tesis biologia 2011
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1
UNIVERSIDAD DE PANAMÁ
CENTRO REGIONAL UNIVERSITARIO DE AZUERO
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y
TECNOLOGÍA
ESCUELA DE BIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
TESIS
«« DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa CCaalliiddaadd MMiiccrroobbiioollóóggiiccaa ddee mmuueessttrraass
OObbtteenniiddaass eenn ssuuppeerrffiicciieess ((vviivvaass ee iinneerrtteess)) ddee 33 EExxppeennddiiooss DDee
CCoommiiddaa EEnn CChhiittrréé»»
PPOORR::
DDAARRIINNEELL MMUUDDAARRRRAA
CC..II..PP.. 66-- 771122-- 445522
YYIIHHAANNAA RRÍÍOOSS
CC..II..PP.. 66-- 770099--22440077
CCHHIITTRREE,, HHEERRRREERRAA,,
RREEPPÚÚBBLLIICCAA DDEE PPAANNAAMMÁÁ,,
AABBRRIILL,, 22001111..
2
UNIVERSIDAD DE PANAMÁ
CENTRO REGIONAL UNIVERSITARIO DE AZUERO
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y
TECNOLOGÍA
ESCUELA DE BIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
TESIS
«« DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa CCaalliiddaadd MMiiccrroobbiioollóóggiiccaa ddee mmuueessttrraass
OObbtteenniiddaass eenn ssuuppeerrffiicciieess ((vviivvaass ee iinneerrtteess)) ddee 33 EExxppeennddiiooss DDee
CCoommiiddaa EEnn CChhiittrréé»»
PPOORR::
DDAARRIINNEELL MMUUDDAARRRRAA
CC..II..PP.. 66-- 771122-- 445522
YYIIHHAANNAA RRÍÍOOSS
CC..II..PP.. 66-- 770099--22440077
CCHHIITTRREE,, HHEERRRREERRAA,,
RREEPPÚÚBBLLIICCAA DDEE PPAANNAAMMÁÁ,,
AABBRRIILL,, 22001111..
Trabajo de Graduación,
como requisito parcial, para
optar por el Título de
Licenciatura en Biología con
orientación en Microbiología
y Parasitología.
3
Comité Asesor
Profesora: Martha Chaves de Von Chong MSc.
Facultad de Ciencias Naturales, Exactas
y Tecnología. Escuela de Biología.
Departamento de Microbiología y
Parasitología.
kmvonchong@cwpanama.net. ___________________
Asesora Principal
Profesor: Alexis De La Cruz Lombardo MSc.
Facultad de Ciencias Naturales, Exactas
y Tecnología. Escuela de Biología.
Departamento de Microbiología y
Parasitología.
Alexish202@hotmail.com __________________
Coasesor
4
DEDICATORIA
A Dios que es la razón de mi existir y me ha dado la fortaleza, paciencia y sabiduría durante la realización de mi trabajo.
A mis padres, en especial a mi madre María E. Ramos y a mis
hermanos Yeni María, Edinel y Yoel Mudarra quien me ha brindado su
amor, cariño y apoyo a través de los años.
A una persona especial, Estbeshlany Sánchez que me ha apoyado desinteresadamente para cumplir con esta etapa de mi vida.
A mi cuñado Farid Bobadilla que me ayudó de una forma u otra para la culminación de mi proyecto.
A mi abuela Lucia Quintero y a mis tíos que quienes con su amor y
oraciones me ha servido de inspiración y ayuda para culminar con este
estudio.
DARINEL
5
DEDICATORIA
Durante éstos últimos años de lucha y esfuerzo puedo decir con gran
orgullo, gracias a Dios por permitirme llegar casi a la cúspide de mis
más grandes y anhelados sueños; y por tal motivo, quiero dedicarte este trabajo.
A mi querida Madre y mi querido Padre, porque para mí son un
ejemplo, ya que con su ayuda sincera y desinteresada han sabido llevarme adelante, brindarme consejos y todo su apoyo.
A mi querido abuelo Pipo, que fue un ejemplo de Esposo, Padre,
Abuelo, Amigo. Permitiéndome ser una persona de bien, te dedico este
logro, ya que eres mi más grande inspiración.
A mis hermanas Yohany y Yohan por su apoyo sincero.
A una persona especial, Blin por su ayuda sincera y desinteresada.
A mis primitos José, Enrique, Juanky, porque me han servido de inspiración para culminar este trabajo de graduación.
A mis abuelos y tíos y demás familiares por sus sacrificios, esfuerzos y apoyo incondicional.
Los quiero a todos por su apoyo, su cariño y no duden que trataré de
avanzar sin temor frente a los obstáculos que se presentes en el camino y sabré sobrepasarlos por ustedes.
Los quiero con todo el corazón
Yihana
6
AGRADECIMIENTO
Primeramente le agradecemos a Dios por otorgarnos la sabiduría y la salud para lograrlo.
A los dueños de los expendios de comida y a sus empleados por permitirnos realizar ésta investigación.
A nuestros asesores de tesis, la profesora Marta de Von Chong, al
profesor Alexis de La Cruz; por darnos el apoyo y los conocimientos necesarios para lograr esta meta.
A la profesora Priscila González y al profesor Hernán Córdoba por su amabilidad, por facilitarnos sus conocimientos, tiempo e ideas.
Y por último, les agradecemos a todos los profesores de la Escuela de
Biología y a todos nuestros compañeros y amigos porque de una forma
u otra aportaron su granito de arena en esta investigación.
Darinel y Yihana
7
INDICE GENERAL
RESUMEN
INTRODUCCION
CAPITULO I
1. Alteración de los Alimentos…...………………………………………………….…5
2. Biofilm. Crecimiento sobre superficies……...……………………………………...5
2.1. Etapas en la Formación del Biofilms Bacterianos en Relación con los
Alimentos……………………………………………………………………………….5
2.2. Importancia del Control Higiénico en las Superficies
Alimentarias………………………………………………………………………….…6
2.2.1. Biofilm en superficies vivas……..……………………………………..6
2.2.2. Biofilm en superficies inertes………………..……………………..….7
2.3. Resistencia del Biofilm a los Diferentes Sistemas de Desinfección..………...7
3. Fuentes de Contaminación…………………………………..……………………...7
3.1. Principales Fuentes Contaminantes……..………………………………….....8
3.1.1. Ambiente……….………………………………………………………..8
3.1.2. Clientes…………..………………………………...………………….....8
3.1.3. Equipos (superficies inertes)……………….………………………..…8
4. Contaminación Cruzada de los Alimentos……………………………….…….….9
8
5. Microorganismos Patógenos en los Alimentos……………………….….….…...9
6. Generalidades de los Parámetros Microbiológicos Evaluados en la
Investigación…………………………………………………………………………10
6.1 Mesófilos aerobios……………….……………………………………………10
6.2. Coliformes totales...…………………………………………….…………....10
6.3. Escherichia coli……………………………………………………….……....11
6.4. Hongos…………………………………………………….…………………..11
6.4.1. Hongos filamentosos………………………………………………....12
6.4.2. Levaduras………………………………………………………...…..13
7. Características de los Medios de Cultivo y Pruebas Utilizadas para la
Investigación…………………………………………….………………………...…13
7.1. Medios de pre-enriquecimiento……………….…...……………………....13
7.1.1. Caldo Peptonado……………………...…………………………….13
7.2. Medios de enriquecimientos……….……………………………...……….14
7.2.1. Plate Count Agar (PCA)…………………………...……………....14
7.2.2. Agar Endo Less……………………………..……………………....14
7.2.3. Agar Papa Dextrosa (PDA)………………………………..………..14
8. Pruebas Realizadas para Caracterizar Microorganismos en el Estudio……...14
8.1. Tinción de Gram……………………………………………..………….….14
9
8.2. Catalasa………………………………………………………………...15
8.3. SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)………………………………………15
8.4. Prueba del Citrato……………………………………………………..15
8.5. Prueba de Indol………………………………………………………..16
9. Normas Microbiológicas Internacionales para Expendios de Comida (Normas
peruanas y mexicanas)……………………………………………………………...17
9.1. Normas para superficies inertes…………………………………………….17
9.2. Normas para superficies vivas…………………………………….………...17
Capítulo II
1. Materiales, Equipos, Medios de Cultivos y Diseño Experimental……..….....20
1.1. Materiales y Equipos…………………………………………………….….20
1.2. Medios de Cultivos…………………………………………………………..20
2. Metodología…………………………………………………………………….21
2.1. Ubicación del Estudio………………………………………………………21
2.2. Diseño
Experimental………………………………………………………………….….21
2.3. Toma de Muestra……………………………………………………….….22
2.4. Procesamiento………………………………………………….…………...22
3. Pruebas Realizadas para Evaluar los Microorganismos Estudiados….23- 24
10
CAPITULO III (RESULTADO Y DISCUSIÓN)
RESULTADOS……………………………………………………………….……25-37
DISCUSIÓN………………………………………………………………………..38-40
CAPÍTULO IV (CONCLUSIONES, RECOMENDACIONES, BIBLIOGRAFÍA
Y ANEXOS).
CONCLUSIONES…………………………………………………………………….42
RECOMENDACIONES……………………………………………………….....43-44
BIBLIOGRAFÍAS………………………………………………………………...45-47
ANEXOS……………………………………………………………………….….48-58
11
INDICE DE CUADROS
Cuadro N° 1. Límites microbiológicos aceptables para coliformes totales, E coli y
patógenos en superficies inertes según las normas peruanas……………..………17
Cuadro N° 2. Límites microbiológicos aceptables para coliformes totales, E coli y
patógenos en superficies vivas según las normas peruanas……………...………17
Cuadro N° 3. Límites microbiológicos aceptables según las normas mexicanas para
superficies vivas e inertes…………………………………………….……...………18
Cuadro N0 4. Análisis de Varianza para Mesófilos Aerobios entre los tres
expendios de comida…………………………………...……………………..………26
Cuadro N0 5. Prueba de rangos múltiples de Duncan para mesófilos aerobios entre
los tres expendios de comida………………………………………………….….…..26
Cuadro N0 6. Análisis de Varianza para coliformes totales entre expendios de
comida……………………………………………………………………………..…27
Cuadro N0 7. Análisis de Varianza para E. coli entre los tres expendios de
comida……………………………………………….…………………………….....28
Cuadro Nº 8. Análisis de Varianza para mesófilos aerobios entre las superficies
vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida…….……29
12
Cuadro Nº 9. Prueba del rango múltiple de Duncan para Mesófilos aerobios entre
las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida…………………...29
Cuadro Nº 10. Análisis de Varianza para Coliformes Totales entre las superficies
vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de
comida………………………………………………………………………………..30
Cuadro Nº 11. Prueba del rango múltiple de Duncan para Coliformes Totales
entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de
comida…………………………………………………………………………….….31
Cuadro Nº 12. Análisis de Varianza para E. coli entre las superficies vivas e
inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida………………..….31
Cuadro Nº 13. Prueba del rango múltiple de Duncan para E. coli entre las
superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida………………..….….32
Cuadro Nº14. Muestreo N°1 en los tres expendios de comidas………………..…50
Cuadro Nº15. Muestreo N°2 en los tres expendios de comida……………………51
Cuadro Nº16. Muestreo N°3 en los tres expendios de comidas...…………………52
Cuadro Nº17. Muestreo N°4 en los tres expendios de comida………………........53
13
Cuadro Nº18. Muestreo N°5 en los tres expendios de comidas………………….....54
Cuadro Nº19. Muestreo N°6 en los tres expendios de comidas…….....……………55
14
INDICE DE GRÁFICAS
Grafica N01. Porcentaje de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cm
2de
mesófilos aerobios entre los tres expendios de comida…………...…………………27
Grafica N0 2. Promedios de recuento total (UFC/cm
2) para Coliformes Totales y E.
coli entre los tres expendios de comida………………………….……….…………28
Gráfica N0
3. Promedio de recuento total (UFC/cm2) para
mesófilos aerobios en
superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida……………………..…30
Grafica N 0
4. Promedio de recuento total (UFC/cm2)
para Coliformes Totales y E.
coli entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida….…..….32
Gráfica Nº 5. Comparación de los niveles de UFC/cm2 de mesófilos aerobios en las
superficies inertes (mesa y tabla) con las normas mexicanas………………….…..33
Gráfica Nº 6. Comparación de los niveles de UFC/cm2 de coliformes totales y E.
coli de las superficies inertes (mesa y tabla) con las normas peruanas………….34
Gráfica Nº 7. Comparación de los niveles de UFC/ ml para mesófilos aerobios en
las superficies vivas (manos) con la normas mexicanas……………………….….35
Gráfica Nº 8. Comparación de los niveles de UFC/ ml para coliformes totales y E. coli en
las superficies vivas (manos) con la normas peruanas……………………….……..36
15
Gráfica Nº 9. Porcentaje de hongos y levaduras en los tres expendios de
comida…………………………...……………………………………………………..37
16
INDICE DE ANEXOS
Fig. 1. Flujograma para el procesamiento de las muestras en el Laboratorio….…49
Fig. Nº 2. Técnica de hisopado que se utilizó para la recolección de la muestra en
superficie inerte, en cada uno de los expendios de comida. (Mesa)………….…….56
Fig. Nº 3. Técnica de hisopado en la tabla (superficie inerte) de cada expendio de
comida………………………………………………………………………….….….56
Fig. Nº 4. Toma de muestras en las manos de la persona que manipula los
alimentos……………………………………………….……………………..………56
Fig. Nº 5. Técnica utilizada para el cultivo de las muestras…………………...…..57
Fig. Nº6. Platos con cultivos positivos de coliformes……………………………….57
Fig.Nº7. Morfología de los microorganismos aislados de los diferentes
expendios…………………………………………………………………………..…57
Fig. Nº 8. Prueba de catalasa negativa aplicada a una colonia bacteriana............58
Fig.Nº10, 11,12. Pruebas bioquímicas para determinar microorganismos en
estudio...........................................................................................................................58
17
RESUMEN
Esta investigación se realizó en la provincia de Herrera, específicamente en el
Distrito de Chitré con el objetivo de determinar la calidad microbiológica de muestras
obtenidas en superficies vivas e inertes de tres expendios de comida, tomando las
debidas precauciones para el desarrollo del proyecto, ya que se utilizó una metodología
que consistió en el hisopado de superficies inertes (mesa y tabla) y enjuague en
superficies vivas (manos). Estas muestras fueron depositadas en recipientes estériles y
transportados adecuadamente para luego realizar el análisis en el laboratorio; para el
cual se utilizó la técnica de esparcido superficial que consistió en depositar 0.1 ml de
cada dilución en un platos Petri con el medio de cultivo para cada microorganismo; se
incubó por 24 horas resultando gran prevalencia de estos microorganismos, incluso
algunas superaron las normas microbiológicas Internacionales (México y Perú).
La evaluación nos permitió conocer la calidad microbiológica en las superficies
estudiadas, destacando la importancia de una buena higiene en las personas que tienen
contacto directo con los alimentos, al igual que los expendios en general para evitar
enfermedades transmitidas por alimentos contaminados.
18
1. INTRODUCCIÓN
De acuerdo a la definición aprobada por la Cumbre Mundial sobre la Alimentación,
existe seguridad alimentaria cuando todas las personas tienen en todo momento acceso
físico y económico a suficientes alimentos inocuos y nutritivos para satisfacer sus
necesidades alimenticias y sus preferencias en cuanto a los alimentos a fin de llevar una
vida activa y sana. La seguridad alimentaria se ha conseguido cuando se garantiza la
disponibilidad de alimentos, el suministro es estable y todas las personas los tienen a su
alcance. (León, 2004).
La contaminación implica la presencia de sustancias indeseables. En la inmensa
mayoría de los casos, los alimentos no cambian su aspecto u otras de sus características
por lo que la contaminación no puede reconocerse a simple vista y pasa inadvertida.
(Ortega, et al., 2002).
El sector alimentario ha tenido un sin número de problemas de índole higiénico
sanitario con consecuencias económicas para el productor como de salud para el
consumidor, lo que lleva a la necesidad de controlar las diferentes etapas desde la
producción hasta que llega al consumidor, esto refiriéndose al alimento como tal. Sin
embargo, el alimento es susceptible de contaminarse de manera física y química,
además de sufrir deterioro microbiano causado por bacterias y otros microorganismos,
lo que lleva a la necesidad de controlar las diferentes etapas desde la producción
agrícola y pecuaria hasta la última donde finalmente llega al consumidor.
Las enfermedades transmitidas por alimentos se conocen como ETAS y se originan por
el consumo de alimentos que contienen agentes contaminantes en cantidades suficientes
19
para afectar la salud del consumidor. Los alimentos involucrados pueden ser preparados
o naturales, sólidos o bebidas simples como el agua. Los agentes contaminantes pueden
ser patógenos como bacterias, virus, hongos, parásitos, o componentes químicos
(toxinas) que se encuentran en el alimento. (Lozada, 2007).
Entre las principales causas de brotes epidémicos de ETAS se encuentran el
entrecruzamiento de productos crudos listos para el consumo, manipulaciones
descuidadas o sin el lavado correcto de las manos, contaminaciones por contacto con
superficies mal higienizadas o vectores, cocción insuficiente de los alimentos,
exposición de los alimentos a temperaturas que favorecen el crecimiento de los
microorganismos, así como el tiempo prolongado entre la elaboración y el consumo.
(Lengomín et at., 1997).
Los brotes a causa de enfermedades transmitidas por los alimentos pueden dañar el
comercio y el turismo, y conducir a la pérdida de ganancias, al desempleo y demandas
legales. Por lo tanto, un control eficaz de la higiene de vital importancia para evitar las
consecuencias adversas a la salud humana y a la economía por las toxiinfecciones
alimentarias. (Salas, 2007).
Este trabajo es importante porque nos permite evaluar la calidad sanitaria en diferentes
expendios de comida utilizadas por cientos de personas cada día. Además les brinda a
los manipuladores de alimentos información necesaria para una mejor asepsia y darle al
consumidor un alimento más seguro, libre de partículas extrañas y evitar
toxiinfecciones.
21
1. ALTERACIÓN DE LOS ALIMENTOS
Se entiende por alteración de los alimentos al cambio de las características
organolépticas, en aspectos como apariencia, olor o sabor que los hace inaceptables para
el consumo. Las alteraciones pueden ser por: descomposición natural, el biodeterioro, la
contaminación por microorganismos y prácticas culinarias incorrectas. Una de las
principales fuentes de contaminación es el ser humano; ya que es el portador de
microorganismos que pueden llegar a los alimentos y causar alteraciones. De allí que
durante el proceso de manufactura el personal debe pasar por una higiene adecuada,
sobre todo aquellos que se encargan de prepararlos. Es importante limpiar y desinfectar
todos los enseres que tienen contacto con los alimentos, ya que son el principal vehículo
de contaminación. (Zavala, 1999; Madigan, et al., 2010).
2. BIOFILMS: CRECIMIENTO MICROBIANO SOBRE LAS SUPERFICIES
Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos y polímeros
extracelulares, y tienen la capacidad para comunicarse con las bacterias circundantes y
posteriormente fijarse y desarrollarse sobre superficies hidrófobas o hidrófilas, bióticas
o abióticas. Se pueden encontrar en todos los medios donde existan bacterias: en el
medio natural, clínico o industrial puesto que solo necesitan un entorno hidratado y una
mínima presencia de nutrientes para desarrollarse. (Fuster, 1996).
2.1 ETAPAS EN LA FORMACIÓN DE BIOFILMS BACTERIANOS EN
RELACION CON ALIMENTOS
a). Adherencia: Se da por medio de flagelos y fimbrias, la motilidad ayuda a la bacteria
a alcanzar la superficie.
b). División de los microorganismos: la bacteria comienza a dividirse y las células hijas
se extiende alrededor del sitio de unión formando microcolonias.
22
c). Formación de la matriz: las bacterias empiezan a secretar un exopolisacárido que
contribuye a la matriz del biofilm y forma canales.
d). Liberación: algunas bacterias de la matriz del biofilm se liberan para poder colonizar
nuevas superficies, cerrando el proceso de formación del biofilm. (Medina y Rendón,
1998).
2.2 IMPORTANCIA DEL CONTROL HIGIÉNICO EN LAS SUPERFICIES
ALIMENTARIAS
La capacidad de las bacterias para adherirse a las superficies con las que entran en
contacto con los alimentos, conlleva serios problemas higiénicos y numerosas pérdidas
económicas por los productos que se llegan a desechar. Por este motivo, es preciso
eliminar todos los microorganismos de las superficies en contacto con los alimentos,
antes de que los contaminen y establezcan un biofilm que serviría de reservorio.
(Escobar y Melillo, 2009).
2.2.1 Biofilm en Superficies Vivas
Las bacterias pueden adherirse a cualquier parte del cuerpo humano solo basta con
encontrar un nutriente de su preferencia en un lugar húmedo para adherirse. Los lugares
más frecuentes donde se encuentra biofilms en superficies vivas pueden ser: en las
superficies de los dientes, manos, uñas, vagina de la mujer, etc. Los manipuladores de
alimentos deben evitar hablar en el momento que manipulan los alimentos, lavarse las
manos constantemente y utilizar la ropa apropiada. Estas recomendaciones son
necesarias para brindar un alimento más seguro al consumidor. (Serrano y Herrera,
2005).
23
2.2.2 Biofilm en Superficies Inertes
Las bacterias son capaces de adherirse fuertemente a una gran variedad de materiales
utilizados en la industria alimentaria, tales como: mesa, tabla, pisos, paredes, plástico,
etc. Una vez adheridas, las bacterias se reproducen rápidamente y se vuelven muy
difíciles de remover, formando una comunidad microbiana denominada "Biopelícula" o
biofilm, afectando a los alimentos que están en contacto con ellas. (Olave, 2001).
2.3 RESISTENCIA DEL BIOFILM A LOS DIFERENTES SISTEMAS DE
DESINFECCIÓN
El exopolímero protege a los habitantes del biofilm de la dispersión de sustancias
nutritivas, del acceso de los biocidas y de la desecación. Un proceso de limpieza puede
llegar a eliminar el 90% de los microorganismos de una superficie con detergentes
alcalinos formulados con quelantes, ya que resulta efectiva en la eliminación del
biofilms. La principal limitación de los sistemas de limpieza reside en los problemas de
acceso a diversas zonas como ranuras, grietas, etc. La resistencia a los antimicrobianos
parece depender de la estructura tridimensional que presenta el biofilm; cuanto más
viejo y grueso sea, más resistencia le da, si se desmonta la estructura se pierde la
resistencia; en consecuencia la eficacia de la desinfección estará directamente
relacionada con la capacidad de la limpieza previa que resulta la mejor prevención.
(Pinto, 2010).
3. FUENTES DE CONTAMINACION
La contaminación de los productos alimenticios puede ser afectada por peligros físicos,
químicos y biológicos. Los físicos son cualquier materia extraña presente en el
alimento, ejemplos: metales, plástico, vidrio, entre otros. Los químicos son sustancia
24
presente en el alimento en forma natural, intencional o accidental, que resulte
perjudicial a mediano o largo plazo, ejemplos: Lubricantes, limpiadores, desinfectantes,
etc. Y los biológicos que son agente o esporas, que puedan representar un peligro
potencial para el consumidor del alimento preparado. Ejemplos: bacterias, virus y
hongos. (Mora, 2007).
3.1. Entre las principales fuentes contaminantes podemos encontrar:
3.1.1. Ambiente:
Los sitios que con mayor frecuencia presentan proliferación de microorganismos son los
drenajes, trampas de grasas, pisos, paredes, respiradores. (Superficies inertes).
3.1.2. Clientes:
Las manos, pies y ropa de los empleados, clientes y vendedores externos también
pueden estar contaminados con microorganismos patógenos; esto permite la
contaminación de los pisos y cualquier artículo utilizado por los empleados, mediante la
contaminación cruzada.
3.1.3. Equipos: (superficies inertes)
Utilizados para el transporte, almacén o preparación de los alimentos son fuentes de
contaminación; son más aquellos que presentan dificultades para la limpieza, como lo
son las ruedas de carritos que transportan los alimentos, las rebanadoras entre otras;
luego que se da la contaminación por las fuentes antes mencionada, es importante
conocer los factores que permiten a los microorganismos contaminar, crecer y
dispersarse. (Escobar y Melillo, 2009).
La falta de higiene del personal de los preparadores de alimentos, el lavado inadecuado
de las manos o superficies de los utensilios, son factores que pueden favorecer que no se
eliminen completamente los organismos de origen fecal y éstos pueden contaminar los
25
alimentos que se manejan o consumen y ser una posible causa de diarrea. (Salomón, et
al., 2006).
4. CONTAMINACIÓN CRUZADA DE LOS ALIMENTOS
La contaminación cruzada es el proceso mediante el cual los alimentos entran en
contacto con sustancias ajenas, generalmente nocivas para la salud. Aunque es fácil de
prevenir, es una de las principales causas de intoxicación alimentaria.
La misma puede ser: directa e indirecta. La contaminación cruzada directa ocurre
cuando un alimento limpio entra en contacto directo con un alimento contaminado. Y la
contaminación cruzada indirecta se da cuando un alimento limpio tiene contacto con
una superficie contaminada previamente por otro alimento u otra fuente. (Casonu,
2009).
5. COMO AFECTAN LOS MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN LOS
ALIMENTOS
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), son originadas por la ingestión de
alimentos o agua que contiene distintos agentes patógenos que afectan la salud del
consumidor en forma individual o colectiva. Con la globalización, cambios en los
estilos de vida de los consumidores y las preferencias alimentaria, se han producido
cambios en la formulación, manufactura y distribución de alimentos con el propósito de
disminuir estas enfermedades (Garay, 2002).
Patógenos asociados a los alimentos: Salmonella, Shigella, Staphylococcus aereus,
Listeria, E. coli O157:H7 entre otras; estas pueden estar asociados con condiciones
sanitarias deficientes, agua y alimentos contaminados, al igual que condiciones de vida
en hacinamiento. (Goldberg, et al., 2007).
26
Las personas que tienen algunas de estas enfermedades o presenten síntomas no deberían
preparar alimentos o servir agua a otros hasta que se haya demostrado que no son
portadores de alguna bacteria y deben ser vigilados por el MINSA. (CDC, 2005).
6. GENERALIDADES DE LOS PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS
EVALUADOS EN LA INVESTIGACIÓN
6.1 Mesófilos aerobios
En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras cuya temperatura
óptima de crecimiento está entre 25 – 45º C.
En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las
condiciones higiénicas de la materia prima, la limpieza, desinfección y control de la
temperatura durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento
si se han realizado de forma adecuada.
Para identificarlos se utiliza la técnica de Recuento en placa de mesófilos. La mayoría
de los alimentos (excepto los fermentados como quesos, embutidos, etc.) se consideran
no aptos para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos aun
cuando se sepa que estos no son patógenos y que no hayan llegado a modificar
considerablemente los caracteres organolépticos del alimento. (Benítez, 2009).
6.2 Coliformes Totales
Constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la
mayoría de las especies que involucra. Son bacilos Gramnegativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas
en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros
principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. (Camacho, et al.,
27
2009). Su presencia en alimentos es signo de mala calidad higiénica en el proceso, falta
de higiene de los manipuladores, recontaminación después del proceso o contaminación
procedente del suelo. (Lozada, 2007).
6.3 Escherichia coli
Está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con
producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C.Es productora de diarrea con
características de virulencia que le permite lesionar las células intestinales o alterar la
función del intestino. El contacto humano durante el procesamiento del alimento puede
introducir la infección al igual que el contacto con las superficies, ya que es un
indicador de contaminación fecal o con excretas. (Fernández, et al., 2003).
6.4 Hongos
Son una clase distinta de microorganismos, la mayoría de las cuales vive en libertad en
la naturaleza, donde funcionan como desintegradores en el ciclo de energía.
Los hongos son eucariota con un nivel más alto de complejidad biológica que las
bacterias. Pueden ser unicelulares o diferenciarse y convertirse en pluricelulares
mediante el desarrollo de filamentos ramificantes. La mayoría de los hongos se
reproducen por esporas, diminutas partículas de protoplasma rodeado de pared celular.
La mayoría de los hongos están constituidos por filamentos tubulares que reciben el
nombre de hifas. Cada hifa está rodeada por una pared celular que normalmente
contiene quitina, un material que también forma parte del exoesqueleto de los insectos.
La mayoría de las hifas no están divididas en células separadas y los núcleos y
orgánulos están esparcidos por todo el citoplasma. Sin embargo, algunas hifas pueden
estar divididas por tabiques llamados septos, pero, incluso en estas hifas, los septos
28
poseen unos poros que permiten el movimiento de orgánulos dentro de la hifa. (Ryan y
Ray, 1998).
Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La
proliferación de hifas, resultante de este crecimiento, se llama micelio. Cuando el
micelio se desarrolla puede llegar a formar grandes cuerpos fructíferos, tales como las
setas u otras estructuras que contienen esporas reproductoras. Normalmente, los cuerpos
fructíferos son la parte más visible del hongo y suelen crecer por encima del suelo o de
otras superficies, de manera que las esporas pueden ser dispersadas por las corrientes de
aire o mediante otros mecanismos. Por el contrario, el micelio normalmente permanece
enterrado.
El metabolismo micótico es heterotrófico y requiere carbono exógeno para el
crecimiento. Existe una gran diversidad metabólica, pero la mayoría de los hongos
crecen con tan solo una fuente de carbono orgánico e iones de amonio o nitrato como
fuente de nitrógeno. En la naturaleza, los nutrimentos para los hongos libres provienen
de la materia orgánica en descomposición. No existen hongos que sean anaerobios
estrictos. (Ryan y Ray, 1998).
Entre los tipos más comunes de hongos en alimentos tenemos:
6.4.1 Hongos Filamentosos: Están naturalmente adaptados al crecimiento sobre
superficies, ya que requieren de un contacto cercano con el sustrato debido a su
nutrición heterótrofa, secreciones de enzimas extracelulares, absorción de nutrientes a
través de la pared celular y el crecimiento apical de sus hifas. Los hongos que crecen
sobre superficies constituyen biopelículas, a diferencia de las biopelículas bacterianas,
las biopelículas fúngicas han recibido menor atención, aunque recientemente están
29
cobrando mayor relevancia por ser causante de infecciones alimentarias. (Villenas y
Gutiérrez, 2003).
6.4.2 Levaduras: Las levaduras alteradoras de alimentos, se definen como especies
particulares capaces de causar deterioro en alimentos y bebidas. Su papel es secundario
en la contaminación microbiana de alimentos, las condiciones ambientales de
preservación de estos, que tienden a inhibir el crecimiento de bacterias, han favorecido
la aparición de levaduras contaminantes, causantes igualmente de afectaciones en los
parámetros organolépticos de buena calidad en alimentos frescos, semi-elaborados y
elaborados. (Orberá, 2004). Las biopelículas están constituidas por microcolonias
incluidas dentro de una matriz polimérica y representan una forma de crecimiento
microbiano. Las levaduras pueden colonizar las superficies en contacto con alimento
formando biopelículas que son resistentes a muchos desinfectantes. (Durán, et al.,
2007).
7. CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS
UTILIZADAS PARA LA INVESTIGACIÓN
7.1 Medios de pre-enriquecimiento
7.1.1 Caldo peptonado
Para el enriquecimiento preliminar, poco selectivo de bacterias, particularmente
Enterobacteriaceas patógenas. Es recomendado para ser utilizado en lugar de solución
fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos
fisicoquímicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado como medio base
para la fermentación de hidratos de carbono, se debe adicionar el indicador de Andrade
y el hidrato de carbono en cuestión.
30
7.2 Medios de enriquecimientos
7.2.1 Plate Count Agar (PCA)
Este medio no contiene ningún supresor de indicadores. Es primordialmente usado para
determinar el contenido microbiano total. Controla el crecimiento de bacterias viables
de una muestra.
7.2.2. Agar Endo Less
Medio de cultivo utilizado para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en la que
se diferencia por su coloración en las colonias de las bacterias (color verde brillante E.
coli, color rojo con aspecto mucoso Klebsiella y colonias rojo intenso Enterobacter).
7.2.3 Agar Papa Dextrosa (PDA)
Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y mohos a partir de alimentos y otros
materiales. Los hidratos de carbono y la infusión de papa favorecen el crecimiento de
levaduras y hongos, en tanto que por el bajo rango de pH, la flora acompañante se
reduce significativamente. (Gutiérrez, 2000).
8. PRUEBAS REALIZADAS PARA CARACTERIZAR MICROORGANISMOS
EN EL ESTUDIO.
8.1 Tinción de Gram:
Las tinciones que tiñen de diferente color a células que son de diferentes morfologías se
llaman tinciones diferenciales. Una tinción diferencial muy importante y ampliamente
usada en microbiología es la Tinción de Gram. Dependiendo del resultado de esta
tinción las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: las grampositivas aparecen
31
de color morado y las gram negativas de color rosa. Esta diferencia en la respuesta a la
tinción de gram se debe a diferencias en la estructura de la pared celular de las células
grampositivas y gramnegativo. (Madigan, et al., 2009).
8.2 Catalasa:
Se utiliza para comprobar la presencia de la enzima catalasa que se encuentra en la
mayoría de las bacterias aeróbicas y anaeróbicas facultativas que contienen citocromos.
Originalmente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus spp. (-) de Micrococcus spp. (+) y/o Staphylococcus spp. (+), Listeria
monocytogenes (+), y los entéricos (-). (Cedeño y Poveda, 2009).
8.3 SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)
Los medios para detectar motilidad son semisólidos, presentan una concentración de
agar de 7,5g / 1000 ml o menor ya que concentraciones elevadas harían al medio
demasiado firme para permitir la libre diseminación de los microorganismos.
Este medio contiene triptófano. Las bacterias que tienen la enzima triptofanasa son
capaces de hidrolizar y desaminar triptófano con la producción de indol, ácido pirúvico
y amoniaco.
El medio de cultivo posee también tiosulfato de sodio como fuente de azufre y hierro
peptonizado como indicador de sulfuro. (López y Carola, 2006).
8.4 Prueba de Citrato:
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como
única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en
32
su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las Enterobacterias
estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella,
Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato
de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y
azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la
eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será,
aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. (Cortés, 2001).
8.5 Prueba de Indol
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha
liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima
triptofanasa.
Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo
de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano).
Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta
mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos
conocidos. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del
reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la
prueba será considerada positiva (Cortés. 2001).
33
9. NORMAS MICROBIOLÓGICAS INTERNACIONALES PARA
SUPERFICIES EN CONTACTO CON ALIMENTOS ESPECÍFICAS PARA
EXPENDIOS DE COMIDA. (PERUANAS Y MEXICANA).
9.1 Normas para Superficies Inertes
Son las superficies externas o internas de los utensilios que estén en contacto directa o
indirectamente con el alimento. Ejemplo: mesa, tabla de picar.
9.2 Normas para Superficies Vivas
Son las partes externas del cuerpo humano que entran en contacto con los utensilios y
alimentos durante su manipulación y consumo.
Cuadro N° 1. Límites microbiológicos aceptables para coliformes totales, E coli y
patógenos para superficies inertes según las normas peruanas.
Coliformes totales
< 200 UFC/ cm2
E. coli
0 UFC/ cm2
Patógenos
0 UFC/ cm2
Cuadro N° 2. Límites microbiológicos aceptables para coliformes totales, E coli y
patógenos para superficies vivas según las normas peruanas.
Coliformes totales
100 UFC/ cm2
E. coli
0 UFC/ cm2
Patógenos
0 UFC/ cm2
Fuente: (Guía técnica para el análisis microbiológico de superficies en contacto con alimentos y
bebidas, 2007).
34
Cuadro N° 3. Límites microbiológicos aceptables para Mesófilos aerobios según las
normas mexicanas para superficies vivas e inertes.
Fuente: (Normas Mexicanas, 1994).
Para superficies inertes
< 400 UFC/ cm2
Para superficies vivas como las manos
< 3000 UFC/ ml
36
1. MATERIALES, EQUIPOS, MEDIOS DE CULTIVOS Y DISEÑO
EXPERIMENTAL.
1.1 MATERIALES Y EQUIPOS
Autoclave
Incubadora
Balanza
Guantes
Papel toalla
Alcohol al 70 – 95%
Jabón líquido
Mascarilla
Bata
Caja de porta objetos
Hisopos
Papel parafina
Mechero de alcohol
Nevera
Bolsas estériles
Vasos químicos
Tijeras
Probeta
Espátula
Erlermeyer
Puntas estériles de 100 – 1000 µl
Micro pipetas
Refrigeradora
Bolsas de hielo
Agitador magnético
Cinta adhesiva
Cámara de flujo laminar
Papel Manila
1.2 MEDIOS DE CULTIVOS
Caldo Peptonado
Agar Papa Dextrosa (hongos y levaduras)
Agar Endo Less (Coliformes totales y E. coli)
Agar para mesófilos (PCA)
37
2. METODOLOGÍA
2.1 Ubicación del Estudio
Esta investigación fue llevada a cabo en tres expendios de comida llamados:
Restaurante Panamá, Restaurante La Central, Restaurante La Estrella; ubicados en la
central de Chitré, Provincia de Herrera. Los mismos fueron muestreados durante los
meses de abril a mayo del 2010.
2. 2 Diseño Experimental
Esta investigación es de carácter descriptivo expofacto con un diseño completamente al
azar y se basó en clasificar el área estudiada en superficies inertes, como la tabla y la
mesa y superficies vivas como las manos.
El área seleccionada para el muestreo en este caso, las superficies inertes fueron: el
centro de la tabla de picar (en la parte superior) y el borde de la mesa utilizando hisopos
para el muestreo. Para superficies vivas se tomó muestras de enjuague de ambas manos
de la mesera por toda la superficie, dentro de una bolsa plástica con caldo peptonado.
(Guía técnica, 2007).
Se tomaron tres muestras de cada expendio (mesa, tabla y mano), siendo evaluados tres
expendios de comida haciendo un total de nueve muestras por semana, dando como
resultado, cincuenta y cuatro muestras por seis semanas con sus respectivas réplicas.
38
2.3 Toma de la muestra
Las muestras fueron tomadas de los siguientes sitios: en las superficies inertes (mesa y
tabla), tomando un área plana de 8 cm x 8 cm marcado con una platina delimitada
estéril, la cual consistió en frotar un hisopo tres veces en sentido diagonal, horizontal y
vertical en el área marcada por la platina durante 20 segundos (Escobar y Melillo,
2009).
Para superficies vivas (manos) se utilizó el método de enjuague usando bolsas plásticas
con caldo peptonado, adaptándolo a la unidad experimental y siguiendo las normas
microbiológicas recomendada para la toma de la muestra. (Guía técnica, 2007).
2.4 Procesamiento
Las muestras fueron llevadas a la unidad de Investigación del Centro Regional
Universitario de Azuero (C.R.U.A.) donde se procedió a realizar el análisis
microbiológico. En las superficies inertes (tabla y mesa), las muestras (hisopos) fueron
transportados dentro de los tubos de ensayo que contenían 3 ml de caldo peptonado.
Para superficies vivas (manos), se depositó 100 ml de caldo peptonado en una bolsa
plástica estéril, se introdujo las manos del manipulador hasta la altura de la muñeca.
Luego se le solicitó al manipulador que realizara un frotado de los dedos y
particularmente alrededor de las uñas y en la palma de las manos, durante un minuto
aproximadamente.
Al llegar al laboratorio, se agregó 1 ml de cada muestra en 9 ml de agua peptonada
estéril, siendo ésta la dilución madre (10-1
). Las diluciones se realizaron hasta llegar a
10 -3
para después tomar 0.1 ml y sembrarlo por esparcido en PCA (mesófilos aerobios),
Endo Less (coliformes) y PDA (hongos). Luego se incubó a 37 °C por 24 horas y
procedimos a contar colonias. El total de colonias obtenidas se multiplicó por el factor
39
de dilución, teniendo así la cantidad de UFC/cm2. Para calcular los resultados se utilizó
la fórmula: nc x fd x Ud/ cm2. (Escobar y Melillo, 2009).
3. PRUEBAS REALIZADAS PARA EVALUAR LOS MICROORGANISMOS
ESTUDIADOS:
3.1 Tinción de Gram
Realizamos un frotis fijándolo con calor, luego se tiñó por 1 minuto con Violeta
Cristal, se lavó con agua y se cubrió con solución Yodada durante 1 min, se lavó
nuevamente con agua, se decoloró con mezcla alcohol etílico/acetona. Después se
escurrió y lo cubrimos con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Por último se
lavó y secó para observar la morfología en el microscopio.
3.2 Pruebas Bioquímicas
De las colonias encontradas en los medios de cultivos, procedimos a realizar pruebas
bioquímicas para su confirmación las cuales detallamos a continuación:
3.2.1 Prueba de catalasa
Con la ayuda de un asa, colocamos una colonia al azar sobre un porta objeto estéril y se
añadimos una gota de peróxido de hidrógeno. Es positiva si se observa la formación de
burbujas indicando la liberación de oxígeno.
3.2.2 Prueba de SIM
Se Siembra con un asa recta, por picadura central hasta llegar al fondo del tubo. Luego
se incuba a 370C por 24 horas, se observa la producción de sulfuro, motilidad y para
verificar el indol, se le adiciona 2 o 3 gotas del reactivo Kovacs.
3.2.3 Prueba del citrato
Se inocula con el asa recta hasta el fondo, luego se incuba a 24 horas a 370C. Solo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrían multiplicarse en este medio y liberan
40
iones de amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte
basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de
verde a azul. Por el indicador de Bromotimol.
3.3 Análisis Estadísticos
Nuestros datos fueron analizados mediante el Análisis de Varianza (ANOVA) para
determinar la diferencia significativa en cada prueba.
42
RESULTADOS
El estudio arrojó que existieron diferencias significativas entre los tres expendios de
comida para mesófilos aerobios, datos que se muestra en el cuadro Nº 4.
Cuadro N0 4. Análisis de Varianza para Mesófilos Aerobios entre los tres
expendios de comida
Fuente DF Suma de
cuadrados
Cuadrado
de la
media
Coeficiente
de
Variación
Media F-Valor Pr > F
Modelo 2 2.765 1.382 74.90893 0.843 3.46 0.039*
Error 51 20.383 0.399
Total 53 23.149
*: Existen diferencias significativas
**: Existen diferencias altamente significativas
ns: No existen diferencias significativas
La prueba de rangos múltiples de Duncan muestra que el Restaurante la Estrella
presentó mayor nivel de mesófilos aerobios en comparación con los otros dos
expendios, como lo muestra el cuadro Nº 5.
Cuadro N0 5. Prueba de rangos múltiples de Duncan para mesófilos aerobios entre
los tres expendios de comida
Duncan Agrupamiento
Media N Expendios de Comida
A 1.087 54 Restaurante La Estrella
A 0.902 54 Restaurante Panamá
B 0.542 54 Restaurante La Central
43
El Restaurante la Estrella presentó mayor porcentaje de mesófilos aerobios (UFC/cm2)
en comparación con los otros dos expendios, como lo muestra la gráfica Nº 1.
Grafica N01. Porcentaje encontrado de Unidades Formadoras de Colonias
(UFC) / cm2
de mesófilos aerobios entre los tres expendios de comida.
36%
20%
44% Restaurante Panamá
Restaurante La Central
Restaurante La Estrella
No hubo diferencias significativas en el Análisis de Varianza para Coliformes totales
entre los tres expendios de comida, datos que se muestran en el cuadro Nº 6.
Cuadro N0 6. Análisis de Varianza para coliformes totales entre expendios de
comida
Fuente DF Suma de
cuadrados
Cuadrado
de la media
Coeficiente de
Variación
Media F-Valor Pr > F
Modelo 2 1.464 0.732 124.480 0.481 2.04 0.1404ns
Error 51 18.303 0.358
Total 53 19.767
*: Existen diferencias significativas
**: Existen diferencias altamente significativas
ns: No existen diferencias significativas
44
El cuadro N° 7 muestra que no hay diferencias significativas en el Análisis de
Varianza para E. coli entre los tres expendios de comida.
Cuadro N0 7. Análisis de Varianza para E. coli entre los tres expendios de comida
Fuente DF Suma de
cuadrados
Cuadrado de
la media
Coeficient
e de
Variación
Media F-
Valor
Pr > F
Modelo 2 0.582 0.291 115.459 0.379 1.52 0.228ns
Error 51 9.776 0.191
Total 53 10.359
*: Existen diferencias significativas
**: Existen diferencias altamente significativas
ns: No existen diferencias significativas
El Restaurantes Panamá presentó mayor promedio del recuento total de coliformes
totales y E. coli en comparación con los otros dos expendios. Datos que se muestran en
la Gráfica Nº 2.
Grafica N0 2. Promedios del recuento total (UFC/cm
2) para Coliformes Totales y
E. coli entre los tres expendios de comida.
0
5
10
15
20
25
Restaurante
Panamá
Restaurante La
Central
Restaurante La
Estrella
Expendios de Comida
UF
C C
oli
form
es
/ cm
2
Coliformes totales
E. coli
45
El análisis de varianza realizado a la prevalencia de mesófilos aerobios en las
superficies vivas e inertes, se encontraron diferencias altamente significativas de los
tres expendios de comida. Datos mostrados en el cuadro Nº 8:
Cuadro Nº 8. Análisis de Varianza para mesófilos aerobios entre las superficies
vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida.
Fuente DF Suma de
cuadrados
Cuadrado
de la
media
Coeficiente
de
Variación
Media F-Valor Pr > F
Modelo 2 9.081 4.540 82.082 0.780 11.06 <.0001**
Error 159 65.251 0.410 Total 161 74.332
*: Existen diferencias significativas
**: Existen diferencias altamente significativas
ns: No existen diferencias significativas
La prueba de rangos múltiples de Duncan mostró diferencias altamente significativas
entre las superficies estudiadas, con un mayor recuento en la tabla, datos que se
muestran en el cuadro Nº 9.
Cuadro Nº 9. Prueba del rango múltiple de Duncan para Mesófilos aerobios entre
las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.
Duncan Agrupamiento
Media
N
Superficies
A 0.806 54 Mesa
B 1.057 54 Tabla
C 0.478 54 Manos
46
La tabla obtuvo mayor promedio en UFC de mesófilos aerobios en comparación con las
demás superficies (mesa y manos). Como se muestra en la gráfica N°3.
Gráfica N0
3. Promedio del recuento total (UFC/cm2) para
Mesófilos aerobios en
superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.
Hubo diferencias significativas en el Análisis de Varianza para Coliformes Totales
entre las superficies (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida, como se
muestra en el cuadro Nº 10.
Cuadro Nº 10. Análisis de Varianza para Coliformes Totales entre las superficies
vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida.
*: Existen diferencias significativas
**: Existen diferencias altamente significativas
ns: No existen diferencias significativas
Fuente DF Suma de
cuadrados
Cuadrado
de la
media
Coeficiente
de
Variación
Media F-
Valor
Pr > F
Modelo 2 4.124 2.062 127.450 0.444 6.43 0.0021*
Error 159 50.952 0.320
Total 161 55.076
47
La prueba de rangos múltiples de Duncan muestra que hay diferencias significativas en
las superficies inertes (tabla) con respecto a las demás superficies en estudio. Datos
mostrados en el cuadro Nº 11.
Cuadro Nº 11. Prueba del rango múltiple de Duncan para Coliformes Totales
entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.
Duncan Agrupamiento
Media
N
Superficies
B 0.335 54 Mesa
A 0.670 54 Tabla
B 0.328 54 Manos
El Análisis de Varianza para E. coli entre las superficies vivas e inertes de los tres
expendios de comida muestra que existieron diferencias significativas. Los datos se
observan en el cuadro Nº 12.
Cuadro Nº 12. Análisis de Varianza para E. coli entre las superficies vivas e
inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida.
*: Existen diferencias significativas
**: Existen diferencias altamente significativas
ns: No existen diferencias significativas
Fuente DF Suma de
cuadrados
Cuadrado
de la
media
Coeficiente
de
Variación
Media F-
Valor
Pr > F
Modelo 2 1.459 0.729 120.609 0.345 4.20 0.0167*
Error 159 27.605 0.174
Total 161 29.064
48
Según la prueba de rangos múltiples de Duncan hubo diferencias significativas entre las
superficies inertes (tabla) con respecto a las demás superficies estudiadas. Datos
mostrados en el cuadro Nº 13
Cuadro Nº 13. Prueba del rango múltiple de Duncan para E. coli entre las
superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.
Existió mayor promedio de UFC/ cm2
de coliformes totales y E. coli en las superficies
inertes (tabla) con relación a las otras dos superficies (mesa y manos). Datos mostrados
en la gráfica N° 4.
Grafica N 0
4. Promedio del recuento total (UFC/cm2)
para Coliformes Totales y E.
coli entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.
Duncan Agrupamiento Media N Superficies
B 0.297 54 Mesa
A 0.478 54 Tabla
B 0.262 54 Manos
49
Entre las superficies inertes estudiadas, la tabla no cumplió con las normas
internacionales utilizadas en esta investigación para mesófilos aerobios. Los valores se
observan en la gráfica Nº 5.
Gráfica Nº 5. Evaluación de los niveles de UFC/cm2 de mesófilos aerobios en las
superficies inertes (mesa y tabla) comparándolas con las normas mexicanas.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Mesa Tabla
Superficies Inertes
UF
C/c
m2
Mesófilos encontrados
Norma Mexicana
50
Para superficies inertes, solo la tabla no cumplió con las normas internacionales para
coliformes totales, datos que se muestran en la gráfica Nº 6.
Gráfica Nº 6. Evaluación de los niveles de UFC/cm2 de coliformes totales y E. coli
de las superficies inertes (mesa y tabla) versus las normas peruanas.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Mesa Tabla
Superficies Inertes
UF
C/c
m2 Coliformes totales
E. coli
Normas peruanas
51
Los niveles de UFC/ml de mesófilos aerobios cumplieron con las normas
internacionales (normas mexicanas) para superficies vivas (manos). Datos mostrados
en la gráfica Nº 7.
Gráfica Nº 7. Evaluación de los niveles de UFC/ ml para mesófilos aerobios en las
superficies vivas (manos) comparándolas con la normas mexicanas.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Manos Norma mexicana
Superficies vivas
UF
C/m
l
52
Para superficies vivas (manos), cumplieron con las normas internacionales (normas
peruanas) para coliformes totales y E. coli. Datos que se muestran en la gráfica Nº 8.
Gráfica Nº 8. Evaluación de los niveles de UFC/ ml para coliformes totales y E. coli
en las superficies vivas (manos) comparándolas con la normas peruanas.
0
20
40
60
80
100
120
Manos
Superficies Vivas
UF
C/m
l Coliformes totales
E. coli
Normas peruanas
53
El estudio arrojó niveles altos de levaduras entre los tres expendios de comida. Datos
mostrados en la gráfica Nº 9.
Gráfica Nº 9. Porcentaje detectado de hongos y levaduras en los tres expendios de
comida.
50%
22%
19%
9%
Levadura
Aspergilus
Penicillium
Fusarium
54
DISCUSIÓN
Esta investigación tiene como objetivo determinar la calidad microbiológica en las
superficies vivas e inertes de tres expendios de comida en Chitré, dando como resultado
lo siguiente: existieron diferencias significativas en el análisis de varianza para
mesófilos aerobios entre los tres expendios de comida (ver cuadro Nº 1). Se
comprobó mediante la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan que hubo diferencias
significativas entre el Restaurante La Estrella y Restaurante La Central, entre el
Restaurante Panamá y Restaurante La Central; sin embargo, entre el restaurante que La
Estrella y Restaurante Panamá no existieron diferencias significativas, comprobando
así, que algunos expendios presenta mejor desinfección que otros, datos que se
muestran en el cuadro N° 2. La elaboración de comidas preparadas es una actividad de
elevado riesgo sanitario, ya que en ella se registra el mayor número de brotes de
enfermedad de transmisión alimentaria (Malo y Prior, 2004). Para coliformes totales y
E. coli no existieron diferencias significativas entre los tres expendios de comida (ver
cuadro N° 3, 4). El restaurante La Estrella obtuvo mayor cantidad de mesófilos
aerobios en las superficies vivas e inertes (mesa, tabla y manos) con un porcentaje de 44
%, seguido del restaurante Panamá con un porcentaje de 36 % y por último, el
restaurante La Central con 20 % (ver Grafica Nº1). Para Coliformes totales y E. coli, el
restaurante Panamá es el más alto con un promedio de 20UFC/cm2 para coliformes
totales y 7 UFC/cm2 para E. coli en los seis muestreos realizados. El restaurante La
Estrella va precedido del restaurante Panamá con un promedio de 18 UFC/cm2 de
coliformes totales y 5 UFC/cm2 para E. coli. Y por último, el restaurante La Central
con 9 UFC/cm2 para coliformes totales y 3 UFC/cm
2 para E. coli. Datos que se pueden
observar en la Gráfica Nº2.
55
En el caso de las superficies vivas e inertes, existieron diferencias altamente
significativas para mesófilos aerobios (ver cuadro N° 5); siendo la tabla la que
presentó mayor promedio con 46 UFC/cm2. (Ver gráfica Nº3). La producción de
alimentos libres de contaminantes no solo depende del lugar de su producción sino
también del proceso de elaboración y de las personas que están en contacto con ellos
(Rembado y Aluffi, 2009). Para coliformes totales y E coli existieron diferencias
significativas, mostrando que hubo contaminación de origen fecal por una mala higiene
personal (ver cuadro N° 7 y 9). Los coliformes totales tienen un promedio de 28
UFC/cm2 y E. coli 8 UFC/cm
2 en la tabla. En segundo lugar, se encuentra la mesa con
12 UFC/cm2 de coliformes totales y 6 UFC para E. coli. En último lugar se encuentra
las manos con 7 UFC para coliformes totales y 2 UFC para E. coli. (Ver gráfica Nº 4).
En la tabla existió una alta contaminación de mesófilos aerobios, coliformes totales y E.
coli superando las normas mexicanas y peruana. En la mesa no se encontró
contaminación para mesófilos aerobios y coliformes totales ni E. coli, basándose en la
norma mexicana para mesófilos aerobios y la norma peruana para coliformes totales y
E. coli. (Ver gráfica 5y6). En las superficies vivas (manos) no superaron las normas
internacionales para mesófilos aerobios y coliformes totales y E. coli. (Ver gráfica Nº7
y 8).
En el caso de los hongos y levaduras, aún no se han establecido normas para superficies
que indiquen dentro de qué rango se encuentran, más sin embargo, estos son
microorganismos de origen ambiental que disminuye la vida útil del producto y se
asocian con materia prima contaminada o ambiente contaminado. (Escobar y Melillo,
2009). Para hongos se encontró gran cantidad de levadura en los expendios de comida,
encontrado en mayor proporción en la mesa y en las manos. En segundo lugar se
encuentra los hongos del género Aspergillus seguido del género Penicillium. El hongo
56
que se encontró en menor proporción fue el género Fusarium. (Ver gráfica Nº9). La
alteración por levaduras no constituye un peligro para la salud del consumidor, más sin
embargo, indica que hubo deficiencia en los procesos de sanitización. (Escobar y
Melillo, 2009).
58
CONCLUSIONES
1. Tanto en superficies vivas como inertes los niveles de E. coli, estuvieron por encima
de las normas.
2. Los mesófilos aerobios y coliformes totales en la mesa se mantuvieron por debajo de
las normas.
3. La superficie de mayor prevalencia de microorganismos fue la tabla, superando las
normas internacionales.
4. El restaurante La Estrella presentó mayor cantidad de mesófilos aerobios.
5. Para Coliformes totales y E. coli el restaurante Panamá fue el que presentó mayor
cantidad en ambos microorganismos.
6. Según ésta investigación el restaurante La Central presentó mejor calidad
microbiológica.
7. La bacteria que se encontró con mayor frecuencia fue E. coli.
8. Las levaduras se encontraron con mayor prevalencia.
9. En algunos manipuladores de alimentos obtuvimos niveles altos de coliformes,
incluso E. coli.
59
RECOMENDACIONES
1. Vigilar más de cerca la calidad microbiológica de superficies en cada expendio
por parte de los dueños del establecimiento.
2. Se recomienda que en los expendios de comida evaluados sean procesados por
separado las carnes de los vegetales, por ejemplo la tabla de picar en cada
expendio debe desinfectarse cada vez que se utilice para preparar la comida.
3. En cada expendio de comida debe existir una desinfección por cada preparación
de alimentos, ya que los mismos son fuente de contaminación prolongada.
4. El personal que labora en cada expendio de comida debe ser capacitado sobre la
posible contaminación a la que pueden estar expuestos los alimentos y las
consecuencias de los mismos.
5. Los uniformes y demás utensilios deben ser lavados correctamente para evitar
contaminación.
6. Las mesas deben desinfectarse con mayor frecuencia para evitar contaminación
entre una comida y otra.
7. Se debe realizar supervisión por parte del Ministerio de Salud en los expendios
de comida, para asegurar que no se presente ninguna contaminación que pueda
afectar al consumidor.
60
BIBLIOGRÁFIA
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YIJnnRmEymG4JWiwm0ptmg2O0BLVysIINY3i6e506Vq33MQxViHzL3bpyexw5
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64
Fig. 1 Flujograma para el procesamiento de las muestras en el Laboratorio.
PCA Endo Less PDA
Se realizaron diluciones hasta llegar a 10-3
. Luego se procedió a sembrar por esparcido
0.1 ml de la última dilución en los platos que contenía PCA, Endo Less y PDA con sus
respectivas réplicas.
65
Cuadro Nº14. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el primer muestreo del estudio.
.
Expendios de comida Sitios de
muestreos
Réplicas Mesófilos
aerobios
Coliformes
totales
E.
coli
Hongos
Restaurante Panamá Mesa 1 1 0 0 Aspergillus
Restaurante Panamá Mesa 2 0 0 0 Aspergillus
Restaurante Panamá Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 2 0 50 20 0
Restaurante La Central Mesa 3 0 1 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 3 1 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 1 0 0 0 Levadura
Restaurante Panamá Tabla 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 3 0 0 0 Levadura
Restaurante La Central Tabla 1 65 34 14 Levadura
Restaurante La Central Tabla 2 42 52 16 Levadura
Restaurante La Central Tabla 3 53 32 7 Levadura
Restaurante La Estrella Tabla 1 0 0 0 Aspergillus
Restaurante La Estrella Tabla 2 3 0 0 Levadura
Restaurante La Estrella Tabla 3 2 0 0 levadura
Restaurante Panamá Manos 1 10 0 0 0
Restaurante Panamá Manos 2 6 0 0 0
Restaurante Panamá Manos 3 6 0 0 0
Restaurante La Central Manos 1 1 0 0 0
Restaurante La Central Manos 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Manos 3 1 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 1 0 0 0 Levadura
Restaurante La Estrella Manos 2 0 0 0 Penicillium
Restaurante La Estrella Manos 3 1 0 0 Penicillium
66
Cuadro Nº15. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el segundo muestreo del estudio.
Expendios Sitios de
muestreos
Réplicas Mesófilos
aerobios
Coliformes
totales
E.
coli
Hongos
Restaurante Panamá Mesa 1 298 243 100 Levadura
Restaurante Panamá Mesa 2 168 175 82 Levadura
Restaurante Panamá Mesa 3 272 192 90 Levadura
Restaurante La Central Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 1 4 0 0 Aspergillus
Restaurante Panamá Tabla 2 2 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 3 3 0 0 Aspergillus
Restaurante La Central Tabla 1 25 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 2 36 0 0 Aspergillus
Restaurante La Central Tabla 3 24 1 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 1 138 15 6 Penicillium
Restaurante La Estrella Tabla 2 59 20 8 Penicillium
Restaurante La Estrella Tabla 3 70 22 12 Penicillium
Restaurante Panamá Manos 1 16 0 0 Fusarium
Restaurante Panamá Manos 2 27 0 0 Fusarium
Restaurante Panamá Manos 3 24 0 0 Fusarium
Restaurante La Central Manos 1 1 0 0 0
Restaurante La Central Manos 2 13 0 0 0
Restaurante La Central Manos 3 1 0 0 Levadura
Restaurante La Estrella Manos 1 84 2 1 Aspergillus
Restaurante La Estrella Manos 2 25 1 0 Levadura
Restaurante La Estrella Manos 3 13 2 1 Aspergillus
67
Cuadro Nº16. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el tercer muestreo del estudio.
Expendios Sitios de
muestreos
Réplicas Mesófilos
aerobios
Coliformes
totales
E.
coli
Hongos
Restaurante Panamá Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 1 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 3 0 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 1 2 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 2 3 1 1 Levadura
Restaurante La Central Tabla 3 1 1 1 0
Restaurante La Estrella Tabla 1 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 3 0 0 0 0
Restaurante Panamá Manos 1 1 1 1 Levadura
Restaurante Panamá Manos 2 9 1 1 Levadura
Restaurante Panamá Manos 3 27 1 1 Levadura
Restaurante La Central Manos 1 0 0 0 Levadura
Restaurante La Central Manos 2 49 0 0 0
Restaurante La Central Manos 3 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 1 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 3 0 0 0 0
68
Cuadro Nº17. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el cuarto muestreo del estudio.
Expendios Sitios de
muestreos
Réplicas Mesófilos
aerobios
Coliformes
totales
E.
coli
Hongos
Restaurante Panamá Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 3 1 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 3 1 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 1 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 3 0 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 1 45 300 94 Levadura
Restaurante La Central Tabla 2 53 0 0 Levadura
Restaurante La Central Tabla 3 31 30 0 Levadura
Restaurante La Estrella Tabla 1 300 299 94 Penicillium
Restaurante La Estrella Tabla 2 299 300 76 Penicillium
Restaurante La Estrella Tabla 3 300 300 80 Penicillium
Restaurante Panamá Manos 1 6 1 1 Aspergillus
Restaurante Panamá Manos 2 3 3 3 Aspergillus
Restaurante Panamá Manos 3 4 0 0 Aspergillus
Restaurante La Central Manos 1 9 1 1 0
Restaurante La Central Manos 2 3 1 1 0
Restaurante La Central Manos 3 3 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 1 2 3 1 0
Restaurante La Estrella Manos 2 10 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 3 18 0 0 0
69
Cuadro Nº18. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el quinto muestreo del estudio.
Expendios Sitios de
muestreos
Réplicas Mesófilos
aerobios
Coliformes
totales
E.
coli
Hongos
Restaurante Panamá Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 3 13 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 1 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 3 4 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 1 23 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 3 59 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 1 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 2 0 0 0 0
Restaurante Panamá Tabla 3 0 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 1 105 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 2 113 0 0 0
Restaurante La Central Tabla 3 15 0 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 1 3 0 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 2 2 0 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 3 2 0 0 0
Restaurante Panamá Manos 1 18 75 73 Levadura
Restaurante Panamá Manos 2 25 300 1 Levadura
Restaurante Panamá Manos 3 14 1 1 Levadura
Restaurante La Central Manos 1 0 0 0 0
Restaurante La Central Manos 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Manos 3 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 1 4 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 2 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 3 44 0 0 Fusarium
70
Cuadro Nº19. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el sexto muestreo del estudio.
Expendios Sitios de
muestreos
Réplicas Mesófilos
aerobios
Coliformes
totales
E.
coli
Hongos
Restaurante Panamá Mesa 1 2 0 0 0
Restaurante Panamá Mesa 2 11 0 0 Levadura
Restaurante Panamá Mesa 3 30 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 1 8 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 2 0 0 0 0
Restaurante La Central Mesa 3 0 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 1 3 1 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 2 4 0 0 0
Restaurante La Estrella Mesa 3 0 1 0 0
Restaurante Panamá Tabla 1 77 30 3 Penicillium
Restaurante Panamá Tabla 2 300 54 5 Penicillium
Restaurante Panamá Tabla 3 50 14 6 Levadura
Restaurante La Central Tabla 1 12 6 1 0
Restaurante La Central Tabla 2 60 8 1 0
Restaurante La Central Tabla 3 14 4 1 0
Restaurante La Estrella Tabla 1 60 2 0 0
Restaurante La Estrella Tabla 2 72 6 4 0
Restaurante La Estrella Tabla 3 58 7 3 0
Restaurante Panamá Manos 1 10 0 0 aspergillus
Restaurante Panamá Manos 2 5 0 0 aspergillus
Restaurante Panamá Manos 3 5 0 0 Levadura
Restaurante La Central Manos 1 1 0 0 0
Restaurante La Central Manos 2 1 0 0 0
Restaurante La Central Manos 3 6 0 0 0
Restaurante La Estrella Manos 1 19 0 0 Levadura
Restaurante La Estrella Manos 2 14 3 0 0
Restaurante La Estrella Manos 3 40 1 0 0
71
Toma de la muestra
Fig. Nº 2. Técnica de hisopado que se
utilizó para la recolección de la muestra
en superficie inerte, en cada uno de los
expendios de comida. (Mesa).
Fig. Nº 3. Técnica de hisopado en la tabla
(superficie inerte) de cada expendio de
comida.
Fig. Nº 4. Toma de muestras en las manos
de la persona que manipula los alimentos.
72
Procesamiento de las muestras en el laboratorio
Fig. Nº 5. Técnica utilizada para el
cultivo de las muestras.
Fig. Nº6. Platos con cultivos positivos de
coliformes.
73
Pruebas Bioquímicas
Fig. Nº8. Prueba de catalasa negativa
aplicada a una colonia bacteriana
Fig.Nº9. Prueba de SIM con resultado
positivo de motilidad
Fig.Nº7. Morfología de los
microorganismos aislados de los
diferentes expendios.
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