (acídicas)• Independiente de ATP• Muerte por necrosis
Ca2+-proteasas• Citosólico• Muerte por necrosis
sustratos:•Proteínas T
1/2 largo
•Proteínas de membrana•Proteínas extracelulares
sustratos:•inespecífico
Enrique Castro, 2003
48© 2011 Enrique Castro
Recambio regulado de proteínas: ubiquitinaRecambio regulado de proteínas: ubiquitina
• pequeña, 76 aa• muy conservada• 7 Lys (aceptoras)
C-terminal Ub se une a ε-N-Lys
Ubiquitina= etiqueta de destrucción
Genes de Ub:• Fusión (Ub-L40, Ub-S27)• Locus poli-Ub
• proteasa de procesamiento
poli-Ubiquitinación:•Ub-COOH --> N-Lys-Ub
Enrique Castro, 2003
49© 2011 Enrique Castro
Mecanismo de ubiquitinaciónMecanismo de ubiquitinaciónUna E1 (enzima activadora de ubiquitina)Pocas E2 (UBC enzima conjugante de ubiquitina)Muchas E3 (proteína-Ub ligasas)(reconocimiento del sustrato)
E1:• activa Ub (AMP)•Transfiere a E2 (SH)
E2:• reserva de Ub activada• Donador de Ub
E3:• Transferencia al sustrato• Determinante de especificidad de sustrato(reconocimiento de señales)
Enrique Castro, 2003
50© 2011 Enrique Castro
Señales de ubiquitinación: especificidad E3Señales de ubiquitinación: especificidad E3 N-Terminal
• mecanismo básico (procariotas)
•
D-box• ciclinas
KEN-box• Securinas
Secuencias PEST• F. transcripción homeóticos• Enzimas metabólicas• Proteínas de señalización
Daño molecular• Oxidación/desplegado
Señales leídas por E3(especificidad de unión)
Enrique Castro, 2003
51© 2011 Enrique Castro
Proteasoma 26S: degradador de proteínasProteasoma 26S: degradador de proteínas
Complejo 26S:• Barril 20S: catalítico• Tapa 19S: reguladora
19S:• impide acceso inespecífico• Unión poli-Ub• Isopeptidasa (liberación Ub)• ATPasa: transferencia a cavidad
20S:• Centro activo interno (N-terminal de beta)
• Procesiva, intermedios no liberados
• Producto:péptidos 7-9
nucleofilo interno: previene ataque inespecífico
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