trabajo de expo amilasas
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍAESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
“TECNOLOGIA DEL BIOPROCESAMIENTO DE AMILASAS”
CURSO: BIOINDUSTRIASDOCENTE: Ing. Augusto ,CASTILLO CALDERON.
CICLO: IX
Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 1
“TECNOLOGIA DEL BIOPROCESAMIENTO DE
AMILASAS”
“TECNOLOGIA DEL BIOPROCESAMIENTO DE
Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 2
AMILASAS”
I. INTRODUCCION:
Las Amilasas son una familia de enzimas que rompen el almidón (polisacárido),
primero en cadenas cortas y luego en glucosa libre. Las amilasas son utilizadas en
cervecería, en panificación e industria textil. La principal aplicación de las amilasas es
en la industria cervecera. El problema en la fabricación de la cerveza en que las
levaduras sólo son capaces de fermentar las hexosas (principalmente, glucosa). También
pueden utilizar como fuente de energía a los disacáridos, como la sacarosa y la maltosa,
los cuales son degradados a monosacáridos por enzimas hidrolíticos de la célula. La α-
amilasa (1,4, α-glucanohidrolasa) es una enzima extracelular que hidroliza los enlaces α
1-4 glicósidicos de polisacáridos, tales como el almidón, glicógeno o productos de
degradación de los mismos.
Tiene una actividad enzimática que oscila entre 53-129 U/L, su peso molecular va de
los 40 000 a 50 000 Da, su actividad requiere de la presencia de iones cloruro. Esta
enzima tiene importancia en la industria alimentaria como: dulcería, cereales y
panadería, y específicamente en la sacarificación maltogénica, sin embargo, su
producción es limitada y es un producto de exportación. La α-amilasa que es producida
de manera natural por Aspergillus oryzae tiene un peso molecular de 52 x 310. Las
enzimas de origen microbiano presentan ventajas técnico-económicas: poseen tiempos
de generación menores, tienen requerimientos de espacio menor por unidad de enzima
producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la disponibilidad de nuevas
enzimas. Los preparados industriales de enzimas, se caracterizan por la actividad
particular de la enzima deseada, por el efecto del pH, temperatura, tiempo de reacción,
concentraciones de la enzima y del sustrato, así como el efecto de los inhibidores o
activadores, que pueden presentarse en las aplicaciones industriales. La producción de
una enzima, incluye dos etapas principales: la fermentación, en la que se multiplica el
microorganismo productor de la enzima, y la de recuperación y purificación en la que se
aísla la enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. En la industria se
utilizan más los preparados enzimáticos, pues la purificación de la enzima podría
representar costos adicionales en la producción de alimentos. La calidad de la enzima
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está en función de la fermentación, pues esta influye directamente en la
coloración, olor y estabilidad de la enzima.
La β- amilasa o α- 1,4 glucan – maltohidrolasas es una exoenzima que ataca los
enlaces α- 1,4 glucosídicos en la parte externa de la cadena de almidón, la β- amilasa
separa unidades de maltosa a partir de extremos no reductores de esta por hidrolisis
alternas de enlaces glucosídicos (Pedroza, 1999). Las β amilasa atacan la amilosa solo
desde un extremo a la vez, y a causa de ello, son mucho menos afectivas que las α-
amilasas (Baker,1994 ).
Debido a que esta enzima está imposibilitada para hidrolizar los puntos ramificados α-
1,6 en la molécula de almidón, los productos finales de la acción sobre el sustrato son
maltosas y dextrinas. Formándose pocas cantidades de maltotriosas y glucosa.Las β-
amilasas contienen un grupo sulfhídrico esencial para la actividad enzimática, que se
lleva acabo de forma óptima en un rango de Ph entre 4 y 5.La actividad de la enzima se
analiza mediante métodos colorimétricos que miden la cantidad de azucares reductores,
liberados a partir del almidón. Estas enzimas están presentes en gran número de
bacterias Gram positivas formadoras de esporas, (Gonzales , 2002). Aunque el
rendimiento en las cepas silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes
que producen 200 veces más enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993).
II. OBJETIVOS:
- Conocer los microorganismos más utilizados en este campo y los sustratos mas característicos para la producción de amilasas.
- Conocer los productos comercializados en el mercado en base a microorganismos productores de amilasas.
- Conocer las aplicaciones de las amilasas en la industria alimentaria
- Dar a conocer investigaciones recientes en el campo de la producción de amilasas.
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III. ANTECEDENTES:
La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en Dinamarca y
Japón, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las primeras preparaciones de
renina a partir del estómago de terneros y de amilasa de origen fúngico.
Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como
productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa
Esta familia de enzimas hidrolíticas está compuesta por a proteínas catalíticas: alfa-
amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran ampliamente
distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradación
del almidón en la germinación de las semillas; en tejidos animales, cumpliendo una
misión digestiva; y en diversas especies de microorganismos como hongos y bacterias.
Como bien es conocido las cadenas de almidón están compuestas por dos grandes sub-
cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por atacar los enlaces
1,4-alfa-glicosídicos en el centro de la cadena de los polisacáridos, por lo que se la
conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligosacáridos.
La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y pequeños
compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de degradar
parcialmente la amilopectina y el glucógeno debido a que no es capaz de desdoblar los
enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificación de la cadena del
polisacárido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantas y bacterias, también
cumple la función de degradar los enlaces 1,4-a-glucosídicos.
Importancia del bioproducto:
Mundialmente, la producción de enzimas está desarrollándose aún más, bajo el
principio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicación de esta
industria gira en torno a países industrializados que tienen la capacidad de investigar y
producir a gran escala lo cual margina a países menos desarrollados a causa de carencia
de recursos, infraestructura y desarrollo en el campo biotecnológico. Sin embargo, esta
afirmación no ha sido un impedimento para que en diversos lugares del mundo se
investigue en el área de la enzimología y el impacto que estas ocasionan en los procesos
y reacciones químicas. Las enzimas amilasas son las más estudiantes en este campo
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debido a su influencia directa en la degradación del almidón, uno de los
productos alimentarios más explotados a nivel mundial.
Las enzimas son productos de las células y por lo tanto pueden obtenerse a partir
de tejidos animales, tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación empleando
microorganismos seleccionados. Las plantas han sido la fuente tradicional de ciertas
enzimas. La cebada malteada también ha sido fuente importante de enzimas vegetales.
La industria cervecera ha empleado tradicionalmente este material crudo por su
actividad proteásica y amilásica. Debido a que las aplicaciones industriales de las
enzimas requieren que estas sean producidas a gran escala y bajo costo, el empleo de
algunas enzimas de origen vegetal y animal ha ido decayendo, a favor de las enzimas de
origen microbiano.
Países productores:
Unas 20 Compañías de Europa, Japón y Estados Unidos Realizan la Producción de
Enzimas, pero el mercado es dominado por 3 de Ellas:
Compañía Países (%)
Novo Nordisk Dinamarca Con El 50% de Las
Ventas a Nivel
Mundial
Gist
Brocade
s
Neatherlands Con El 35% de Las
Ventas a Nivel Mundial
Rhom
and
Haas
Alemania Con El 15% de Las
Ventas a Nivel Mundial
El mercado de las enzimas ha tenido gran crecimiento a partir de los Años 70. En la
Industria Alimentaría. En América latina existen empresas productoras de enzimas en:
México, Brasil, Argentina y Uruguay.
En Colombia hay una enorme producción de enzimas una escala industrial, siendo
Importadas de Diversos Países de Europa, de Japón, Estados Unidos, Canadá y México.
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Usos y aplicación de las enzimas:
Reducir viscosidad (hidrólisis).
Mejorar extracciones (degradación de pectina).
Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa).
Sustitución de ingredientes y coadyuvantes en procesos.
Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para
disolver almidones en determinados procesos industriales.
En la maduración de frutas la amilasa es sintetizada en la
maduración, degradando el almidón de las frutas en azúcar, y
volviéndolas más dulces.
Ahorro con procesos más eficientes obteniendo menos
subproductos indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento
de rendimiento de producto.
Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto
único (jarabe de alta concentración de fructosa)
APLICACIONES DE LA ALFA AMILASA EN PROCESOS
INDUSTRIALES:
INDUSTRIA USO
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Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos, a que
tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de trabajo).
Además, lograr más material procesado con el mismo equipo y menos consumo de energía
también ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industria alimentaria nos ofrece la ventaja
de:
Glucosa y jarabes Hidrolisis parcial o total del almidón de maíz para obtener gran cantidad de edulcorantes.
Elaboración de papel Licuan el almidón que ocasiona problemas de viscosidad en la aplicación de fibras (pero variable del papel).
Textiles Licuar el almidón aumentando su solubilidad y mejorando la manufactura de textura.
Panificación Durante el esponjamiento y fermentación de la masa
aceleran la fermentación en la masa, un desprendimiento
gaseoso mayor y uniforme, aumenta el volumen y textura
del pan con una miga de porosidad más fina y de costra más
uniforme y coloreada.
Tabla 1.Aplicación de la alfa amilasa en procesos industriales
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Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el mercado enzimático llegando a
sustituir completamente procesos de hidrolisis química en la industria del
almidón. Esto se debe a una característica esencial dentro de esta familia de
proteínas. La termoestabilidad de esta enzima, industrialmente, ha hecho que
las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos procesos
Tabla 2. Acción que ejerce sobre el almidón de la fosforilasa, α-
glucosidasa, α- amilasa, β-amilasa y enzimas desrramificadoras.
IV. MATERIA PRIMA:
Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse como medio de
cultivo varían naturalmente según la enzima por elaborar y pueden ser de los siguientes
orígenes:
a) Materias azucaradas o amiláceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y
afrechos de trigo, arroz o maíz;
b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, caseína, gelatina
y afrechos de extracción de semillas oleaginosas;
c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea;
d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados
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de levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas y eventualmente
vitaminas.
- El sustrato principalmente utilizado en la producción de cerveza es el almidón
de cebada, el cual es degradado por las amilasas.
Otro proceso industrial en que participan estos tipos de enzimas es en la obtención de un
edulcorante con alto contenido en fructosa a partir de almidón de maíz, para la
producción de amilasas.
- Fuente de energía: industrialmente predomina el empleo de almidones y
melazas.
- Fuente de carbono: melaza.
- Fuente de nitrógeno: genermente se emplean sales de amonio o amoniaco, pero
ciertos microorganismos y para ello se utilizan productos en las formas mas
económicas con mayor contenido de nitrógeno por ejemplo: derivados de
caseína, soya, levadura.
- Fuentes de minerales: K ,Mg, Fe, fosfatos y sulfatos a los medios de cultivo.
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Fuentes Materia prima ,
sustratos , insumos.
C Melaza ,alfrechos de
trigo, almidon de maíz.
N Derivados de caseína,
soya.
Fuentes minerales K ,Mg, Fe, fosfatos y
sulfatos a los medios de
cultivo
Fuente de energía industrialmente
predomina el empleo de
almidones y melazas.
V. MICROORGANISMOS SOBREPRODUCTORES:
Tabla 3: de microorganismo productores de β-amilasas en la industria
alimentaria
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Aunque el rendimiento en las cepas silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes que producen 200 veces más enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993).
microorganismos productores:
Bacillus polymyxa
B. cereus
Streptomyces sp.
Rhizopus japonicus.
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Carbohidrasas:
Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas
responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los enlaces
glucosídicos a-1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos:
a amilasas las cuales rompen al azar los enlaces en el interior del
sustrato (endoamiladas).
b- amilasas las cuales hidrolizan ordenadamente unidades de maltosa
a partir de los extremos no reductores del sustrato (exoamilasas) y
glucoamilasas que liberan unidades de glucosa a partir de los
extremos no reductores del sustrato
VI. BIOPROCESAMIENTO TECNOLOGICO
Elaboración de enzimas de origen animal o vegetal: Si se trata de enzimas de
origen animal la simple trituración de algunos tejidos especializados, como el
páncreas o el hígado, permite formar una papilla, la cual se extrae a continuación
con un solvente adecuado como agua, acetona fría
(-20°C ), glicerina o una solución salina. En forma parecida se procede con los
tejidos vegetales, previamente sometidos a trituración o disrupción (rotura).
También puede partirse de los jugos de expresión de los respectivos tejidos, cuya
estructura celular se destruye por autolisis, plasmólisis o por congelación, la cual
revienta las paredes celulares.
Elaboración de enzimas de origen microbiano. Actualmente la tendencia
industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos por aquellas
que resultan de la aplicación de cultivos de microorganismos seleccionados, que
generan la enzima específica. La producción de enzimas por microorganismos
tiene la ventaja de su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo
relativamente breve: Por ejemplo, 1 a 5 días en el caso de una fermentación
discontinua por lotes ("batch"). Además, se puede incrementar el rendimiento de
una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a modificar sus
condiciones ambientales, o bien, a formar por vía genética cepas mutantes, en las
cuales la producción de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa
original. De este modo procesos de selección, adaptación y mutación han mejorado
considerablemente la producción de enzimas a partir de microorganismos.
Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y
extracelular, es decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las
genera; pues entonces no precisan de la ruptura de las células microbianas para su
extracción como es necesario en las enzimas intracelulares de biosíntesis.
La elaboración de enzimas de origen microbiano comprende diferentes etapas:
1. Selección de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de
enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la
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firma American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization
Research Branch o de otro organismo o instituto reconocido.
2. Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse
como medio de cultivo varían naturalmente según la enzima por elaborar y pueden
ser de los siguientes orígenes:
a) Materias azucaradas o amiláceas: como melaza, jarabe de glucosa, almidones y
afrechos de trigo, arroz o maíz.
b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, caseína,
gelatina y afrechos de extracción de semillas oleaginosas.
c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea;
d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y
autorizados de levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas y
eventualmente vitaminas.
Fuera de la composición del medio constituyen parámetros importantes que
deben controlarse en el cultivo, las condiciones óptimas del caso, en cuanto a
temperatura, pH, aireación (para suministrar el oxígeno necesario y evitar
exceso de calor de reacción), y velocidad de agitación.
En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentación se distingue entre:
---- Los cultivos en superficie de medios líquidos o semisólidos, usándose ya sea
sartenes o tambores rotatorios, y cultivos en profundidad, actualmente más usados,
mediante tanques agitados, de lecho fijo o de lecho fluidizado (partículas
suspendidas y agitadas, lo que facilita su mezcla y circulación.
Terminada la incubación del proceso fermentativo se separa la biomasa junto con
el resto de las células y los componentes sólidos del medio de cultivo por filtración
o centrifugación. El liquido resultante, generalmente aún bastante heterogéneo,
puede utilizarse directamente como preparado enzimático; Pero, generalmente, se
somete a una purificación y/o aislamiento posteriores, que comprenden diferentes
fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas de origen vegetal o animal.
Purificación y aislamiento de enzimas.
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1. Sin perjuicio que un preparado enzimático puede consistir en el mismo
extracto o caldo fermentado que sólo se somete a una clarificación y
concentración (preparado líquido) o desecación (preparado sólido) se recurre
también a métodos de aislamiento y purificación de enzimas en gran escala, lo cual
se logra principalmente por los siguientes procesos:
2. Adsorción selectiva con hidróxidos de hierro o aluminio coloidales: a cierto pH,
pues no todas las proteínas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida
se lava con agua o solución salina y luego sé eluye a pH diferente, generalmente
alcalino mediante otra solución salina, por ejemplo, de fosfato.
3. Por precipitación, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad
hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adición de sales a cierto pH y a
elevada concentración iónica o por solventes orgánicos (alcohol, acetona,
isopropanol) a baja temperatura. La sal más usada es el sulfato de amonio por su alta
solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la
viscosidad de la solución.
4. Diálisis por gradientes de concentración a través de membranas semipermeables.
5. Ultrafiltración por aspiración o presión a través de membranas de porosidad fina
como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas,
pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura .
6. Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidón, agar o dextrano.
7. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina,
como en columna con intercambiadores iónicos, geles o tamices moleculares.
El control de todas estas etapas en su forma más rigurosa, es necesario para
asegurar el máximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de
los productos enzimáticos obtenidos.
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VII. AVANCES TECNOLOGICOS Y CIENTIFICOS:
“PRODUCCIÓN DE AMILASA POR EL CULTIVO DE Aspergillus sección nigri”
OBJETIVO GENERAL:
Producción de amilasas en fermentación de cultivo sumergido de Aspergillus
Nigri.
ANTECEDENTES:
Son muchos y variados los antecedentes tanto del cultivo de Aspergillus y otros
hongos filamentosos, como en la producción de diferentes metabolitos, como las
enzimas. Sin embargo el estudio de los microorganismos como productores de
enzimas, es sumamente bajo, siendo de aproximadamente del 2%, y este porcentaje
no incluye solamente a los hongos, sino que también las incluye a las bacterias.
El trabajo de laboratorio llevado a cabo fue posible gracias a que los
microorganismos utilizados tienen un corto tiempo de crecimiento, su cultivo es
fácil, que sus exigencias nutritivas son sencillas y manejables y que los
procedimientos de screening para las características deseadas son más fáciles.
Existe una asociación de comerciantes de enzimas denominada “The Association of
Microbial Food Enzyme Producer”; en dicha asociación figuran empresas de
diversos países como USA, Alemania, Inglaterra, Países Bajos, Dinamarca, Japón,
Italia, etc., pero no figura la Argentina, ni como productor ni como comerciante.
Demostrando que no está desarrollada en la industria de los alimentos, el área de la
producción de metabolitos utilizando microorganismos productores de los mismos,
perdiendo una oportunidad de desarrollo muy importante.
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
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Los medios utilizados fueron el Papas Dextrosa Agar (PDA), para el
aislamiento primario y como medio formulado y seleccionado previamente
para la fermentación se utilizó el medio 09 con la siguiente composición
Todos los medios ensayados anteriormente tienen como componente básico más
importante el almidón, ya que el mismo puede ser degradado hasta azúcares
sencillas. Pero el caldo 09 fue el que mejor resultado manifestó.
MICROORGANISMOS EMPLEADOS:
Cepas salvajes de Aspergillus Sección Nigri aisladas en PDA.
BIOPROCESAMIENTO TECNOLOGICO:
Preparación del Inoculo:
Cepas de Aspergillus Sección Nigri, aisladas del medio ambiente, e identificado su
género y sección, fueron sembradas en PDA hasta que el desarrollo de la colonia
alcanzo 4 cm de diámetro aproximadamente y con manifiesta esporulación. De la
colonia obtenida se extrajeron esporas, procediendo a su suspensión en solución
fisiológica estéril, para poder realizar siembras en placa con medio 09, realizando
diferentes repiques he incubando en estufa de cultivo, durante 10 días a temperatura
ambiente.
Fermentación
El proceso se realizó en un fermentador Cole Parmer , con un tanque reactor que
cuenta con una capacidad de 2 litros, el equipo cuenta con un sistema de aireación,
utilizando aire filtrado, posee un sistema de mezclado del sustrato para una óptima
transferencia de masa, el método utilizado para el ensayo es en cultivo sumergido,
utilizando una velocidad de agitación de 50 rpm , a una temperatura de incubación de
30°C y un pH=2. La preparación para la operación del fermentador fue realizada
Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 18
teniendo en cuenta el cierre hermético de todas sus válvulas y su posterior
esterilización a 121°C durante 15 minutos; procediéndose a su inoculación.
Se tomaron muestra en forma diaria del sustrato fermentado para ensayar la
posible presencia de actividad amilolítica en el mismo.
Detección de la presencia de amilasas
La existencia de actividad amilolítica en las cepas ensayadas se determinó “in situ”
utilizando el procedimiento amiloclástico de la hidrolisis del almidón por la
disminución de la formación del complejo almidón-yodo. Observando la ausencia de
almidón detectable por este método.
Los ensayos de screening para comprobar la presencia de actividad amilolítica en el
sustrato fermentado se realizaron agregando 1 ml del mismo a 1 ml de lugol
detectando la presencia de actividad amilolítica por la ausencia de almidón
detectable.
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Foto 2: Fotografía del fermentado utilizado
Foto 1: Microfotografía de Aspergillus Sección Nigri. (40X)
Resultados:
Las fermentaciones ensayadas utilizando el método de cultivo sumergido de Aspergillus
Sección Nigri. se llevo a cabo durante 10 días, en este tiempo el microhongo desarrollo
floculos, sin esporulación, con un tamaño promedio de los mismos de aprox. 2 cm
(Foto1). El tamaño de los mismos fue influenciado por la velocidad de mezclado
utilizado, si se aumenta la velocidad, disminuye el tamaño del mismo. Al finalizar los
ensayos de las fermentaciones, el almidón había sido degradado completamente. Al
utilizar un caldo que tiene un sustrato de almidón como única fuente de carbono indica
que la capacidad amilolítica desarrollada por el hongo es importante.
Conclusiones:
Teniendo presente que es factible la producción de amilasas en fermentación de cultivo
sumergido de AspergillusSección Nigri, y su amplia utilización tanto en las industrias
alimenticias, textiles y farmacéuticas es importantecontinuar con futuros ensayos y el
estudio de diversos parámetros.
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BIO-PROCESAMIENTO DE LA CÁSCARA DEL PLÁTANO PARA LA PRODUCCIÓN DE AMILASA POR Penicillium sp.
INTRODUCCIÓN
Las amilasas se utilizan en las industrias de procesamiento de almidón para la hidrólisis
de los polisacáridos tales como el almidón en azúcar constituyentes simples . Para
satisfacer la demanda de estas enzimas en las industrias, se requiere un medio de bajo
costo para la fermentación de la amilasa . El proceso de estado sólido de fermentación
(SSF) ofrece una mejor oportunidad para la biosíntesis de productos de alto costo con la
ayuda de un medio de bajo costo. Residuos agroindustriales son generalmente
considerados como el mejor sustrato ; y los usos de los desechos agrícolas hacen SSF un
método alternativo atractivo . En Asia, se ha estimado que alrededor de 20.000
toneladas de cáscara de plátano se descartan anualmente de sus plantas de
procesamiento; presenta serios problemas ambientales. Se estimó que las cáscaras de
plátano contienen 14.6% de glucosa y 56% de sacarosa . Que se realizó un aumento de
la atención a la utilización de diferentes desechos agroindustriales para la agregación de
valor mediante SSF por hongos filamentosos. Las especies de hongos tales como
Aspergillus, Rhizopus y Penicillium se considera que son los principales productores
de amilasa. El objetivo principal del presente estudio es el de utilizar la cáscara de
plátano para la producción de amilasa por Penicillium sp. y la reducción sustancial de la
contaminación agroindustrial para el medio ambiente.
MATERIALES Y METODOS
El aislamiento, la detección e identificación de Penicillium sp.
Pulpa de coco contaminado se recogió del campo de la agricultura y el crecimiento
filamentoso se evidenció la presencia de hongos. El organismo fue recogido
asépticamente y se cultivaron en agar de dextrosa de patata (PDA) y se incubó a 37 ° C
durante 4 días. Las colonias que aparecieron en las placas de agar PDA fueron
transferidos a Czapck levadura autolisado (CYA) placas de agar bajo condiciones
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estériles para la purificación y la caracterización adicional de la cultura como se
recomienda por Singh et al. . El medio de agar CYA se compone de (g L)
NaNO3, 3,0, K2HPO4, 1,0, KCl, 0,5, MgSO4.7H2O, 0,5, FeSO4.7H2O, 0,01,
extracto de levadura, 5,0, sacarosa, 30,0, 15,0 agar y solución de metal traza , 1,0 ml. La
solución de metales traza se compone de ZnSO4.7H2O, 1,0 g; CuSO4.5H2O, 0,5 g en
100 ml de agua destilada. Las placas inoculadas se incubaron a 37 ° C durante 7 días.
Revisión preliminar de especies de hongos para la actividad de la amilasa se detectó en
almidón método de la placa de agar según lo descrito por Hols et al. [10]. Además, el
organismo se identificó tentativamente como Penicillium sp. basado en características
morfológicas y la observación microscópica.
Mantenimiento del cultivo e inóculo
Penicillium sp. se cultivó en cultivos inclinados PDA, cultivadas durante 6 - 8 días
para la esporulación y almacenados en un refrigerador a 4 º C para su posterior
inoculación. El inóculo se preparó añadiendo 10 ml de agua destilada estéril y se
transfiere a una cultura PDA inclinación esporulado. Las esporas fueron desalojados con
la aguja de inoculación en condiciones asépticas y la suspensión se utilizó con una
dilución adecuada como inóculo . Un ml de suspensión de esporas contenía
aproximadamente 5 x 106 esporas.
Sustrato
El plátano rojo se obtuvo de la mercado de la fruta local en Nagercoil y pelado. La
cáscara se lavó con agua del grifo, seguido de agua doble destilada para eliminar las
partículas de polvo. Se corta y se secó al aire seguido por el secado al sol durante 8 a 10
días. Las piezas secas se pulverizan, se tamizaron, y se almacenaron a temperatura
ambiente.
Agitar cultivos en matraz
En el presente estudio, Penicillium sp. se cultivó en un sistema de cultivo sumergido en
un medio que contiene polvo fino 2,5% cáscara de plátano y el pH se mantuvo a 7,0,
mediante la adición de NaOH 1 N / HCl. Matraz Erlenmeyer que contiene 150 ml de
medio líquido se inoculó con un ml de suspensión de esporas y se incubó a 37 º C y 150
rpm durante cinco días. Diez ml de medio de cultivo se retiró cada 24 h y la actividad de
la amilasa se ensayó. Este experimento se realizó principalmente para determinar el
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período de incubación aproximado para la producción de amilasa, ya que, en
cultivos en matraz de agitación, los parámetros se pueden controlar mucho más
eficazmente que por la SSF.
Fermentación en estado sólido (SSF)
Pellicillium sp. se hizo crecer en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 5,0 g de
la cáscara de plátano. El pH del medio de fermentación se ajustó a 7,0 con tampón
fosfato (0,1 M, pH 7,0) y el contenido de humedad se mantuvo a aproximadamente
75%. El contenido del matraz se mezcló a fondo y se esterilizó en un autoclave a 121 º
C y se enfrió a temperatura ambiente. El sustrato no se enriqueció con sales minerales
durante todo el experimento. Un ml de la suspensión de esporas se inoculó y se incubó a
37 º C. El matraz fermentado se hace girar suavemente cada 12 h para facilitar la mezcla
uniforme. Después de cuatro días de incubación, se añadió 40 ml de agua destilada
doble esterilizada al matraz de Erlenmeyer fermentado. La mezcla se agitó durante 30
min a temperatura ambiente (155 rpm / min) y la suspensión se apretó por tela de
muselina, seguido por centrifugación. Se obtuvo una solución clara y se utilizó como la
enzima en bruto.
Ensayo enzimático
La enzima amilasa se ensayó de acuerdo con el método descrito por knMiller . La
mezcla de reacción consistió en 0,5 ml de solución de enzima en bruto y 1 ml de
almidón soluble (1%, w / v) preparado en tampón de fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,0).
La mezcla se incubó durante 30 min a 37 º C y un ml de ácido dinitrosalicílico se añadió
una solución (DNS) y se hirvió durante 10 min. El volumen se completó hasta 20 ml
con agua destilada. La absorbancia se leyó a 540 nm usando un espectrofotómetro UV-
Visible. Una unidad de actividad de la amilasa se define como la cantidad de enzima
que libera 1 μ mol de azúcar reductor como glucosa / min bajo condiciones ensayadas.
Estimación total de proteínas
El contenido de proteína total de la muestra de enzima se determinó como se ha descrito
por Lowry et al. Usando albúmina sérica bovina como estándar (1mg/ml).Impacto de
los parámetros del proceso de producción de amilasa durante la fermentación en estado
sólido y sus propiedades Los parámetros de proceso importantes que influyen en la
síntesis de la amilasa por Penicillium sp. en las propiedades de fermentación y enzimas
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de estado sólido fueron estudiados. La estrategia seguida fue, para optimizar
cada parámetro, independiente de los otros y se emplearon condiciones óptimas
posteriormente en todos los experimentos.
Optimización de la producción de amilasa de Penicillium sp.
Parámetros de proceso importantes que afectan a las producciones de amilasa durante la
fermentación en estado sólido (SSF) se han optimizado, a saber, el período de
fermentación, el contenido de humedad y pH. Para la optimización del período de
fermentación, el organismo se cultivó a 37 º C en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que
contiene 5 g de cáscara de plátano. El pH del medio se ajustó a 7,0 con un tampón
fosfato (pH 7,0, 0,1 M). La producción de amilasa se estudió mediante la recolección
del cultivo después de cada 24 h durante cinco días. El contenido de humedad aplicado
fue 30, 40, 50, 60, 70 y 80% (masa / volumen). El pH del medio de fermentación (3.0,
4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0) se ajustó con una solución de tampón adecuado antes de la
inoculación, y se estudió la producción de amilasa. Los experimentos se llevaron a cabo
a 37 ° C, a 150 rpm / min en un agitador rotatorio y la producción de la enzima se
determinó a partir de la enzima en bruto.
Propiedades de las enzimas
Se estudiaron las propiedades importantes de Penicillium amilasa. El efecto del pH
sobre la actividad de la enzima fue encontrado por la incubación de la amilasa en bruto
con un tampón 0,1 M que varió desde 3,0 hasta 8,0 (tampón de citrato, pH 3,0, tampón
de succinato, pH 4,0 y 5,0, tampón fosfato, pH 6,0 y 7,0, tampón Tris , pH 8,0) durante
30 min a 37 ° C y la actividad enzimática se ensayó como se describió anteriormente. El
efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática se determinó mediante la
incubación de la muestra de enzima en bruto a temperaturas que varían de 30 a 70 º C
durante 30 min y la actividad de la enzima se ensayó. La estabilidad térmica de una
amilasa se determinó mediante la incubación de la enzima sin sustrato a 50 ° C durante
1 h y el porcentaje de actividad enzimática residual se ensayó.
La purificación parcial de Penicillium amilasa
Enzima amilasa se purificó parcialmente mediante la aplicación de 3 pasos diferentes.
Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 2-8 º C hasta que se indique lo
contrario.
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Paso 1: fraccionamiento de sulfato de amonio
Amilasa crudo se fraccionó mediante la aplicación de sulfato de amonio sólido que
oscila entre 27 y 33% (g/100 ml). La solución se mantuvo a 2-8 ° C durante 4 h y se
centrifugó a 10000x g durante 10 min. El precipitado se disolvió en un volumen mínimo
de tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 7,0) y la actividad de la amilasa se ensayó.
Paso 2: cromatografía en columna de Sephadex G-75
La muestra obtenida desde el paso 1 se dializó durante la noche contra el tampón (pH
7,0) y se aplicó en Sephadex G 75 (Amersham Biosciences, Suecia) en columna (1,5 ×
40 cm). Se pre-equilibrada con tampón de fosfato de sodio (pH 7,0, 0,05 M) y se diluyó
con el mismo tampón. La tasa de flujo se ajustó a 1,0 ml min-1 y veinte fracciones (2,5
mL cada uno) fueron recogidas. El perfil de proteínas se representó mediante la
observación de su absorbancia a 280 nm. Las fracciones activas se sometieron para la
actividad amilolítica.
Paso 3: Diálisis
Las fracciones activas obtenidas de la columna de filtración en gel se reunieron y se
concentraron por diálisis contra una solución de sacarosa al 50% durante la noche a 4 °
C. La muestra concentrada se sometió a ensayo de amilasa.
Cimografía amilasa
La muestra se dializó de paso 3 se cargó en una electroforesis en gel de poliacrilamida
no desnaturalizante (8,0%). Para identificar la ubicación de la actividad de la amilasa
(zona clara sobre un fondo azul), el gel se incubó durante 1 h a 37 ° C en 1% de almidón
soluble (w / v) en tampón fosfato (pH 7,0, 0,1 M). El gel se tiñó con una solución ácida
de yodo (0,2% I2 y 2% de KI en HCl 0,2 N)
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Tabla No.1: Resumen de Purificación de la amilasa de Penicillium sp. en la
cultura de estado sólido. La muestra de enzima cruda se preparó por
agitación del medio de fermentación (cultivo de 4 días de edad) con 40 ml de
agua doblemente destilada durante 30 min, a 37 ° C en un agitador orbital a 150
rpm.
DISCUSIÓN RESULTADO
Sustrato
El uso de sustrato sólido para la producción de amilasa tiene muchas ventajas sobre la
fermentación sumergida. En este estudio, la cáscara de plátano se utilizó como sustrato
para la producción de amilasa por Penicillium sp. Aunque los estudios revelaron que los
residuos del plátano, principalmente pila plátano fue considerado como el medio de
fermentación para la cultura de estado sólido, muy pocos estudios tratan sobre la cáscara
de plátano. El uso de residuos de plátano en producción de amilasa fue descrito por
Pandey . Residuos del plátano como pila plátano y la cáscara de plátano picado en
Bacillus subtilis se utilizaron para la producción de α-amilasa en SSF.
Evaluación e identificación de Penicillium sp. para la actividad de la amilasa
El organismo fue aislado del coco y se tamiza para la actividad de la amilasa. Almidón
placa de hidrólisis dio como resultado amilasa positivo y 13 mm zona incoloro se formó
alrededor del pocillo de muestra (Fig. 1). El microorganismo aislado en color, el aislar
en Glucosa en placas de agar de Sabouraud fueron de 5 a 6 cm de ancho en la 7 días de
incubación, el reverso era negro parduzco, estípites eran cortos y suaves, la penicilina
tenia forma de ampolla esférica o elíptica y la collula se corta. Los conidios eran lisas y
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tenía una reflexión color marrón en la masa. Sobre la base de la observación
morfológica y microscópica, el organismo aislado se identificó tentativamente
como Penicillium sp.
Figura 1: Ensayo de placa de yodo para la
actividad de la amilasa penicilina (la zona de
la degradación del almidón). El caldo de 48
h SSF se incubó en el agujero de placas de
agar de almidón durante 12 h, a 37 º C.
Optimización de la producción de enzimas:
Dada este estudio, la producción de enzimas máxima (36 ± 3U / g de sustrato) se obtuvo
(fig. 2) después de la 4 días de incubación como se describe por Kathiresan y
Manivannan en P. fellutanum; P. janthinellum (NCIM 4960). Se observó que en el
presente estudio, inicialmente, la producción de la enzima aumentó al aumentar periodo
de fermentación hasta 96 h, y disminuyó a partir de entonces. En el cultivo en matraz de
agitación, el período de fermentación óptima para la producción de la enzima se
encontró que era 96 h, similar a la SSF y la producción de enzimas fue de 19 ± 3,5 U /
ml, que era comparativamente menos de SSF. El efecto del nivel de humedad en los
procesos de SSF varían entre 30 y 80%. La producción de la enzima fue alta (24 ± 4 U /
g) a 70% de contenido de humedad (fig. 3). Balkan y Ertan, [20] informaron de que el
contenido de humedad óptimo para el crecimiento y la utilización de sustrato depende
del organismo y el sustrato utilizado para el cultivo. En P. janthinellum (NCIM 4960),
producción de amilasa α se encontró que era alta a 60% de humedad que era casi
comparable con el presente estudio. El efecto del pH sobre la producción de amilasa se
estudió mediante la incubación de Penicillium sp. en el medio de fermentación mediante
la variación del pH de 3,0 a 8,0 a 37 º C durante 96 h. Se obtuvo la máxima actividad de
la amilasa (31 ± 1 U g de sustrato /) a pH 7,0 (Fig. 4) que era comparable con el
resultado de P. rugulosum.
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Figura 2: Efecto del tiempo de fermentación en la producción de amilasa. Condiciones
de proceso: temperatura 37 ° C, tiempo de incubación de 5 días, 5 g de cáscara de
plátano, de pH 7,0.
Figura 3: Efecto del nivel de humedad del sustrato inicial (%) en la producción de
amilasa en el sistema SSF. Condiciones de proceso: temperatura 37 ° C, pH 7,0, tiempo
de incubación de 4 días.
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Figura 4: Producción de la amilasa por Penicillium sp. a diferentes valores de pH del
sustrato sólido. Condiciones de proceso: temperatura 37 ° C, humedad 70%, tiempo de
incubación 96 h.
Propiedades de las enzimas
El efecto del pH sobre la actividad de la enzima se estudió mediante la incubación de la
solución de enzima con tampones a pH variable (3,0 a 8,0). La actividad de la amilasa
fue de 0,5 ± 0,1, 1,2 ± 0,3, 1,5 ± 0,2, 2,6 ± 0,5 y 2,5 ± 0,5 U / ml para los pH 3,0, 4,0,
5,0, 6,0 y 8,0 respectivamente. El pH óptimo para la actividad de la amilasa se encontró
a pH 7,0 (3,4 ± 0,15 U / ml), que era comparable con Rugulosum penicillium donde se
encontró el pH óptimo en 7,0. El efecto de la temperatura sobre la actividad de la
enzima se ensayó a diferentes temperaturas y la was7.0 pH. La actividad enzimática fue
de 2,3 ± 0,2, 3,8 ± 0,5, 4,0 ± 0,1 y 2,5 ± 0,2 U / ml para las temperaturas de 30, 40, 60 y
70 ° C. La actividad enzimática se encontró que era alta a 50 ° C (4,5 ± 0,1 U / ml) que
se encontró que era 57 ° C en P. rugulosum . La actividad de la enzima se encontró que
era estable a 50 ° C durante 20 min, que correspondía a un 100 ± 2% la actividad
enzimática residual que perdió 13 ± 2,5% después de 30 min de incubación a esta
temperatura. La actividad enzimática fue de 4 ± 1% después de 1 h de incubación a 50 °
C. Estos resultados fueron mejores que el obtenido por otros autores que informó de
que α-amilasa a partir de P. chrysogenum era estable a 30 ° C durante 20 min y perdió
alrededor de 8% a 40 ° C después del mismo tiempo.
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Estimación de proteínas
La concentración de proteína de Penicillium sp. se midió por el método de Lowry. Se
encontró que la concentración de proteína extracelular era 13 ± 4 mg ml-1 en la cultura
de estado sólido después de 96 h de incubación a 37 ° C.La purificación parcial de la
amilasa de Penicillium sp.
La amilasa bruto obtenido a partir de la SSF de Penicillium sp. Mostró 0.346 U / mg de
proteína. Fracción de sulfato amónico dio 0.664 U / mg de proteína. Fracciones de
cromatografía de filtración en gel mostraron 15,8 U / mg de proteína con una pureza de
pliegue 45.
La fracción se dializó frente a 50% de sacarosa proporcionó 36,9% de actividad de la
amilasa. El resumen de purificación se representa en la Tabla 1 para Penicillium sp. A
este respecto, Haska y Ohta [23], almidón crudo purificado digestión de amilasa a partir
de P. brunneum N º 24 por la combinación de fraccionamiento con sulfato de amonio,
filtración en gel Toyopearl HW-55F,de DEAE Sephadex A-50 y DEAE etapas de
cromatografía de celulosa. La muestra concentrada obtenida de la diálisis se aplicó el
8% electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (como se describe en materiales y
métodos) y la banda incoloro indicó la hidrólisis del almidón (Figura 5).
Figura 5: tinción actividad amilasa. Actividad amilasa visto como una banda incoloro
mientras que el resto de la muestra de gel de fondo azul.
CONCLUSIÓN
Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 30
El hongo, Penicillium sp. segrega eficazmente amilasa mediante la
utilización de la cáscara del plátano. En Asia, especialmente India más de
20 variedades de plátano y cáscaras de plátano no se utiliza plenamente.
El presente estudio reveló que la cáscara del plátano es el buen medio para la
producción de amilasa por Penicillium sp. Este sustrato se puede utilizar como
el medio sin la adición de otros metales minerales / oligoelementos para la
secreción de amilasa.
Los resultados indicaron un excelente ámbito para la utilización de los residuos
de banano para la producción comercial de la amilasa por Penicillium sp. en
SSF y por lo tanto puede ayudar a reducir la contaminación ambiental.
OBTENCIÓN DE AMILASAS FÚNGICAS A PARTIR DE Aspergillus sp.,
AISLADO DE SEMILLAS DE LENTEJAS.
Este proyecto se llevó a cabo en Bogotá - Colombia y su objetivo fue aislar
microorganismos productores de amilasas para producir enzimas hidrológicas
del almidón. El agente productor detectado fue una cepa del genero Aspergillus
sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Este microorganismo fue llevado a
medio de cultivo en agar YPD bajo parámetros específicos de incubación. Luego
de 18 días se realizó cambio de sustrato a salvado de trigo y se llevó a cabo
pruebas de Lugol, medición de actividad enzimática y extracción del complejo
enzimático. Los resultados indican que las amilasas presentes en el complejo
enzimático obtenido del cultivo de Aspergillus sp., sobre salvado de trigo,
fueron activas en el desdoblamiento de la molécula de almidón a pH 5.0 y
temperatura de 37ºC demostrando su carácter débilmente ácido y su
proveniencia mesófila. El equivalente de dextrosa como medida cuantitativa de
la hidrólisis del polisacárido fue de 6.5, evidenciando la capacidad enzimática
amilolítica del complejo enzimático obtenido. En este trabajo se confirmó teoría
antes mencionada y la capacidad de hongos del género Aspergillus sp., para la
producción de amilasas.
Producción de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos en cultivos
de aguas de lavado de dos empresas alimentarias.
El objeto de este proyecto fue de analizar la producción de enzimas amilasas por
cepas de Aspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y cárnicas
Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 31
para determinar la capacidad de producción de proteasas, amilasa y de
depuración de medio donde crecen. La metodología aplicada se basó en la
creación de un medio de cultivo de aguas de lavado con aplicación de
nutrientes que mejoren la adaptación del agente. Se implementó pruebas de
azucares, niveles de nitrógeno y fosforo y demanda química de oxigeno (DQO). Se
analizaron los parámetros de producción de enzima, pH, temperatura y
concentración de iones. Los resultaron indican que los niveles de amilasa y proteasa
obtenidos son marcadamente dependientes de la concentración inicial de almidón en
el medio de cultivo. Las fuentes de nitrógeno (peptona, aminoácidos y extracto de
levadura) fueron totalmente influyentes en la producción de enzimas. El pH óptimo
encontrado fue de 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50ºC.
Producción de amilasas de levaduras floculantes. Este proyecto desarrollado
en Pakistán se destinó en la consecución de seis especies de levaduras
productoras de amilasas. Para analizar sus niveles de producción bajo el medio
de cultivo agar almidón y como fuente de carbono se agregó extracto de
levadura, almidón y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio
estuvo contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptación del
microorganismo incubado a una temperatura de 25ºC., se realizaron pruebas de
producción de enzima, degradación de sustrato, turbidimetría y velocidad de
crecimiento. Del la metodología ejecutada se aislaron 3 cepas de levadura
correctamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabajó con saliva
humana, produciendo 28 U/ml, la cual presentó una estabilidad en el rango de
25-60ºC. Los niveles de las demás cepas fueron muy inferiores al registrado
anteriormente.
DETERGENTE CON FORMULACIÓN ENZIMÁTICA DE AMILASA
OBTENIDA DE Aspergillus niger. UN ESTUDIO COMPARATIVO EN
DETERGENTES COMERCIALES
El proyecto manifiesta una problemática de la necesidad de compuestos
naturales y eficaces para la industria de detergentes. El presente artículo describe
la producción, purificación y parcial caracterización de un complejo de amilasa
producido por A. niger y uso potencial en formulación de detergentes. Se diseñó
un cultivo con distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que
Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 32
mejor resultados otorgará en cuanto a producción de amilasa se refiere.
Se trabajó con medio APM usando residuos industriales de proteína de
soya y almidón como fuente de carbono además de minerales. Se
realizaron ensayos analíticos con pruebas de DNS, iodometría y control de los
parámetros de pH y temperatura. El extracto obtenido del complejo enzimático
fue comparado en tres formulaciones comerciales de detergentes para determinar
su actividad de limpieza en equipos de hospitales, cirugía y endoscopia. Los
resultados indicaron que el microorganismos con mejor performance en la
producción de amilasa fue el Aspergillus niger con una producción de 3.9 U/ml
en medio sumergido y una actividad excelente de degradación de en el rango de
50-55ºC y un pH de 4.0.
VIII. CONCLUSIONES:
La tecnología enzimática tiene múltiples aplicaciones, como fabricación
de alimentos, los progresos que están realizando actualmente la
ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar el desarrollo
cada vez mayor del uso de las enzimas.
La producción de enzimas a gran escala tiene su principal aplicación en
la industria de la fermentación.
La utilización de enzimas en los alimentos presentan una serie de
ventajas, además de las de índole económico y tecnológico.
Las enzimas utilizadas dependen de la industria y del tipo de acción
que se desee obtener.
Se puede manipular genéticamente, la biosíntesis de enzimas para
optimizar los procesos, pero se debe tener en cuenta, las respectivas
normas.
La producción de enzimas a gran escala tiene su principal aplicación en
la industria de la fermentación.
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS :
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