tema 4 metodologias

??????????Técnicas para estudiar las proteínas2011 1

blanca.ortiz@siu.udea.edu.co

Mecánicos

Licuadora

Sonicador

Prensa francesa

Perlas de vidrio

Arena de mar

Homogenizador

Químicos/TermicosLisis por lisozima

Lisis por Detergentes

Nitrógeno liquido

Masa (m)

Densidad de la solución (p)

Radio del tubo (r)

Velocidad angular (w- rad.s-1)

Volúmen de la partícula (V) (Vp)

PolysomesMicrosomes

Cromatografías

CM – Carboxi-metilCromatografía de intercambio catiónico

DEAE – Dietil-aminoetilCromatografía de Intercambio aniónico

-CH3-CH2-NH+(CH2CH2)2+

NaCl

Na+

Cl-

-CH2-COO-

NaClNa+

Cl-

Línea de Origen

Placa de Sílica o Celulosa

Frente del solvente

Cromatografía de capa delgada (TLC)

Metionina

Isoleucina

Leucina

Fenilalanina

Valina

Triptófano

Tirosina

SerinaAlanina

Glicina

Homocisteína

Cisteína

Origen

3H2O H+

C OH

O

O

C

COH

COH

O

O

C

COH

C H

R

COO-

H3N++ +

CO2

OC

HR+

C

O

O

C

C=N-C

O-

O

C

C + +

NinhidrinaAminoácido

Pigmento púrpura

Ninhidrina

DIALISIS

. .Eppendorf

Membrana

Vm = volúmen de la muestraCsm = concentración de sales muestraVt = volúmen tampónCst = concentración de sales tampónVT = volúmen totalCsf = concentración de sales finales.

Tiempo recomendado de 16 a 24 horas

No. de cambios Vs. Tiempo

Se trabaja a 4°C (cuarto frío)

Manejo: con guantes para evitar contaminación con proteasas, DNAsas, RNAsas

(Vm) * ([Csm]) + (Vt) * ([Cst])

VT= ([Csf])

Volúmen tampón diálisis Vs. Concentración sales

Tto.Tto.Urea ó Urea ó ββ-ME-ME

DiálisisDiálisis

Bradford – A595 nm25 – 200 µg/ml

Prot. Basicas (R)

Lowry – A660 nm5 – 100 µg/ml(Y – W – H)

BCA– A562 nm10 – 1.200 µg/ml

0.5 – 10 µg/ml(C – W – Y)

(NH4)2S2O8) Persulfato de Amonio

(PA)

C6H16N2

N`N`N`N`-Tetramethylethylenediamine

(TEMED)

% Acrilamida Resolución de Separación – kDa.

15 15 a 45

12.5 15 a 60

10 18 a 75

7.5 30 a 120

5 60 a 212

Gradientes

5 - 20 15 - 200

3 - 30 13 - 950

Coomassie Brillant Blue.Afinidad por proteínas Básicas: Lys, Arg.

AgNO3Afinidad proteínas ácidas ácido aspártico, ácido glutámico

7.4

21.9

30.2

36.3

52.2

PM1 2 3 4 5 6 7 8 9 10PM

21

30

36

52

85

MW 1 2 3 4 5 6 7

1 - 500 ng, 2 - 250 ng, 3 - 125ng, 4 - 62.5ng, 5 - 31.2ng, 6 - 15.6ng y 7 - 7.8ng.

Curva BSA (promega)

No Proteína No. Proteína

1 Pepsin 10 β-amilasa

2 Ovalbumina 11 Nicotinamida deaminasa

3 α-amilasa 12 α-ureasa

4 Albumina 13 Catalasa

5 Transferrina 14 Xantina oxidasa

6 Ovotransferrina 15 Apoferritina

7 Hexoquinasa 16 Ureasa

8 Lactato deshidrogenasa 17 Ribulosa difosfato carboxilasa

9 Cetona-1-fosfato aldolasa

37

25

15

10

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

37

25

15

10

PM 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

G1: 19 – 22 kDa G2:23 – 25 kDa

G3: 26 – 29 kDa G4: 30-36 kDa

BSA Estandarización

Proteínas de Mtb

Condiciones Corrido:

Tiempo Volts. mA Watts(2) 10 min 200V 4mA 4W(3) 10 min 450V 3mA 4W(4) 10 min 750V 2mA 4W(5) 5 min 1200V 1mA 4W(6) 5 min 1600V 1mA 4W(7) 2 hrs 2000V 1mA 4W

Equilibrar las tirillas:Equilibrar las tirillas:Buffer 4X LDS (invitrogen)Buffer 4X LDS (invitrogen)

Incubar con agitación 10 min a T. amb.Incubar con agitación 10 min a T. amb.

Condiciones Corrido: Gel 4-12% Bis-Tris (invitrogen)Gel 4-12% Bis-Tris (invitrogen)

Tiempo Volts. mA Watts50 – 55 min 200 190 - 170 38

Buffer de corrido: MES-SDS (invitrogen)Buffer de corrido: MES-SDS (invitrogen)

75

50

37

25

20

Guanidina-6M: 2D-PAGE– 200 µg (10-05-06)

Guanidina-6M: 200 µg (10-10-06) 2% SDS: 200 µg (10-10-06)

Triton 4% Fase acuosa: 200 µg (10-10-06)Triton 114 4% Fase deterg.: 200 µg (10-10-06)

75

50

37

25

20

15

10

100

150

250

75

50

37

25

20

15

10

100

150

250

75

50

37

25

20

15

10

100

150

250

75

50

37

25

20

15

10

100

150

250

1

2

3

4

5

6

+-

0rigen

Pozos

Proteínas del suero en geles de agarosa

37

49

64

82

115

180

26

19

C/ND LES/ND LES +A/NDC/D LES/D LES +A/DPM

Hemoglobina + Igs = 75% - 80%

Suero Control

Suero LES Suero LES + Anemia

2% SDS: 2D-PAGE– 200 µg (10-05-06)

75

50

37

25

20

15

10

100

150250

10090608bfrB

10090615Control 1

HsPx

10090610phoS1

10090612 Control 2

Ald (Rv2780)

Triton 4% Fase acuosa: 2D-PAGE – 200 µg (10-05-06)

75

50

37

25

20

15

10

100

150

250

1010060301rpmC

10090616Control 1

HsPx

1010060313ppiA (19 kDa) +

rplF (19 kDa)

1010060306lsr2

1010060309rplT (15 kDa) + rplR (13 kDa)

1010060311Possible HsPx

1010060303HP: Rv1738

10090613 Control 2

Ald (Rv2780)

Toma de la muestraToma de la muestra

Se corta la puntaSe corta la punta

Servilleta Servilleta BlancaBlanca

VidrioVidrio

GelGel

Eliminar todo el liquidoEliminar todo el liquidotomado con la muestratomado con la muestra

Auto-samplerAuto-sampler Capillary-HPLCCapillary-HPLC

ES-Ion Trap-MSES-Ion Trap-MS

Sheath GasSheath Gas

LC FlowLC Flow

Auxiliary GasAuxiliary Gas

ESI NeedleESI Needle

HeatedHeatedCapillaryCapillary

Tube LensTube Lens

OctapoleOctapoleEndcapEndcap

RingRingElectrodeElectrode ConversionConversion

DynodeDynode

Electron Electron MultiplierMultiplier

Workings of the Electrospray-Ion Trap Mass SpectrometerWorkings of the Electrospray-Ion Trap Mass Spectrometer

Cátodo (Cátodo (-)-)

Anodo (+)Anodo (+)

Papel de filtro (3M)Papel de filtro (3M)

GelGel

Membrana de Membrana de nitrocelulosanitrocelulosa

Proteínastransferidas

1er. Ac.2do. Ac.

Unido a laenzima

Revelado

Inmunotransferencia

ANTICUERPOS ANTICUERPOS MONOCLONALES????MONOCLONALES????

Monoclonales

VS Policlonales

Balb/c

Epitopes

Lineales

Conformacionales

De NOVO

Día= -30 -15 -3 -2 -1 0 -45

Ag + ACF Ag + AIF Ag

Desarrollos Biotecnológicos

QuiméricoFC humano/Fab murino

ximab

Anticuerpo humanizadoFC humano/

Fab Humano-murinozumab

Humano100% humano

umab

Factores variables de cadena simple

ScFv

Anticuerpos humanizados

Proteína de fusiónFC Ig/Receptor de una proteína humana

cept

Proteínas de Fusión con el Fc

Proteínas de Fusión con el Fc

Aislamiento y marcaje para su

Identificación

To be or not to be?

Anticuerpos específicos

Inhibidores TNFα

Proteína de fusión dimérica ⇒ Ligando de la porción extracelular de TNF p75 ⇒ Fracción Fc de la IgG1

Ac monoclonal quimérico 75% / 25%

Anticuerpos específicos• “Inmunoterapia Sérica”• Von Behring y Kitasato Premio Nobel• Generación de anticuerpos monoclonales

(Kohler, Milstein, Jerne)

Monoclonales murinos

Corta vida mediaInmunogénicosReacciones alérgicas

Anticuerpos recombinantesQuiméricos

Anticuerpos Humanizados

Von Behring

Kitasato

Antitoxina del tetano (1890)Descubrieron que al inyectar el suero sanguíneo de un animal afectado por el tétanos a otro, se genera inmunidad a la enfermedad en el segundo.

En 1891 trataron con suero a una niña enferma de difteria salvando su vida. Esto le hizo sospechar a Behring la existencia de unas sustancias (que llamó antitoxinas) que eliminaban las toxinas segregadas por las bacterias lo que supuso un gran avance en el conocimiento de las defensas corporales.

Por este trabajo obtuvo el primer Premio Novel de fisiología y Medicina en 1901.

Niels K. Jerne

Georges Kohler

Cesar Milstein

N. K. Jerne junto con César Milstein y Georges J.F. Kohler obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en el año 1984, por sus teorías sobre la especificidad en el desarrollo y control de los sistemas inmunitarios y por el descubrimiento del principio activo de la producción de ANTICUERPOS MONOCLONALES

Gerald Maurice Edelman ''Por sus descubrimientos de la estructura química de los anticuerpos"( compartido con Rodney Robert Porter)Premio Novel Medicina 1972

"Por su descubrimiento del principio genético para la generación de la diversidad en los anticuerpos“premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1987

Gerald Maurice Edelman

Susumu Tonegawa

RodneyRobert Porter